Krooninen sairaus

tiivistelmä

Novel biomarkkereita syövän diagnosoinnissa ja hoidossa valinta tarvitaan kipeästi helpottamaan varhaista havaitsemista ja parantaa hoidon tuloksia. Olemme aikaisemmin tunnistaneet uuden fosforylaatiokohdan seriinin 506 (PS506) on topoisomeraasi-I (topo-I), ja ovat osoittaneet, että se on yleisesti ilmaistu johdetut solulinjat useita syöpiä, mukaan lukien keuhkosyöpä, mutta on alhainen solulinjoissa ei-syöpäkudokset. Tässä olemme tutkineet, miten PS506 ilmentyminen keuhkoissa kudosnäytteiden korreloi niiden pahanlaatuinen tila. Huomaamme, että PS506 ekspressio on merkittävästi kohonnut pahanlaatuisia kasvaimia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) verrattuna viereisiin, ei-syöpä keuhkokudoksen ja hyvänlaatuisia keuhkokasvaimia. PS506 ilme oli jopa 6 kertaa suurempi pahanlaatuinen yksilöiden kuin pariksi ei-pahanlaatuinen kudos. Käyttämällä hyvin tunnettu NIH /NCI 60-solulinjan paneelista, me korreloi kaikkein kohonneet ekspressiotasot PS506 keuhkojen, munasarjojen ja paksusuolen syövän solulinjat lisääntynyt herkkyys kamptotesiini, kasvi, alkaloidi, joka on kohdistettu topo-I. Tämä on johdonmukainen aikaisempiin tutkimuksiin pienemmässä näytteenotto solulinjojen ja meidän toteamisesta PS506 lisää topo-I DNA: n sitoutuminen. Kaksi laajalti käytetty kemoterapeuttisten munasarjasyövän ja paksusuolen syöpä, topotekaani ja irinotekaani, vastaavasti, ovat peräisin camptothecin. Irinotekaani on myös näkyvissä kliinisissä kokeissa NSCLC. Tuloksemme viittaavat siihen, että kohonnut PS506 ekspressio voi korreloida kliinisen kemosensitiivisyys näitä aineita munasarja-, paksusuoli-, ja NSCLC. PS506 voi siis toimia biomarkkeri diagnoosin tai hoidon valinnassa.

Citation: Zhao M, Gjerset RA (2015) topoisomeraasi-I PS506 kuin Dual Function Cancer biomarkkereiden. PLoS ONE 10 (8): e0134929. doi: 10,1371 /journal.pone.0134929

Editor: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, Kiina

vastaanotettu: 04 lokakuu 2014; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2015; Julkaistu: 06 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Zhao, Gjerset. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: RG Biopharma tuettiin muodossa palkkojen tekijöiden (RAG, MZ), mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit kirjoittajat nivelletty ”kirjoittaja maksut” -osiossa.

Kilpailevat edut: MZ ja RAG ovat sidoksissa RG Biopharma, jossa tämä tutkimus tehtiin. Tämä yritys kuuluminen ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. RG on keksijän US-patentti # 8431353 ja US-väliaikainen patenttihakemus 62054242.

Johdanto

Uusi molekyyli- biomarkkereita syövän, erityisesti merkitystä mekanismi syövän tai syövän hoidossa, voi parantaa voima nykyisin käytettävien diagnostisten lähestymistapoja, vähentää yli diagnoosi, helpottaa hoidon valinta, ja parantaa huomattavasti syövän säilymiseen. Olemme aikaisemmin tunnistaneet uuden fosforylaatiokohdan topoisomeraasi I (Topo I) seriinitähde 506 (PS506), joka ilmentyy voimakkaasti syövän solulinjat, mutta on alhainen havaittavissa solulinjoissa, jotka ovat peräisin normaaleista kudoksista, joten se on mahdollinen ehdokas kuten pahanlaatuisuuteen liittyvä biomarkkereiden diagnoosia varten [1].

Topo I on keskeinen tehtävä DNA aineenvaihduntaa ja on ainutlaatuinen solukohteeseen irinotekaanin ja topotekaani, kaksi laajalti käytetty kemoterapeuttisten peräisin kasvi alkaloidi kamptotesiini (CPT) [2, 3]. Lieventämällä DNA superkierteitä jotka muodostavat aikana DNA: n replikaation ja transkription, Topo I lievittää vääntöjännitystä DNA ja mahdollistaa edelleen etenemistä replikaatiohaarukan ja transkriptio monimutkainen, vastaavasti [4-6]. Peruselatusaine taso fosforylaation, lähinnä seriinitähteissä sen N-terminaalinen domeeni eroaa PS506 on tarpeen topo I DNA: ta sitova ja aktiivisuus [7]. Lisääntynyt topo I fosforylaation esiintyy monissa syövän solulinjat ja korreloi ilmentymisen PS506 ytimessä domeeni [8, 9]. Olemme havainneet, että PS506 ilmentyminen korreloi myös kohonneeseen seriini-treoniini proteiinikinaasi, CK2, ja että yhdistelmä-DNA-topo I voidaan fosforyloitiin seriini 506 puhdistettua CK2 [1]. CK2, joka ilmentyy alhaisilla tasoilla normaaleissa soluissa [10], on taipumus lisätä syövän, ja korkeat tasot ovat osoitus huonoon ennusteeseen [11-15]. Hiirillä, kohonnut CK2 voimistaa pro-onkogeenisiä signalointireittien ja tekee yhteistyötä oncogenes edistää kasvainten [16-22], mikä viittaa siihen, että CK2 voi olla keskeinen rooli syövän luomalla suotuisan ympäristön edelleen onkogeenisia muutoksiin. Siten poikkeava ilmentyminen PS506 voi olla oire pro-onkogeenisen ympäristö luoma kohonnut CK2.

terapeuttinen merkitystä topo I tekee myös PS506 mahdollinen biomarkkereiden hoitoon valinnan. CK2 välittämän S506 fosforylaatiota basaalisesti fosforyloidun yhdistelmä-topo I luo topo I kohonnut DNA sitoutumisaktiivisuutta ja kohonnut DNA rentoutumista aktiivisuutta superkier- plasmideissa [1, 8]. Havaitsimme, että solulinjat, jotka ilmentävät kohonnut PS506 tasot olivat usein herkempiä CPT, sopusoinnussa vaikutusmekanismi tämän lääkkeen, joka käyttää entsymaattiseen aktiivisuuteen topo I luoda sen tappava vaikutus [1]. Koska CPT ja huumausainerikoksia mahdollistavat topo I-välitteisen DNA nirhaisemalla mutta estävät topo I välittämän DNA religatoitiin, ne aiheuttavat DNA lohkon murtuma säilyä ja lopulta muodostaa tappavan DNA double-lohkon murtuma. Tämä mekanismi uskotaan huomioon terapeuttisia vaikutuksia irinotekaanin ja topotekaani [2, 23, 24]. Parannettu DNA: ta sitova ja DNA relaksaatiovaikutuksen vietämme kanssa PS506 muodossa topo I voi olla vaikutusta myös kliinistä vastauksia irinotekaani ja topotekaani edistämällä muodostumista DNA double-säikeen katkoksia.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet oletusta, että PS506 ilmentyminen on ominaista maligniteetin, ja että korkeimmat ekspressiotasot korreloi soluvasteita CPT-pohjainen huumeita. Arvioida suhdetta PS506 maligniteetin olemme tutkineet kudosnäytteiden pahanlaatuisten keuhko- kasvainten, pariksi ei-pahanlaatuisia vieressä keuhkojen epiteelin, ja hyvänlaatuisia keuhkojen kasvaimet. Arvioimaan hyödyllisyyttä PS506 indikaattorina reagoida CPT-pohjainen huumeita, olemme seulotaan sen ilmentymistä solulinjoissa NCI-60 solulinjaa paneeli joille CPT herkkyyden profiilit oli saatavilla National Cancer Institute /Developmental Therapeutics Program ( NCI /DTP) tietokanta. Tulokset osoittavat hyvin valikoiva yliekspressio PS506 kaikissa pahanlaatuinen keuhkojen näytteet tutkitaan, verrattuna viereiseen ei-pahanlaatuista kudosta ja hyvänlaatuinen kasvain yksilöitä. Solulinjoissa on peräisin keuhkojen, paksusuolen ja munasarjojen syöpien, huomaamme, että korkeimman PS506 ilmaisun korreloi lisääntynyt CPT herkkyys.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta

pAb506P kani-IgG tuotettiin on 21-aminohapon fosfopeptidi (TVGCCS * LRVEHINLHPELKKC, jossa fosfoseriini 506 on merkitty *), kuten aiemmin on kuvattu [1]. Vuohen anti-topo I IgG, joka tunnistaa topo I C-terminaalissa, ja hiiren monoklonaalinen anti-aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Hiiren monoklonaalinen anti-tubuliinia ostettiin Novus Biologicals (Littleton, CO). Toissijainen vasta-aineet vuohen anti-kani-piparjuuri-peroksidaasi (HRP), vuohen anti-hiiri-HRP, ja aasin anti-vuohi-HRP: tä (Santa Cruz Biotechnology). Post immunosaostus Westerns, ensisijainen vasta-aine havaittiin käyttäen Pierce Clean-Blot IP Detection Reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA), joka tunnistaa vain koko, ehjä IgG eikä hajotetun kevyen tai raskaan ketjun alayksiköistä.

solun viiva

NCI-H358 ihmisen bronchioalveolar ei-pienisoluinen karsinooma solut (H358), luettelonumero CRL-5907, ostettiin toukokuuta 2011 American Type Culture Collection ja olivat mykoplasma-ilmaiseksi. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa 10% CO

2 Dulbeccon Modified Eagles Medium, jota oli täydennetty 10% vastasyntyneen vasikan seerumia, ja lisäaineita, kuten aikaisemmin on kuvattu [8]. Kampotekiiniosan hoitoon, soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan, kun läsnä oli 0,1 tai 1 uM kamptotesiini (Sigma, St. Louis, MO), minkä jälkeen sadonkorjuun ja Western-analyysillä, kuten on kuvattu alla.

Solupelletit

Jäädytetyt solupelletit NCI 60-solulinja paneeli saatiin Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) Kasvain varasto National Cancer Institute (NCI) ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Solu linjat joka solu pellettejä saatiin luetellaan (S3 taulukko).

Tissue yksilöitä

Kaikki kudosnäytteet Tässä tutkimuksessa käytetyt jäädytettiin, anonyymi, julkisesti saatavilla arkistointiin yksilöt ei- pienisoluinen keuhkosyöpä kanssa pariksi ei-pahanlaatuinen kontrollikudoksen tai yksilöitä hyvänlaatuinen keuhkokasvaimia. Kaikki näytteet saatiin Western Division Osuuskunnan Human Tissue Network (CHTN), Vanderbilt University, Nashville, TN. Ei tunnistettavia yksityisiä potilaan tai luovuttajan tiedot toimitettiin näytteet. Koska tietoa ei ole saatu interventio tai vuorovaikutuksessa yksittäisten ja koska ei ole tunnistettavissa yksityisiä tietoja toimitettiin meille, tämä tutkimus ei ole ihmiskoe määrittelemien CFR 46.102f ja OHRP ohjeet tutkimustyön koodattu henkilökohtaisia ​​tietoja tai biologisten näytteiden ja myönnettiin vapautus tarkastelun Torrey Pines Institute for Molecular Studies IRB.

Western analysoi

Solusakat (vastaa ~ 10

7 solua /pelletti) tai kaksi läheltä piti konfluentteja 10 cm levyt PBS-pestiin H358-soluja (vastaa ~ 2 x 10

7-solut) lyysattiin lisäämällä 350 ui per pelletti tai 700 ui levyä kohden kylmää RIPA-puskuria (10 mM TRIS, pH 8, 0,15 M NaCl: a, 0,1% SDS, 1% NP40, 1% deoksikolaatti), johon täydellinen proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (Roche, Nutley, NJ), lisättiin juuri ennen käyttöä, ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [8]. Jäädytetyt kudosnäytteet (keskimääräinen paino ~ ,3-+0,5 g) homogenoitiin 3 ml: ssa RIPA-puskuria jäällä käyttäen kudosjauhimessa ja sitten sentrifugoitiin jätteiden poistamiseksi. Solu- ja kudos- lysaateista jaettiin eriin ja pakastettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Tuore sulanut lysaattia käytetään kunkin geelin aikavälillä.

lysaatit (70 ug proteiinia, ellei toisin mainita) erotettiin SDS-PAGE käyttäen Criterion 10-20% Tris-HCI esivalettuja geelejä (Bio-Rad Laboratories , Hercules, CA). Vastaava määrä juuri sulatettua näyte viitteen varasto H358 lysaattia mukana kussakin ajossa yhteisenä ohjaus. Seuraavat elektroforeesi, proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille ja immunovärjättiin inkuboimalla primaarista vasta-ainetta (1: 500 tubuliinin; kaikki muut 1: 100), jonka jälkeen asianmukaiset HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1: 1000), ja Pierce ECL reagenssi ( Thermo Scientific), jota seurasi altistus elokuva. Kalvot skannattiin käyttäen Alpha Imager ja kvantitoitiin käyttäen mukana ohjelmisto. PS506 juovien voimakkuudet normalisoitiin viittaus H358 ohjaus.

immunosaostus /Western blotting

Immunosaostukset suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu [25]. Lyhyesti, solulysaatteja eksponentiaalisesti kasvavia H358-soluja valmistettiin RIPA-puskurissa, kuten edellä on kuvattu. Solun proteiinien (1-2 mg) immunosaostettiin keinutuoli yön yli 50 ul vuohen anti-topo I (~ 10 ug). Immunokompleksit kerättiin lisäämällä 20 ui proteiini AG agaroosi seurasi sentrifugointi. Immuuni- komplekseja hajotettiin alhaisessa pH: ssa ilman ditiotreitolia tai β-merkaptoetanolia, jotta vältetään dissosiaatio IgG. Elektroforeesi näyte puskuria lisättiin ja näytteet alistettiin SDS-PAGE, kuten on kuvattu Westerns, ilman kiehuva edelleen varmistamiseksi, että IgG säilyi ennallaan. Länsi käsiteltiin kuten edellä on kuvattu, paitsi että puhtaan blot IP Detection Reagent (Thermo Scientific) käytettiin havaitsemaan primaarisen vasta-aineen.

ELISA-analyysi

Serine 506-fosforyloidun ja ei-fosforyloitua muodot 21-aminohapon topo I peptidi on kuvattu edellä (katso Antibodies kohta) syntetisoitiin Biopeptide Co., Inc. (San Diego, CA). Immulon H2B ELISA-levyt (Thermo Scientific) päällystettiin yön yli 4 ° C: ssa 100 ui peptidien suspendoitiin uudelleen 2 ug /ml päällystyspuskuriin (50 mM NaHCO

3, pH 9). Levyt pestiin pesupuskurilla (Tris-puskuroitu suolaliuos [TBS], pH 7,5, 0,5% Tween), ja blokattiin TBS, joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia (BSA). Levyt pestiin kerran pesupuskurilla ja inkuboitiin sitten 1 h sarjalaimennoksilla (kahtena kappaleena) on pAb506P TBS /1% BSA: ta, pestiin uudelleen, ja niitä inkuboitiin 1 tunnin ajan vuohen anti-kani-HRP. Sen jälkeen toinen pesuvaiheen, levyjä inkuboitiin HRP-substraattia 3,3 ’, 5,5’-tetrametyylibentsidini (1-vaihe SLOW TMB ELISA, Thermo Scientific) mukaan valmistajan ohjeiden. Absorbanssi 450 nm: ssä luettiin.

alkalisella fosfataasilla käsittely

300 ug solulysaattia valmistettiin RIPA-puskurissa ilman fosfataasi-inhibiittorit, käsiteltiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa 300 yksiköllä vasikan suolen alkalista fosfataasia (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) puskurissa säädettiin 0,1 M NaCl, 0,01 M MgCl

2, 0,001 M DTT ehdottivat valmistaja. Rinnakkaista ohjauskanavaa lysaatti valmistettiin läsnä fosfataasiestäjät inkuboitiin puskurissa puuttuu alkalisen fosfataasin.

Tilastolliset analyysit

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad® Prism ohjelmistoa (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

tulokset

Ominaisuudet pAb506P

kanin polyklonaalinen IgG, pAb506P, nostetaan PS506-peptidi ainutlaatuinen Topo I, on ollut aikaisemmin osoitettu tunnistamaan 90 kDa solujen topo I syövän solulinjat samoin kuin PS506 sisältävä muoto yhdistelmä-topo käsiteltiin proteiinikinaasi CK2 [1]. Antiseerumi on erittäin spesifinen fosforyloidun muodon immunisoivan peptidin, kuten on esitetty vertailevassa titrauskäyrät peptidin ELISA-menetelmällä (kuvio 1A). Lisäksi näkyvämpi pAb506P-reaktiivisia lajeja, jotka liikkuivat noin 45 kDa SDS-PAGE /Westerns on myös läsnä (kuvio 1 B, kaista 1, nuolet osoittavat kannat 45 kDa: n ja täyspitkä Topo I H358 NSCLC solulysaateista). Topo I laji samankokoisia on raportoitu Jurkat leukemiasoluja [26]. 45 kDa: n lajia esiintyy pieni bändi blotit tutkittiin vuohen anti-topo I (kuvio 1 B, kaista 2), ja se voidaan immunosaostettiin H358 solulysaateista vuohen anti-topo I (kuvio 1C), mikä osoittaa, että se jakaa immunoreaktiivisuus täyspitkää topo I mutta on todennäköisesti vähäinen laji. Heikompi reaktiivisuus täyspitkät topo I pAb506P voi ilmoittaa, että se ei ole täysin fosforyloitiin tällä sivustolla. pAb506P reaktiivisuus vähenee seuraavan hoitoon H358 solulysaateista alkalisella fosfataasilla, joka vahvistaa, että se edustaa fosforyloitua laji (kuvio 1 D). Sekä täyspitkät topo I ja 45 kDa PS506-positiivisia lajit valikoivasti säädeltiin hoidon jälkeen kamptotesiinin (CPT), olosuhteissa, joissa tubuliinin säätö pysyy muuttumattomana, mikä osoittaa, että täyspitkä topo I ja 45 kDa: n säännellään samalla tavalla vastauksena CPT (kuvio 1 E). Topo I on ainutlaatuinen kohde CPT, ja on aikaisemmin osoitettu olevan erityisesti säädellä vähentävästi CPT-käsitellyissä soluissa [27]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että 45 kDa: n laji on todennäköisesti fosforyloitu hajoamistuote topo I Koska se on ensisijainen laji havaittiin solulysaateista, arvioimme sen ilmentymistä kudosnäytteet.

(A ) Vertaileva titraus käyrät pAb506P on ELISA-levyt päällystettiin topo I ympäröivä peptidi seriini 506 päällä, joko sen fosforyloidun tai ei-fosforyloitua muotoa. (B) Western-analyysit H358 solulysaateista (100 ug /kaista) hybridisoitiin pAb506P (kaista 1) tai vuohen anti-topo I (kaista 2). Nuolet osoittavat kannat 45 kDa: n ja täyspitkä Topo I (C) Topo I immunosaostuksella (vuohen anti-topo I C-terminaalissa) seurasi pAb506P Western of H358 solulysaateista. Kaista edustaa 200 ug lähtöaineena. (D) Western-analyysi PS506 ja aktiinille H358-solulysaateista ennen (LASK) ja käsittelyn jälkeen alkalisen fosfataasin (AP). (E) Western-analyysi PS506 (käyttäen pAb506P), täyspitkä topo I (käyttäen vuohen anti-topo I) ja tubuliinin H358-soluissa ennen ja jälkeen 24 tuntia solujen käsittely 0,1 tai 1 uM CPT.

PS506 ilmaisun pahanlaatuinen, hyvänlaatuinen, ja normaali keuhkokudoksessa

pAb506P käytettiin näytön PS506 ilmaisun nimettömänä yksilöiden ei-pienisoluisen keuhkosyövän kasvaimia (karsinoomat, adenoomia) ja ei-pahanlaatuiset keuhkokudoksessa ( kuten pariksi näytteet samasta potilaasta), sekä hyvänlaatuisia keuhkokasvaimia. Näytteet saatiin Western Division Osuuskunnan Human Tissue Network (CHTN) ja luetellaan niiden kuvaukset (S1 taulukossa. Ominaisuudet kasvain /ei-kasvain pareja (tarjoamat CHTN) S2 Taulukko. Ominaisuudet hyvänlaatuiset kasvaimet (edellyttäen by CHTN)). Kudoshomogenaatteja valmistettiin pariksi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kasvain ja ei-pahanlaatuisten keuhko- kudoksen, ja hyvänlaatuisia keuhkojen kasvain näytteet analysoitiin SDS-Page /Western läsnäolo PS506, ja kvantitoitiin digitaalinen analyysi juovien voimakkuudet. Varmistaa standardoinnin eri geelejä, valmistimme yhden lysaattia H358 soluja, jotka pakastettiin erinä. Tuore sulatetut n erä tätä lysaattia Jokaisessa geeli ajaa vertailustandardina.

Kuvio 2A esitetään edustava Western blot varten PS506 in Hyväksytty pahanlaatuinen /ei-pahanlaatuisen yksilö paria 8-13 yhdessä H358 vertailustandardeissa. PS506 tasolle suhteessa H358 olivat samalla arvioitava kaikille 21 pareittain plus 8 hyvänlaatuisia ja tulokset vahvistettiin toisessa erillisellä kokeella. Keskiarvot ja keskihajonnat kahdessa kokeessa on lueteltu taulukossa 1 (pareina) ja taulukossa 2 (hyvänlaatuiset kasvaimet) ja piirrettiin kuviossa 2B. Kaikissa 21 pahanlaatuinen /ei-pahanlaatuinen yksilö paria, PS506 ilmentymistä koholla pahanlaatuinen näytteen. Kuusitoista 21 (76%) pahanlaatuinen näytteistä ilmaistaan ​​noin 2-6-kertaisesti enemmän PS506 kuin ei ole pahanlaatuisia pariksi yksilö, keskiarvon ollessa noin 3 kertaa suurempi. Viisitoista 21 (71%) pahanlaatuinen näytteistä ilmaistaan ​​PS506 korkeammalle tasolle yleinen keskiarvo on 0,39 kaikille yksilöille (punainen katkoviiva kuviossa 2B). Tärkeää on, mikään 8 hyvänlaatuinen yksilöitä ja vain 2 21 pariksi ei-pahanlaatuinen yksilöitä (yhteensä 2/29 [7%]) ilmaistuna PS506 yläpuolelle keskimääräisen tason. Siten pahanlaatuinen näyte oli 10 kertaa todennäköisemmin kuin ei-pahanlaatuinen yksilö ilmaista PS506 suurempi kuin keskimäärin kaikkien yksilöiden.

(A) edustaja PS506 Western blot yksilöiden NSCLC ja niiden pariksi hyvänlaatuisen yksilöt (näyte paria 8-13). H358 on vertailuohjaussignaalit kvantifiointiin kaikkien PS506 blotteja. Taulukot 1 ja 2 luettelon näytteet analysoidaan ja kvantifiointiin PS506 tasolle suhteessa H358. (B) Bar kuvaaja PS506 tasot esitetään taulukoissa 1 ja 2, ryhmitellään pariksi pahanlaatuinen /ei-pahanlaatuisia yksilöitä ja hyvänlaatuisia kasvaimia. (C) hajontakuvio PS506 tasojen taulukoista 1 ja 2, ryhmitellään pahanlaatuinen (M), ei-pahanlaatuinen (N), ja hyvänlaatuisia (B) kasvaimia. P-arvot laskettiin parittomalla t-testillä.

sirontakaavio Kuviossa 2C esittää PS506 tasot kolmet yksilöitä: 21 pariksi pahanlaatuinen (M) ja ei-pahanlaatuiset (N) kudoksiin, ja 8 hyvänlaatuinen kasvain kudosten (B). Keskimääräinen PS506 tasot (merkitty mustat viivat kussakin sarjassa) ovat 0,60 (pahanlaatuinen), 0,24 (ei-pahanlaatuinen Paired), ja 0,24 (hyvänlaatuinen). Erot keskimääräisissä PS506 tasojen näytejoukoille arvioitiin olevan parittoman, kaksisuuntainen t-testi. Kuten kuviossa 2C, ero pahanlaatuista kudosta ja ei-pahanlaatuiset pariksi kudos oli erittäin merkitsevä (

p

0,0001), ja ero pahanlaatuista kudosta ja hyvänlaatuinen kasvain kudos oli merkitsevä (

p

= 0,0115). Mitään merkittävää eroa ei havaittu PS506 tasoilla hyvänlaatuisia ja ei-pahanlaatuiset kudoksissa (

p

= 0,86). Nämä tulokset osoittavat, että PS506 ilmentyminen liittyy vahvasti pahanlaatuisuuteen.

PS506 ilmaisun ja CPT herkkyys

Aiemmassa tutkimuksessa tarkastellaan PS506 tasojen erilaisissa syöpäsolulinjoissa, olemme huomanneet, että korkein PS506 tasot olivat läsnä solulinjoissa suurin herkkyys topo I kohdistetun kasvi alkaloidi, CPT, jossa eroja noin 2-3-kertainen välillä CPT-herkkä ja kestävä solulinjoissa [1]. Jatkaa näitä havaintoja, arvioimme suhteellinen PS506 tasot NCI 60-solulinja paneelissa saatavana jäädytetty solu pelletit Division of Cancer Treatment ja diagnoosi kasvain varasto NCI. Paneeli sisältää solulinjat, jotka ovat peräisin eri kasvaintyypeissä, mukaan lukien leukemia, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, paksusuolen syöpä, melanooma, munasarjasyöpä, munuaissyöpä, eturauhassyöpä, rintasyöpä, ja keskushermoston syövät. Koska solulinjat on laajalti tunnettu NCI herkkyyttä CPT ja muita kokeellisia ja perustettu kemoterapeuttiset lääkkeet, ne tarjoavat pitkälle standardoituihin resurssi, jonka kanssa korreloivan mahdollinen biomarkkereiden kanssa kemosensitiivisyys [28].

Solulysaatit pakastetusta solu- pelletit arvioitiin PS506 ilmentyminen SDS-PAGE /Western samalla tavalla kuin kudos- näytteet. Kvantitoitiin digitaalisesti ja PS506 tasolle suhteessa H358 ohjaus arvo tarkastettiin toisen erillisellä kokeella ja keskiarvo. Sillä 42 solulinjoja, jotka CPT arkaluonteisuuden data oli saatavissa, olemme havainneet, että PS506 tasot jaettiin laajalla alueella, kuten havaittiin kasvaimen kudosnäytteistä. Keskimääräinen taso PS506 kaikissa 42 solulinjoissa oli 0,37 suhteessa H358 yhteinen valvonta; arvo huomattavasti suurempi kuin keskimääräinen arvo 0,24 havaittu ei-pahanlaatuisten pariksi kudoksen tai hyvänlaatuisia kasvaimia (kuvio 2). Me seuraavaksi verrataan suhteellista PS506 arvot 42 solulinjojen kanssa herkkyydessä CPT NCI /Developmental Therapeutics Program (DTP)% kasvu arvot vahvistettu yhdellä suurella annoksella (10 uM) CPT määritys [29]. Tässä määrityksessä negatiivisen prosentuaalinen kasvu arvo osoittaa menetys alkaa solun massan takia solukuolema, kun taas positiivinen arvo osoittaa prosenttiosuutena käsittelemättömistä solujen kasvun, kuten kuvattu DTP verkkosivuilla [28].

Havaitsimme korrelaatio PS506 ilmaisun ja CPT herkkyys ryhmittely 20 ei-pienisoluisen keuhkosyövän, paksusuolen ja munasarjasyövän solulinjoissa, jotka edustavat kolmea syöpien osalta CPT-hormoniin pohjautuvien hoitojen, ovat joko FDA: n hyväksymä (paksusuoli, munasarja) tai arvioidaan parhaillaan meneillään olevissa kliinisissä tutkimuksissa (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä) [30, 31]. Taulukossa 3 on esitetty näiden solulinjojen keskimääräinen PS506 tasolta kahdesta kokeesta (suhteessa H358 soluja), ja CPT herkkyyttä saatavilla tietoa NCI /DTP verkkosivuilla [28]. Kuvio 3 esittää sirontakuvaajan suhteellisen PS506 arvot kolmeen alaryhmään määritelty niiden CPT herkkyys: 8 herkin (40%), 8 eniten resistenttejä (40%), ja loput 4 välituotteen herkkyys (20%) . Suhteellinen PS506 aleni mukaan CPT herkkyyden 0,39 (herkin) 0,21 (väli herkkyys) 0,18 (kestävä). Parittoman, kaksisuuntainen t-testi osoitti merkittävän eron (

p =

0,028) keskimääräisen PS506 tasoa välillä herkin ja kaikkein kestävät solulinjat, vastaa meidän aikaisempiin tutkimuksiin pienemmällä näytteenotto solulinjat [1]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että keuhkojen, paksusuolen ja munasarjojen syöpien, ilmaus PS506 on yksi tekijä, herkkyys CPT-pohjainen huumeita. Tärkeää on, puolet solulinjojen nimetty CPT herkkä-mutta yksikään niistä, joiden välissä on CPT herkkyys tai CPT vastus-ilmaisi PS506 tasolle ylittää keskiarvo 0,37 kaikille 42 solulinjoissa.

sirontakuvaajaan suhteellisen PS506 tasot solulinjoissa, jotka edustavat 40% kaikkein CPT herkkä, 40% kaikkein CPT kestävä, ja 20% keskitason herkkyys joukossa joukko munasarjasyövän, paksusuolen syöpä, ja NSCLC solulinjat. Punainen katkoviiva 0,37 osoittaa keskimääräisen PS506 tasolla solulinjoissa jolle CPT herkkyyden tietoja oli saatavilla. P-arvo on laskettu parittomalla t-testillä.

Myös verrattuna PS506 tasolle CPT herkkyys suurempi ryhmä 42 solulinjojen edustavat laajempaa syöpätyyppien (katso: S3 Taulukko. CPT herkkyys ja PS506 tasoilla solulinjoja NCI 60 solulinjasta paneeli). Tässäkin havaitsimme välistä positiivista PS506 tasojen ja CPT herkkyys, kaikkein vastustuskykyisiä jotka ilmentävät matalan PS506 tasolle (40% linjat, tarkoittaa PS506 taso = 0,34) ja herkimpiä jotka ilmentävät korkeampia PS506 tasolle (40 % linjat, tarkoittaa PS506 taso = 0,41), mikä on yhdenmukaista mallia, jossa PS506 osaltaan CPT herkkyyttä. Analyysissä tämän suurempaa ryhmää, erot keskiarvojen ei ollut tilastollisesti merkitsevä, mutta (

p

= 0,43), johtuen mahdollisesti osuutta solutekijöiden riippumaton topo I, kuten CPT otto, solunsisäisen CPT aineenvaihdunta ja jakautuminen, sekä soluvasteen DNA-vaurion, jotka kaikki voivat vaikuttaa lopputulokseen CPT hoitoja [32]. Kuitenkin seulonnan tulokset tukevat käsitystä, että PS506 tasoja voidaan käyttää terapiassa valinnan tiettyjä syöpiä.

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että ilmentyminen PS506 on maligniteetin-spesifinen, ja että korkeimman PS506 ilmaisun syöpäsolulinjoissa keuhko-, paksusuoli-, ja munasarjasyöpä alkuperä korreloivat lisääntynyt herkkyys CPT. PS506 tasot olivat koholla kaikissa 21 pahanlaatuinen yksilöitä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä verrattuna pariksi ei-pahanlaatuinen kudos ja 8 hyvänlaatuinen keuhkojen kasvain yksilöitä. Useimmissa näytteen paria, kasvu PS506 ilmentymisen pahanlaatuinen vs. ei-pahanlaatuista kudosta vaihteli 2-kertaiseksi 6-kertaiseksi. Kaksi ei-pahanlaatuisia ryhmät yksilöt (21 hyvänlaatuisen kudosten ja 8 hyvänlaatuinen kasvain kudokset), eivät olleet merkitsevästi erilaisia ​​PS506 ilme. Vaikka absoluuttiset tasot PS506 ilmentymisen pahanlaatuinen kasvain näytteet oli vaihteleva, 71% pahanlaatuisten kasvainten näkyy PS506 tasolle yläpuolella väestössä keskimäärin (kaikki näytteet yhdistetään, eli pahanlaatuinen + hyvänlaatuisen), kun taas vain 7% ei-pahanlaatuisten yksilöitä ilmaisi PS506 yläpuolella väestössä keskimäärin.

Kun arvioimme NCI-60 solulinjan paneelista, huomasimme myös, että keskimääräinen PS506 ilmentymistaso poikki solulinjoissa oli korkeampi kuin ei-pahanlaatuinen kudosnäytteet (0,37 solulinjoja vastaan ​​0,24 hyvänlaatuisen yksilöt). Analysoimme korrelaatio PS506 ilmaisutapoja solujen herkkyys topo I-kohdistuva lääkkeiden CPT käyttäen CPT herkkyys saatavilla tietoa NCI /DTP verkkosivuilla. Keuhkojen, paksusuolen ja munasarjasyövän solulinjoissa, jotka edustavat kolmea syöpien osalta CPT-johdetut kemoterapeuttisten on hyväksytty tai ovat kliinisiä testejä, olemme huomanneet, että 40% kaikkein CPT-herkkä solulinjat ilmensivät huomattavasti korkeampi PS506 kuin teki 40% vastustuskykyisimmät solulinjat, vastaa meidän aikaisempien havaintojen pienemmässä näytteenotto käytettävissä solulinjoista [1]. Väliportaan PS506 ilmentymistä havaittiin 20%: solulinjoja, joiden välissä on CPT herkkyys. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PS506 voi toimia, yhdessä muiden kliiniset tekijät, joilla helpotetaan päätöksentekoa varten potilaiden hoitoon CPT johdettuja lääkkeitä, irinotekaani ja topotekaani. Oikea valinta lääkkeen on ratkaisevan menestyksen hoidon. Tämä on erityisen totta toisen linjan hoito, kuten epäonnistunut hoito voi johtaa vähentynyt fyysinen kunto potilaan ja lisää todennäköisyyttä, että jatkokäsittely on hävinnyt. Nykyä ei ole olemassa luotettavia ennustavan testien herkkyyttä CPT johdettuja lääkkeitä. Soveltaminen PS506 apuna hoidon valinnassa muodostaisi kriittinen vaihe kohti saavuttaa enemmän yksilöllisiä hoito-ohjelmia.

kehitys veripohjaisten määrityksiä PS506 saattavat tarjota diagnostista määritystä varhaista havaitsemista tai seurantaa keuhkojen syöpää tai muita syöpiä. Useat kiertävä proteiinimarkkereita hetkellä kliinisessä käytössä tiettyjä syöpiä, lähinnä seurantaa. Näitä ovat CA125 munasarjasyöpä, CA19-9 haimasyöpä, CEA paksusuolen syöpä, ja PSA eturauhassyövän (tarkistetaan [33]). CYFRA21-1, joka on sytokeratiinista markkerin epiteelisolujen plasmassa tai veressä, on yhdistetty ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja muita epiteelin syövät, mutta on erittäin vaihteleva herkkyys tai spesifisyys maligniteetti. Tuoreessa raportissa kuvataan ELISA-määritystä varten tymidiinikinaasin veressä yksilöiden keuhkosyövän havaitsemiseen, [34]. Ottaen huomioon, että Topo I on yksi 10-25% runsain solun proteiinien soluissa ja plasmassa [35], joka on samanlainen testi PS506 on todennäköisesti toteuttamiskelpoinen ja herkkä. Kun kyseessä on keuhkosyöpä, yskös perustuva määritys voi myös olla mahdollista, kuten syöpäsolut ovat läsnä ysköksen keuhkosyöpään potilailla. Useat muut ehdokas merkkiaineita on tunnistettu [36, 37]. Ei kuitenkaan biomarkkereiden ole vielä osoitettu olevan tarvittava herkkyys, spesifisyys, ja toistettavuus varmennettavat rutiinikäyttöön kliinisessä käytössä, ja lisäksi biomarkkerit tarvitaan.

Mahdollisuus, että PS506 voi olla syy Syöpää lisää huomattavasti kiinnostuksensa biomarkkerina. Koska topo I hallussaan DNA nicking /uudelleenligatoimalla toimintaa, sen tiukka sääntely on kriittinen välttää poikkeava DNA nicking jotka voisivat horjuttaa genomin ja edistää pahanlaatuisten etenemisen [38]. Ektooppisesti ilmentynyt topo I recombinogenic hiivassa ja bakteerien ja voi siten edistää DNA uudelleenjärjestelyjä ja muita genomin epävakautta nisäkässoluissa sekä [39, 40]. Tämä mahdollisuus on todiste siitä, että Topo I on olennaista kromosomin hajoamista aikaan yhteiset hauras sivustoja (CFSs), jossa DNA uudelleenjärjestelyjä esiintyy yleisesti syövän [41, 42]. Yksi hyvin tunnettu CFS, FRA3B, on usein järjestetty uudelleen keuhkosyövän [43].