PLoS ONE: Next-Generation Sequencing keuhkosyöpään EGFR eksonit 18-21 mahdollistaa tehokkaan Molecular Diagnosis of Small rutiininäytteitä (Sytologia ja Biopsia)
tiivistelmä
Valikoima keuhkosyöpää potilaiden hoidon tyrosiinikinaasiestäjiksi suunnattu EGFR edellyttää määritysohjelman
EGFR
mutaatioita. Useimmilla potilailla, joilla on edennyt, käyttökelvottoman keuhkosyöpä rajoitettu kasvain näytteet edustavat usein ainoa materiaali saatavilla sekä histologisen kirjoittamista ja molekyylitason analyysi. Me määritelty seuraavan sukupolven sekvensointi protokolla suunnattu
EGFR
eksonien 18-21 sopiva rutiini diagnoosi tällaisten kliinisistä näytteistä. Pöytäkirja validoitu valitsematon sarjassa 80 pieniä koepaloja (n = 14) ja sytologia (n = 66) edustavista näytteistä materiaalin tavallisesti toimitettu diagnostinen arviointi kolmen asian lääkäriasemilla Italiassa. Näytteet arvioidaan järjestelmällisesti kasvainsolujen lukumäärä ja osuus suhteessa ei-neoplastisia soluja. Ne analysoitiin erissä 100-150 amplikonien ajoa kohti saavuttaen analyyttinen herkkyys 1% ja saadaan riittävä määrä lukee, kattamaan kaikki eksonit kaikki näytteet analysoitiin. Seuraavan sukupolven sekvensointi verrattiin Sangerin sekvensoinnilla. Jälkimmäinen tunnistaa 15
EGFR
mutaatioita 14/80 tapauksessa (17,5%), mutta ei havaita mutaatioita, kun osuus neoplastiset solut oli alle 40%. Seuraavan sukupolven sekvensointi tunnistaa 31
EGFR
mutaatioita 24/80 tapauksessa (30,0%). Mutaatioita havaittiin suhteessa kasvainsolujen niinkin alhainen kuin 5%. Kaikki mutaatiot tunnistetaan Sangerin menetelmällä vahvistettiin. 6 tapauksessa seuraavan sukupolven sekvensointi tunnistaa eksonin 19 deleetioita tai L858R-mutaation ole nähnyt jälkeen Sangerin sekvensoinnilla, jolloin potilas tulee käsitellä tyrosiinikinaasin estäjiä. Yhdessä ylimääräinen tapauksessa R831H mutaatio hoitoon liittyvät vastus tunnistettiin käytettäessä
EGFR
villityypin kasvain jälkeen Sangerin sekvensoinnilla. Seuraavan sukupolven sekvensointi on kestävä, kustannustehokas ja parantaa huomattavasti havaitsemiseen
EGFR
mutaatioita. Sen käyttöä olisi edistettävä kliinisen diagnoosin mutaatioiden yksilöiden kanssa epäsuotuisa kasvainsolujen sisältöä.
Citation: de Biase D, Visani M, Malapelle U, Simonato F, Cesari V Bellevicine C, et al. (2013) seuraavan sukupolven sekvensointi keuhkosyöpään
EGFR
eksonit 18-21 mahdollistaa tehokkaan Molecular Diagnosis of Small rutiininäytteitä (Sytologia ja Biopsia). PLoS ONE 8 (12): e83607. doi: 10,1371 /journal.pone.0083607
Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University, Taiwan
vastaanotettu: 18 elokuu 2013; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2013 Julkaistu: 23 joulukuu 2013
Copyright: © 2013 de Biase et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Kirjoittajat vahvistavat, että tämä tutkimus tukee Italian hallituksen MURST avustus (Grant no. 20093XZC57_003) GT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
keuhkosyöpä usein esittelee jo pitkällä ja on johtava syy syövän liittyvän kuoleman kehittyneissä maissa (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). Löytö vuonna 2004, että aktivoivat somaattiset mutaatiot tyrosiinikinaasin
EGFR
geeni tehdä kasvain herkkiä tyrosiinikinaasiestäjät (TKI) käsittely on edustanut yksi merkittävä läpimurto alalla molekyyli onkologian viime vuosikymmenellä [1,2]. Satunnaistetussa kliinisessä tutkimuksessa on osoitettu, potilas vastauksia TKI Erlotinibi (Tarceva, OSI Pharmaceutical) tai Gefitinibi (IRESSA, Astrazeneca) ensilinjan hoitoon noin kahdella kolmasosalla potilaista, joilla
EGFR
mutatoitunut kasvaimista hinnat paljon parempi joita saadaan tavanomaisilla platinapohjaisen kemoterapian [3-9].
EGFR
mutaatiot ovat ”kriittisiä” biomarkkerit asianmukaisesti valita potilaita TKI hoitoa, ja ohjeet molekyylitason diagnoosin on linjattu toimialajärjestöt sekä Euroopassa että Yhdysvalloissa [10, 11]. Useimmat – 80-90% – ja
EGFR
mutaatiot ovat joko pieniä eksoni 19 deleetioita tai L858R eksonissa 21, mutta muut TKI herkkä
EGFR
mutaatiot voivat esiintyä eksonit 12, 19 , 20, 21. Mutaatiot liittyvä TKI vastarintaa, kuten T790M eksonissa 20, voivat myös kehittää pienissä kasvainsolun sublclones ja on tunnistettava [1,2,8,12-23].
EGFR
mutatoitunut kasvaimet ovat tyypillisesti adenokarsinoomat, jossa mutaatiot voidaan tunnistaa noin neljännes tapauksista, ja suurempi osuus kasvainten Aasian potilaista.
adenokarsinooman pidetään nykyään yleisin keuhkosyövän alatyyppiä, jotka muodostavat noin 40% kaikista ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC) [24] ja molekyylitason analyysi
EGFR
eksonit 18, 19, 20, 21 suositellaan kaikissa adenokarsinooma tai keuhkokasvaimia kanssa adenokarsinooma komponentti [10]. Siten patologista arviointiin keuhkosyöpä nyt vaatii sekä tarkkaa alatyypitys histologiset ja immunohistokemiallisella tutkimuksia sekä määritettäessä
EGFR
mutaatiostatuksesta riippumatta valita potilaita TKI hoitoa. Tämä perusteellinen arviointi edellyttää luonnollisesti riittävä määrä kasvainkudoksen hyvälaatuista, kuten ne on saatu keuhkojen asemointia [25].
Valitettavasti 60% NSCLC ovat korkeat vaiheessa paikallisesti levinnyt ja /tai toimintakyvyttömäksi kasvaimia, jotka ovat jo etäpesäkkeitä kaukaisiin sivustoja, kun he havaitaan (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). Siten potilailla, joilla on tällaisia kasvaimia hyvin rajallinen näytteet – pieni koepaloja tai sytologia yksilöt – ovat yleensä vain aineiston histologista kirjoittamalla ja molekyylitason analyysi [26]. Näiden näytteiden kysymys näytteen puhtauden eli osuuden leesion materiaalin ”kontaminoivien” hyvänlaatuinen tai leesiotonta soluissa on usein kriittinen [27,28]. Sanger-sekvensoinnilla, yleisimmin käytetty menetelmä mutaation havaitsemiseksi ei ole tarpeeksi analyyttisen herkkyyden luotettavasti mutaatioiden tunnistamiseksi näytteissä, joissa on pieni osuus kasvainsolujen. Se voi antaa vääriä negatiivisia tuloksia, jos prosenttiosuus neoplastisten solujen on alle yleinen kynnys 50%, joka vastaa 25%: mutatoituja alleeleja, olettaen, että mutaatio on heterotsygoottinen ja että
EGFR
kromosomikeskukseen 7p12 on dysomic [29 ]. Siksi vaihtoehtoisia menetelmiä – kullakin on omat etunsa ja haittansa – on ehdotettu havaitsemaan
EGFR
mutaatioita, jonka tavoitteena on saavuttaa suurempi herkkyys. Monet tällä hetkellä käytetään molekyylitason analyysi rutiininäytteitä [30]. Näitä ovat High Resolution Sulamispiste (HRM) [31], Restriction Fragment Length (RFLP) [32], mutantti alleeli-spesifinen PCR: llä [33], Peptide Nucleic Acid Lukittu PCR kiristysruuvi (PNA-PCR) [34,35], pyrosequencying [36], ja immunohistokemia erityisiä EGFR vasta-aineiden havaitsemiseksi L858R mutaatio ja eksonin 19 deleetio [37,38]. Jotkut mutaatio-erityisiä menetelmiä, kuten Scorpion ARMS (TheraScreen EGFR29 mutaatio sarjat QIAGEN Manchester [entinen dxs], Manchester, Englanti) [39] erittäin suuren herkkyyden (~ 1%), mutta aliarvioivat ole ennalta suunniteltu mutaatioita ja vaativat melko merkittävän määrän DNA, ei aina saatavilla rajoitetusti näytteissä [40,41].
kehitys seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) menetelmät – tunnetaan myös massiivinen rinnakkaissekvensointijärjestelmät koska ne mahdollistavat rinnakkaista analyysia erittäin suuri määrä DNA-molekyylejä – on edustanut yksi enemmän merkittäviä teknisiä edistysaskeleita molekyylibiologian [42]. Nämä menetelmät ovat saatavilla vuodesta 2005 ja tuottavat merkittäviä läpimurtoja onkologian määrittely mukaan luettuna koko DNA-sekvenssin yleisimpiä ihmisen syövissä [43].
Tämä on multisentrinen tutkimus arvioimaan soveltamista NGS mole- diagnoosin
EGFR
mutaatioiden rajoitettu näytteitä NSCLC, pienten koepaloja ja sytologia yksilöitä. Sijasta analysoidaan muutamia tapauksia varten useita geenejä, päätimme kohdistaa rinnakkaissekvensointijärjestelmät kuin
EGFR
mutaatio ”hot spot”. Painopiste oli
EGFR
analyysin, koska, kuten edellä mainittiin,
EGFR
mutaatioita joudutaan usein tunnistettu DNA: ta yksilöitä, jotka ovat molemmat ongelmallisia molekyylitason diagnoosin ja samalla ovat hyvin ratkaiseva päättää potilaan hoitoa. NGS sekvensointi tuloksia verrattiin Sangerin sekvensoinnin menetelmä nykyisin käytössä rutiini molekyylitason analyysi kolmen italialaisen kumppanin keskuksissa Bologna, Padova ja Napoli, jotka osallistuivat tutkimukseen.
perusteltu, että huolimatta sen suurempi monimutkaisuus verrattuna Sangerin sekvensoinnin (tai muilla vaihtoehtoisilla menetelmillä) NGS tarjoaa useita etuja – korkea analyyttisen herkkyyden, seulonta koko nukleotidisekvenssi kohdealueen, semikvantitatiivinen arviointi mutatoidun alleelin, analysointi monia näytteitä yhdellä ajolla (korkea suoritusteho) – jotka tekevät siitä ihanteellisen tutkimuksen keuhkosyöpä. Tuloksemme osoittavat, että NGS voidaan soveltaa tehokkaasti tarpeisiin rutiini DNA-analyysi, ja että se edustaa käytännössä vaihtoehto muille nykyisin käytössä havaitsemiseksi
EGFR
mutaatioita.
Materiaalit ja menetelmät
Ethics lausunto
Koska
EGFR
mutaatioanalyysiin on osa rutiinidiagnoosimenetelmää workup sairastavien potilaiden NSCLC tarvetta etiikan valiokunnan hyväksyntää ei ollut tarpeen tämän tutkimuksen mukaisesti lääketieteellisen eettiset ohjeet on Azienda Unità sanitaria locale di Bologna, Azienda Universitaria Policlinicon Università degli Studi di Napoli Federico II, Azienda Universitaria Policlinicon Università degli Studi di Padova ja mukaisesti yleisvaltuutukseen käsitellä henkilötietoja tieteellisiin tarkoituksiin ”The Italian tietosuojaviranomainen ”(https://www.garanteprivacy.it/web/guest/home/docweb/-/docweb-display/export/2485392). Niinpä näiden ohjeiden, kattavan kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen allekirjoitettiin menettelyjä (hieno neula pyrkimys, koepaloja ja kirurginen asemointia), joka tuotti kudosnäytteitä ja niiden diagnostista workup. Kaikki tiedot ihmisen materiaali hallitaan anonyymi numeerisia koodeja. Kliiniset tiedot ja seurata tietoja ei käytetty tässä tutkimuksessa. Kaikki näytteet käsitellään noudattaen Helsingin julistuksen (https://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/).
Case valikoima ja kokoelma kasvaimen materiaalin molekyylien analyysi
Kahdeksankymmentä näytteitä NSCLC valittiin satunnaisesti potilailla, jotka tehtiin diagnostinen workup klo osiin anatominen patologian että Bellaria sairaalan-Bolognan yliopisto ja Maggiore Hospital Bolognassa ja yliopistollisen sairaalan Napolin ja Padova. Kaikilla potilailla oli kliininen indikaatio
EGFR
mutaatio testaus kehittynyt keuhkosyöpä. Kasvainsolut molekyylitason analyysi saatiin sytologia diat 66 tapauksissa ja formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotetut (FFPE) kudosleikkeiden 14 biopsianäytteistä. Sekä sytologian ja kudosnäytteistä rutiininomaisesti käsitelty ja diagnooseja sulatettu standardin kriteerit.
Kaikki tapaukset käsiteltiin DNA: n eristämisessä jälkeen patologisen tarkastelu varmisti läsnäolo ainakin sata kasvainsoluja. Osuus kasvainsolujen /Solujen kokonaismäärä (eli kasvainsolujen rikastettu) arvioitiin kaikissa tapauksissa. Kokonaismäärä neoplastisten solujen näytteessä läsnä käsitellään molekyylitason analyysi arvioitiin myös. Se arvioitiin seuraavasti: Tietyssä erässä neoplastisia solut laskettiin viisi yhden neliömillimetrin kentät (1 mm
2) ja keskimääräinen näistä arvoista lasketaan; keskimääräinen kerrottiin, että kokonaispinta-ala (mm) näytteen – sytologisesta preparaatti tai histologian osa koepala – valittu molekyyli analyysiä.
sytologian näytteet solut raaputettiin piiriin valittu analyysiin kun kansi-slip poistaminen upottamalla luistin ksyleeniin. Sillä FFPE materiaali, kuusi 10 um leikkeet leikattiin kustakin valitun lohkon, jota seuraa yksi hematoksyliinillä ja eosiini tahra (H Life Technologies) ja ajettiin ABI 3730 analysaattori (Life Technologies) Napoli yliopistollisessa sairaalassa ja Padova yliopistollisessa sairaalassa.
EGFR
Exon
Sanger-sekvensoinnilla 5′-3 ’
NGS 5′-3′
Pituus (bp) B Ex18 FwCATgTCTggCACTgCTTTCCggCTgAggTgACCCTTgTC184Ex18 RvAgggACCTTACCTTATACACCgCCTgTgCCAgggACCTTACEx19 FwAgCATgTggCACCATCTCACAgCATgTggCACCATCTCAC182Ex19 RvATgAgAAAAggTgggCCTgACCCACACAgCAAAgCAgAAAEx20 FwAgCCACACTgACgTgCCTCTAgCCACACTgACgTgCCTCT208Ex20 RvCCTTATCTCCCCTCCCCgTATgCACACACCAgTTgAgCAgEx21 FwTgCAgAgCTTCTTCCCATgACCTCACAgCAgggTCTTCTC196Ex21 RvgCATgTgTTAAACAATACAgCCCACCTCCTTACTTTgCCTCCTTable 1. käytetyt alukkeet monistamiseen EGFR eksonien 18-21.
pohjustajat 454 seuraavan sukupolven sekvensointi liittyvät sekvenssin 10 nukleotidin (MID – Multiple Identifier), 4 nukleotidin ”liittymä” ja 25 nukleotidin of ” universaali sekvenssi ”, mukaisesti valmistajan ohjeiden (ei esitetty taulukossa). Ex, Exon; Fw, Forward; Rv, Käänteinen. CSV Lataa CSV
454: Next Generation Sequencing.
sekvenssianalyysi
EGFR
eksonin 18, 19, 20 ja 21 suoritettiin 454 GS-Junior Next Generation sekvensseri (Roche Diagnostics , Mannheim, Saksa), vakiintuneita protokollia (https://www.454.com/).
Lyhyesti näihin kuuluvat seuraavat vaiheet: PCR-monistus kohdesekvenssin, puhdistus monistetut fragmentit, emulsion PCR, ja talteenotto emulsion PCR-tuotteita, jotka sitten ladataan Titanium PicoTiterPlate (Roche Diagnostics) ja 454 GS Junior väline massiivisesti rinnakkaisen pyrosekvensointi. Alukkeet alkuperäisen vahvistus ajaa modifioidaan universaali hännän sekvenssit ja useita tunnisteita (MID) nukleotidin (Integrated DNA Technologies Inc, www.idtdna.com). Erityinen Pari MID sekvenssit tunnistaa yksiselitteisesti kunkin näytteen (kohdesekvenssi).
EGFR
mutaatio analyysi määrittelimme seuraavat työnkulun muodossa, käyttäen alukkeita esitetään taulukossa 1 analysoida eksonit 18- 19-20-21. Noin 10 ng genomista DNA: ta monistettiin kunkin eksonin. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen FastStart High Fidelity Taq -polymeraasia (Roche Diagnostic, Mannheim, Saksa). Kussakin sekvensointi aikavälillä 100-120 eri kohdesekvenssien analysoitiin rinnakkain pyrosekvensointi. Tämä antoi meille mahdollisuuden tutkia 25-30 tapausta ajaa, koska kaikki neljä
EGFR
eksonit arvioitiin kaikilla potilailla, joiden otaksuttu määrä noin 700 lukee per kohde, mukaan valmistajien tietojen mukaan (http: //www.454.com/).
Kun otetaan huomioon, että jokainen kohdesekvenssin – eksonin ja potilaan erityinen – on yksiselitteisesti siitä erityinen pari MID, vähintään 5 eteenpäin alukkeiden ja ainakin 6 alukkeilla taaksepäin ainutlaatuisia MID olivat tutkittava 30 tapausta samassa ajossa (tai päinvastoin ainakin 6 eteenpäin alukkeiden ja ainakin 5 käänteinen niistä). Käytimme grid järjestelmiä kohden
EGFR
eksoni tunnistamaan ainutlaatuinen yhdistyksen välillä MID parit ja erityisiä kohdesekvenssien (katso kuva 1). Sekä myötä- lohkon sekvenssit ( ”lukee”) arvioitiin jälkeen rinnakkain vahvistus kohde-DNA. Saadut sekvenssit analysoitiin käyttämällä Amplicon Variant Analyzer (AVA) Software (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Vain nukleotidin havaittuja muutoksia molemmat juosteet katsottiin mutaatioanalyysiä puhelun. Epäselvä pohja puhelut liittyvät osuuksilla homopolymeerin 4 emäsparin tai kauemmin ei ole katsottu mutatoitunut johtuen rajoituksista pyrosekvensointi kemian, jota käytetään 454 NGS sekvenssianalyysiin [47,48].
Jotta tietyssä 454 seuraavan sukupolven sekvensoinnin ajaa tietyn kohdesekvenssin liittyy ainutlaatuinen pari MID käytimme verkkoon järjestelmiä; MID paria EGFR eksonissa 18 havainnollistetaan; roomalaiset numerot osoittavat potilaan näytteitä. Ex, Exon; Fw, Forward; Rv, Käänteinen.
Analyyttinen herkkyys.
Analyyttinen herkkyys meidän 454 sekvensointi työnkulun muotoa
EGFR
mutaatioanalyysiin testattiin sarjalaimentamalla (1: 1 , 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) DNA poolista näytteiden kätkeminen homotsygoottinen nukleotidin polymorfismi G A olevat 2470 asemaan
EGFR
sekvenssi (c2470 G , CAG CAA, Q787Q eksoni 20) pooliin näytteitä, jotka eivät harbor nukleotidisubstituutiosta (c2470, CAG). Kukin analyysi toistettiin vähintään kahdesti.
Vähäinen määrä panos DNA analyyttisen kynnysarvoa.
Syöte DNA analyyttisen kynnysarvo tehtiin laimennossarja H
2O määrittää minimaalinen määrä DNA välttämättömiä mutaation havaitsemiseen.
454: Next Generation Sequencing toistettavuus.
Inter-määritys toistettavuus (eli tulosten johdonmukaisuus kanssa samaa protokollaa eri ajoissa) määritettiin toistamalla sekvenssianalyysi 20 DNA-näytteitä, jotka oli aiemmin tunnettu niiden
EGFR
mutaatiostatuksesta tila (11 villityypin tapauksissa ja 9
EGFR
mutatoitunut niistä – 7, jossa on deleetio eksonista 19, joista L858R ja yksi kanssa T790M mutaatioita).
Tulokset
Suorituskyky 454 Next Generation Sequencing protokolla
Analyyttinen herkkyys ja määritelmä kynnys mutaatioanalyysiä puhelun.
Analyyttinen herkkyys 454 NGS riippuu kokonaismäärästä lukee, että voidaan saada annetun näytteen. Sen jälkeen meidän 454 sekvensointi muodossa protokolla, joka kohdentuu otaksuttu määrä noin 700 lukee per amplikonin, testasimme järjestysnumero (1: 1, 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) laimennus DNA c 0,2470 G nukleotidi substituutio 2470 polymorfisen paikalle
EGFR
geenisekvenssin poolissa ihmisen DNA ilman vaihdosta (c.2470 G).
c.2470 G Korvaushoidon johdonmukaisesti havaittu alas 1: 100 laimennus vain, jos vähintään 10 konsensukseen c.2470 G nukleotidisekvenssi lukee jälkeen saatiin rinnakkain 454 sekvensointi. Tämä havainto on esitetty kuviossa 2. 1: 100 laimennos c.2470 G DNA-nukleotidisekvenssi, substituutio ei havaittu, kun kokonaismäärä lukee oli 2359, mikä vastaa 23 yhteisymmärrykseen c.2470 G sekvensseissä (kuvio 2D ). Se ei havaittu, kun kokonaismäärä lukee oli 750, joka olisi vastannut 7 yhteisymmärrykseen c.2470 G sekvensseissä (kuvio 2E). C.2470 G Korvaushoidon ei myöskään havaittu 1: 1000 laimennus, vaikka kokonaismäärä lukee analysoitu oli erittäin korkea (välillä 3000 ja 4000), mutta ei riitä saavuttamaan 10 c.2470 G lukee jotka olisivat edellyttäneet yhteensä 10.000 lukee kohti amplikoni (kuvio 2F).
AF) polymorfisen c.2470 G Korvaushoidon havaittiin jäljempänä mainittujen pitoisuuksien DNA ei kanna polymorfismin: 1: 1 ( A), 1: 2 (B), 01:10 (C), 1: 100 (D), mutta ei 1: 1000 (F). 1: 100 laimennoksesta c.2470 G Korvaushoidon havaittiin, kun kokonaismäärä lukee sallittu havaita vähintään 10 lukee kanssa c.2470 G muutos (tämä tarkoittaa vähintään 1000 yhteensä lukee) (D). C.2470 G Korvaushoidon ei havaittu, kun kokonaismäärä lukee ollut riittävä havaitsemaan vähintään 10 lukee kanssa c.2470 G muutos (E).
Perustuen näiden havaintojen loimme kriteerinä määrittämään näytteen mutatoitunut tunnistamista mutaation vähintään 10 lukee (i)
ja
vähintään 1% kokonaismäärästä lukee analysoitu (ii). Vaatimus 10 konsensukseen lukee tekee kriteerit mutaatioprosessiin puhelun tiukempia näytteille, jotka tuottavat kokonaismäärä lukee odotettua pienempi, mikä varmistaa spesifisyyden tuloksia.
Vähäinen määrä panos DNA analyyttinen kynnysarvoa.
määrän DNA: han, havaitsemiseksi c.2470 G DNA klo analyyttisen herkkyyden kynnystä 1% (1: 100 c.2470 G DNA laimennus) oli jaksoittain pieneni alkaen 10 ng , määrittää minimaalinen tulo DNA tarpeen havaita nukleotidin vaihdon. Minimaalinen 2 ng DNA: ta oli riittävä johdonmukaisesti saada monistettavissa DNA ja havaita c.2470 G vaihdon. Ottaen huomioon, että kukin ihmisen diploidi solu sisältää 7 pg DNA: ta, 2 ng 1: 100 laimennos c.2470 G DNA in c.2470_G DNA vastaavat havaitsemiseen noin 4 mutatoituja soluja yhteensä 200 solua ilman mutaatio, olettaen, että mutaatio on heterotsygoottinen ja
EGFR
dysomic.
toistettavuus.
arvioimiseksi toistettavuus 454 rinnakkaissekvensointijärjestelmät käytimme 20 DNA-näytteiden aiemmin ominaista niiden
EGFR
mutaatiostatuksesta tila: 11 oli
EGFR
villityypin, 7 oli eksonin 19 deleetio ja yksi kutakin oli L858R-eksoni 21 mutaatio ja T790M-eksoni 20 mutaatio. Kukin näyte toistettiin kahdesti 454 NGS ja kaikissa tapauksissa mutaatiostatuksesta riippumatta vahvistettiin. Näytteissä, jotka tunsivat
EGFR
mutaatioita prosenttiosuus mutatoitunut lukee vaihteli keskimäärin 2,6% (mediaani vaihtelu 1,45%, alue 0. 6% – 8,6%).
Patologiset diagnoosi ja mikroskooppinen arviointi kasvain cellularity ei-pienisoluisen keuhkosyövän näytteitä
Kahdeksankymmentä tapausta tutkittiin. Patologiset diagnoosit on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Viisikymmentäkuusi 80 tapausta olivat ensisijainen keuhkovaurioita diagnosoitu adenokarsinooma (n = 33) tai ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ei muuten määritelty (NOS) (n = 23). Kaksikymmentäkaksi näytteet olivat kasvainetäispesäkkeiden: 18 imusolmukkeet, 2 keuhkosairaudet, ja 2 luuhun. Kaksi näytettä oli sytologia valmisteiden pleuraeffuusio.
Biopsianäytteissä
Diagnosis
lukumäärä kasvainsolujen
Kasvainsolulinja rikastamiseen
N = 1414 Adenocarcinoma848-42,504 (mediaani: 11828) 15-80% (mediaani: 60,0%)
9 Ensisijainen
5Metastasis (LN 3, Bone 2) b sytologia SamplesDiagnosisNumber kasvainsolujen
b
Kasvainsolulinja enrichmentN = 66190-730,000 (mediaani: 11200) 5-80% (mediaani: 42,5%) 38 Adenocarcinoma952-228,150 (mediaani: 3956) 10-80% (mediaani: 32,5%)
24Primary
12Metastasis (LN 10, Pleura 2) B
2 pleuraeffuusio
28 NSCLC190-730,000 (mediaani: 18000) 5-80% (mediaani: 50,0%)
23Primary
5 etäpesäke (LN 5) b Yhteensä SamplesDiagnosisNumber kasvainsolujen
,
b
Kasvainsolulinja enrichmentN = 80190-730,000 (mediaani: 17400) 5 -80% (mediaani: 50,0%) 52 Adenocarcinoma848-228,150 (mediaani: 5000) 10-80% (mediaani: 45,0%)
33 Ensisijainen
17Metastasis (LN 13, Pleura 2, Bone 2)
2 pleuraeffuusio
28 NSCLC190-730,000 (mediaani: 18000) 5-80% (mediaani: 50,0%)
23Primary
5 etäpesäke (LN 5) B Taulukko 2. kliinis tiedot analysoiduista näytteistä.
määrä neoplastisten solujen arvioitiin kaikkiaan 14 biopsianäytteissä;
b
määrä neoplastisten solujen arvioitiin 39 66 sytologia näytteitä; kvantitatiivinen arviointi osuus kasvainsolujen tehtiin kaikissa 80 tapauksessa. LN, imusolmukemääritysmenetelmä; NSCLC, Non pienisoluinen keuhkosyöpä. CSV Lataa CSV
arvioinnin tulokset kasvaimen soluihin on esitetty taulukossa 2 ja kuviossa 3. osuus kasvainsolujen /Solujen kokonaismäärä (eli kasvainsolujen rikastettu) arvioitiin kaikissa tapauksissa. Prosenttiosuudet neoplastiset solut vaihtelivat 5-80% (keskiarvo 45,2%, mediaani 50,0%). 35 näytettä osuus neoplastiset solut oli alle 40%. Puolessa tapauksista osuus neoplastiset solut oli alle 50%. Kokonaismäärä neoplastisten solujen näytteessä toimitettiin
EGFR
mutaatioanalyysiin arvioitiin 53 tapauksessa. Se vaihteli 190 ja 730.000 (keskiarvo 68147, mediaani 17400). Numeerinen arvio kasvainsolun rikastamiseen ja kokonaismäärästä neoplastisten solujen analysoitiin
EGFR
mutaatio oli saatavilla kaikissa mutta kahdessa tapauksessa, joissa poikkeavien tulosten välillä Sanger ja seuraavan sukupolven sekvensoinnin (katso jäljempänä).
A) sytologia näyte 72-vuotias nainen adenokarsinooma metastaattinen on välikarsinan imusolmuke (toukokuu Grumwald Giemsa, 200X suurennos, aseta 600X); osuus neoplastisten solujen näytteessä on 35%; DNA-analyysi oli villityypin jälkeen Sangerin sekvensoinnilla, mutta NGS osoitti kaksi
EGFR
mutaatioita (G721W, R831H) (tapaus 57 taulukko 5). B) Ohutsuolikoepala alkaen 65 vuotta vanha mies adenokarsinooma metastaattinen luun (nikaman runko) (hematoksyliinillä ja eosiini, 200X suurennos, aseta 600X); osuus neoplastisten solujen näytteessä on 5%; DNA-analyysi oli villityypin jälkeen Sangerin sekvensoinnilla, mutta NGS osoitti L858R
EGFR
mutaatio (tapaus 80 taulukko 5).
EGFR mutaatiostatuksesta riippumatta
Sangerin sekvensoinnilla .
tulokset Sangerin sekvensointia esitetään yhteenveto taulukoissa 3, 4 ja 5, ja kuvioissa 4 ja 5. Mutaatiot havaittiin 14 80 tapauksessa (17,5%) käyttäen Sanger-sekvensoinnilla. Yhteensä 15 mutaatiota tunnistettiin: 10 oli eksonin 19 deleetion 3 olivat L858R (eksoni 21), yksi oli G719A (eksoni 18), ja yksi oli T790M mutaatio (eksoni 20). Yhdessä tapauksessa oli kaksinkertainen T790M ja L858R mutaatio. Mutaatiot löydettiin 9 52 (17,3%) tapauksista diagnosoitu adenokarsinooma ja 5 28 (17,8%) sytologia näytteistä, jotka voivat olla kauempana aliluokitusta ja diagnosoitiin NSCLC. Ne löytyivät 3 14 (21,4%) kudosnäytteistä ja 11 66 (16,7%) sytologia näytteistä Sangerin sekvensoinnilla havaitaan mutaatioita laajalla neoplastisten solujen määrä. Yksi eksonin 19 deleetio (del L747-A752) tunnistettiin yksilö, jolla on pienin määrä neoplastisten solujen meidän sarjassa (190 neoplastiset solut). Kuitenkin kaikissa tapauksissa, joissa Sangerin sekvensoinnilla havaittu
EGFR
mutaatioita osuus neoplastisten solujen näytteessä oli 40% (taulukko 3, kuviot 4 ja 5).
Biopsianäyttei-
lukumäärä mutatoitunut tapausten
Yhteensä Mutaatiot havaittu
Mutaatiot havaittu näytteissä, joissa 40% kasvainsolujen
Mutaatiot havaittu näytteissä 40% kasvainsolujen
Sangerin (%)
NGS (%)
Sanger
NGS
Sanger
NGS
Sanger
NGS
N=14 3 (21,4)
6 (42,9)
b
494
8
b
01
Del Ex19
2
2
2
2
2
2
0
0
L858R
1
2
1
2
1
1
0
1
Other muts.
1
5
1
5
1
5
0
0
sytologia SamplesNumber mutatoitujen casesTotal Mutaatiot observedMutations näytteissä havaitaan kanssa 40% neoplastisten cellsMutations näytteissä havaitaan 40% kasvainsolujen
Sangerin (%) B
NGS (%) B
Sanger
NGS
Sanger
NGS
Sanger
NGS
N = 6611 (16,7) 18 (27,3)
c
11221114
c
08
d
Del Ex19
8
12
8
12
8
9
0
3
L858R
3
3
3
3
3
3
0
0
Others muts.
0
7
0
7
0
2
0
5
Kaikki SamplesNumber mutatoitujen casesTotal Mutaatiot observedMutations näytteissä havaitaan kanssa 40% neoplastisten cellsMutations näytteissä havaitaan 40% kasvainsolujen
Sangerin (%) B
NGS (%) B
Sanger
NGS
Sanger
NGS
Sanger
NGS
N = 8014 (17,5)
24 (30,0)
d
153115
22
c
09
b
Taulukko 3. EGFR mutaatioanalyysiin käyttäen Sanger ja Next Generation sekvensointi.
Eräässä tapauksessa kaksinkertainen mutaatioita havaittiin;
b
kahdessa tapauksessa kahden /useita mutaatioita havaittiin;
c
neljässä tapauksessa kaksinkertainen /useita mutaatioita havaittiin;
d
kuudessa tapauksessa kaksinkertainen /useita mutaatioita havaittiin. NGS, Next Generation Sequencing; Del EX19, deleetion eksonissa 19; Muut MutS, mutaatioiden muut kuin eksonin 19 deleetio tai L858R. CSV Lataa CSV
SANGER
tyyppi mutationExNum tapauksissa
Arvioitu rooli TKI treatmentReferencesG719A181Response [1,2,15,17] Exon 19 deletions1910Response [1,2,8,13,15-17] L858R213Response [1,14-16] T790M201Resistance [19-21] NGSType of mutationExNum tapauksissa
b
Arvioitu rooli TKI treatmentReferencesG719A181Response [1,2 , 15,17] eksoni 19 deletions1914Response [1,2,8,13,15-17] L858R215Response [1,14-16] P772S201Response (Otaksuttavat) [18] T790M201Resistance [19-21] R831H211Resistance [22] F795S201Undefined (raportoitu SCC, okasolusyöpä;