Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Metylointi aiheuttama vaiennettu

PRSS3

on ollut osoitettu olevan merkitsevästi yhteydessä invasiivisen virtsarakon syöpä, ja ilmaus

C16orf74

geenilokus on osoitettu korreloivan positiivisesti

PRSS3.

tavoitteena olevassa tutkimuksessa oli arvioida suhdetta

C16orf74

ekspressiotaso ja etenemistä ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC).

Materiaalit ja menetelmät

C16orf74

mRNA tutkittiin real -Time RT-PCR (RT-PCR) analyysi 193 kasvain näytteitä primaarisessa NMIBC. Expression analysoitiin kliinisistä ja koeparametreihin. Kaplan-Meier käyrät ja Coxin monimuuttuja regressiomallien vastaavasti määrittämiseen käytettiin ilman taudin etenemistä ja tunnistaa riippumattomia ennustusparametrit etenemisen.

Tulokset

analyysi käyttäen Kaplan-Meier -käyrät paljasti pitkittyneen ilman taudin etenemistä korkea-

C16orf74

-expressors verrattuna matalan ilmentäjät (p 0,001). Coxin monimuuttuja regressio-analyysi paljasti, että alhainen

C16orf74

mRNA ekspressiotasot ovat merkittävä riskitekijä taudin etenemistä potilailla, joilla on primaarinen NMIBC (HR: 10,042, CI: +2,699-37,360, p = 0,001).

Johtopäätökset

Vähentynyt ilmentyminen

C16orf74

korreloi merkittävästi etenemisen ensisijainen NMIBC.

C16orf74

ilmentymistaso on potentiaalisesti käyttökelpoinen markkeri ennustamaan etenemisen ensisijainen NMIBC potilailla.

Citation: Kim WT, Yun SJ, Park C, Kim IY, Moon SK, Kwon TG, et al . (2010) tunnistaminen

C16orf74

markkerina Progression in Primary Non-Muscle Invasiivinen virtsarakon syövän. PLoS ONE 5 (12): e15260. doi: 10,1371 /journal.pone.0015260

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 elokuu 2010; Hyväksytty: 02 marraskuu 2010; Julkaistu: 21 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, Science and Technology (2010-0001730). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yli 90% virtsarakon syöpiä ovat siirtymäkauden solukarsinoomat, ja useimmat ovat papillaarinen, hyvin tai kohtalaisen eriytetty ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC) [1] – [2]. Jälkeen endoskooppinen resektio, syövän uusiutumista tapahtuu suurin osa (50-70%) potilailla, joilla on NMIBC [3]. Noin 20% näistä potilaista myöhemmin kokevat taudin etenemiseen lihasten invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC) asianmukaisen käsittelyn jälkeen, kuten höyläysleikkaus (TUR) ja rakkoon epirubisiinihoidon, mitomysiini-C, tai Bacillus Calmette-Guerin (BCG) [1] – [2]. Siten toistuvia jälkeen TUR ja myöhemmät syövän etenemisen ovat ongelmallisia potilaille ja urologien samankaltaisia. Lähes 25% vasta diagnosoitu virtsarakon syöpäpotilailla on MIBC, ja valtaosa näistä tapauksista ovat erittäin histologisia asteen. Lähes 50% potilaista, joilla MIBC jo piilevä etäispesäkkeitä aikaan diagnoosi [1] – [2].

Useat mahdollisia kasvainmerkkiaineet on tunnistettu virtsarakon syövän, mutta harvat ovat osoittaneet tehoa ehdot ennustaa taudin uusiutumisen ja etenemistä. Kuitenkin useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että synnyssä

p53

,

RUNX3

,

RASSF1A

, ja

PRSS3

ovat tiiviisti mukana kehittämiseen ja etenemisen virtsarakon syöpä [4] – [7]. Erityisesti

RASSF1A

ja

PRSS3

promoottori metylaatio liittyy kehittynyt kasvain vaiheessa [7], mikä viittaa siihen, että nämä geenit saattavat liittyä virtsarakon syövän etenemisessä.

PRSS3

puolestaan ​​on osoitettu liittää positiivisesti

C16orf74

ilmaisun [8].

C16orf74

(MGC17624) geenilokus on kromosomin 16q24.1, ja sen toiminta on vielä tunnettu. Tulokset useista genominlaajuisten tutkimukset ovat osoittaneet, että

C16orf74

osallistuu tulehduksellisten prosessien. Tuumorinekroositekijä (TNF) -α on keskeinen säätelijä tulehduksellinen kaskadi kroonisiin tulehdussairauksiin, ja potilailla, joilla on tulehduksellinen sairaus,

C16orf74

liittyy vahvasti anti-TNF-vasteen [9].

C16orf74

on hypoksian säännelty geeni [10] – [11]. Winter et ai. [10] kertoi, että

C16orf74

mediaani RNA ilmentymistaso on itsenäinen ennustetekijä uusiutumisen elinaika pään ja kaulan alueen syöpä.

C16orf74

on myös osoitettu voimistuvan imusolmuke-positiivisen etäpesäkkeet potilailla, joilla on suun kautta kielen levyepiteelisyövän [12], ja korreloivan positiivisesti

PRSS3

ilmentyminen rintasyövässä [8 ].

Äskettäin raportoimme tunnistaminen etenemisen liittyvän geenin luokittelija, joka oli voimakas ennustearvo suhteen sairauden tulosten NMIBC [13]. Tässä tutkimuksessa,

C16orf74

oli yksi kahdeksasta ehdokas identifioitujen geenien ennustamaan sairauden etenemistä NMIBC, mikä viittaa mahdollisesti suhdetta virtsarakon syöpä ja

C16orf74

. Nykyisessä tutkimuksessa arvioimme suhde

C16orf74

ja NMIBC tuloksia käyttäen dataa edellisessä tutkimuksessa väestö sekä uusia tapauksia, joissa kaikissa on pitkän aikavälin seurannassa.

Tulokset

1. Lähtötilanteen ominaisuudet

keski-ikä 193 potilaalla on ensisijainen NMIBC oli 64,1 ± 14,0 vuotta, ja mediaani seuranta-aika oli 44,9 kuukautta. Seitsemänkymmentä potilasta (36,8%) koki toistuminen ja 20 (10,4%) koki etenemistä. Muita lähtötilanteen ominaisuudet potilaista on esitetty taulukossa 1.

2. Arvo

C16orf74

mRNA: n ilmentymisen tasolla ennustetyövälineenä merkkiaineena etenemisen

suhde

C16orf74

mRNA ilmaisun taso ja aika taudin etenemiseen analysoitiin. Käyttämällä ROC käyrä, sulku arvo (11,7784) etenemisen, jolla on korkein herkkyys (53,2%) ja spesifisyys (85%) määritettiin. Aika taudin etenemiseen oli merkitsevästi erilainen korkean ja matalan

C16orf74

mRNA ilmaisun ryhmät, että aika taudin etenemiseen korkean

C16orf74

ilmaisua ryhmässä oli merkitsevästi pidempi kuin alhaisen ilmentymisen ryhmässä (p 0,001) (Fig. 1). Vuonna univariate Coxin regressioanalyysiä useiden kliinis (ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, lukumäärä, luokka, vaihe, rakkoon hoito, ja

C16orf74

mRNA ekspressiotasot), ikä, rakkoon hoito ja

C16orf74

mRNA ekspressiotasot olivat merkittäviä riskitekijöitä etenemiseen (p = 0,031, p = 0,034 ja p 0,001, tässä järjestyksessä). Monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä, ikä ja matala

C16orf74

mRNA-ekspressiotasot olivat merkittäviä riskitekijöitä ilman taudin etenemistä potilailla, joilla on primaarinen NMIBC (HR: 1,049, CI: 1,005-1,094, p = 0,030; ja HR : 10,042, CI: 2,699-37,360, p = 0,001, vastaavasti) (taulukko 2). Monimuuttuja Coxin regressioanalyysi potilaalla on rakkoon hoito, ikä ja matala C16orf74 mRNA-ekspressiotasot olivat merkittäviä riskitekijöitä ilman taudin etenemistä potilailla, joilla on primaarinen NMIBC kanssa rakkoon hoito (HR1.055, CI: 1,005-1,108, p = 0,031; ja HR: 14.170, CI: +2,719-73,837, p = 0,002, tässä järjestyksessä).

keskustelu

Trypsiini on jäsenenä seriiniproteaasiperheen koodaama kolme trypsinogeeniä geenejä, mukaan lukien

PRSS1

,

PRSS2

ja

PRSS3

koodaavat trypsinogeenin I, trypsionogen II, ja trypsinogeeniä IV (tunnetaan myös nimellä mesotrypsinogen), vastaavasti [14] – [16] . Tämä entsyymi on tunnettu voimakas proteolyyttinen entsyymi, joka voi tuhota kudosta [17] – [18]. On ristiriitaisia ​​raportteja kirjallisuudessa roolin trypsiinin tai PRSS3 kasvainten etenemistä, joidenkin tutkimusten määrittämällä myönteisesti [19] – [23], kun taas toiset ovat raportoineet, että trypsiini tai PRSS3 näyttelee kasvain ehkäisevästä rooli. Ilmaisu on PRSS3 pienenee virtsarakon, ruokatorven ja mahalaukun syöpiin, ja menetys PRSS3 ilmaisun johtuu epigeneettiset äänenvaimennusjärjestelmän kautta promoottori hypermetylaation [7], [24] – [25]. Erityisesti vaimentaminen

PRSS3

jonka promoottorin metylaation on merkittävästi liittyy invasiivisia kasvaimen vaiheessa virtsarakon syöpä [7].

ilmentyminen

C16orf74

on osoitettu korreloivat positiivisesti

PRSS3

. Hockla et ai. [8] kertoi, että

C16orf74

on alas säätelee knockdovvn

PRSS3

ja voimistuvan mesotrypsin hoitoa. Tähän mennessä ei ole raportoitu yhteenliittymän

C16orf74

virtsarakon syövän, lukuun ottamatta aikaisemmassa työssä tekijät [13]. Tässä olemme analysoineet suhde mRNA: n ekspressiotasot

C16orf74

ja etenemistä ensisijainen NMIBC. Vähentynyt ilmentyminen

C16orf74

oli merkitsevästi yhteydessä taudin etenemiseen NMIBC potilailla, mikä viittaa siihen, että

C16orf74

on kasvain tukahduttava rooli, samanlainen

p53, RUNX3

ja

PRSS3

, sairauden etenemisessä. Tähän mennessä toiminta

C16orf74

on tuntematon, ja lisätutkimuksia tarvitaan määrittelemään täsmällisesti reitin, jolla

C16orf74

vaikutteita etenemistä ensisijainen NMIBC.

Yleensä kliininen ja patologinen parametrit, kuten kasvaimen, kasvain vaiheessa imusuonten invaasio, kasvaimen koon, CIS, papillaarinen tai kiinteä kasvain arkkitehtuuria, ja multifocality on pidetty hyödyllisiä ennustetekijöitä parametrit taudin etenemiseen NMIBC. Näistä tekijöistä yleensä kasvaimen, vaihe, ja läsnäolo CIS pidetään tärkeimpänä. Nykyisessä tutkimuksessa, rakkoon hoito oli riskitekijä etenemisen yhteydessä univariate analyysiä. On kuitenkin mahdollista, että potilailla, jotka saivat rakkoon hoito oli kliinisesti riskiryhmä uusiutumisen tai etenemisen sijaan, että hoito vaikuttaa etenemistä [26]. Eri molekyylimarkkerit on myös arvioitu taudin etenemistä. Viime aikoina useat tutkimukset ovat tunnistaneet oletetun etenemistä liittyvien geenien NMIBC käyttäen geenin ilmentymisen analyysi [27] – [29]. Wang et ai. [27] ehdotti 57-geenin paneeli auttaa ennustamaan etenemistä NMIBC. Birkhahn et ai. [28] kertoi, että

HRAS

,

VEGFR3

, ja

VEGF

ekspressiotasoja liittyivät etenemiseen 81% herkkyys ja 94% tarkkuus. Eguchi et al. [29] kertoi, että menetys 8p23.3 on merkkiaine ennustamiseen etenemisen ja uusiutumisen NMIBC. Aiemmin olemme tunnistaneet ehdokas etenemistä liittyvä geeni luokittelija, joka oli voimakas ennustearvo suhteen sairauden tulosten NMIBC [13]. Vaikka

C16orf74

on yksi molekulaarinen merkkiaine tämän ehdokkaan etenemistä liittyvä geeni luokittelija, se riitti ennustaa riskiä etenemistä NMIBC vahva riskisuhde yli 10 kun monimuuttujamenetelmin.

nykyisessä tutkimuksessa selvitimme mRNA ekspressiotasot

C16orf74

ihmisen ensisijainen NMIBC kudosten suhteellisen suuri väestö, jolla on pitkäaikainen seuranta-ajan aikana, sekä useita tunnettuja kliinisiä riskitekijöitä, kuten ikä , kasvaimen koko, määrä kasvaimia, T-luokka, kasvaimen, ja rakkoon hoito [30] – [31]. Nämä näkökohdat Tutkimuksen suunnittelu lainata voimaa tuloksia, ja viittaavat vahvasti siihen, että

C16orf74

voi olla kliinisesti käyttökelpoinen ennustaja etenemisen ensisijainen NMIBC.

Yhteenvetona vähentynyt ilmentyminen

C16orf74

oli merkitsevästi yhteydessä etenemistä ensisijaisen NMIBC, ja ilmentymistason

C16orf74

oli itsenäinen ennustetekijöitä determinantti syövän etenemiseen.

C16orf74

voisi olla keskeinen rooli etenemistä NMIBC. Siten

C16orf74

ilmentymistaso on hyödyllinen markkeri ennustamiseen etenemisen ensisijainen NMIBC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

1. Eettinen lausunto

eettinen komitea Chungbuk National University hyväksytty tätä protokollaa, ja kirjallinen suostumus saatiin kuhunkin aiheeseen. Kerääminen ja analysointi kaikki näytteet hyväksyi Institutional Review Board of Chungbuk National University.

2. Potilaat ja Tissue Näytteitä

Ensisijainen NMIBC näytteitä potilaista, joilla on histologisesti vahvistamat siirtymäkauden cell carcinoma saatu meidän instituutti käytettiin nykyisen tutkimuksen. Potilaat, joilla on samanaikainen karsinooma

in situ

(CIS) tai lyhyen aikavälin seuranta-ajan (alle 6 kk), ja ne, jotka tehtiin radikaali cystectomy tai joille oli epätäydellinen tietojen kerääminen, jätettiin tekemään tutkimuksen väestö enemmän homogeeninen. Kaikkiaan 193 ensisijainen NMIBC näytettä analysoitiin.

Kaikki kasvaimet macrodissected, tyypillisesti 15 minuutin sisällä kirurginen resektio. Jokainen virtsarakon syöpä näyte vahvisti patologisen analyysin osa kudoksen näytteen tuore osastoja TUR yksilöitä ja sitten jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Toinen TUR suoritettiin 2-4 viikon kuluessa alkuperäisen resektion kun virtsarakon syöpä näyte ei sisältänyt asianmukaista lihas- tai kun korkea-asteen kasvain havaittiin [32]. Potilaat, joilla oli T1 kasvain, useita kasvaimia, suuria kasvaimia (≥3 cm halkaisijaltaan), tai korkealaatuista Ta NMIBC sai yhden syklin rakkoon hoito (BCG tai mitomysiini-C) [26], [32]. Jos potilas kieltäytyi rakkoon hoito, sitä ei anneta jälkeen TUR. Hoitovaste arvioitiin kystoskopian ja virtsan sytologia. Potilaat, jotka olivat vapaita taudista 3 kuukauden kuluessa hoidon arvioitiin 3 kuukauden välein 2 ensimmäisen vuoden aikana ja sen jälkeen joka 6. kuukausi sen jälkeen [26], [32]. Kasvaimet lavastettuja ja porrastettu 2002 TNM luokittelu ja 1973 WHO pisteytysjärjestelmä, vastaavasti [32] – [33]. Toistuminen määriteltiin toistumisen ensisijaisen NMIBC alemman tai saman patologinen vaiheessa ja eteneminen määriteltiin sairaus, jossa on korkeampi TNM kun uusiutumisen.

3. RNA ja rakentaminen cDNA

RNA eristettiin kudoksista, käyttämällä 1 ml TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja homogenisoimalla 5 ml: n lasiputkeen. Homogenaatti siirrettiin 1,5 ml: n putkeen ja sekoitettiin sitten 200 ul: lla kloroformia. Kun oli inkuboitu 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, homogenaattia sentrifugoitiin 13 minuuttia (min) 13000 x

g

4 ° C: ssa. Ylempi vesipitoinen faasi siirretään puhtaaseen putkeen ja sen jälkeen 500 ui isopropanolia lisättiin. Seosta inkuboitiin 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja sen jälkeen putki sentrifugoidaan 8 minuuttia 13000 x

g

, 4 ° C: ssa. Ylempi vesipitoinen faasi heitettiin pois, ja sekoitettiin 500 ul: aan 75% etanolia, ja sentrifugoitiin sitten 5 minuutin ajan 13000 x

g

, 4 ° C: ssa. Pois heittämisen jälkeen ylempi vesikerros, pelletti kuivattiin huoneenlämpötilassa, liuotettiin dietyylipyrokarbonaatilla (DEPC) käsiteltyä vettä, ja sen jälkeen säilytettiin -80 ° C: ssa. Laatu ja luotettavuus RNA varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja etidiumbromidivärjäyksellä, minkä jälkeen silmämääräisesti ultraviolettivalossa. cDNA valmistettiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Saksa) mukaan valmistajan protokollan.

4. Reaaliaikainen PCR

Reaaliaikainen PCR-monistus suoritettiin käyttäen Roottorin Gene 6000 instrumentti (Corbett Research, Mortlake, Australia) määrällisesti ilmaus

C16orf74

. Reaaliaikainen PCR määritykset suoritettiin mikro-reaktioputkille (Corbett Research, Mortlake, Australia) käyttämällä SYBR Esiseos EX Taq (TAKARA BIO INC., Otsu, Japani). Käytetyt alukkeet monistusta olivat

C16orf74

(179 emäsparia) sense (5′-AAT GTG TGT CAG CAG CAG CA-3 ’) ja anti-sense (5′-TTT CTC CAT CAT CTG GGC AC-3 ”). PCR-reaktio suoritettiin lopullisessa tilavuudessa 10 ui, joka koostuu 5 ui 2 X SYBR esiseos EX Taq-puskuria, 0,5 ui kutakin 5′- ja 3’-aluketta (10 pmol /ul), ja 1 ui näytettä cDNA. Tuote puhdistettiin QIAquick (Qiagen, Hilden, Saksa), määrällisesti spektrofotometrillä (Perkin Elmer MBA2000, Fremont, CA), ja sitten sekvensoitiin automaattisella laserilla fluoresenssi sekvensseri (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Foster City, WI). Kymmenkertainen sarjalaimennoksia tunnetun pitoisuuden tuotteen (100 pg /ul 0,1 pg /pl) käytettiin luomaan standardikäyrä reaaliaikainen PCR. Reaaliaikaisen PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 1 sykli 20 sekuntia (s) 96 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 2 s 96 ° C: ssa denaturoinnin, 15 s ajan 60 ° C: ssa kuumennuksen ja 15 sekuntia 72 ° C laajennus. Sulaminen ohjelma suoritettiin 72-95 ° C: ssa kuumentamalla nopeudella 1 ° C per 45 sekuntia. Spektritiedot otettiin kiinni ja analysoitiin Roottorin Gene Real-Time Analysis Software 6.0 Build 14 (Corbett Research, Mortlake, Australia). Kaikki näytteet ajettiin kolmena kappaleena.

glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) B analysoitiin endogeenisen RNA viitegeenin ja geenien ilmentymisen normalisoitiin ilmaus

GAPDH

.

5. Tilastollinen analyysi

normalisoimiseksi erittäin vinossa jakeluun mRNA: n ilmentymisen tasojen

C16orf74

, tiedot olivat luonnollinen log muunnetaan ja sitten takaisin muuttaneet varten tulosten tulkinnassa [34]. Vastaanotin toimii ominaisuudet (ROC) käyriä käytettiin määrittämään optimaalisen cutoff pisteen mRNA-tasolla että tuottivat korkeimmat herkkyys ja spesifisyys etenemisen. Käyttämällä näitä arvoja potilaat luokiteltiin korkea tai matala

C16orf74

ilmaisu ryhmiä. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa aikaa taudin etenemiseen, ja erot arvioitiin käyttäen log-rank tilastoja. Prognostisia arvo

C16orf74

suhteen etenemistä analysoitiin käyttämällä Coxin monimuuttuja suhteellista vaaraa regressiomalleja. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SPSS 12.0 ohjelmistoa (SPSS Inc., Chicago, IL), ja p-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.