Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa. Death PCA ensisijaisesti seurausta etäpesäke. Mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi kinaasin 4 (MAP2K4) yli-ilmennetään invasiivisia PCa vaurioita ihmisissä, ja voidaan estää pienimolekyylisiä hoitomuotoja, jotka osoittavat myönteistä aktiivisuutta faasin II tutkimuksissa. Kuitenkin MAP2K4 rooli säätelyssä metastaattisen käyttäytyminen on kiistanalainen ja tuntematon. Tutkia me valmistimme ihmisen PCa solulinjoja, jotka yli-ilmentävät joko villityypin tai konstitutiivinen aktiivinen MAP2K4. Orthotopic istuttaa hiirten osoitettiin MAP2K4 lisää muodostumista etäpesäkkeiden. Konstitutiivinen aktiivinen MAP2K4, mutta ei villityypin, lisää kasvaimen koko ja verenkierrossa olevia kasvainsoluja veressä ja luuytimessä. Täydentävät

in vitro

tutkimuksissa vakaan MAP2K4 yliekspressio edistää solujen invaasiota, mutta ei vaikuta solujen kasvuun tai muuttoliike. MAP2K4 yli-ilmentyminen lisää ilmentymistä lämpöshokkiproteiini 27 (HSP27), proteiinin ja proteaasin tuotantoa, jolla on suurin vaikutus matriisimetalloproteinaasi 2 (MMP-2), sekä

in vitro

ja hiiren kasvainnäytteissä. Edelleen, MAP2K4 välittämää nousua soluinvaasiota ovat riippuvaisia ​​lämpöshokkiproteiini 27 (HSP27) ja MMP-2, mutta ei kun MAP2K4 välitöntä loppupään tavoitteet, p38 MAPK tai JNK. Osoitamme, että MAP2K4 kasvattaa ihmisen PCa etäpesäke, ja pitkittynyt yli ilmaisun indusoi pitkän aikavälin muutoksia soluviestitykseen johtavia reittejä riippumattomuus p38 MAPK ja JNK. Nämä havainnot antavat mekanistinen selitys ihmisen tutkimuksia yhdistää nousu HSP27 ja MMP-2 etenemistä etäpesäkkeitä. MAP2K4 on validoitu tärkeänä terapeuttisena kohteena estämällä ihmisen PCa etäpesäkkeitä.

Citation: Pavese JM, Ogden IM, Voll EA, Huang X, Xu L, Jovanovic B, et al. (2014) mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi Kinase 4 (MAP2K4) Edistää Human Eturauhassyöpä Metastasis. PLoS ONE 9 (7): e102289. doi: 10,1371 /journal.pone.0102289

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: May 1, 2013 Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 14 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Pavesen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health (NIH) RCB, CA122985 ja eturauhasen SPORE CA90386, ja JMP, NIH T32 AG000260 ”Drug Discovery Training in Age liittyvät häiriöt”, ja jonka Walter S. ja Lucienne Driskill Graduate ohjelma biotieteiden Northwestern University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä Yhdysvalloissa miehillä, ja toiseksi yleisin syöpä kuolema [1]. Vaikka yli 90% ihmisistä paikallisluonteisia PCA ei kuole niiden taudista, joilla etäpesäkkeitä on parantumaton sairaus ja valtaosa kuolee PCA [2]. Ymmärtäminen metastaattista leviämistä ihmisen PCa säännellään on kriittinen biologinen merkitys. Tämä tieto antaa meille mahdollisuuden tunnistaa potilaat ovat vaarassa ja siten tarvitsevat intervention, ja muodostavat perustan kehittämiselle kohdennettujen hoitostrategioiden.

mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi kinaasin 4 (MAP2K4, joka tunnetaan myös MKK4, MEK4 tai SEK1) on dual-spesifisyys proteiinikinaasi fosforyloi seriini ja treoniini, sekä tyrosiinitähteitä. MAP2K4 on jäsen mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) signalointireitin ja tyypillisesti aktivoi kaksi alavirran tavoitteet, p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (p38 MAPK) ja c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) [3]. Rooli MAP2K4 ihmisen PCa syövän etenemistä, ja kehittämällä etäpesäkkeiden erityisesti, on kiistanalainen. MAP2K4 sijaitsee kromosomisegmentin 17p11.2, joka voidaan menettää nopeudella noin 7-10% ihmisen epiteelisyöpien, erityisesti munasarja- ja rintasyöpää, [4], [5] Tästä syystä, se oli alun perin oletettiin olevan tuumorisuppressorina. Rotan PCa mallia, käyttäen soluja, joista puuttuu kromosomaalisessa segmentissä, joka sisältää MAP2K4 erityisiä palauttaminen MAP2K4 proteiinin vähentää PCa etäpesäke keuhkojen seuraavat kylki injektion näiden solujen [6]. Tässä mallissa, lisääntynyt MAP2K4 myös hidastunut kasvu metastaattisen solujen saapuu keuhkoihin, mikä johtuu todennäköisesti G1 solukierron pysähtymisen [7].

Kuitenkin muut tutkimukset osoittavat, että MAP2K4 luojana pro-metastasoitunut fenotyyppi, ja tuki käsitystä, että se lisäisi etäpesäke. MAP2K4 aktivoi p38 MAPK, joka ajaa monet vaiheet metastaattisen kaskadin, mukaan lukien epiteeli- ja mesenkymaalitransitioon (EMT), solu invaasio, ja metastaattinen kolonisaatio (tarkistetaan [8]). MAP2K4 ilmentyminen lisääntyy eturauhasen korkean luokan intraepiteelisen neoplasia (HGPIN) vaurioita sekä hiiren perustuvaa TRAMP malli spontaani PCA sekä ihmisen yksilöt [9]. Myös MAP2K4 ilmentyminen lisääntyy alussa invasiivisia eli PCA vaurioita ihmisissä ja lisääntynyt MAP2K4 ilmentyminen merkitsevästi korreloi korkeamman patologinen vaiheessa [9]. Mielenkiintoista on, että nämä ja muut tutkimukset, tasot MAP2K4 sitten laski myöhäisessä vaiheessa etäpesäkkeitä, mikä osoittaa, että MAP2K4 kasvu on kriittinen aikaisin vaiheita metastaattisen Cascade [10]. Tämä vaikutus aikaisin vaiheet on vahvistettu

in vitro

tutkimuksissa. Käyttämällä useita erilaisia ​​ihmisen normaalia ja syöpä eturauhasen solulinjoissa ja ohimenevää suunniteltu ilmaus MAP2K4 ryhmämme osoittivat, että MAP2K4 lisää soluinvaasiota, kriittinen osoitus metastasointiin

in vitro

[11]. Havaitsimme myös MAP2K4 tärkeä terapeuttinen tavoite pieniä yhdistettä estäjiä. Tarkemmin, osoitimme, että MAP2K4 oli terapeuttinen kohde pienen yhdisteen, 4 ’, 5,7-trihydroxyisoflavone (genisteiiniä), sen vaikutukset, kun hyökkäys estäminen [11], [12], ja että genistein estää ihmisen PCa metastasoitumisen potilaalle tehdä hiirimallissa [13]. Kautta useita siihen liittyviä tutkimuksia, tunnistimme polku, transformoiva kasvutekijä (TGF) β → MAP2K4 → p38 MAPK → lämpöshokkiproteiini 27 (HSP27) → matriisimetalloproteinaasi tyypin 2 (MMP-2) → ihmisen PCa soluinvaasiota, ja että se estetään genisteiini- [11] – [16]. Olemme myös osoittaneet, että mahdolliset genisteiini- annettavaksi ihmisille, joilla oli paikallinen PCa vähenee MMP-2: n ilmentymisen eturauhaskudoksessa [11]. Käyttämällä

in vivo

eläinmalleissa, muuttunut MAP2K4 ilmaisu voi muuttaa etäpesäke muissa ihmisen epiteelisyövissä. Erityisesti muut ryhmät ovat osoittaneet MAP2K4 Knockdown pienenee metastaattista kasvaimen kasvua hiirimalleissa rinta- ja haimasyövän [17], [18].

Koska MAP2K4 muokattuna ilme sekä varoituksia merkitystä ihmisille, sen

in vitro

johtuvat vaikutukset ihmisen eturauhasen soluja, ja monipuolinen vasteita rotan ja ihmisen epiteelin syövän solulinjoissa, on tärkeää nimenomaan määrittää MAP2K4 rooli säätelyssä metastaattisen käyttäytymistä ihmisen PCa. Vaikka MAP2K4 on terapeuttinen tavoite genisteiinin, genisteiinin kykenee monia erilaisia ​​vaikutuksia. Siksi huolimatta genisteiini n esto Ihmisen PCa etäpesäke, rooli MAP2K4 säätelyssä etäpesäkkeiden muodostumiseen ei voida määrittää näistä havainnoista. Epävarmuus MAP2K4 n säätelijänä ihmisen eturauhasen syövän etäpesäke kasvaa lisäksi tutkimuksia useilla eri syöpätyyppejä, jotka tukevat joko aggressiivisuutta vähentävänä [6], [7], [19] – [21], tai stimuloiva rooli [9], [11], [17], [18]. Mikä tärkeintä, kukaan ei ole tutkinut MAP2K4 rooli säätelyssä metastaattisen käyttäytymistä ihmisen PCa.

Nykyisessä tutkimuksessa osoitamme useita uusia havaintoja. Ensinnäkin MAP2K4 lisääntynyt ihmisen PCa etäpesäke. MAP2K4 lisääntynyt kasvaimen kasvu

in vivo

, mutta ei

in vitro

. Paineessa krooninen ilmaisun, joka emuloi kliininen tilanne, MAP2K4 johti rewiring solun signalointireittien. Tämä johti ohitus välitöntä loppupään signalointi proteiineja, p38 MAPK ja JNK. Olemme tunnistaneet ainutlaatuisen mekanismin, jolla korvataan jolloin MAP2K4 johtanut jopa sääntelyn ilmaisemisessa HSP27 kokonaisproteiinista. Tämä puolestaan ​​on johtanut korkeampiin absoluuttiset tasot fosforyloitua HSP27 ja lisäykset loppupään MMP-2. MAP2K4 perustuva metastaattisen fenotyypin osoitettiin olevan riippuvainen HSP27 ja sen alavirran efektorin, MMP-2. Nämä havainnot osoittavat, että MAP2K4 on tärkeä tekijä ihmisen PCa etäpesäke, ja he siten vahvistaa sitä terapeuttisena kohteena estämiseksi PCa etäpesäkkeitä. Ne tarjoavat myös mekanistisen selityksen kliinisiä tutkimuksia yhdistää kasvaa MAP2K4, HSP27 ja MMP-2 ilmaisun tulevaa kehitystä etäpesäke.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Northwestern University (PHS Assurance # A3283-01). Kaikki Leikkaus suoritettiin isofluraanianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Soluviljely ja transfektio

PC3-M ja LNCaP-soluja ylläpidettiin RPMI 1640-alusta täydennettynä 2 mM L -glutamine, 10 mM HEPES-puskuria, 50units /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% hiilidioksidia. 1542CPTX soluja ylläpidettiin Keratinosyyttien SFM-alusta täydennettynä 2 mM L-glutamiinia, 10 mM HEPES-puskuria, 50units /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä, 10% naudan sikiön seerumia, 5 ng /ml EGF: ää Human Recombinant, 50 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta (Life Technologies) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% hiilidioksidia.

MAP2K4 stabiileja transfektoituja soluja luotiin transfektoimalla PC3-M, LNCaP tai 1542CPTX soluja, joiden alkuperä on aiemmin kuvattu [22], jossa TransIT-LT1 transfektioreagenssi (Mirus Bio LLC), ja plasmidi-DNA: valmistajan ohjeiden mukaisesti. Soluja kasvatettiin G418-valinnan olosuhteissa, yksittäiset pesäkkeet kerättiin ja laajennettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu meidän [23]. Indikoitu kokeissa saatu yksittäisten klonaalisia solulinjoja ne transfektoitiin lisäksi, kuten edellä, jossa GFP-ekspressioplasmidin, valittu kohdassa blastisidiinia kasvuolosuhteissa, ja puhdistettiin sitten käyttämällä steriiliä solujen lajittelu perustuu GFP tila. Solulinjoja todennettu kuvattujen menetelmien mukaisesti American Type Culture Collection (ATCC), Technical Bulletin nro 8, Cell Line Verification Test suositukset [24]. Erityisesti solut varhainen (ts 15 kohtia) jäädytetyt varastoja käytettiin ja saivat täydennystä jälkeen 20 kohtia, solut tehtiin rutiini mikroskooppinen tutkimus vahvistaa yhtenäinen ja vakio matkapuhelinarkkitehtuurin eikä mikrobi-infektion, ja solut testattiin ja selvinnyt mykoplasmatulehduksen.

knockdown kokeita Dharmacon ON-Targetplus SMARTpool siRNA kohdistaminen MAP2K4 (L-003574-00-0005), HSP27 (L-005269-00-0005), MMP-2 (L-005959- 00-0005), tai ei-kohdistaminen siRNA (D-001810-10-05) transfektoitiin soluihin käyttäen Dharmafect Duo (T-2010, kaikki Thermo Scientific) sekä pCMV-β-galaktosidaasin (Agilent Technologies), ja käyttää 48 tunnin kuluttua, kuten on kuvannut meitä [11].

Reagenssit ja Plasmidit

Äänestyksessä olivat ostettu vasta, SEK1 /MKK4 (# 9152), fosfori-p38 MAPK (T180 /Y182) (# 4631), p38 MAPK (# 9212), fosfori-SAPK /JNK (T183 /Y185) (# 4668), SAPK /JNK (# 9258), fosfori-HSP27 (# 2401), HSP27 (# 2402) , ja GAPDH (# 2118), kaikki Cell Signaling Technology, ja piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla anti-hiiri ja anti-kani, GE Healthcare Biosciences; plasmidit, villityypin ja konstitutiivista aktiivinen MAP2K4 (# 14615 ja # 14813, Addgene) ja GFP (kirkkaat värit pcDNA 6,2 /N-EmGFP-GW /TOPO, Invitrogen); kemialliset estäjät, p38 MAPK-inhibiittori, SB203580 (Sigma-Aldrich) ja niihin liittyvät negatiivinen kontrolli, SB202474, ja JNK Inhibitor II (SP600125), ja JNK Inhibitor II negatiivinen kontrolli (N

1-metyyli-1,9-pyrazoloanthrone), kaikki EMD Millipore.

hiirimallissa Human Eturauhassyöpä etäpesäke

Solut istutettiin ja etäinen etäpesäke määrällisesti ovat aikaisemmin kuvanneet meille, muutoksin [13], [25]. Lyhyesti, 2,5 x 10

5-soluja istutetaan vatsanpuoleinen eturauhanen 6-8 viikkoa vanhat Balb /c kateenkorvattomissa hiirissä, ruokitaan Harlan Teklad 2016S ruokaa ja vettä

ad libitum

, ja sijaitsee este laitos 12 tunnin valo /pimeä jaksoissa. Jälkeen 6 viikkoa, kasvain kudos jäädytettiin, keuhkot formaliinilla /parafiiniin, ja veressä ja luuytimessä viljeltiin täydellisessä RPMI 1640 median G418 10 päivää, ja läsnäolo CTC muistiin.

45 mikronin vaihe-osaan, vieressä 4 mikronin keuhkokudoksesta leikkeitä immunovärjättiin GFP ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 15-kertainen verrattuna VC, niin WT-MAP2K4 ja CA-MAP2K4 soluissa. MMP-9 ei merkittävästi 2-kertaisesti, mutta vain WT-MAP2K4 soluja. MMP-10 ja MMP-13 ei vaikuttanut. Siksi MAP2K4 välittämää nousua invaasiota eivät johdu muutoksista solujen vaeltamiseen, vaan liittyy muutoksiin proteaasin ilmentyminen, MMP-2 erityisesti. Tämä on kliinisesti merkittäviä kuin MMP-2 voi hajota kollageeni IV tärkeä osa eturauhasessa, ja on yhteydessä huonoon ennusteeseen, kuten uusien etäpesäkkeiden (tarkistetaan [31]).

Seuraava tutkittu lisääntynyt kasvaimen kokoa havaittu CA-MAP2K4 hiiret, kuvio 1E, onko kasvu on muuttunut

in vitro

, kuvio 2E-F. Vuonna viiden päivän

in vitro

MTT-määritystä, ei eroja solujen kasvua ryhmien välillä havaittiin, kuvio 2E. Vuonna 14-päivän pehmeä agar pesäkemuodostusta, CA-MAP2K4 solut kasvoivat hieman hitaammin kuin VC ja WT-MAP2K4 soluissa, mutta tämä muutos ei ollut merkittävä, kuvio 2F. Nämä havainnot osoittavat, että alle

in vitro

kasvun olosuhteissa, ei WT-MAP2K4 eikä CA-MAP2K4 vaikuttaa solujen kasvuun.

MAP2K4 yliekspressio nimenomaan muuttaa HSP27 fosforylaation ja kokonaisproteiinin ilmaisun

edellä esitetyt havainnot osoittavat, että MAP2K4 suhteellisen nimenomaan lisää MMP-2. Ohimenevä muutos MAP2K4 säätelee MMP-2 ja solujen invaasiota fosforylaatio ja aktivaatio p38 MAPK [12]. Lisäksi p38 MAPK, MAP2K4 voi myös joko aktivoida JNK tai molemmat proteiinit, riippuu mallista järjestelmän [32]. JNK on yleisesti liittyy muutoksia lisääntymistä ja apoptoosin vasteena korostaa ihmisen PCa [33] – [35], mutta myös muutoksia solujen muuttoliike ja invaasiota [36], [37]. Siksi arveltu, että krooninen MAP2K4 ilmaisua lisäisi aktivoitumista p38 MAPK ja /tai JNK. Testasimme tätä teoriaa tutkimalla fosfo-p38 MAPK, -JNK1 ja -JNK2 tasot Western blot MAP2K4 yli ilmentämissolulinjat käyttäen fosfoproteiinin spesifisiä vasta-aineita. Kuitenkin meidän havainnot eivät tue hypoteesia kuin yliekspressio MAP2K4 ei lisännyt myöskään fosforia tai kokonaisproteiinipitoisuus tasoja joko p38 MAPK tai JNK, kuva S2.

Meidän tulokset tukivat hypoteesia, että olosuhteissa jatkuvan MAP2K4 yliekspressio, kuten tapahtuu kliinisessä tilanteessa, korvaavia reittejä voidaan ohittaa tavoitteet välittömästi alavirtaan MAP2K4, mikä jättää heidät inaktivoidulla tilassa. HSP27, joka on alavirtaan p38 MAPK, kasvattaa sekä MMP-2: n ilmentymisen ja solujen invaasiota ihmisen PCA olosuhteissa ohimenevän transfektion [12], [15]. Siksi tutkittiin tilan HSP27, kuvio 3A-B. Yleiseen tasoon sekä fosforia ja yhteensä HSP27, verrattuna GAPDH, lisättiin. Fosforia ja yhteensä HSP27 kasvoi 3,4 (merkittävästi) ja 2.7 (vain trendi, 2-puolinen p-arvo = 0,065), vastaavasti, WT-MAP2K4 soluja, ja molemmat merkittävästi 3,1 ja 3,0-kertainen CA-MAP2K4 soluissa . Fosfo-HSP27 /yhteensä HSP27 suhde nousu oli pieni, ja merkittävä ainoastaan ​​WT-MAP2K4 soluissa. Nämä havainnot osoittavat MAP2K4 johtaa kohonneeseen koko ja fosfo-HSP27-proteiinia. Ei ollut eroja HSP27-geenin ilmentymisen välillä MAP2K4 yli-ilmentävät ja VC soluja, kuvio 3C, mikä osoittaa, että erot proteiiniekspressiossa johtui muutoksia käännös- ja /tai proteiinien hajoamista. Yhdessä nämä havainnot määrittää, että krooninen MAP2K4 yli-ilmentyminen johtaa lisääntyneeseen HSP27-proteiinin ilmentyminen, kun taas ohittaen aktivointi p38 MAPK ja JNK.

ilmentyminen koko ja fosforyloidun muotoja HSP27 proteiinien arvioitiin Western blot, että osoitettu solulinjoissa, AB. Tiedot kolmesta eri blotit graafisesti INB, kun keskiarvo ± SEM. C), HSP27 transkriptipitoisuuksissa mitattiin qRT /PCR, normalisoitu GAPDH, ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM prosenttiosuus VC.