Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Huolimatta alkuperäisen myönteisen vastauksen hormoniablaatioterapia, eturauhasen syöpiä poikkeuksetta toistuu aggressiivisempia, hoidon vastustuskykyisiä muotoja. Puute käsityksemme taustalla geneettisiä muutoksia siirryttäessä androgeeniriippuvaisen (AD) ja ADI eturauhassyövän kasvua haittaavat kykymme kehittää tavoitteelliseen terapeuttisia strategioita tehokkaaseen hoitoon ADI eturauhassyövän.

Menetelmät /Principal Ensimmäisen

seulomalla aktivoitujen ihmisen kinaasien, olemme tunnistaneet

TPL2

, joka koodaa seriini /treoniini-kinaasi, ajaminen ADI eturauhassyövän kasvua. TPL2 aktivoituminen yli-ilmentävät joko villityypin tai konstitutiivisesti aktivoitua muotoa TPL2 aiheuttama ADI kasvua, kun taas tukahduttaminen

TPL2

ilmaisun ja sen kinaasiaktiivisuuden ADI eturauhassyövän solut estivät solujen lisääntymistä alle androgeenin köyhdytettyä olosuhteissa . Tärkeintä on,

TPL2

ylössäädellään ADI eturauhasen syöpiä sekä

PTEN

poisto hiirimallissa ja kliinisen eturauhassyövän yksilöitä.

Johtopäätökset /merkitys

Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että

TPL2

kinaasi on keskeisessä asemassa edistettäessä ADI eturauhassyövän etenemistä. Lisäksi tukahduttaminen TPL2 vähenee ADI eturauhassyövän kasvua ja tiheä TPL2 yli-ilmentymisen ihmisen ADI eturauhassyöpänäytteissä vahvistaa TPL2 tavoitteeksi hoitoon tätä tappavaa tautia.

Citation: Jeong JH, Bhatia , Toth Z, Oh S, Inn KS, Liao CP, et al. (2011)

TPL2 /COT /MAP3K8 (TPL2) B Aktivointi Edistää androgeenisesti väheneminen-Independent (ADI) Eturauhassyöpä Kasvu. PLoS ONE 6 (1): e16205. doi: 10,1371 /journal.pone.0016205

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Ranska

vastaanotettu: 07 syyskuu 2010; Hyväksytty: 08 joulukuu 2010; Julkaistu: 18 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Jeong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat ja tukevat DoD 060868 ja ACS apurahan IRG-58-007-48 jotta JHJ, NIH myöntää CA 109147 ja R01 CA 136924 on GAC, NIH myöntää CA 59705 ja CA 113392 on PRB, ja CA082057, CA31363, CA115284, AI083025, DE019085, CA148616, Hastings Foundation, ja Fletcher Jones säätiön JUJ. (https://cdmrp.army.mil/, https://www.cancer.org/, https://www.nih.gov/, https://www.fletcherjonesfdn.org/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä esiintyy 1 6 American men, jossa on yli 2 miljoonaa asun tauti. Leikkaus on tehokas, lähes 100%: lla potilaista jäljellä syöpä-ilmaiseksi useita vuosia, jos tauti havaitaan varhaisessa vaiheessa, ja syöpäsolut rajoittuvat eturauhanen [1]. Kuitenkin, kun syöpä leviää yli eturauhanen, lopputulos on lähes aina kohtalokas. Koska syöpäsolujen vaativat testosteronin polttoaineen niiden kasvua ja selviytymistä, androgeenipuutteen hoito on suunniteltu pysäyttämään syövän kasvua joko pysäyttämällä testosteronin tuotantoa tai estää hormoni toimimasta syöpäsolujen [2]. Huolimatta alkuperäisen myönteinen vastaus hormonihoito, eturauhassyövän solut poikkeuksetta toistuu aggressiivinen, androgen ehtymisestä riippumaton (ADI) muodossa. Vaikka geneettisiä muutoksia, jotka liittyvät taudin alkamisen ja etenemisen eturauhasen syöpä on tutkittu intensiivisesti [3], [4], [5], [6], [7], taustalla olevien siirtymistä androgeeniriippuvaisen (AD) ADI eturauhasen syövän kasvun suhteellisesti vähemmän hyvin ymmärretty. Tämä ymmärryksen puute vaikeuttaa kykymme kehittää tavoitteelliseen terapeuttisia strategioita tehokkaaseen hoitoon ADI eturauhassyövän.

läsnäollessa androgeenin, androgeenireseptorin (AR) läpikäy fosforylaatio, dimerointi, ja kulkeutuessa ydin, jossa se sitoutuu androgeeni- vaste-elementit (ARE) sivustoilta, jolloin transkription aktivaation kohdegeenien [8]. Kuitenkin pakottavia tiedot, mukaan lukien RNAi Knockdown ja käyttöönotto antagonistien androgeenireseptorin (AR), osoittavat, että AR on edelleen tarpeen ADI eturauhassyövän kasvua [9], [10], [11]. Siksi alle androgen-köyhdytettyä olosuhteissa, ADI eturauhassyövän solut näyttävät kehittää solunsisäisiä strategioita, jotka aktivoivat AR signalointireitille. Monet mekanismit on ehdotettu: lisääntynyt

AR

ilmaisun

AR

geenimonistuksen, lisääntynyt

AR

herkkyys tehostamalla AR vakautta ja ydinvoiman lokalisointi, laajentanut AR ligandispesifisyys läpi mutaatioiden sen ligandisitoutumisdomeenista, ja lisääntynyt AR aktiivisuuden kautta translaation jälkeisiä modifikaatioita [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Toisaalta, aktivointi muut signaalitransduktion reittien, kuten BCL-2 aktivointi, voi myös ohittaa riittävällä AR aktivointi proliferaatiota ja eloonjäämistä eturauhassyöpäsolujen [19]. Lopuksi ennestään alapopulaatio ADI eturauhassyöpäsolujen kantaisä /kantasoluja piirteet saattavat tulla hallitseva alle androgen-köyhdytettyä olosuhteissa [20].

Useat tutkimukset osoittavat, että aktivointi RAS /RAF /MEK /ERK-reitin saattaa korreloida ADI eturauhassyövän kasvua [5], [13], [21], [22]. Äskettäin geenitekniikalla hiiri (GEM) malli, jossa ilmaus voimakas aktivaattori RAS-MAPK signalointi, B-RAF

E600, on suunnattu eturauhasen epiteelin käyttämällä tet-indusoituva järjestelmä, joka on kehitetty invasiivisen adenokarsinooma , ja tämä edelleen edennyt veltto ADI vaurioiden jälkeen kastraation [23]. Kuitenkin vasta-intuitiivisesti, aktivoivat mutaatiot RAS /RAF /MEK /ERK-reitin ovat harvinaisia ​​ihmisen eturauhasen syövissä, vaikka autokriinisen ja paracrine kasvutekijä silmukat näkyvät aktivoida reitin [24], [25]. Tärkeää on, tuore tutkimus ehdotti, että kromosomaalisia uudelleenjärjestelyjä RAF kinaasireitin on ylimääräinen lähteitä MEK /ERK aktivaatiota, edistää eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen [26].

Jotta tunnistaa uusia kinaasi geenejä liittyvä ADI eturauhassyövän kasvua, me seulotaan kirjasto aktivoitujen ihmisen kinaasien. Tässä raportoimme tunnistamisen seriini /treoniini-kinaasi,

TPL2

, ajaminen ADI eturauhassyövän kasvua aktivointi MEK /ERK-signalointireitin aktivaatio ja NF-KB: n. Tämä antaa vihjeen löytää uusia lähteitä MEK /ERK-reitin aktivaatio ADI eturauhasen syöpiä. Lisäksi tukahduttaminen TPL2 vähenee ADI eturauhassyövän kasvua ja tiheä TPL2 yli-ilmentymisen ihmisen ADI eturauhassyöpänäytteissä validoi TPL2 tavoitteeksi hoitoon tätä tappavaa tautia.

Tulokset

tunnistaminen TPL2, seulomalla kirjasto aktivoitujen ihmisen kinaasien

tunnistaa uusia kinaasin liittyvistä geeneistä ADI eturauhassyövän kasvua, me seulotaan kirjasto 354 aktivoitujen ihmisen kinaasien koostuu 98 kinaasin liittyvien avointa lukukehystä ( ORF: t) ja 256 ihmisen kinaasit kloonattiin Gateway-yhteensopivat retrovirus- kohde vektori, pWN-MF-DEST, jossa myristylaatiodomeenin sekvenssin ja FLAG-epitooppimerkin (MF) lisättiin N-päiden kunkin käyttöön ORF [27] . Koska lukema varten ruudulla, käytimme reportterikonstruktio sisältävä

cis

sääntelyvälineitä promoottorialueen (5,8 ke sisältävän

AR

tehostajana) eturauhasen antigeenin (

PSA

) geeni, joka ilmentyy voimakkaasti normaalissa eturauhasessa epiteelin ja eturauhasen kasvaimissa [28], [29]. Promoottori /tehostaja aktiivisuus voidaan mitata fuusioituneen

Luciferase

reportterigeenin (kuvio 1A). Jotta voitaisiin tunnistaa mahdolliset kinaasi geenien pystyy aiheuttamaan transkriptionaalista aktiivisuutta

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alueella alle androgeenista köyhdytettyä olosuhteissa, jokainen kinaasi konstruktia, yhdessä reportteriplasmidia oli kotransfektoidaan yksittäisiin kuoppiin 12-kuoppaisella levyllä, joka sisälsi androgeeniriippuvaisissa LNCaP (AD-LNCaP-soluja) kasvatettiin väliaineessa, jota on täydennetty R1881, synteettisen androgeenin (kuvio 1A). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, AD-LNCaP-soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% hiilellä erotettua nautasikiön seerumia (CS-FBS) ilman R1881. 24 tunnin kuluttua inkubaation transkriptionaalista aktiivisuutta

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alueella alle androgeenin köyhdytettyä olosuhteissa mitattiin Lusiferaasimäärityksiä. Ulos 354 aktivoitujen ihmisen kinaasi geenien ilmentymistä

TPL2

geenin AD-LNCaP-soluissa indusoi korkein PSA transkriptionaalisen aktiivisuuden puuttuessa R1881 (kuvio 1 B ylempi). Kuten valvontaa, muiden onkogeenien, kuten

RAF

ja

RAS

jotka on aiemmin tiedetään liittyvän kanssa ADI eturauhassyövän kasvua, sisällytettiin [5], [22], [23] , [26], [30]. Niiden ilme todellakin indusoi transkriptionaalisen aktiivisuuden

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alueella alle androgeenista köyhdytettyä olosuhteissa joillekin, mutta vähemmässä määrin kuin

TPL2

. Kuitenkin, kun testattiin androgeenireseptorin (AR) -negatiivinen DU-145 eturauhasen syöpäsolujen,

TPL2

ei indusoinut ADI transkriptionaalista aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että AR ilmentyminen on tarpeen ADI transkription aktivointi

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alueella aiheuttama

TPL2

(kuvio 1 B keski; huomaa muutoksen laajuus Y-akseli). Toisaalta, androgeenista ehtyminen riippumaton C4-2B (ADI-C4-2B) solut osoittivat korkeita endogeenisten tasojen transkriptionaalista aktiivisuutta

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alue puuttuessa R1881 (kuvio 1 B alhaalla). Nämä tiedot esiin mahdollisuuden, että ennestään geneettiset ja epigeneettiset muutokset ADI-C4-2B solut osaltaan nostaa endogeenisen tason ADI transkriptionaalisen aktiivisuuden vetämänä

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alue. On huomattava, induktio transkriptionaalista aktiivisuutta

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alueeseen

TPL2

yliekspressio AD-LNCaP-soluissa oli selvempää (suurempi kuin 20-kertainen) alhaisella tasolla (0.1~0.001 nM) R1881, joka on verrattavissa fysiologisiin androgeenivaikutuksen potilailla, joille on tehty kastraatio leikkaus (kuvio 1 C). Lisäksi ADI transkription aktivaatio kumoutui kanssa TPL2 estäjän kohtelun joko TPL2 yli-ilmentymisen AD-LNCaP tai yksinkertaisesti endogeenisen TPL2 ilmaisua ADI-C4-2B soluissa (kuvio 1 D). Testata mahdollisuutta, että korkea endogeeninen taso ADI transkriptionaalisen aktiivisuuden

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alueen ADI-C4-2B solut voivat olla lisääntyneen TPL2 ilmaisua, vertasimme ilmentymistason

TPL2

AD-LNCaP ja ADI-C4-2B soluissa. Todellakin, ADI-C4-2B solut osoittivat korkeampaa

TPL2

ilmaisua kuin AD-LNCaP-soluja (kuvio S1A). Lisäksi C4-2B soluissa, PSA tehostaja /promoottorin aktiivisuus vastaa alhainen eksogeenisen TPL2 ilmaisun, mutta ei korkeita TPL2 ilmentymisen (kuvio S1B). On mahdollista, että korkea TPL2 eksogeenisen ilmaisun C4-2B soluja, jotka jo ilmaisevat korkeampaa endogeenisen TPL2 ilmaisun kuin LNCaP, aiheuttaa haitallisia vaikutuksia PSA tehostaja /promoottorin aktiivisuutta. Siksi olemme tunnistaneet

TPL2

ehdokkaaksi onkogeeni, joka voi liittyä ADI eturauhassyövän kasvua.

(A) Kaaviokuva tunnistamisen kandidaattigeenien joilla houkutella transkription aktivoituminen

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alue toimittaja rakentaa alle androgeenista köyhdytettyä olosuhteet androgeeniriippuvaisissa LNCaP. Myr, myristoylaatio- sekvenssi; ARE, androgeenireseptorin vastaus elementtejä; CS-FBS, hiilellä erotettua naudan sikiön seerumia. (B) Suhteellinen LUC aktiivisuus (

PSA

tehostaja /promoottori lusiferaasiaktiivisuuden normalisoidaan pGL3 beta-galaktosidaasi-aktiivisuus) mitattiin, kun oli inkuboitu 24 tunnin ajan 10% CS-FBS ilman R1881 (lukuun ottamatta toisen sarake 10% CS-FBS + 1 nM R1881 kontrollina), seuraavat kotransfektion ilmentävien plasmidien konstitutiivisesti aktivoidut muodot on merkitty kinaasi geenejä. Taitteen induktio arvot (suhteellinen LUC aktiivisuus jaettuna suhteellinen pohjapinta LUC aktiivisuus vektorisäätö) on merkitty kuvaajassa LNCaP. Suhteellinen LUC toiminta upon

TPL2

ilmaisu on merkitty punaisella. Tilastollisesti merkitsevä LUC toimintaan verrattuna vektorisäätö ilman R1881 hoitoa on merkitty * (p 0,05). (C) Suhteellinen LUC aktiivisuus konsentraation kasvaessa R1881 LNCaP-soluissa ohimenevästi kotransfektoitiin joko ilmentävien plasmidien Myristoylated

TPL2

tai tyhjällä vektorilla. Tilastollisesti merkitsevä LUC aktiivisuuden verrattuna kuhunkin vastaavaan R1881 pitoisuus vektorisäätö on merkitty * (p 0,05). (D) Suhteellinen LUC aktiivisuus konsentraation kasvaessa TPL2 inhibiittorin joko AD-LNCaP-soluihin väliaikaisesti transfektoitiin yhdessä plasmideilla, jotka ilmentävät Myristoylated

TPL2

tai transfektoimattomissa AI-C4-2B soluja. Suhteellinen LUC toiminta /ilman R1881 on merkitty mustalla kontrolleina. Tilastollisesti merkitsevä LUC toimintaan verrattuna vektorisäätö ilman R1881 hoitoa on merkitty * (p 0,05). Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa kukin kolmena rinnakkaisena, ja kukin sarake edustaa keskiarvo ± keskihajonta.

TPL2 aktivointi Indusoi ADI kasvu AD eturauhassyöpäsolujen

Voit tarkistaa onko

TPL2

liittyy toiminnallisesti ADI eturauhasen syöpäsolujen kasvua, tutkimme toiminnalliset seuraukset yliekspressio tai vaimennuksen

TPL2

AD tai ADI eturauhasen syöpäsolujen, vastaavasti. Ensinnäkin, onko

TPL2

yliekspressio riittävät edistämään ADI eturauhassyövän kasvua, loimme AD-LNCaP stabiileja solulinjoja yli-ilmentävät joko N-terminaalisesti myc-merkittyä villityypin [

myc-TPL2

(WT)], konstitutiivisesti aktivoitu muoto, jossa on deleetio 70 aminohappoa sen C-päässä [

myc-TPL2

(ACk)], tai kinaasi-inaktiivinen muoto

TPL2

[

myc-TPL2

(D270A)] käyttäen pBabe-puro-vektoriin (kuvio 2A). Jokaisen näistä transdusoitujen geenin vahvistettiin western blot (kuvio 2B). Mielenkiintoista on, että ilmaus

myc-TPL2

(ACk) konstitutiivisesti aktivoitua mutantti oli pienempi kuin

myc-TPL2

(WT) ja

myc-TPL2

D270A mutantti huolimatta jolla on korkein fosfori-ERK, alavirtaan signalointi molekyyli (kuvio 2B). Mahdollisuuden poistamiseksi ilmaisun tason vaikutuksia, loimme toinen joukko AD-LNCaP stabiileja solulinjoja, jotka yli-ilmentävät joko C-terminaalisesti lippu merkitty villin tyypin (

TPL2

WT-lippu), konstitutiivisesti aktivoitu muoto, jossa on deleetio 70 aminohappoa C-terminaalissa (

TPL2

-delC-lippu), tai kinaasi-inaktiivinen muoto

TPL2

(

TPL2

– toimeton-lippu) käyttäen pEF-IRES-Puro vektori (kuva S2). Tämä ehto osoitti myös alemman ilmaus

TPL2

-delC-lippu kuin

TPL2

WT-lippu ja

TPL2

-inactive-lippu (kuva S2), mikä viittaa siihen, että ilmentymistä konstitutiivisesti aktivoitua muotoa

TPL2

edellä fysiologiset tasot voi olla haitallisia vaikutuksia solun. Kuitenkin riippumatta

TPL2

ekspressiotasoja, yleinen LNCaP solut, jotka ilmentävät joko

myc-TPL2

(WT) tai myc-

TPL2

(ACk) osoitti kiihtyi solujakautumisessa androgeeni- riistää, -matala, ja rikas olosuhteet verrattuna LNCaP soluihin, jotka ilmentävät joko pelkkää vektoria tai myc-

TPL2

(D270A) mutantti (kuvio 2C). Erityisesti LNCaP solut, jotka ilmentävät myc-

TPL2

(ACk) osoitti tilastollisesti merkitsevää solujen lisääntymisen verrattuna ohjata soluja (LNCaP-GFP) androgeenisäädellyn köyhdytettyä kunnossa ja alhaisilla tasoilla R1881 (0,01 nM ja 0,1 nM) 3, 6, 9 päivää (* p-arvo 0,05). Samanlaisia ​​tietoja saatiin stabiileja solulinjoja rakennettu pEF-IRES-Puro vektori (kuva S2). Näin ollen nämä tiedot osoittavat, että

TPL2

aktivaatiota yli-ilmentävät joko villityypin tai konstitutiivisesti aktivoidun muodon TPL2 johtaa edistämiseen ADI kasvun AD-LNCaP-soluissa.

(A ) Kaavio vakaa LNCaP solulinjojen yli-ilmentävät joko

GFP

, myc-merkitty villin tyypin

TPL2

[

myc-TPL2

(WT)], joka on myc- tagged konstitutiivisesti aktivoitu muoto

TPL2

joiden katkaisu 70 aminohappoa sen C-päässä [

myc-TPL2

(ACk)], tai myc-merkityn kinaasi-inaktiivinen muoto

TPL2

[

myc-TPL2

(D270A)] käyttäen pBabe-puro ekspressiovektoriin. (B) Western blot analyysi ekspression havaitsemiseksi

TPL2

rakentaa edellä (kuten on osoitettu nuolilla punaisella). β-aktiini käytettiin kontrollina lastaus saman määrän proteiineja. (C) MTT-määrityksissä mittaamaan solun proliferaation stabiilien solulinjojen edellä puuttuessa tai heikosti R1881 (0,01 nM, 0,1 nM, ja 1 nM). Tilastollisesti merkitsevä solujen lisääntymisen verrattuna ohjata soluja (LNCaP-GFP) on merkitty * (p 0,05).

tukahduttaminen TPL2 Expression tai estäminen Sen kinaasiaktiivisuutta ADI Eturauhassyöpä solut tulokset alennetulla leviämisen Fenotyypit

Seuraavaksi onko ADI syöpäsolujen ovat riippuvaisia ​​

TPL2

niiden ADI solujen kasvua, olemme tukahdutti

TPL2

ilmentymistä tai vaikutusta joko by shRNA välittämä knockdovvn tai TPL2 estäjähoidon, vastaavasti. Kuten kuviossa S1,

TPL2

ilmentyminen oli on suurempi ADI-C4-2B soluissa kuin AD-LNCaP-soluissa. Vähentynyt ilmentyminen

TPL2

ADI-C4-2B solujen shRNA-välitteisen knockdovvn käyttäen pLKO.1-TRC vektori varmistettiin western blot (kuvio 3A). ADI-C4-2B solujen vähentynyt ilmentyminen

TPL2

osoitti merkittävästi vähentää lisääntymisnopeus alle androgen-köyhdytettyä olosuhteissa (kuvio 3B). Olemme vahvistaneet näitä tietoja ylimääräisillä shRNA välittämä Knockdown järjestelmän avulla pGIPZ lentivirusvektorilla (kuva S3). Lisäksi ADI solujen kasvua ADI-C4-2B soluissa oli myös merkittävästi vähentynyt, kun hoito on TPL2 inhibiittorin [kuvio 3C; 50% estävä pitoisuus (IC

50) oli 4,0 uM määritettiin kuten kuvassa S4]. Tukahduttaminen MEK /ERK-reitin ADI-C4-2B solujen hoidossa TPL2 varmistettiin Western blot (kuvio 3D). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että

TPL2

aktivaatio on välttämätön tehokkaan ADI kasvua ADI-C4-2B soluissa.

(A) Western blot -analyysi osoittaa määrä

TPL2

ekspressiota vakaa C4-2B solulinjat ilmensivät mainittuja shRNAs käyttäen pLKO.1-TRC lentivirusvektori aikaan seuraavan MTT-määrityksellä. β-aktiini käytettiin kontrollina lastaus saman määrän proteiineja. (B) MTT-määrityksissä mittaamaan solun proliferaation stabiilien solulinjojen ilman R1881. * P 0,05. (C) MTT-määrityksissä solujen proliferaation mittaamiseen androgeenin ehtyminen riippumaton C4-2B solujen hoidossa TPL2 estäjä (4 uM). (D) tukahduttaminen MEK /ERK-reitin ADI-C4-2B solujen kasvaessa pitoisuus TPL2 estäjän vahvistettiin Western blot.

TPL2 aktivointi Edistää ADI Eturauhassyöpä kasvu PTEN poisto Mouse Model

Aikaisemmin se oli osoitettu, että bialleelisen ehdollinen PTEN poisto eturauhasen epiteelin voisi aiheuttaa adenokarsinooma että esitetään yhteenveto useimmat histopatologisen piirteitä ihmisen eturauhassyövän [31], [32], [33]. Vielä tärkeämpää on, androgeeniablaatio näiden hiirten kirurgisen kastraation johti syntymistä ADI eturauhassyövän kasvua (kuvio 4A) [33]. Äskettäin eturauhassyövän solulinjat perustetaan ensisijainen eturauhasen syöpää

PTEN

poisto malli [34]. Kun pitkän aikavälin kulttuuri näiden solujen alle androgeenista köyhdytettyä olosuhteissa, ADI eturauhassyövän kaltaisia ​​soluja nimetty ”E” solujen kehittynyt ajan aluksi massiivinen solukuolema AD soluja. Lisäksi eturauhassyövän solulinjat perustettiin myös toistuvia ADI eturauhassyövän joka kehittyi jälkeen kirurgisen kastraation ja nimeltään ”CE” soluihin [34]. Toisin kuin E-solut, nämä CE solulinjoja androgen ehtyminen riippumaton alusta alkaen siten, että ei ollut alkuperäisen massiivinen solukuolema alle androgeenin köyhdytettyä olosuhteissa. Sen tutkimiseksi,

TPL2

aktivointi on fysiologisesti merkityksellisiä ADI kasvaimen kasvua

in vivo

, ensin verrattiin ekspressiotasot

TPL2

välillä E solulinjojen (E2 ja E4) ja CE solulinjoja (CE1, CE2, ja CE3). CE-solulinjat (CE1, CE2, ja CE3) osoittivat korkeampaa

TPL2

ilmentymisen verrattuna E solulinjoja (E2 ja E4), Western blot ja immunohistokemia (kuvio 4B ja 4C). Mielenkiintoista, E solulinjat osoittivat hieman korkeampia

AR

ilmaisu kuin CE solulinjat, mikä viittaa siihen, että E solulinjat voinut hankkia ADI kasvua vaikka AR yli-ilmentyminen (kuvio 4B). ADI solujen kasvua CE solujen (CE1, CE2, ja CE3) oli enemmän selvästi vaikutti kuin E soluja (E2 ja E4), kun käsitellään lisääntyvää on TPL2 estäjän (kuvio 4D). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että

TPL2

tarvitaan myös tehokasta ADI eturauhasen syöpäsolun kasvua hiirimallissa.

(A) Kaaviokuva ”Pb-Cre4 :: PTEN

f /f :: β-Actinp-GFP

f /f-Luc ”hiirimallissa, jossa

PTEN

alleelit homozygously poistetaan ja

Luciferase

ilmentyy eturauhasessa epiteelin eturauhasen-erityinen

probasiinin

promoottori (Pb) -indusoituun Cre rekombinaasin ilme. Näiden yhdisteiden hiirille kehittyi eturauhasen intraepiteliaalista neoplasia (PIN), eturauhasen invasiivisia adenokarsinooma, ja metastaattinen eturauhassyöpä ilmoitettuina aikoina. Tärkeintä on, androgeeniablaatio näiden hiirten kirurgisen kastraation johti syntymistä ADI eturauhassyövän kasvua ajoittain vaihtelevat 7-28 viikkoa kastraation jälkeen kaikissa elävissä hiirissä. E2 ja E4 eturauhassyövän solulinjat perustettiin alun perin primäärisistä syöpäsolujen ennen kastraatio myöhemmin kehittyi ADI kasvu upon pitkäaikainen kulttuuri alle androgeenin köyhdytettyä olosuhteissa. Kuitenkin CE1, CE2, ja CE3 eturauhassyövän solulinjat perustettiin ADI eturauhasen syöpiä jälkeen kastraation. Kuvat (200X) edustavat solun morfologioita E2 ja CE1 soluja. (B) Western blot -analyysi verrata ekspressiotasot AR ja TPL2 välillä E solulinjojen (E2 ja E4), ja CE solulinjat (CE1, CE2, ja CE3) soluja.

β-aktiini

käytettiin kontrollina lastaus saman määrän proteiineja. AD, androgeeniriippuvainen; ADI, androgen ehtyminen riippumaton; ja AR, androgeenireseptorin. (C) immunohistokemiallinen analyysi tutkia

TPL2

ilmaisun AD ja ADI eturauhasen syöpien

PTEN

poisto hiirimallissa. Ihmisen pohjukaissuolesta joka ilmentää suuria määriä endogeenista TPL2 käytettiin positiivisena kontrollina (ylhäällä oikealla). Negatiivisena kontrollina, kudos värjättiin ainoastaan ​​sekundaarisen vasta-aineen (ylhäällä vasemmalla). Pca, eturauhasen adenokarsinooma. (D) MTT-määrityksissä solujen proliferaation mittaamiseen E-solujen (E2 ja E4), ja CE-soluja (CE1 ja CE3) ja hoitoon eri TPL2 inhibiittoria (0, 1, 5, tai 10 uM). Tilastollisesti merkitsevää pienenemistä solujen lisääntymisen verrattuna ajoneuvon käsittely on merkitty * (p 0,05).

TPL2 ilmentymistä ylössäädellään ihmisen ADI eturauhassyövän yksilöitä

Lopuksi, vahvistaa kliinistä merkitystä

TPL2

kinaasi toimia ihmisen ADI eturauhassyövän kasvua, tutkimme taajuus

TPL2

ilmentymisen ADI ihmisen eturauhassyövän yksilöitä käyttämällä kudossiruina (TMA). Olemme arvioineet TPL2 immunovärjäyksen 12 normaalin (N), 52 hormonia infektoitunut (HN), 52 hormonia tulenkestävä (HR), 26 hormonia naiivi metastaattinen (HN Met), ja 12 hormoni-etäpesäkkeisen (HR Met) formaliinilla parafiiniin näytteitä. Kuviossa 5A esitetään edustavat kuvia TPL2 ilmentymisen normaalissa eturauhasessa, hormoni-naiivi eturauhassyöpä, ja hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä ihmisen eturauhasen TMA näytteitä. Kuten kuviossa 5B on esitetty, yleisen värjäytymisen taajuus TPL2 kasvoi hormoni-infektoitunut (34,8%) ja hormoni-tulenkestävät (36,5%) näytteistä verrattuna normaaleihin eturauhasessa (18,2%). Korotukset ovat merkittävämpiä metastaattisessa eturauhassyöpänäytteissä kanssa 46,2% (p 0,05) hormoneihin naiivi metastasoitunut ja 41,7% hormoneilla etäpesäkkeisen näytteitä, mikä viittaa siihen, että TPL2 ilmaisua voidaan myös liittyä eturauhassyövän etäpesäkkeiden. Erityisesti sekä yleinen keskiarvo värjäys pisteet ja taajuus näytteiden vahva straining pisteet kasvoi etenemistä eturauhassyövän (kuvio 5B). Yhdessä nämä TMA tiedot viittaavat siihen, että TPL2 ilmentyminen ylössäädellään kanssa etenemistä eturauhassyövän.

(A) edustaja kuvia jokaisen normaalin eturauhasen (N), hormoni-naiivit eturauhassyöpä (HN), hormoni-tulenkestävät eturauhassyöpä (HR), hormoni-naiivit metastaattinen eturauhassyöpä (HN Met), ja hormoni-etäpesäkkeisen eturauhassyövän (HR Met) värjättyjen ihmisen eturauhasen kudossiruina. TPL2 ekspressio havaittiin immunohistokemiallisella analyysillä käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​TPL2. (B) tilastollinen analyysi TPL2 ilmaisun kussakin ryhmässä N, HN, HR, HN Met, HR Met näytteitä värjättyä ihmisen eturauhasen kudossiruina suhteen keskiarvon värjäyksen tulokset ja värjäys prosenttiyksikköä. Tilastollisesti merkittäviä eroja keskimääräisessä värjäys pisteet on merkitty * (p 0,05). Yhteensä näytenumeroita kustakin ryhmästä huomattava. Värjäytymisvoimakkuus pisteytettiin itsenäisesti kahdessa urologian patologit 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäytyminen), 2 (väli värjäys), ja 3 (voimakas värjäytyminen) jokaisesta näytteestä.

Keskustelu

eturauhassyöpä on helppo hoitaa ja parantaa, jos se havaitaan varhaisessa vaiheessa, jolloin kasvaimen kasvu on edelleen rajoittuu eturauhasen. Kuitenkin, kun syöpä leviää yli eturauhanen, hoito vaikeutuu, vaikka hoitovaihtoehtoja, kuten sädehoito, hormonihoito, ja kemoterapiaa käytetään vaihtelevalla tehokkuutta. Syntyminen aggressiivisempi, androgen ehtymisestä riippumaton (ADI) muodossa eturauhasen syöpä on komplikaatio esiintyy usein ja syy epäonnistumiseen hormonihoidon. Siksi tutkimukset liittyvät tunnistaminen ja luonnehdinta genetiikan taustalla ADI eturauhassyövän kasvua ovat kriittisiä tulevaa kehitystä tavoitteelliseen terapeuttisia strategioita tehokkaaseen hoitoon ADI eturauhassyöpää. Tässä tutkimuksessa, seulomalla kirjasto aktivoitujen ihmisen kinaasien, me tunnistettu ja karakterisoitu kinaasi geeni,

TPL2

, joka näyttää ajaa ADI eturauhassyövän kasvua. Vielä tärkeämpää on,

TPL2

ylössäädellään ADI eturauhasen syöpiä sekä

PTEN

poisto hiirimallissa ja kliinisen eturauhassyövän yksilöitä. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että

TPL2

kinaasi on keskeisessä asemassa edistettäessä ADI eturauhassyövän etenemistä.

TPL2

, joka tunnetaan myös syövän etenemiseen lokuksen 2, joka koodaa tuote, jossa on deleetio sen C-terminaalinen alue kloonattiin alun perin, kuten transformoivan geenin ihmisen kilpirauhasen karsinooma solulinjassa, ja se oli nimeltään

cot

(syöpä Osaka kilpirauhasen) [35]. Lähes samaan aikaan, se on myös tunnistettu proteiinikinaasi kehittämiseen liittyvät T-solu lymfooma, kun huomattiin, että Moloney-hiiren leukemiaviruksen proviraalisen perimän oli integroitu viimeksi intronin

TPL2

geeni tuloksena poistetaan sen C-päätteen [36]. Siirtogeeninen hiiri tutkimus osoitti, että vain siirtogeenisiä hiiriä, jotka ekspressoivat C-terminaalista poistetaan muodossa

TPL2

valvonnassa proksimaalisen

Lck

promoottori kehitetty T-solulymfooma, mikä viittaa siihen, että C-terminaalinen domain villityypin

TPL2

näyttelee estävä rooli sen kinaasiaktiivisuuden [37]. Itse asiassa, C-terminaalista poistetaan TPL2 on lisääntynyt stabiilisuus ja korkeampi tietyn kinaasin aktiivisuus kuin villityypin. Lisäksi, TPL2 vuorovaikutuksessa negatiivinen säätelijä, NF-KB: n inhiboiva proteiini NF-κB1 p105 kautta C-päähän, ja näin ollen C-terminaalinen poistettu TPL2 on epäherkkä p105 negatiiviseen säätelyyn [38], [39]. Mielenkiintoista on, että

TPL2

ilmentyminen on myös yliaktiivista noin 40% ihmisen rintasyöpänäytteistä, joka voi aiheuttaa kasvu

TPL2

geenin kopioluvut [40]. Siksi on tärkeää määrittää, onko TPL2 aktivaatiota ihmisen eturauhassyövän näytteet voivat johtua joko geneettisen mutaation C-terminaalisella alueella tai geenin kopioluku kasvaa. Tuloksemme osoittivat, että TPL2 ilmentyy korkeammalla tasolla ADI-C4-2B soluissa kuin AD-LNCaP ja siten edistää korkean endogeenisen tason ADI transkription aktivaation

PSA

tehostaja /promoottori

cis

sääntelyvälineitä alue ADI-C4-2B soluissa (kuvio S1). Vertasimme myös

TPL2

sekvenssit kahdessa solulinjassa, mutta ei ole havainnut mitään sekvenssi ero, mikä viittaa siihen, että ADI fenotyypin C4-2B solujen ei liity erityisiä mutaatioita

TPL2

geenin. Lisäksi edellinen tutkimus osoitti, että mRNA taso

TPL2

hiiren eturauhasen kasvoi jälkeen kirurgisen kastraation, mutta se väheni sen jälkeen kun antamista uudelleen testosteroni [41]. Nämä microarray tiedot viittaavat siihen, että

TPL2

ilmentymistä eturauhasen käänteisesti säätelee testosteronin transkriptiotasolla. Siksi on mahdollista, että vähentynyt taso androgen hormonihoidon saattaa lisätä TPL2 ilmaisua, jolloin eturauhassyövän solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä alle androgeenin köyhdytettyä olosuhteissa. Tämä hypoteesi on alle aktiivinen tutkimuksen.

läsnä androgeenin, AR läpikäy fosforylaatio, dimerointi, ja translokaation tumaan, jossa se sitoutuu ARE sivustoja, jolloin transkription aktivaation kohdegeenien [8] . Kuitenkin useat raportit osoittavat, että AR on edelleen tarpeen ADI eturauhassyövän kasvua [9], [10]. Mitä taustalla olevien mekanismien TPL2 välittämän ADI eturauhassyövän kasvua, kysymys on siitä, onko tämä toiminta edellyttää AR ilmaisun ja toimintaa. Kumota TPL2 välittämän PSA promoottoriaktivoinnilla AR-negatiivisten DU-145 syöpäsolujen viittaa siihen, että

TPL2

-välitteisen ADI eturauhassyövän kasvua voi olla edelleen riippuvaisia ​​AR toimintaa.