Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen uusia proteiineja, jotka voidaan mahdollisesti edistää syövän synnyn on vaadittu hanke. Tässä raportoimme ensimmäistä biokemiallinen luonnehdinta uusia F-box ja WD40 sisältävän proteiinia, FBXW4. Olemme tunnistaneet vuorovaikutuksessa proteiinin kumppanit ja osoittivat, että FBXW4 on osa ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen. Lisäksi Fbxw4 lokus on yhteinen sivusto proviraalisen insertion eri retroviruksen insertiomutageneesin hiiren syövän malleista ja Fbxw4 mRNA: ta ilmentyy suuresti involuting hiiren maitorauhasen. Alkaa luonnehtia biokemiallinen funktio Fbxw4, käytimme proteomiikka-analyysi osoittaa, että Fbxw4 vuorovaikutuksessa Skp1 (SKP1), Cullin1 (CUL1), Ring-box1 (RBX1) ja kaikki komponentit COP9 signalosomi. Kaikki nämä vuorovaikutukset ovat riippuvaisia ​​ehjä F-box domain of Fbxw4. Lisäksi Fbxw4 pystyy olemaan vuorovaikutuksessa ubikitinoituja proteiinien soluihin F-box riippuvaisella tavalla. Lopuksi, me osoitamme, että FBXW4 on mutatoitu, menetetään ja alle ilmaistu erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa ja kliinisten potilaan näytteistä. Tärkeää on, ekspressio FBXW4 korreloi selviytymisen potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Yhdessä ehdotamme, että FBXW4 voi olla uusi kasvain vaimennin, joka säätelee tärkeisiin solun prosesseja.

Citation: Lockwood WW, Chandel SK, Stewart GL, Erdjument-Bromage H, Beverly LJ (2013) Novel Ubiquitin ligaasia Complex, SCF

Fbxw4, vuorovaikutuksessa COP9 signalosomi in F-Box riippuvaisella tavalla, mutatoituu, Lost ja Under-ilmaistuna ihmisen syövissä. PLoS ONE 8 (5): e63610. doi: 10,1371 /journal.pone.0063610

Toimittaja: Deanna M. Koepp, University of Minnesota, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 helmikuu 2013; Hyväksytty: 05 huhtikuu 2013; Julkaistu: 02 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Lockwood et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH), Molecular tavoitteet COBRE, 8P20GM103482-10 (ja LJB), Wendy Will Case Cancer Fund, GB220413 (ja LJB), Kosair Pediatric Cancer Research Program palkinto (ja LJB). Tätä työtä tukivat myös NCI Cancer Center avustustuen P30 CA08748 on Microchemistry ja Proteomiikka Core Laboratory (ja HEB), Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Tätä työtä tukivat myös, osittain NIH Grant P01 CA94060 ja PO1 CA129243-01 (Harold Varmus) ja NIH sisäiset NCI ja NHGRI varat (Harold Varmus). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ubiquitin ligaasia kompleksit katalysoivat konjugoinnin ubikitiinipromoottori substraatille proteiineja [1]. Ubikinaa- proteiinien voi olla monenlaisia ​​vaikutuksia proteiinin toiminnan paras hyvin tutkittu on sääntelyn proteiinin vakauden [2]. Ubikitiini-ligaasia kompleksit (joita kutsutaan myös E3 ubikitiinipromoottori ligaasit) vuorovaikutuksessa E1 (ubikitiinipromoottori aktivoiva entsyymi), ja E2 (ubikitiinipromoottori konjugointientsyymiä) [1]. E1- ja E2 entsyymit ovat yleensä jaettu monet E3 ligaasit ja E3 komponentti on spesifisyys tekijä, joka vaikuttaa suoraan alustaan ​​proteiineja. Yksi tyyppi E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen, SCF ubikitiini ligaasi monimutkainen, sisältää Skp1, Cullin1, rengas-box1 ja jonkin yli seitsemänkymmentä F-box sisältävien proteiinien koodattu genomien korkeampien eukaryoottien [3], [4]. F-box domain vastaa suoraan vuorovaikutuksessa Skp1, kun taas muilla aloilla sisällä proteiinia ovat vastuussa vuorovaikutuksessa ja tuo alustan proteiineja läheisyys ubikitiinipromoottori ligaasilla [5]. Tärkeää on, useita F-box sisältävät proteiinit ovat hyvin ominaista pelata suoraan rooleja synnyssä ihmisen syövistä [6], [7], [8], [9], [10]. Esimerkiksi mutaatiot, jotka johtavat lakkaa toimimasta FBXW7 tai BTRCP johtaa vakauttamiseen sukulaisamideillaan alustan proteiineja, Notch, MYC ja sykliini tai Beta kateniinin, vastaavasti, jotka kaikki ovat hyvin tunnettuja onkogeenien [6], [9] , [11], [12], [13], [14], [15].

COP9 signalosomi on mega-daltonin kokoinen kompleksi, joka koostuu vähintään kahdeksan proteiineja alunperin tunnistettu geneettinen näyttö Arabidopsis [16], [17]. COP9 kompleksi tiedetään säätelevän monia ubikitiinipromoottori ligaasia komplekseja. Tarkkaa mekanismia, jolla COP9 säätelee toimintaa ubikitiinipromoottori ligaasia komplekseja ei ole täysin ymmärretty, mutta on ehdotettu säädellä vuorovaikutusta f-box-proteiinien ja Skp1 säätelemällä konjugaation pienen proteiinin nedd8 ja Cullin1 [18], [19 ]. Sykli neddylation /de-neddylation helpottaa ubikitiinipromoottori ligaasilla-alustan vuorovaikutus ja myöhemmät vaihtuvuus alustan. Näin ollen, toimintaa monet näistä ubikitiinipromoottori ligaasin kompleksien on osoitettu vaatia vuorovaikutusta COP9 signalosomi oikea toiminta. Mielenkiintoista on, että useita komponentteja on COP9 signalosomi tiedetään olevan COP9 riippumattomia toimintoja ja on osoitettu myötävaikuttavan syövän [20], [21], [22].

FBXW4 lokus oli alun perin kartoitettu kuin alue ihmisen kromosomissa 10, joka oli syy lokukseen raajan epämuodostuman häiriö kohdalta käsi ja jalka 3 (SHFM3) [23], [24], [25], [26]. SHFM3 on vika kehittämisessä apikaalisella ektodermiharjanteessa aikana raajojen muodostumiseen, joka aiheuttaa aplasiaa Keski numerot johtavat, vakavimmissa tapauksissa ainoastaan ​​kaksi numeroa per raaja [27], [28]. Myöhemmin todettiin myös, että Fbxw4 oli myös uran vastuussa spontaani hiiri kehityshäiriöitä vika, joka muistutti SHFM3 ihmisellä [29]. Joukko julkaisuja väittämällä, että muuttaminen FBXW4 vastaa vioista, jota seuraa julkaisuja, jotka viittaavat alkupään lokuksen koodaavaa Fgf8 voi olla syyllinen [30], [31]. Tähän mennessä mitään tyydyttävää tietoja ei unclouded asiaa.

Riippumatta siitä FBXW4 syy edistää SHFM3, tähän mennessä ei molekyyli- tai biokemiallisia toiminto on katsoneet FBXW4. Yhdistämällä data mining, ilmentyminen tutkimukset, proteomiikka ja biokemian olemme alkaneet laajentaa tietämystä FBXW4. Osoitamme, että Fbxw4 on osa ubikitiinipromoottori ligaasilla kompleksi, joka sisältää Skp1, Cullin1, Rbx1 ja COP9 signalosomi. Assembly tämän monimutkaisen riippuu F-box domain of Fbxw4. Mikä tärkeintä, osoitamme, että FBXW4 lokus on yleisesti poistetaan, alle ilmaistaan ​​ja somaattisesti mutatoitunut ihmisen syövissä. Lisäksi vähentynyt FBXW4 ilmaisu korreloi huonon säilymisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita. Yhdessä oletamme, että FBXW4 voi olla unappreciated tuumorisuppressorigeenin ihmisen maligniteettien, koska sen kyky säädellä toiminto kriittisten signalointireittien.

Materiaalit ja menetelmät

rt-PCR-analyysi Fbxw4 ilme

QRT-PCR suoritettiin ”hiiren normaalia kudosta qPCR paneeli Olen alkaen Origene kissa. # MNRT101 (Rockville, MD, USA) käyttäen SYBR Green Applied Biosystmes (Foster City, CA, USA) kanssa edellyttäen GAPDH oligot ja ”3 mus Fbxw4 rt” 5′-GTCCTCATCATGCCCAGAGAAGAC-3 ’kanssa’ 5 mus Fbxw4 ATG ’: 5 ’-ATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATGC-3’ tai ’5 mus Fbxw4 rt ”5′- GTCCTGTG GTTATGACACCTATG-3’ ja ’3 mus Fbxw4 no stop” 5′-TGGGTTCTGA AAGTCTAAGACGTG-3’.

plasmidikonstrukteja

Fbxw4 ja Fbxo46 konstruktit ostettiin Origene (Rockville, MD, USA) ja käytettiin PCR-malleja. (Fbxw4 kissa. # MMM1013-7512491; Fbxo46 kissa. # MMM98477851). Fbxo46 monistettiin seuraavien oligojen käyttäen Vent DNA-polymeraasia (NEBL, Ipswich, MA, USA): Mus Fbxo46 atg RI, 5’GCGCGAATTCACCATGGACAGGGGCAGCCTCCTGCCC-3 ’; mus Fbxo46 ei lopeta Sall 5’GCGCGTCGACCCTCCCCTCTTCCCGGCCAGC-3 ’. PCR-monistetut fragmentit kloonattiin TOPO tylppä kloonausta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Täyspitkän Fbxo46 pilkottiin sitten EcoRI: llä ja Sall: llä ja kloonattiin pBabe-FLAG vektori, digestoitiin EcoRI: llä ja XhoI: llä, joka sisältää 3 ’FLAG-epitoopin tag alas stream ja kehyksen Xhol, FLAG-epitooppi seuraa sitten lopetuskodonit ja SalI-paikan. Fbxo46 kanssa 3 ’in-frame FLAG pilkottiin sitten ulos pBabe EcoRI: llä ja Sall: llä ja kloonattiin EcoRI: llä ja Xhol-retrovirusvektorin MIGRX.

Fbxw4 monistettiin Origene klooni Vent DNA- polymeraasin seuraavat oligot: mus Fbxw4 atg RI, 5’GCGCGAATTCACCATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATG-3 ’; mus Fbxw4 lippu lopettaa XhoI, 5’GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG-3 ’. PCR-monistetut fragmentit kloonattiin TOPO tylppä. Täyspitkä Fbxw4 sisältävät in-frame 3 ’FLAG tag sitten talteen digestoimalla EcoRI ja XhoI. Tämä fragmentti kloonattiin sitten EcoRI- ja Xhol MIGRX.

Fbxw4

-fbox monistettiin täyspitkä Fbxw4 TOPO klooni käyttäen seuraavia oligoja: Fbxw4 lippu lopettaa XhoI, 5’GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG -3 ’, mus Fbxw4 -fbox EcoRI, 5-GCGCGAATTCACCATGGCCCGGGCCTCGCTCAACACC-3’. PCR-monistettu fragmentti kloonattiin EcoRI: llä ja Xhol MIGRX.

pRK5-HA-Ubiquitin Addgene # 17608 talletettu Ted Dawson [32].

Soluviljely

293 T-solut hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. DNA-transfektiot 293-T-solut tehtiin käyttäen PEI, suhteessa 2,5 mikrogrammaa PEI /mikrogramma DNA: ta. Kaikki solu-uutteet valmistettiin seuraavasti kaapia keräämiseen 293 T-soluja käyttäen CHAPS lyysipuskuria (1% CHAPS pesuainetta, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7, 5 mM EDTA). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä BCA-proteiinimääritysreagenssilla Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) cat # 23225. 30 ug kokonais-proteiinia käytettiin standardi Western blot menettelyä. Kemiluminesenssiosoitusta suoritettiin käyttäen SuperSignal WestFemto Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) valmistajan protokollan mukaisesti.

Immunosaostukset

200 ug proteiinia inkuboitiin 400 ul koko CHAPS-puskuria ja inkuboitiin 15 ul näyttämän affiniteettimatriksia yhden tunnin ajan 4 asteessa. Inkuboinnin jälkeen matriisi pestiin kolme kertaa CHAPS-puskuria, ja sitten SDS-latauspuskuria lisättiin suoraan pesty matriisi, keitettiin ja ladattiin suoraan kuoppiin PAGE-geelillä. Lääkehoitojen suoritettiin kuten tekstissä on kuvattu käyttämällä 25 uM MG132.

Vasta

Tubulin # B512, FLAG M2 konjugoitujen agaroosihelmet, FLAG polyklonaalisella # F7425 (Sigma, St. Louis, MO, USA); HA affiniteettimatriisiin ja HA # 3F10 (Roche, Indianapolis, IN); Ubikitiinipromoottori # 3933 (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA, USA); SKP1 kissa. # Ab10546 ja COPS2 /TRIP15 kissa. # Ab4537 (Abcam, Cambridge, MA, USA); COPS5 /JAB1 kissa. # Sc-9074 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

Immunosaostusanalyysi ja Proteiinin tunnistaminen nano-Liquid kromatografia pari Tandem-massaspektrometria (LC-MS /M) B

10-150 mm levyt 293 t-soluja transfektoitiin ohimenevästi käyttäen Fugene6, kohti valmistajan protokollaa (Roche, Indianapolis, IN). 48 tunnin transfektion jälkeen solut otettiin talteen kaapimalla kylmässä. CHAPS lysaatit valmistettiin ja kvantifioitiin edellä kuvatulla tavalla. 50 mg koko lysaattia inkuboitiin FLAG konjugoitu -agaroosihelmiä (Sigma, St. Louis, MO, USA) yön yli 4 astetta lempeä rocking. Agaroosihelmillä lisättiin pylvääseen ja pestiin 10 kertaa kolonnin tilavuutta painovoimaista virtausta. Pylväs suljettiin ja 1 lasihelmikerroksen tilavuudesta FLAG-peptidiä (PBS-liuos, jonka pitoisuus on 5 mg /ml ja laimennettiin sitten 1:10 CHAPS-puskuria) lisättiin pylvääseen ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 asteessa. Korkki poistettiin ja -100 ui fraktioita kerättiin eluution läpi virtaa painovoiman. 50% jokaisen fraktion (-5 jakeita) oli western blotattiin anti-FLAG-vasta. Tyypillisesti ensimmäinen osa puuttui kohdeproteiinin ja joko osa 2 tai 3 oli suurin kohdeproteiinin. -40%: N fraktio, joka sisältää suurimman osan FLAG-tag puhdistettu proteiini oli osittain ratkaistu käyttämällä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla; seokset keskitettiin yhdeksi, 3 mm leveä ”pino” elektroforeesin avulla SDS ”-vertailugeeliä” kunnes kirjoittamalla ”erottaminen geeli”, jota seuraa lyhyt värjäys Coomassie Blue ja leikkaamalla pinottu proteiinin bändi. Näytteiden valmistelu ja massaspektrometrialla suoritettiin täsmälleen kuten aiemmin on kuvattu [33].

Telineiden (Proteome Software Inc., Portland, OR), versio 3_6_1 käytettiin edelleen vahvistaa ja rajat taulukoida MS /MS-pohjainen peptidi ja proteiini tunnistamista. Proteiini ja peptidi todennäköisyys asetettiin 95% vähintään peptidi, joka on yksi.

Tulokset

Fbxw4 on yhteinen sivusto proviraalinen paikoilleen ja ilmaistaan ​​vaihtelevasti normaaleissa hiiren kudoksissa

tunnistamiseen ja uusien geenien ja geenituotteiden on johtanut ylivoimainen määrä julkisesti saatavilla ja aineistoja. Mietimme, kaivos- nämä saatavilla aineistoja voisi tuottaa hypoteesin tuottaville havaintoja ympäröivästä mahdollisesti kiinnostavia geenejä. Yksi tällainen tietokanta on ”retroviruksen merkityt syöpää geeni tietokannan, joka on kokoelma proviraalisten sisäänpanokohdat klooneja eri tutkijat etsivät uusia geenejä, jotka voivat edistää leukemogenesis (ja viime aikoina transposoni-mutageneesi tutkimuksissa hematopoieettisten ja kiinteät maligniteetteja). Yhteinen sivustoja proviraalisten integraatio ovat lokuksen jotka tarjoavat valikoivan edun solut disregulating ilmentymistä solun geenejä. Kuten tukea, useimmat yleisin sivustoja proviraalisten insertion ovat todellisia onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla. Me kysyi tämän tietokannan ja totesi, että Fbxw4 geenilokus oli ainoa lokukseen 30 yleisimmin tunnistettu insertion paikkoja, joita ei ole ehdotettu rooli syövän tai ollut biokemiallisesti tunnettu. On ollut tähän mennessä 13 insertiokohdat kloonattiin sisällä koodattu Fbxw4 geenin ja insertiot on kloonattu sekä eteen- että taaksepäin suunnan (kuvio 1A). Tämä data voi ehdottaa, että proviruksen laittamista lokukseen voi johtaa menetykseen Fbxw4 funktion.

. Tutkiminen UCSC genomin selaimen (genome.ucsc.edu) ja Retroviral Tagged Cancer Gene Database (https://variation.osu.edu/rtcgd/index.html) osoittaa, että useita retrovirus- insertioita on kloonattu sisällä puhtaaksi Fbxw4 lokukseen. Nuolet osoittavat suuntautuneisuutta lisätyn proviruksen. Eksonit ilmoitetaan alareunassa ja aseman ja laajuuden hiiren kromosomin 19 näkyy päälle. Nimet annetaan kloonattuja provirus- insertiot merkitty vasemmalle. Sisäänpanokohdat alkavat ’MMT ”kloonattiin hiiren maitorauhasen kasvain viruksen aiheuttamaksi nisäkarsinoomia. Sisäänpanokohdat alkavat ’DKM ”,” 248 ”ja” B5 ”kloonattiin leukemiat mistä hiiren leukemiavirus kiihtyi hematopoieettisten syöpien. B. FBXW4 portaattomasti ilmentyy normaaleissa hiiren kudoksissa. Oligoja spesifisiä hiiren Fbxw4 käytettiin suorittamaan kvantitatiivinen RT-PCR aiheesta ”Hiiren normaalin cDNA TissueScan array”. Arvot normalisoitiin kvantitatiivinen RT-PCR varten GAPDH. C. Kaaviokuva Fbxw4 proteiinia. Numerot edustavat aminohappoja proteiinin. Domeenien sisällä Fbxw4 on merkitty.

Se, että Fbxw4 ei ole koskaan tunnettu siitä, sai meidät tutkimaan ekspression tässä lokuksessa yksityiskohtaisemmin. Ensin määritellään mitä ekspressiokuviota Fbxw4 mRNA on yli normaalin hiiren kudoksissa. Käyttäen cDNA valmistetaan eri hiirikudoksissa havaitsimme silmiinpistävä ekspressiotaso, erityisesti involuting maitorauhasen (kuvio 1 B). Tämä viittaa siihen mahdollisuuteen, että Fbxw4 ilmentyminen lisääntyy ja se voi myötävaikuttaa aikana apoptoottisen prosessin.

Fbxw4 vuorovaikutuksessa komponentteja E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla ja COP9 signalosomi

Proteiini motiivi algoritmi osoittaa, että Fbxw4 proteiini sisältää F-box domain, motiivi, joka on yleensä osallisena vuorovaikutus E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen ja viisi WD-40 motiiveja, jotka ovat tiedä proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen moduulit (kuvio 1 C). Huolimatta geneettiset tutkimukset suoritetaan Fbxw4 locus, ei ole ollut tutkimuksia tutkia biokemiallinen funktio Fbxw4. Koska ensimmäinen yritys ymmärtää mahdollisen tehtävän Fbxw4 suoritimme immunosaostus on FLAG-merkitty Fbxw4 seurasi massaspektrometrialla tunnistaa, puolueettomasti, Fbxw4 vuorovaikutuksessa proteiineja (kuvio 2A). Kaksi valvonta toimi apuna tietojen tulkintaa; immunosaostus solulysaateista ilmentävät vain FLAG-epitooppi-tag (jatk.) tai immunosaostuksella solulysaateista ilmentämään FLAG-merkitty F-box ”ainoastaan”, jotka sisältävät proteiinia (Fbxo46) suoritettiin. Näiden kokeiden arvot osoittivat, että Fbxw4, eikä valvoa, immunosaostettiin komponentteja E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla (SKP1 ja CUL1) sekä komponenttien COP9 signalosomi, kun taas sekä F-box sisältävät proteiinit vuorovaikutuksessa SKP1. Mielenkiintoista on, että yhden peptidin, joka vastaa RBX1 tunnistettiin myös FLAG-immunosaostuksella Fbxw4 ilmentävät lysaateista eikä muita lysaateista (ei esitetty) B

. Taulukko edustaa ainutkertaisten peptidien tunnistettu yhdestä edustavasta massaspektrometria koe seuraavat FLAG immunosaostuksella solulysaateista ohjaus soluja, jotka ilmentävät FLAG vain ”Contr.”, Tai soluja, jotka ilmentävät FLAG-Fbxw4 tai FLAG-Fbxo46. Sarake vasemmalla kertoo koon vuorovaikutuksessa proteiinin in kilo-daltonia (kDa). Gene nimet proteiineja, jotka sisältävät tunnistettuja peptidejä on esitetty oikeassa sarakkeessa. Komponentteja E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkaisia ​​varjostetaan vaaleanharmaa; komponentit COP9 signalosomi on varjostettu tummanharmaa. B. validointi tietojen massaspektrometria data immunosaostuksella seurasi western blot. 293 T-soluja transfektoitiin plasmideilla, jotka sisältävät FLAG- Fbxw4, FLAG-Fbxo46 tai tyhjän vektorin (v). 48 tuntia transfektion jälkeen solulysaatit valmistettiin ja immunosaostukset suoritettiin mono-klonaalisia anti-FLAG-vasta-aineita (M2) (immunosaostamaan Fbxw4- tai Fbxo46-vuorovaikutuksessa komplekseja). Western blotit suoritettiin havaitsemiseksi Fbxw4 tai Fbxo46 (FLAG rb; polyklonaalisen aineen kanssa; yläpaneeli), SKP1, COPS5 tai COPS2. C. Expression of Fbxw4 muuttaa migraation endogeenisen SKP1 geelisuodatuskromatografialla. 293 T-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (vasen paneeli) tai cplasmid, joka sisältää FLAG-Fbxw4 (oikea paneeli). 48 tuntia transfektion jälkeen solulysaatit valmistettiin ja erotettiin superpose6 geelisuodatuspylväässä. Western blotit suoritettiin joka toinen osa havaita Fbxw4 (top paneelit) tai SKP1 (alhaalla paneelit). Koska Fbxw4 SKP1 eluoituu huipun ollessa murto-osa 23, kun taas kun Fbxw4 ilmaistaan ​​on co-eluoinnin Fbxw4, jossa on piikit osa 15 ja huokostilavuuden. Koko standardit poistuvat tietyn jakeet on esitetty.

validoimiseksi tietoja massaspektrometrillä suoritimme immuunisaostuksissa seurasi western blotit spesifisten vasta tunnistettuja proteiineja. New lysaatit valmistettiin, jotka ilmensivät joko FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxo46 tai FLAG vain ohjaus (kuvio 2B). Saadut tiedot osoittavat, että sekä Fbxw4 ja Fbxo46 vuorovaikutuksessa SKP1, mutta vain Fbxw4 vuorovaikutuksessa komponenttien COP9 signalosomi.

edelleen vahvistaa havainto, että Fbxw4 voi olla vuorovaikutuksessa endogeenisten SKP1 teimme geelisuodatuskromatografia solulysaateista transfektoitu tyhjällä vecotor tai vektorin ilmentymisen FLAG-Fbxw4 (kuvio 2C). Fraktiot saatu kromatografia oli western blotattiin anti-SKP1 vasta-aine. Solut, jotka eivät ilmennä eksogeenista Fbxw4 sisältävät SKP1 joka eluoituu murto vastaa alle 67 kDa, kun taas ilmaus Fbxw4 johtaa yhteistyöhön eluoinnin SKP1 kanssa Fbxw4 kahteen uuteen komplekseja yli 200 kDa ja monimutkainen, että eluutteja . Muuttunut migraatio SKP1 kahteen uuteen jakeet, jotka myötäeluoituvat kanssa Fbxw4 tukee löytää Fbxw4 vuorovaikutuksessa komponentteja E3 ligaasin monimutkainen.

Fbxw4 vuorovaikutuksessa SKP1 ja COP9 signalosomi in F-box riippuvaisesti

Ennen määrittää tarkasti biokemiallinen funktio Fbxw4, halusimme tietää, mikä vuorovaikutusta riippui F-box domain. Tätä varten me valmistimme FBXW4 rakenteen, joka ei ole ensimmäinen 71 aminohappoa, kutsutaan Fbxw4

-fbox (kuvio 3A). Jälleen, immunosaostus ja sitä seuraava massaspektrometrialla suoritettiin solulysaateista ilmentävien FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox tai FLAG vain, määrittää, mitä proteiineja vuorovaikutuksessa vastaavat proteiinit. Ei peptidejä, jotka vastaavat komponentteja E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla tai komponenttien COP9 signalosomi tunnistettiin Fbxw4

-fbox, nämä proteiinit jälleen vuorovaikuttavat Fbxw4 (kuvio 3B). Validoida tietoja massaspektrometrillä suoritimme immuunisaostuksissa seurasi western blotit spesifisten vasta tunnistettujen Fbxw4 vuorovaikutuksessa proteiineja. Lysaatit valmistettiin jotka ilmaistaan ​​joko FLAG-FBXW4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 tai FLAG vain valvontaa. Tiedot osoittavat, että Fbxw4 ja Fbxo46, mutta ei Fbxw4

-fbox vuorovaikutteisesti SKP1 (kuvio 3C).

. Kaaviokuva Fbxw4

-fbox proteiinia. Numerot edustavat aminohappoja proteiinin. Verkkotunnukset sisällä Fbxw4

-fbox on merkitty. B. Taulukko edustaa ainutkertaisten peptidien tunnistettu yhdestä edustavasta massaspektrometrialla kokeessa seuraavat FLAG immunosaostuksella solulysaateista ohjaus soluja, jotka ilmentävät FLAG vain ”Contr.”, Tai solut, jotka ilmentävät FLAG- Fbxw4 tai FLAG- Fbxw4

-fbox. Sarake vasemmalla kertoo koon vuorovaikutuksessa proteiinin in kilo-daltonia (kDa). Gene nimet proteiineja, jotka sisältävät tunnistettuja peptidejä on esitetty oikeassa sarakkeessa. Komponentteja E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkaisia ​​varjostetaan vaaleanharmaa; komponentit COP9 signalosomi on varjostettu tummanharmaa. C. validointi tietojen massaspektrometria data immunosaostuksella seurasi western blot. 293 T-soluja transfektoitiin plasmideilla, jotka sisältävät FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 tai tyhjän vektorin (v). 48 tuntia transfektion jälkeen solulysaatit valmistettiin ja immunosaostukset suoritettiin mono-klonaalisia anti-FLAG-vasta-aineita (M2) (immunosaostamaan Fbxw4-, Fbxw4

-fbox- tai Fbxo46-vuorovaikutuksessa komplekseja). Western blotit suoritettiin havaitsemiseksi Fbxw4, Fbxw4

-fbox tai Fbxo46 (FLAG rb; polyklonaalisen aineen kanssa; yläpaneeli) tai SKP1.

FBXW4 vuorovaikutuksessa ubikitinoituja solun proteiinien

Olemme kiistattomasti osoittaneet, että Fbxw4 vuorovaikutuksessa E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen ja COP9 signalosomi. Olemme posited että Fbxw4 olisi vuorovaikutuksessa ubqiuitinated proteiineja solun sisällä. On tunnettua, että monet substraatit E3 ubikitiinipromoottori ligaasit, ubikitinaation substraatin proteiinin johtaa nopean vapautumisen monimutkainen. Siksi arveltu, että esto-proteasomin johtaisi kertyminen nämä solun proteiinien ubikitinoitu jonka Fbxw4 ligaasilla monimutkainen. Siten kertyminen ubikitinoitu proteiineista voisi puolestaan ​​johtaa rikastuminen välistä vuorovaikutusta Fbxw4 ja ubikitinoituja alustoille. Solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (v), HA-Ubiquitin, tai HA-Ubiquitin ja FLAG-Fbxw4. 36 tuntia transfektion solut käsiteltiin proteasomin estäjä, MG132, kuusi tuntia. Solu-uutteet valmistettiin ja immunosaostettiin anti-HA-vasta-ainetta ja sen jälkeen western blottauksella Fbxw4 (kuvio 4A, yläpaneeli). Lisääntynyt määrä Fbxw4 todettiin vuorovaikutuksessa ubikitinoitu proteiinien seuraavien MG132 hoitoa. Tämä Fbxw4 näytti olevan normaali molekyylipaino viittaa lisääntynyt yhdistys FBXW4 kanssa ubikitinoitu proteiineja eikä kasvua ubiquitated Fbxw4. Lisäksi lisääntynyt määrä Fbxw4 jotka immunosaostettiin anti-HA antiobody ei johtunut kasvu kokonaismäärän Fbxw4 koska ei ollut lievää laskua kokonaismäärä Fbxw4 seuraavista MG132 hoidon (kuvio 4A, alempi paneeli). Kuten edelleen tukea käsitystä, oli kasvu koko tasoilla ubikitinoituja proteiinien ja kasvu määrä ubikitinoituja proteiineja, jotka immunosaostettiin Fbxw4 seuraavat immunosaostuksella Fbxw4 samasta lysaateista seuraavat MG132 hoidon (kuvio 4A, keskimmäinen paneeli).

. Fbxw4 voidaan immunosaostettiin ubikitinoituja proteiinien ja Fbxw4 voi immunosaostaa ubikitinoituja proteiineja. 293 T-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (v), HA-Ubiquitin, tai HA-Ubiquitin ja FLAG-Fbxw4. 36 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin MG132 (+) tai jätettiin käsittelemättä (-) kuuden tunnin ajan. Solulysaatit valmistettiin ja immunosaostukset suoritettiin joko anti-HA-vasta-aineilla (ylhäällä kaksi paneelia) tai mono-klonaalisia anti-FLAG-vasta-aineita (M2) (alhaalla kaksi paneelia). Western blotit suoritettiin molempien immuunisaostuksissa anti-FLAG ja anti-HA-vasta-aineita. B. FBXW4 osakkuusyritysten solun proteiinien kanssa, jotka endogeenisesti ubikitinoitu. 293 T-soluja transfektoitiin plasmideilla, jotka sisältävät FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 tai tyhjän vektorin (v). 36 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin MG132 (+) tai jätettiin käsittelemättä (-) kuuden tunnin ajan. Solulysaatit valmistettiin ja immunosaostukset suoritettiin mono-klonaalisia anti-FLAG-vasta-aineita (M2) (immunosaostamaan Fbxw4-, Fbxw4

-fbox- tai FBXO46-vuorovaikutuksessa komplekseja). Western blotit suoritettiin havaitsemiseksi Fbxw4, Fbxw4

-fbox tai Fbxo46 (FLAG rb; polyklonaalisen aineen kanssa; yläpaneeli) tai Ubiquitin.

Halusimme tietää, onko samanlaisia ​​tuloksia saataisiin etsimässä at endogeeninen ubikitiinipromoottori, vastakohtana yliekspressoitu HA-Ubiquitin. Lisäksi halusimme selvittää aiemmin havaitut tulokset olivat riippuvaisia ​​ehjä F-box domain. Tätä varten solut transfektoitiin FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 tai FLAG ohjata vain vektori (v). Soluja joko vehikkeliä tai MG132: ssa kuusi tuntia ja solulysaatit valmistettiin. Immunosaostus anti-FLAG-vasta-aineita tehtiin ja western blotit tehtiin havaitsemiseksi endogeenisen ubikitiinipromoottori tai FLAG-merkittyjen proteiinien. Havaitsimme dramaattinen kasvu määrän ubikitiinipromoottori jotka liittyvät Fbxw4. Tämä tulos ei ollut yksinkertaisesti johtuu yli-ilmentyminen Fbxw4 koska kumpikaan Fbxw4

-fbox tai Fbxo46, joka ilmaistiin korkeammille tasoille, osoitti lisääntynyttä vuorovaikutusta ubikitinoitu proteiinien seuraavat MG132 inhiboivan vaikutuksen proteasomin. Nämä tiedot osoittavat, että ehjä F-box domain vaaditaan yhdistys Fbxw4 kanssa ubikitinoitu proteiineja eivätkä kaikki F-box sisältävät proteiinit kykenevät niin dramaattinen lisääntynyt vuorovaikutus ubikitinoituja solun proteiinien seuraavien eston proteasomin. Vaikka vuorovaikutus Fbxw4 ja solun ubikitinoituja proteiinit on riippuvainen hienotunteisuutta f-box domain enemmän työtä tarvitaan onko nämä proteiinit ovat todellisia substraatteja SCFFbxw4 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkaisia ​​tai yksinkertaisesti proteiineja, jotka ovat vuorovaikutuksessa kompleksin rakentamista vaihtoehtoisin.

FBXW4 on mutatoitunut, kadonnut ja alle ilmaistuna ihmisen syövissä

Ennen käsitellä mahdollisuutta, että FBXW4 on tärkeää ihmisen syövässä selvitimme, onko geeni mutatoitunut ihmisen syövissä. Kyselemällä saatavilla julkisia tietokantoja (Cancer Genome Atlas (TCGA) hanke ja Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer (COSMIC) Sanger Institute) huomasimme, että FBXW4 on somaattisesti mutatoitunut seitsemässä -470 kasvaimia, jotka ovat olleet järjestyksessä, toistaiseksi (Kuva 5A). Kaksi mutaatioista ovat hiljaisia ​​eivätkä johda muutoksiin aminohapposekvenssissä proteiinin, mutta kiinnostavaa, neljä missensemutaatioita (R96, G106, R145 ja R367) ovat evoluutiossa säilyneitä myöten joidenkin lajien Drosophila. Itse asiassa, R96L, G106W ja R367C ennustettiin häiritä proteiinin toiminnan hyvin suurella merkitys (p = 0,0003) käyttämällä ProPhylER algoritmia. Näiden lisäksi ennustaa haitallisia mutaatioita, lukukehyksen muutoksen mutaatio, E245fs *, havaittiin rintakarsinooma potilaalle, että johtaisi tuotannon FBXW4 proteiini, joka puuttuu kolme viimeistä WD-40 motiivia (kuvio 5A). Havainto, että somaattiset mutaatiot löydetty ihmisen syövissä ennustetaan häiritä kriittiset tekijät FBXW4 toiminto vahvistaa mahdollisuutta, että FBXW4 säännellään tärkeitä homeostaattisina prosesseja.

. FBXW4 on somaattisesti mutatoitunut ihmisen syövissä. Cancer Genome Atlas (TCGA) hanke ja Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer (COSMIC) päässä Sanger Institute tiedusteltiin somaattisten mutaatioiden FBXW4. Ja -470 kasvaimet, jotka analysoitiin mutaation FBXW4 viisi somaattiset mutaatiot havaittiin aminohapot merkitty kaavamaisesti. Mielenkiintoista, neljä yhden aminohapon, jotka ovat tavoitteita mutaatioita (R96, G106, R145 ja R367) ovat evoluutiossa säilyneitä Drosophila. R96L, G106W ja R367C ennustetaan häiritä proteiinin toiminnan (merkityksen p = 0,0003, käyttäen ProPhylER algoritmi) ja E245fs * mutaatio tuottaa proteiinia, joka ei ole viimeinen kaksi ja puoli WD-49 motiiveja. B. FBXW4 usein menetetty ihmisen syövissä. Taajuus DNA kopioluvun menetys /poisto poikki 719 ihmisen syövän solulinjoissa, jotka edustavat erilaisia ​​kudoksia peräisin Sanger Institutes Cancer Genome Project esitellään yhdessä taajuuden yksittäisissä syövän tyyppejä n ≥ 5. C. FBXW4 on ali-ilmentynyt syövän solu- linjat kopioluku menetys. Box havainnollistavat mRNA ekspressiotasot solulinjoissa menetys /poisto ja ilman menetystä /poisto kaikissa syöpäsolulinjoissa B. vastaavien geenien ilmentyminen mikrosirujen profiilit esitetään yhdessä ilmaisun neljässä yksittäisten syöpätyyppien kanssa korkein taajuus menetys /poisto (iho, rinta, keskushermosto (CNS) ja keuhkosyöpä). Ekspressiotasoja verrattiin ryhmien välillä käyttämällä Mann-Whitneyn U-testi ja p 0,01 katsottiin merkitseväksi. Viikset ovat 10-90 prosentit pisteillä näyttämällä vieraat havainnot. D. FBXW4 katoaa ja alle ilmaistu kliinisessä keuhkoadenokarsinooma kasvaimia TCGA projekti.