Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Angiogeneesi voi olla rooli patogeneesissä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). CXC (ELR

+) kemokiiniperhe ovat voimakkaita edistäjiä angiogeenisen vasteen.

Methods

ilmaus CXC (ELR

+) perheenjäsenet (

CXCL1-3 /GROα-γ

,

CXCL8 /IL-8

,

CXCR1 /2

) tutkittiin sarjassa resektoitiin tuore NSCLC kasvaimia. Lisäksi ilmaisun ja epigeneettiset sääntelyn näiden kemokiinien tutkittiin normaaleissa keuhkoputken epiteelin ja NSCLC solulinjoissa.

Tulokset

Kaiken ilmaus kemokiinin ligandien (

CXCL1, 2

,

8

) ja niiden reseptorien (

CXCR1 /2

) on säädeltiin tuumorinäytteissä verrattuna normaaliin, lukuun ottamatta

CXCL3

.

CXCL8

ja

CXCR1 /2

todettiin epigeneettiseltä säädellä histoni translaation jälkeiset modifikaatiot. Rekombinantti CXCL8 ei stimuloinut solujen kasvua joko normaalin keuhkoputken epiteelin tai levyepiteelikarsinoomasolu line (SKMES-1). Kuitenkin havaittiin kasvua 72 tuntia hoidon adenokarsinoomasolulinja.

Johtopäätökset

CXC (ELR

+) kemokiinit väärin säädellystä NSCLC. Tasapaino näiden kemokiinien voi olla kriittistä kasvaimen mikroympäristössä ja vaatii edelleen selventämiseksi. Jää nähtäväksi, epigeneettisellä kohdentaminen näistä reiteistä on toteuttamiskelpoinen hoitovaihtoehto keuhkosyövän hoidossa.

Citation: Baird AM, Gray SG, O’Byrne KJ (2011) Epigenetiikka asetuksen taustalla on CXC ( ELR

+) kemokiinien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 6 (1): e14593. doi: 10,1371 /journal.pone.0014593

Editor: Kelvin Yuen Kwong Chan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 14 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 02 tammikuu 2011; Julkaistu: 27 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Baird et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rajoittamattoman koulutus- avustusta Pfizer. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: rahoitus tämä projekti antaa Pfizer muodossa palkkaa Anne- Marie Baird. Ei rahoitettiin kulutushyödykkeiden. Myönnetty rahoitus oli apurahan-in-tukea, ja sellaisena se ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Angiogeneesi on tärkeitä kasvua ja leviämistä syövän ja vaikuttaa myös tulehduksellinen muutoksia, jotka saattavat ennalta luovuttaa tälle sairaudelle [1]. CXC (ELR

+) kemokiinien indusoivat angiogeneesiä ja se voi olla tärkeä syöpiä, jotka ovat angiogeenisen fenotyyppi kuten NSCLC [2].

Termi kemokiini viittaa perheeseen pienimolekyylipainoisen (8- 10 kDa) kemotaktinen sytokiineja. Kemokiinit ovat pieniä indusoituvia sytokiineja, jotka ovat kemiallis-houkutteet leukosyyttejä. Kemokiinit luokitellaan niiden aminohappokoostumus, funktionaalisen aktiivisuuden ja reseptoriin sitoutumisen ominaisuudet ja koostuvat neljästä osa perheiden määritellään kahteen ensimmäiseen neljästä konservoitunutta kysteiinitähdettä (a) C, (b) CC, (c) CXC ja (d) CXXXC [3]. CXC-kemokiini perheeseen kuuluu kaksi alatyyppiä, ELR

+ ja ELR

– mukaan erityisesti Glu-Leu-Arg (ELR) motiivi edeltävän ensimmäisen kysteiinitähteen [3]. CXC (ELR

+) promoottorit sisältävät oletetun

cis

elementti, joka tunnistaa NF-KB, ja siksi voi aiheuttaa trans-aktivoitumisen CXC-kemokiinien [4].

angiogeenisen reseptorin varten CXCL8 ja toinen CXC (ELR

+) kemokiinien on CXCR2 [5]. Blockade tämän reseptorin johtaa vähenemiseen angiogeneesin haimasyövän [6], ja merkittävä inhibitio ihmisen melanoomakasvaimen kasvua ja kokeellinen keuhkojen etäpesäkkeiden CXCR2 – /- hiirissä, samoin kuin vähentää angiogeneesiä [7]. Sisällä asetus keuhkojen, syövän kasvua ja metastaattisen potentiaali on alassäädetty useissa hiiren CXCR2 – /- mallit [7], [8]. Kuitenkin CXCL8 voi sitoutua CXCR1 ja CXCL1 /CXCL8 voivat myös sitoutua DARC, vaikka sitoutuminen DARC ei välitä signaalia. Tällä hetkellä tutkimukset DARC viittaavat siihen, että tekee ratkaisunsa ”keräilyyn” ylös kemokiinien ja siten vähentää niiden signalointikapasiteettia. Yli-ilmentyminen DARC johtaa lisääntyneeseen kasvaimen kasvua, mutta tämä johtui induktion suuri nekroottisen alueita kasvaimen [9], [10].

Kemokiinireseptorit säädelty tuumorisoluihin, jonka avulla kasvain hyödyntää kemokiinin rikas ympäristöissä, edistää kasvaimen kasvua ja verisuoniston. Lisäksi kemokiinien voi rekrytoida makrofageja, jotka huomaavat hapenpuuteympäristössä sisällä kasvain ja myöhemmin erittävät pro-angiogeenisten tekijöiden [11], [12]. Aluksi kemokiinit ajateltiin vain olla rooli houkutella erityisiä leukosyytit sivuston vahinkoa; silti se on nyt osoitettu, että ne ovat mukana neoplastisen muutoksen solun, angiogeneesin edistäminen, kasvaimen kloonilaajenemisen ja muutokset ECM, ja erityisesti välittäjänä elinspesifisiä etäpesäkkeitä syöpä [13]. Ligandi-reseptori paria sanelevat etäpesäkkeet malleja rinta- ja keuhkosyövän [14]. Rintasyövän etäpesäkkeitä keuhkoihin, CXCL1 oli osa geenin allekirjoitus, joka sisältyy myös VCAM1 ja MMP-1 [15]. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että kasvain peräisin CXCL8 toiminut houkuttimena kierrättämiseksi kasvainsolujen palata alkuperäiseen kasvain, joka johtaa entistä aggressiivinen kasvain fenotyyppiin [16].

Erilaisia ​​CXC-kemokiinien on havaittu neoplastisia kudosten tuotteina kasvainsolujen tai peruskudoselementeistä [12]. Esimerkiksi kasvaimeen infiltroituvat tulehdussolujen nostaa CXCL8 tasot bronchioalveolar soluissa, yhdessä sen kahden reseptorin [17]. Vahvaa näyttöä siitä, että CXC (ELR

+) kemokiinien on rooli syövän edistämisessä, sillä ne voivat edistää kasvua ja selviytymistä syöpäsolujen [18].

kasvu ja eteneminen syövän riippuu angiogeneesistä ja CXCL8 on osoitettu olevan rooli sen angiogeeninen ja tuumorigeeninen potentiaali. Vuonna munuaissyövän tasot CXCL1, CXCL3 ja CXCL8 olivat koholla verrattuna kontrolleihin ja reseptorinegatiivinen (CXCR2 – /-) hiirillä oli vastaava vähennys kasvaimen kasvua [19]. Tutkimukset käyttäen melanoomakasvaimen mallit tukevat rooli CXCL1, CXCL2, ja CXCL3 välittäjänä kasvaimen angiogeneesiä ja tasojen kaikkien kolmen kemokiinien ovat erittäin ilmaistaan ​​melanooma kasvaimissa. Transfektio CXCL1-3 osaksi kuolemattomiksi ei-tuumorigeeniset solut antoi niille kyky muodostaa kasvaimia [20], [21]. CXCL8 on yksi eniten tutkittu jäsenet CXC (ELR

+) perheen, erityisesti keuhkosyöpä. CXCL8 tunnistettiin geeniekspressiovektoria allekirjoituksen, joka oli predicative huonon ennusteen potilailla, joilla on vaiheen I keuhkosyöpään [22], kun taas tasojen CXCL8 ovat merkittävästi lisääntyneet sekä pahanlaatuisten Pleuraeffuusiot [23] ja NSCLC [24], jossa tasot nousevat kanssa vaiheessa [25] ja korreloi potilaan selviytymistä /uusiutumisen [26].

Kemokiinit tavataan kasvain mikroympäristön arvellaan vähintään viisi roolia kehityksessä kasvaimia ja etäpesäkkeitä; (A) ohjaus leukosyyttien infiltraatiota, (b) muuta kasvaimen immuunivasteen, (c) säädellä angiogeneesiä, (d) toimivat kasvua ja selviytymistä tekijät, ja (e) suoraan liikkeen itse kasvainsoluihin [27]. CXC (ELR

+) ligandit ja reseptorit ovat erityisen tärkeitä välittämisessä NSCLC kasvaimeen liittyvät angiogeneesiin [28] ja elinspesifisiin etäpesäkkeitä [13], [14]. CXCR2 ligandeja myös liitetty NSCLC syövän etenemiseen kautta Snail, korkeat jotka korreloi vähentynyt selviytymisen [29].

Aberrant epigeneettisellä geenin ilmentymisen säätelyyn on yleinen tapahtuma NSCLC [30], [31] . Kohdentamalla epigeneettiset sääntelymekanismeja NSCLC on aktiivinen alue tutkimukseen. Olemme pyrkineet tutkimaan ilmaus CXC (ELR

+) kemokiinien ja niiden reseptorien sarjassa ensisijaisen NSCLC kasvain näytteet ja lisäkilvillä NSCLC solulinjojen, ja suoraan tutkia epigenetiikka on rooli asetuksessa näiden geenien tässä sairaudessa. Tuloksemme osoittavat, että ilmentyminen näiden kemokiinien ja niiden reseptorien usein vapautettiin NSCLC, säännellään kautta suoraan ja suoraan epigeneettisellä mekanismien (histoni translaation jälkeiset modifikaatiot ja DNA CpG metylaatio, vastaavasti) ja ne voivat olla hyvä ehdokas tavoitteita epigeneettiset terapiassa hoidossa tämä syöpä.

Methods

Solulinjat

A549 (adenokarsinooma), SKMES-1 (levyepiteelikarsinooma), H460, H647 ja H1299 (iso karsinooma) ja BEAS-2B (transformoitu normaali bronchoepithelial) solulinjat hankittiin ATCC: ltä (LGC Promochem, Teddington, UK). HBEC solulinjat [32] olivat lahja professori John D Minna (Hamon Centre for Therapeutic Oncology Research, UTSoutwestern, Dallas, TX, USA). Kaikki soluviljelmässä reagenssit hankittiin Lonza (Walkersville, MD, USA). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 seuraavissa tiedotusvälineissä; A549 – F-12 (Ham), jota oli täydennetty 10% (v /v) FBS: ää, penisilliiniä streptomysiiniä (500 U /ml) ja 2 mM L-glutamiinia. BEAS-2B myös ylläpidettiin F-12 (Ham) väliaine lisäämättä FBS. SKMES-1 – EMEM lisäämällä 10% (v /v) FBS: ää, penisilliiniä streptomysiiniä (500 U /ml), 2 mM L-glutamiinia ja 0,1 M ei-välttämättömiä aminohappoja. Kaikki suuret karsinooma linjoja ylläpidettiin RPMI 10% FBS ja penisilliini streptomysiiniä (500 U /ml). HBEC linjat ylläpidettiin Keratinosyyttien seerumittomassa alustassa (SFM), L-glutamiinia (GIBCO Invitrogen, Paisley, Skotlanti) ja täydennetty 2,5 ug ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (rEGF), ja 25 ug naudan aivolisäkeuutteella (GIBCO Invitrogen) .

Ensisijainen kasvainnäytteestä

sarja 37 kasvaimen yksilöt (14 adenokarsinooma ja 23 okasolusyöpä) otettiin potilailla, joilla on varhaisessa vaiheessa NSCLC St. James Hospital, Dublin. Hyväksytty normaalia kudosta otettiin rinnakkain kullekin potilaalle ja näytteet arvioitiin patologi heti leikkely.

reagenssit

Trichostatin A (TSA) hankittiin Calbiochem (San Diego, CA, USA ) ja liuotettiin DMSO: hon pitoisuuteen 250 mg /ml. Soluviljelmiä käsiteltiin ajaksi 16 tuntia siten, että lopullinen konsentraatio on 250 ng /ml.

Fenyylibutyraatin (PB) (tributyylisitraatti ™) oli lahja Triple Crown-Amerikassa, Perkasie, PA, USA. Soluviljelmiä käsiteltiin lopulliseen pitoisuuteen 10 mM 16 h.

5-atsa-2′-Deoksisytidiini (DAC) ostettiin Merck (Darmstadt, Saksa) ja liuotettiin metanoliin. Soluviljelmiä käsiteltiin DAC (lopullinen pitoisuus – 1 uM) 48 tunnin ajan DAC ja median vaihdettava 24 tunnin välein.

Rekombinantti ihmisen CXCL8 ostettiin PromoKine (Promocell GmbH, Heidelberg, Saksa) ja liuotetaan steriiliin tislattua vettä.

SB 225002 hankittiin Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) ja liuotettiin DMSO: hon pitoisuuteen 2,2 uM. Solulinjoja käsiteltiin yhden tunnin ajan ennen lisäämistä CXCL8, jonka pitoisuus on 0,022 uM.

Yhteensä RNA: n eristys ja RT-PCR-monistuksen

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRI reagent® ( Molecular Research Center, Montgomery Road, OH, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ennen ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi, 10 ug kokonais-RNA: ta esikäsitellään pilkkomalla RQ1 DNaasia (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA luotiin käyttäen Superscript III (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) ja Oligo dT (20) alukkeilla (Eurofinsille MWG Operon, Ebersberg, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

solulinjat tutkittiin ilmaus

CXCL1-3

,

CXCL8

,

CXCR1 /2

ja

Beta-aktiini

RT-PCR: llä, käyttäen alukkeita ja hehkutuslämpötiloja esitetään taulukossa 1. PCR-syklien olosuhteet koostuivat -95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 35 sykliä 1 min 94 ° C: ssa, 1 min kohdegeenin hehkutus lämpötilassa ja 1 min 72 ° C: ssa lopulliseen 72 ° C: ° C: ssa 10 minuuttia.

Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja tuotteiden elektroforeesi 1% agaroosigeelillä. Tuotteen kvantitointi suoritettiin käyttäen TINA 2.09c (Raytest, Isotopenmeßgeräte GmbH, Straubenhardt, Saksa) tiheysmittaria ohjelmisto. MRNA ilmaisu normalisoitiin

Beta-aktiini

valvontaa, ja ilmaistiin suhteena kohde-mRNA ilmaisun:

Beta-aktiinin

ilme.

Kromatiini immunosaostuksella (X- ChIP) B

Kromatiini immunosaostus suoritettiin seuraavasti: kun hoidot, solut kiinnitettiin formaldehydillä (lopullinen pitoisuus 1%), suspendoitiin SDS-hajotuspuskuriin (Millipore, Billerica, MA, USA) ja sonikoitiin, kunnes DNA oli hajanaista pituuksiin välillä 200-1000 bp. Alikvootit tätä leikattua DNA sittemmin immunosaostettiin käyttäen OneDay ChIP Kit ™ (Diagenode, Liege, Belgia) mukaan valmistajan ohjeiden. Käytetyt vasta-aineet immunosaostukseen olivat seuraavat: pan asetyyli-histoni H3 (Millipore Cat # 06-599), pan asetyyli histoni H4 (Millipore Cat # 06-598), asetyyli-histoni H3 (K9 /14ac) (Diagenode Cat # pAb -ACHBHS-044), asetyyli-histoni H3 (K9ac) (Diagenode Cat # pAb-ACHAHS-044), asetyyli fosfori – histoni H3 (K9pS10) (Sigma Cat # H0788), di metyyli-histoni H3 (K9Me2) (Sigma Cat # D5567), di metyyli histoni H3 (K4Me2) (Sigma Cat # D5692) ja metyyli-histoni H3 (K4Me) (Sigma Cat # M4819). A ei-vasta-kontrolli on testata epäspesifistä sitoutumista varten.

käytetyt alukkeet tutkia promoottorialueiden

CXCL8

ja

CXCR1 /2

Chip suunniteltiin päässä tunnettu 5 ’UTR sisällä niiden nukleotidisekvenssejä. RT-PCR-syklien olosuhteet olivat samat kuin edellä on esitetty. Alukkeita ja hehkutuslämpötiloja siru on esitetty taulukossa 2.

ELISA

pitoisuus CXCL8 mitattiin elatusaineessa käyttäen DuoSet® ELISA Development Systems (R substraatti käytetty liuos tehtiin fosfaatti sitraattipuskurilla (joka sisältää sitruunahappoa ja Dinatriumvetyortofosfaatti dodekahydraatti, pH 5,0), 10 mg 1, 2-fenyleenidiamiinidihydrokloridi (OPD) ja 18 ui 1 MH

2O

2 .

CXCL2 kvantitoitiin käyttämällä ELISA Development kit ostettiin Strathmann Biotec (Hampuri, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Cellular proliferaatiomäärityksillä

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä Cell Proliferation ELISA, BrdU (Roche Diagnostics Oy, Sussex, UK). Lyhyesti, solut ympättiin 5 x 10

3 /kuoppa 96-kuoppalevylle ja noudatetaan yhdessä yössä. Sen jälkeen täydellinen väliaine poistettiin ja solut pestiin 100 ul: lla PBS: ää. Seerumin tyhjennetty kasvualusta (0,5% FBS), lisättiin keuhkosyövän soluja vain, koska se jäljittelee paremmin fysiologisissa olosuhteissa. Yön yli inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin 24, 48 tai 72 h ihmisen rekombinantti CXCL8 eri pitoisuuksina (0,1-100 ng /ml). Inhibitiotutkimuksissa tehtiin esikäsittelemällä soluja 0,022 uM SB225002 1 h ennen lisäämistä CXCL8. Absorbanssi mitattiin levylukijalla 450 nm: ssä viittauksella aallonpituus asetetaan 690 nm ja tyhjä ja käsittelemättömän kaivoja käytettiin normalisointia varten. Käsittelemättömistä soluista oli asetettu 100%, ja CXCL8 hoidot arvioidaan suhteessa tähän.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (standard keskivirhe). Tilastollinen analyysi suoritettiin InStat (Graphpad ohjelmisto, La Jolla, CA, USA) käyttämällä pariksi yksi pyrstö Opiskelijan

t

-testi. Eroja pidettiin merkittävinä, kun p 0,05.

Tulokset

ilmentäminen

CXCL1-3

,

CXCL8

ja

CXCR1 /2

perus keuhkosyöpä kasvain näytteet

arvioimiseksi ilmaus useiden CXC (ELR

+) perheenjäsenten paneelin normaali /kasvaimen sovitettu potilaan näytteitä vaiheen I ja II potilaat, RT- PCR suoritettiin (kuvio 1A), ja yhteenvetona kuviossa 1B. Densitometrinen analyysi RT-PCR osoitti merkittävää laskua ilmaus

CXCL1

,

CXCL2

(p 0,01) ja

CXCR1

reseptorin (p 0,05) NSCLC tuumorinäytteissä verrattuna normaaliin (kuvio 1 C).

A) tasot

CXCL1

–

3

,

CXCL8

ja

CXCR1 /2

tutkittiin RT-PCR: llä paneelin NSCLC linjat (adenokarsinooma (n = 14), okasolusyöpä (n = 23)) potilaan näytteestä. Edustavat kuvat ylös ja alas säädellään näytteitä näkyvät.

Beta aktiini

tasoja käytettiin normalisointia varten. B) Yhteenveto muutoksista esiintyvien eri CXC (ELR

+) kemokiinien ja niiden reseptorien paneelin kasvain /normaali sovitettu potilaan NSCLC näytteitä. C) Kaiken densitometria analyysit kasvain /normaali sovitettu potilaan NSCLC näytteitä. Data piirretään keskiarvona ± keskivirhettä (n = 37). (N – normaali, T – Kasvain).

ilmentäminen

CXCL1-3

,

CXCL8

ja

CXCR1 /2

on paneeli normaalin ja keuhkosyövän solulinjat

Käyttäen RT-PCR, kemokiinien tutkittiin paneeli normaalin ja NSCLC solulinjoissa (kuvio 2). Kaikki testatut solulinjat ilmaistuna eritasoisia

CXCL1-3

ja

CXCL8

, korkeammat perusekspression havaittu NSCLC linjat. Kuitenkin vahva ilmentyminen sekä reseptorien (

CXCR1 /2

) havaittiin normaalissa solulinjoissa (HBEC3-5).

Paneeli sisältyvät A549 (adenokarsinooma), SKMES-1 (levy- karsinooma), H460, H647 ja H1299 (suuri karsinooma), BEAS-2B: stä (SV40 transformoitu normaali bronchoepithelial) ja HBEC solulinjoja (normaali keuhkoputken epiteelisolujen linjojen kuolemattomaksi puuttuessa virus onkoproteiineja).

Beta aktiini

sisältyy vahvistaa lastaus tehokkuutta. (M – DNA Kokomarkkerina, ve – Negative RT-PCR-kontrolli).

histoni asetylointi osallistuu säätelyyn

CXCL8

ja

CXCR1 /2

ilme

Käyttämällä histonideasetylaasi estäjä (HDACi), Trichostatin A (TSA), induktio on

CXCL8

ja

CXCR1 /2

sekä normaali (HBEC4) ja keuhkosyövän solulinjoja (A549 ja SKMES-1), jossa on samanaikainen lasku

CXCL1-3

(SKMES-1, p 0,05) (kuvio 3A) havaittiin. Induktio

CXCL8

oli merkittävä HBEC4 ja SKMES-1 (p 0,05), kuten kasvu

CXCR1

ja

CXCR2

sekä keuhkojen syöpäsolu linjat (A549 – p 0,05, SKMES-1 – p 0,01) ja

CXCR1

vuonna HBEC4 (p 0,05) (kuvio 3B). Aloittamista uudelleen ilmentymistä näiden reseptorien NSCLC solulinjoissa osoittaisi, että nämä geenit epigeneettiseltä säädellään tasolla histoni asetylaatio. Hoito solulinjojen ylimääräinen histonideasetylaasi-inhibiittori, fenyylibutyraatti (PB), johti myös aktivoituminen

CXCR1 /2

(tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että tulokset ovat HDACi erityisiä. Kaksi kemokiinien valittiin, CXCL2 ja CXCL8, määrittämiseksi proteiinin ilmentymisen ELISA: lla. Kaava havaittu heijastuu että nähty mRNA tasolla SKMES-1, pienentynyttä CXCL2 ja kasvu CXCL8 TSA hoitoon (p 0,05) (kuvio 3C). Kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta proteiinin tasot joko A549- tai HBEC4 välillä pohjapinta ja TSA käsiteltyjä soluja (tuloksia ei esitetä).

) vaikutus TSA hoidon (250 ng /ml 16 tuntia) on ilmaus

CXCL1

–

3

,

CXCL8

ja

CXCR1 /2

. B) Densitometria analyysi ilmaisun käsitellyissä versus käsittelemättömien näytteiden kun normalisoitu

beta aktiini

. Data piirretään keskiarvona ± keskivirhettä (n = 3). C) Käsittely TSA vaikuttaa myös tuotannon CXCL2 ja CXCL8 klo proteiinin tasolla SKMES-1-soluissa. Kemokiinit määrällisesti elatusainetta poistetaan kulttuurin altistumisen jälkeen TSA (250 ng /ml 16 tuntia). Data piirretään keskiarvona ± keskivirhettä (n = 3). (UT – käsittelemätön, TSA – Trichostatin A).

asetukseen

CXCL8

ja

CXCR1 /2

tapahtuu suoraan chromatin remodeling

sen varmistamiseksi, että havaitut vaikutukset HDACi johtuivat kasvoi histonien hyperasetylaation klo edistäjiä

CXCL8

ja

CXCR1 /2

geenit, suoritimme kromatiinin immunosaostuksella (chip) analyysi yksittäisten promoottorit A549-soluja käsiteltiin TSA. Kuten voidaan nähdä kuviosta 4, käsittely TSA johtaa lisääntymiseen PCR-tuotteen määrä on

CXCL8

ja

CXCR1 /2

, mikä osoittaa suurentunutta histonien hyperasetylaation noin promoottorit näiden geenien. Osoitamme, että lysiiniä 9 ja lysiiniä 14 hyperacetylated tällä alueella hoidon jälkeen TSA. Tämä koe osoittaa selvästi, että kromatiinin remodeling on suoraan mukana aktivointi

CXCL8

(kuvio 4A),

CXCR1

(kuvio 4B) ja

CXCR2

(kuvio 4C) -geenin ilmaisu. Lisäksi olemme myös havaittu kasvua histoni H3 lysiinin 4 tri-metylaatio (H3K4me3) on

CXCR1

promoottori (tuloksia ei ole esitetty) ja fosforylaatio seriinillä 10 (H3K9pS10) on

CXCL8

promoottori. Nostamalla H3K4 diemethylation (H3K4Me2) havaittiin vähenevät samanaikaisesti H3K9 dimetyloimalla (H3K9Me2) klo promoottorialueen. Nämä muutokset on yhdistetty transkriptiotekijöiden ja varhaisen reagoinnin geenejä, tässä järjestyksessä, ja lisätä voimaa näyttöä siitä, että nämä geenit dynaamisesti säätelee histoni pos-muutokset translaation.

siru määritys osoittaa, että TSA hoito johtaa kasvuun asetylointi histoni H3 ja H4. A549-soluja viljeltiin, kun läsnä tai poissa TSA (250 ng /ml) ajan 16 h. Sen jälkeen, siru määritys suoritettiin käyttäen seuraavia vasta-aineita; panoroida asetyloitu histoni H3 (Ac H3) ja H4 (Ac H4), histoni H3 asetyloitu lysiiniä 9 ja 14 (H3K9 /K14Ac), histoni H3 asetyloitu lysiinin 9 (H3K9Ac), histoni H3 asetyloitu lysiiniä 9 ja fosforyloidun seriinin 10 (H3K9pS10), histoni H3 dimetylation markkeri lysiinin 9 (H3K9Me2), dimetylation merkkilanka lysiini 4 (H3K4Me2) ja metylaatio merkkilanka lysiini 4 (H3K4Me). Kromatiinin tila promoottorialueen (A)

CXCL8

, (B)

CXCR1

ja (C)

CXCR2

on esitetty. Input DNA toimii positiivisena kontrollina valmistajan suosittelema (Diagenode). A ei-vasta-kontrolli on testata epäspesifistä kuljetukseen DNA histonien. (M – DNA koko tikapuut).

Metylointi ei ole suoraan osallisena säätelyssä CXC (ELR

+) perhe

hoidon jälkeen solujen DNA metyylitransferaasi estäjä (DAC), vaikutukset CXC (ELR +) perheen ekspressio tutkittiin käyttäen RT-PCR: llä (kuvio 5). Merkittävä väheneminen

CXCL3

(p 0,01) havaittiin HBEC4 solulinjassa eikä missään NSCLC solulinjoissa (kuvio 5B).

CXCL8

ilmentyminen indusoituu merkittävästi kaksi kolmesta solulinjojen (HBEC4 /SKMES-1 – p 0,05, kuvio 5B). Kahden reseptorin

CXCR1

ja

CXCR2

merkittävästi indusoi DAC HBEC4 (p 0,01) (kuvio 5A, B). DAC osoittanut kykyä aktivoida

CXCR1

mutta ei

CXCR2

ilmentymistä SKMES-1 (p 0,01) (kuvio 5A, B). DAC voisi aiheuttaa

CXCR2

mutta ei

CXCR1

A549 (p 0,05) (kuvio 5A, B). Vaikka tämä data viittaisi siihen, että DNA CpG metylaatio on mukana säätelyyn ilmentymisen CXC-reseptoreihin ja CXCL8, etsimään UCSC genomin kirjastosta (https://genome.ucsc.edu/) paljasti harva useita CpG jäämät promoottorialueet näiden kolmen geenin. Siksi uskomme muutos ekspressiotasot tämän perheen ehkä koska toissijainen aiheuttamaa DAC käsittely, kuten ylös-säätely erityisiä transkriptiotekijöiden.

A) vaikutus 5-atsa 2’deoxycytidine (DAC) käsittely ilmaisun

CXCL1

–

3

,

CXCL8

ja

CXCR1 /2

. Soluja viljeltiin 1 uM DAC 48 tuntia median ja huumeiden vaihdettava 24 tunnin välein. Expression muutokset mitattiin käyttäen RT-PCR Beta-Actin käytetään sisäisenä kontrollina kvantifiointiin varten. B) Densitometria analyysi ilmaisun käsitellyissä versus käsittelemättömien näytteiden kun normalisoitu

beta aktiini

. Data piirretään keskiarvona ± keskivirhettä. (N = 3). (DAC – 5-atsa-2’deoxycitidine).

Cellular leviämisen SKMES-1 on vähentynyt rekombinanttisen CXCL8, kun taas lisääntynyt A549

Kun käsiteltiin erilaisilla pitoisuudet rekombinantti CXCL8 (0,1-100 ng /ml) ajan 24-72 h, oli suuntaus lasku proliferaatio HBEC solulinjassa verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (tuloksia ei ole esitetty). CXCL8 hoito (100 ng /ml ja 10 ng /ml) aiheutti kasvu leviämisen estämistä A549 solulinjassa (p 0,01-100 ng /ml, p 0,05-10 ng /ml) 72 h käsittelyn jälkeen vain (kuva 6A). Oli kuitenkin merkittävä lasku lisääntymistä 24 tunnin käsittelyn jälkeen in SKMES-1 (kuvio 6B) yhdelläkään testatulla pitoisuudella (p 0,01, 100 ng /ml ja 10 ng /ml; p 0,05 1 ng /ml ja 10 ng /ml), mutta ei muulloin kohta (tuloksia ei ole esitetty). Sen määrittämiseksi, proliferatiivinen vaikutus molempiin näistä solulinjoista johtui spesifisesti CXCL8 hoitoa, joka on CXCR2 neutraloivaa lähestymistapaa tehtiin. Solulinjoja käsiteltiin SB 225002 on aikaisemmin julkaistu IC

50-arvo 22 nM [33] yhden tunnin ajan ennen kuin lisättiin CXCL8 100 ng /ml 72 tuntia (A549) ja 24 h (SKMES-1 ) (kuvio 6C). Saarto CXCR2 reseptorin romutettu proliferatiivisen vaikutuksen sekä A549- ja SKMES-1 solulinjoissa verrattuna CXCL8 hoito yksinään.

A) Solulisääntyminen tutkittiin BrdU määrityksen seuraavien 24-72 tunnin hoidon CXCL8 A549 ( 72 h jälkikäsittely) ja SKMES-1 (24 h hoidon jälkeen) solulinjat. Vain aika pistettä merkittävää tietoa näytetään. Data esitetään prosentteina käsittelemättömään kontrolliin (UT), joka oli asetettu 100% ja on ilmaistu keskiarvo ± SEM. (N = 3) (ε p 0,01 – CXCL8 hoito

vs.

UT, ψ p 0,05 – CXCL8 hoito

vs.

UT) B) Solulinjat käsiteltiin selektiivinen CXCR2 antagonisti (0.022μM) 1 h ennen kuin lisättiin CXCL8 ja viljeltiin ajan 24 (SKMES-1) tai 72 h (A549). Data esitetään prosentteina käsittelemättömään kontrolliin (UT), joka oli asetettu 100% ja on ilmaistu keskiarvo ± SEM. (N = 3).

Keskustelu

CXC (ELR

+) kemokiiniperhe, voimakas angiogeneesiä perhe, todettiin säänneltävä epigeneettiseltä molemmissa NSCLC ja normaali keuhkoputken epiteelisolujen linjojen tasolla sekä histoni translaation jälkeisiä modifikaatioita.

paneelin normaali /kasvaimen Hyväksytty näytteitä, kemokiinien ja reseptorien ei osoittanut muuttuneen ekspressiokuviota välillä adenokarsinooma ja okasolusyöpä näytteitä, lukuun ottamatta

CXCL3

(keskiarvo koholla okasolusyöpä ja vähennetään adenokarsinooma). Korkeammalla CXCL8 on havainnut IHC keuhkosyövässä kudosnäytteistä verrattuna normaaliin [34], ja meidän näytteitä tasoilla

CXCL8

mRNA kohosivat 37,8% (14/37) näytteistä. Vaikka keskimääräinen densitometria arvot (adenokarsinooma n = 14 ja okasolusyöpä n = 23) osoittavat vähentäminen kemokiinien kasvaimen näytteissä (kuvio 1 C), tämä ei ole totta jokaisen yksittäisen näytteen (kuva 1 A). Johtuen heterogeenisuus näytteiden, on vaikea tehdä lopullinen päätelmä perustuu näihin tuloksiin. On kuitenkin huomattava, että ilmaisu monien kemokiinien olivat useimmin havaittu vaimentua siinä NSCLC kasvainten seuraavasti

CXCL1

(64,9%, p 0,01),

CXCL2

( 81,1%, p 0,01),

CXCL3

(59,5%) (kuvio 1 B). Lisäksi tasot

CXCR1

todettiin myös vähentää huomattavasti NSCLC kasvaimissa (35,2%, p 0,05).

paneelia NSCLC solulinjojen käsitelty HDACi oli vähennys

CXCL1-3

kanssa samanaikainen kasvu

CXCL8

ja reseptorit

CXCR1

ja

2

(kuvio 3B). TSA on aiemmin osoitettu säätää ylös CXCL8 keuhkoissa [35] ja rintasyövän solulinjat [36]. Uudelleenaktivointiaika Näiden reseptorien keuhkosyövän solulinjat viittaisi siihen, että he ovat alle epigeneettiset sääntelyn tasolla histonimodifikaation. Yleinen dogma liittyvä HDACi on, että ne toimivat aiheuttavan geenin ilmentymisen. Kuitenkin tässä tutkimuksessa, TSA aiheutti on sekä ylä- ja alaspäin sääntely kemokiinien, vaikutus muiden nähtävillä muissa tutkimuksissa. Esimerkiksi, HDACi on osoitettu alas-säädellä Wilmsin kasvain geeni 1 (WT1) [37] ja EGFR [38]. Rajallinen saatavuus erityisten transkriptiotekijöiden voi johtaa vain tietty määrä ylös geenien. Sinänsä aktivointi

CXCL8

voi johtaa alas asetuksen

CXCL1-3

, joko molekyyli- kytkimen tai titrauksen transkriptiotekijöiden päässä promoottorialueet näistä geeneistä. ChIP tulokset osoittavat, että TSA toimii suoraan remontin promoottorialueen

CXCL8

ja

CXCR1 /2

geenit (kuva 4). Meidän ChIP tulokset osoittavat, että histonien H3 ja H4 tulla hyperacetylated näillä geenin promoottorit, joihin lysiiniä 9 ja 14 histoni H3, ja lysiiniä 5, 8, 12 ja 16 histoni H4. Huomaamme vahva tasojen nousu histoni H3 lysiinin 4 dimetyloimalla (H3K4me2) seuraava aktivointi transkription kautta HDACi, ja myös tarkkailla menetys histonin lysiiniä 4 monomethylation (H3K4me), seuraava aktivointi CXCL8 /CXCR1 /CXCR2. Suostumuksella nykyisen kirjallisuuden, vietämme läsnäollessa tukahduttavan merkin H3K9Me2 klo SMM promoottori ennen aktivointia kautta HDACi, ja tasoa tämän histonimodifikaation lasku aktivaation jälkeen [39], [40]. Nämä tulokset osoittavat, että HDACi aiheuttaa aiheuttaa chromatin remontin kautta histoni translaation jälkeiset modifikaatiot ympärillä promoottorialueen geenien tutkituista osoittaa, että se on aktiivinen osa säätelyssä näiden kemokiinien ja niiden reseptorien.

DNA CpG metylaatio on myös pääkomponenttina epigeneettisellä geenin ilmentymisen säätelyyn. Hypermetyloitunut DNA on usein löydettävissä promoottorialueiden tuumorisuppressorigeeneille syövät, etenkin keuhkosyöpä [30]. Hoidot kanssa DNMTi DAC uudelleen ilmaus

CXCR1

että A549 (kuvio 5B) solulinjaa ja

CXCR2

in SKMES-1 (kuvio 5B).