Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nuclear tekijä KB (NFKB) on keskeinen rooli apoptoosin säätelyyn. Toiminto NFKB on estää sitoutumisen NFKB estäjä (IKB), ja häiriöitä tasapainon NFKB ja lKB on sukua kehittämiseen monia sairauksia, mukaan lukien kasvaimia. Siksi me arveltu, että

NFκB1 (-94del /insATTG) B ja

NFκBIA

(2758 A G) polymorfismit liittyi peräsuolen syöpä (CRC) alttius.

menetelmät

sairaalassa perustuva tapauskontrollitutkimuksessa 1001 CRC potilaiden ja 1005 syöpää vapaa valvonnan taajuus sovitettu iän ja sukupuolen mukaan, me genotyyppi polymorfismit käyttäen polymeraasiketjureaktiota-restriktiofragmenttipituuspolymorfismin (PCR-RFLP) menetelmä ja suorittaa Lusiferaasimäärityksiä ja Western blotting-analyysi sen selvittämiseksi, geneettiset variantit

NFκBIA

muuttamaan geeniekspressioiden ja toimintoja ja siten syöpäriskiä.

tulokset

Huomasimme, että molemmat

NFκB1-94 ins /delATTG

ja

NFκBIA 2758 A G

polymorfismien korreloivat CRC riski (OR = 1,47; 95% CI = 1,14-1,86, ja OR = 1,38; 95% CI = 1,14-1,66, vastaavasti). Lisäksi kun arvioidaan näitä kahta polymorfismien yhteen, yhdistetyt genotyypit 2 variantti (riski) alleelit (

2758GG

ja

-94ins /ins + del /ins

) liittyi suurentunut CRC (OR = 1,71; 95% CI = 1,23-2,38) verrattuna 0 variantti, ja merkittävä suuntaus 2 variantin (riski) alleeleja oli nopeampaa keskuudessa alaryhmien vuotiaiden 60 vuotta naisilla, ei koskaan juovat, tupakoimattomia, henkilöitä, joilla on normaali BMI ja ne, joiden suvussa syöpä (

P

trendi

0,01). Lisäksi Lusiferaasimäärityksiä osoittivat, että G-alleelin 3’UTR merkittävästi vähentynyt

NFκBIA

mRNA vakautta ja

alleelin sääntelyä

miRNA449a in vitro

ja että NFκBIA proteiinin ekspressiotasot

AA + AG

variantti harjoittajat olivat merkittävästi korkeammat peritumoraalista kudoksissa kuin

2758GG

genotyypin.

Johtopäätös

NFκB1

ja

NFκBIA

polymorfismien näyttävät yhdessä myötävaikuttaa riski CRC. Nämä kaksi versiota voi olla geneettinen muokkaaja CRC herkkyys tässä eteläisen Kiinan väestön.

Citation: Song S, Chen D, Lu J, Liao J, Luo Y, Yang Z, et al. (2011)

NFκB1

ja

NFκBIA

polymorfismit liittyvät lisääntynyt riski Sporadic peräsuolen syövän Southern kiinalainen Population. PLoS ONE 6 (6): e21726. doi: 10,1371 /journal.pone.0021726

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2011; Julkaistu: 30 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Tiedesäätiö Kiinan apurahoja [81072042 Lei Wang, 81072366 ja Jiachun Lu ja 81001108 on Yisheng Wei], Guangdongin maakunnan tieteellisen tutkimuksen Grants [8151008901000059, 10251008901000008 Lei Wang] mukaan Gongdong maakunnan hallitus, opetusvirasto Kiinan hallituksen, Science and Technology Department of Kiinan hallituksen [00590101220610034 on Jianping Wang], ja tutkimusrahastoon tohtorikoulutuskeskukseen korkeakoulutuksesta Kiinan [200805580074 jotta Jianpingin Wang] ja Yat-Senin innovatiivisia kykyjä Viljely Program Erinomainen Tutors [88000 -3126201 että Dianke Chen Lei Wang] ja tuettu perustutkimus rahastojen Keski yliopistojen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja toiseksi yleisin syöpä naisilla ympäri maailmaa, ja on arvioitu, että oli noin 1,2 miljoonaa äskettäin diagnosoitu CRC tapauksissa ja 608700 liittyvistä kuolemantapauksista 2008 [1]. Records kunnan kuolema rekisteriin kaupungin Guangzhou, Guangdong, Kiina, osoittavat, että CRC on viidenneksi yleisin syöpä. Kuolleisuus oli dramaattisesti nousi 4,33 /10

5 henkilöä 1970-12.13 /10

5 henkilöä vuonna 2000: n [2]. Suurin osa CRC tapauksista (noin 80%) ovat satunnaisia ​​[3], mutta perinnöllinen alttius on läsnä 20-35%: lla potilaista, mikä viittaa siihen, että sekä geneettiset ja ympäristötekijät edistävät CRC kehitys [4]. Alkoholinkäytön ja tupakoinnin [5], [6], ruokavalion ja elintapojen tekijät [7], ja tulehduksellinen suolistosairaus, kuten haavainen paksusuolen tulehdus [8], [9] ovat osoittaneet liittyvän CRC riski. Vaikka monet ihmiset altistuvat näiden riskitekijöiden, vain muutamia altistuvat yksilöt kehittävät CRC, mikä osoittaa, että geneettinen vaihtelu määritellään osittain yksilöllinen herkkyytensä peräsuolen kasvaimien syntyyn.

Apoptoosi, erittäin säännelty soluprosessin, osallistuu kehittämiseen, kudos homeostaasin ylläpito ja poistaminen ei-toivottuihin soluihin [10]. Säätelyhäiriötä tässä prosessissa on omiaan edistämään kasvaimien syntyyn [11]. Biokemiallinen polkuja apoptoosin ovat monimutkaisia ​​ja riippuvat paitsi soluissa, mutta myös Indusorien apoptoosin. Merkittävät todisteet osoittavat, että esiintyminen ja syövän kehittymisen liittyy sekä laajennettu solujen eloonjäämistä ja keskeytettiin apoptoosin syövän esiasteita ja näin ollen poikkeava apoptoosi voi sallia valitsematta solujen kasvua [12].

Nuclear tekijä kappa B ( NFKB) on merkittävä transkription säätelijä immuunivasteen, soluadheesio, erilaistuminen, proliferaatio, ja apoptoosin [13]. Viisi jäsentä (p50 /p105, p65 /RelA, c-Rel, RelB, ja p52 /P100) on NFKB perhe on tunnistettu, ja dimeerimuodoksi NFκB1 p50 /RelA on tärkeä muoto [14]. Seisoessa solu, NFKB inaktivoituu sytoplasmassa kautta yhdessä eristävän estävä proteiini, IκBα, β tai γ, ja yleisin proteiini tämän perheen on NFKB estäjä α (NFκBIA) [15]. Klassisessa aktivaatioreitin, fosforylaatiota ja hajoamista estävän proteiinien johtaa NFKB irtaantuu NFKB monimutkainen ja translokaation tumaan, jossa se voi aktivoida transkriptiota suuri määrä geenejä [16]. Koska merkittävä transkriptiotekijä, NFKB välittää selviytymisen vastetta estämällä p53-riippuvaista apoptoosia ja säätelystä anti-apoptoottisen jäseniä Bcl-2-perheen ja kaspaasi-inhibiittorit [17], [18]. Sen sijaan, NFKB aktivoituu myös sekä ulkoisten ja sisäisten apoptoottisten ärsykkeille ja välittää ylössäätely pro-apoptoottisia geenejä, kuten

TRAIL R2 /DR5

,

Fas

, ja

Fas

ligandin [19], [20]. Sopimaton aktivointi NFKB voisi häiritä kudosten homeostaasin ja johtaa väärin säädellystä apoptoosin. Lisäksi toiminta NFKB on havaittu useita erilaisia ​​syöpiä, kuten CRC [21], [22], mikä osoittaa, se voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä [23], [24].

NFκB1

(koodaus NFKB) kartat kromosomiin 4q23-q24 ja koostuu 24 eksonista [25], [26], ja sen estävä geeni

NFκBIA

(koodaus IKB) on 3,5 kb pitkä, kuusi eksonit, ja sijaitsee kromosomissa 14q13 [27], [28]. Geneettiset tutkimukset ovat tunnistaneet yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) in

NFκB1

ja

NFκBIA

[29], [30]. Äskettäin yhteinen lisäys /poisto (-94 lisäys /deletionATTG rs28362491) polymorfismi

NFκB1

promoottorialueen ja 3 ’-untranslated alue (3’UTR) polymorfismi 2758A G (rs696) in

NFκBIA

havaittiin merkittävästi korreloi joilla on tulehduksellinen suolistosairaus [31], [32] ja syövät, [33], [34], [35]. Epidemiologiset tutkimukset ovat myös tutkineet yhdistyksen välillä

NFκB1

polymorfismit ja riski CRC saksalaisten ja

NFκBIA

polymorfismi ja riski CRC Ruotsin kanssa ristiriitaisia ​​tuloksia [36], [37].

ei ole ollut edellisessä kertomuksen yhdistyksen välillä

NFκB1

ja

NFκBIA

polymorfismien ja CRC riski. Koska NFKB /IKB-järjestelmä on tärkeä sääntelyn rooli apoptoottisen reitin ja säädeltyyn ilmaus

NFκB1

ja

NFκBIA

on havaittu CRC, me arveltu, että yhdistetty

NFκB1

ja

NFκBIA

polymorfismien voi liittyä suurentunut riski CRC. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me genotyyppi

NFκB1-94 lisäys /deletionATTG

ja

NFκBIA 2758A G

polymorfismien jatkuvaa sairaalan johdolla tapaus-control tutkimus CRC eteläisen Kiinan väestön, ja suoritetaan edelleen Lusiferaasimäärityksiä ja Western blotting-analyysi sen selvittämiseksi, geneettiset variantit

NFκBIA

muuttamaan geeniekspressioiden ja toimintoja ja siten syöpäriskiä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausuma

tutkimusprotokolla hyväksyi institutionaalisten tarkastuslautakunta Sun Yat-Senin yliopistossa. Kirjallinen suostumus saatiin kullekin osallistujalle jälkeen täydellinen selvitys tutkimuksesta.

Tutkittavat ja näytteiden keräämistä

Heinäkuusta 2002 huhtikuussa 2010 kaikkiaan 1001 potilasta, joilla histopatologisesti-vahvistettu ja käsittelemätön satunnaista CRC otettiin takautuvasti rekrytoitiin ensimmäisen ja kuudennen Affiliated Hospital (Ruoansulatuskanavan Anal sairaala) ja Cancer Center Sun Yat-Senin yliopistossa, Guangzhou, Kiina, Affiliated Kasvain sairaalan Guangzhou Medical College, Guangzhou, Kiina, Guangdongin maakunnan kansantasavallan Hospital, Guangzhou, Kiina, ja Panyu kansan sairaalassa, Guangzhou, Kiina. Kaikki nämä aiheet olivat geneettisesti jotka eivät liity etnisten Han kiinalaisia ​​ja olivat kaupungin Guangzhou ja ympäröiviä alueita Etelä-Kiinassa. 1001 tapauksia mukana tässä tutkimuksessa oli 169 (16,9%) tapauksista oikean paksusuolensyöpä, 309 (30,9%) tapauksista jäljellä paksusuolensyöpä, ja 523 (52,2%) peräsuolen syöpä. Mukaan American sekakomitean Cancer pysähdyspaikan Manual oli 171 (17,1%) tapauksista vaiheen I, 320 (31,9%) vaiheen II, 345 (34,5%) vaiheen III, ja 165 (16,5%) vaihe IV. Sillä välin, yhteensä 1005 syöpää vapaa tarkastukset valittiin satunnaisesti aihe altaan yli 10000 yksilöitä, jotka osallistuivat terveystarkastukseen ohjelmia yhteisön terveysasemilla Kiinan Guangzhoussa.

Tutkimus osallistujaa haastateltiin ja tietoja tupakointistatus, alkoholin käyttö ja muut tekijät, kuten suvussa syöpä saatiin käyttämällä strukturoitua kyselylomaketta. Tupakointi tila, alkoholin käyttö ja suvussa syövän määriteltiin aikaisemmin kuvatulla [38]. Aiheet, joiden painoindeksi (BMI) oli 18,5 kg /m

2 luokiteltiin alipainoinen koehenkilöt jonka painoindeksi oli 18,5-24,0 kg /m

2 oli normaali paino, ne, joilla on BMI 24,0 kg /m

2 olivat ylipainoisia [39]. Tapaukset kuuluvat familiaalinen adenomatoottisen polypoosin ja ne tapaukset, jotka täyttivät Amsterdamin perinnöllisten polypoottinen CRC suljettiin.

genotyypin

Viisi ml verta kerättiin jokaisen osallistujan ja genominen DNA eristettiin käyttäen DNA Veri Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Genotyypitys suoritettiin polymeraasiketjureaktio-restriktiofragmentin pituuspolymorfismi (PCR-RFLP) -menetelmää. Määrittämiseksi

NFκB1

promoottori (rs28362491) polymorfismi, SNP sisältävä fragmentti monistettiin käyttäen seuraavia alukkeita: 5′-TGGGCACAAGTCGTTTATGA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CTGGAGCCGGTAGGGAAG-3’ (taaksepäin) . PCR ajettiin 94 ° C: ssa 3 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 s, 56 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 60 s lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 min. PCR-tuotteet (281/285 ep kooltaan) pilkottiin

PFI

MI (Fermentas, Vilna, Liettua) 37 ° C: ssa yön jälkeen 2% agaroosigeelielektroforeesilla. Määrittämiseksi

NFκBIA

(rs696) polymorfismi, SNP sisältävä fragmentti monistettiin käyttäen seuraavia alukkeita: 5′-GGCTGAAAGAACATGGACTTG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GTACACCATTTACAGGAGGG -3’ (taaksepäin). PCR ajettiin 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 32 sykliä 94 ° C 30 s, 54,3 ° C: ssa 45 s ja 72 ° C: ssa 60 s lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 min. Monistettu fragmentit digestoitiin

Hae

III (Fermentas, Vilna, Liettua) yön yli 37 ° C, minkä jälkeen 2% agaroosigeelielektroforeesilla.

genotyypin analyysi tehtiin kaksi experimenters itsenäisesti jotka olivat sokeaksi tilan aiheita kuin potilas tai valvontaa. Edelleen validoimiseksi -genotyypitystulosten, me satunnaisesti valitut 10% näytteistä kunkin 2 SNP suorittamaan toistuvia määrityksiä, ja tulokset olivat 100% yhtäpitävät. Lisäksi 5%: n PCR-tuotteiden kohde-genotyypin puhdistettiin ja varmistettiin suoralla sekvensoinnilla (Kuva S1 ja Kuva S2).

bioinformatiikan analyysi

Sen tutkimiseksi, geneettistä vaihtelua on

NFκBIA

voisi sitoutua MikroRNA (miRNA), etsimme tavoite MikroRNA geneettisen varianttien

NFκBIA

algoritmiin ohjelmat (https://www.targetscan.org ja http: //microrna.sanger .ac.uk /cgi-bin /tavoitteet /v5 /search.pl).

Soluviljely

kolme paksu- adenokarsinooman solulinjoja, HCT116, HT29 ja SW480 hankittiin Culture Collection of Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina) ja viljeltiin rutiininomaisesti Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa tai RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 100 yksiköllä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO 2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa.

RNA-interferenssi, ohimenevä transfektiot ja Lusiferaasimäärityksiä

MiR-449A

matkii kohdistaminen

NFκBIA

, 5′-UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU-3 ’(sense) ja 5′-CAGCUAACAAUACACUGCCAUU-3’ (anti-sense),

miR-449A

estäjä, 5′-ACCAGCUAACAAUACACUGCCA-3 ’, miR -34b jäljittelee kohdistaminen

NFκBIA

, 5′-CAAUCACUAACUCCACUGCCAU-3 ’(sense) ja 5′-GGCAGUGGAGUUAGUGAUUGUU-3’ (anti-sense), ja

miR-34b

estäjä, 5 ’ -AUGGCAGUGGAGUUAGUGAUUG-3 ’syntetisoitiin GenePharma Co. (Shanghai, Kiina). Lisäksi 3’UTR

NFκBIA 2758A

alleelin (2575-2955 emäsparin suhteessa translaation aloituspaikasta), joka sisältää

miR-449A

ja

miR-34b

sitoutumiskohta monistettiin käyttäen seuraavia kahta aluketta, 5′-CCGCTCGAGCAAAGGGGCTGAAAGAA-3 ’(sense) ja 5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAATGTGGTCCTTCCATGA-3’ (anti-sense). Vahvistetut fragmentit pilkottiin

Xho

I ja

Ei

I (New England BioLabs, Ipswich, MA) ja liittää sitten

Xho

I ja

Ei

I restriktiokohta dual-lusiferaasiplasmidin, psiCHECK ™ -2 (Promega, Madison, WI). Lisäksi 3′-UTR

NFκBIA 2758G

alleeli, joka sisälsi mutatoitua mRNA: n sitoutumiskohdan, monistettiin käyttäen PCR-kohdennettua mutageneesiä ja kloonattiin psiCHECK ™ -2. Transfektioon, solut ympättiin 24-kuoppalevyille 1 x 10

5 solua /kuoppa ja sen jälkeen, kun on inkuboitu yön yli, solut ko-transfektoitiin reportteriplasmidilla (2758G tai 2758A alleeli) ja miR jäljittelee tai inhibiittorit käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) seuraten valmistajan protokollaa. Solut hajotettiin 48 tuntia transfektion jälkeen, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja vähintään kolme kertaa itsenäisesti.

Western blotting-analyysi

analysoida korrelaatio

NFκBIA

polymorfismien sen 3’UTR (2758A G ) ja NFκBIA proteiinin ekspressiotasot kudoksissa, 32 pariksi kasvain ja peritumoraalista kudokset saatiin satunnaista CRC potilaista resekoitu kuudennessa Affiliated sairaala Sun Yat-Senin yliopistossa ja arkistoidaan kasvain pankkiin. Kaikki kudokset näytteet histologisesti varmennettu. Immunoblottauksella määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [38] ja vasta-aineiden NFκBIA ja β-aktiini (Precision Task Group, Chicago, USA) käytettiin menettelyä. Proteiini densitometrian suoritettiin käyttäen Gel-Pro Analyzer 4.0 ohjelmisto (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD) ja NFκBIA ilmentyminen normalisoitui vastaan ​​β-aktiini.

Tilastollinen

Kaksipuolinen chi-neliö testejä käytettiin arvioimaan eroja jakaumat ikä, sukupuoli, tupakointi, alkoholin käyttö, painoindeksi, kuukautiset historia, ja suvussa syövän tapausten ja kontrollien välillä. Hardyn-Weinberg tasapaino (HWE) testattiin hyvyyttä-of-fit chi-neliö testi verrata odotettavissa genotyypin taajuuksia havaittujen genotyyppi taajuuksilla (p2 + 2pq + q2 = 1) syövän vapaa valvontaa. Yhdistyksen välillä tapaus-verrokki asema ja kunkin SNP, mitattuna kerroinsuhde (OR) ja sen vastaavan 95%: n luottamusväli (CI), arvioitiin käyttäen ehdoton logistista regressiomallia, ja ilman säätö ikä, sukupuoli, tupakointi tila , alkoholinkäytön tila, BMI, kasvain sivusto, ja suvussa syöpää. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että analyysi yhdistetyn genotyyppien saattaa olla tieteellisesti merkittävä kuin analyysi yhden polymorfismin ennustaa taudin yhdistysten. Siksi yhdistetyn genotyypin tietoja edelleen ositettu iän, sukupuolen, ja tupakointi, alkoholin juominen tila, BMI, kasvain sivusto, ja suvussa syöpää. Regressiomalli käytettiin myös suuntaus testiä. Studentin t-testi suoritettiin tutkimaan ero tasojen lusiferaasireportterigeenin ilmentymisen eri konstrukteja. Kruskal-Wallisin yksisuuntainen ANOVA testejä käytettiin analysointiin NFκBIA proteiinin ilmentymistä peritumoraalista kudoksissa eri genotyyppien. Kaikki testit olivat kaksipuolisia käyttämällä SAS-ohjelmistoa (versio 9.1, SAS Institute, Cary, NC).

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Ominaisuudet tutkimuspopulaation

jakauma demografiset ominaisuudet 1001 satunnaista CRC tapauksissa ja 1005 syöpä-free valvonta on esitetty taulukossa 1. Yleisesti ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa havaittiin ikä, sukupuoli, ja tupakointi välillä tapausten ja kontrollien (

P

0,05 kaikissa). Verrattuna kontrolleihin oli enemmän koskaan juovat (tapaukset kontrolleja, 45,5% vs. 23,6%) (

P

0,01) kohortin CRC tapauksista. Lisäksi verrattuna kontrolleihin, CRC tapaukset olivat todennäköisemmin on suvussa syöpää tai korkeamman painoindeksi (

P

0,05 molemmissa). Näin ollen nämä muuttujat olivat edelleen mukautettu monimuuttujakalibrointiin logistiikkaregressiomallin välttämiseksi sekoittavia tärkeimmistä vaikutuksista SNP tutkittavana. Niitä käytettiin myös myöhemmin kerrostuminen ja geeni-ympäristö vuorovaikutuksen analyysi.

PCR-RFLP tutkimus

NFκB1

promoottorialue ja

NFκBIA

3 ’ UTR alue

suorittaa analyysi

NFκB1

promoottorialueen PCR-RFLP-menetelmällä. Kaksi ATTG toistot ovat läsnä

NFκB1

promoottorialueen, ja yksi alleeli, joka on ATTG lisäys (ins) pilkottiin osaksi 45 bp ja 240 bp: n fragmentti pilkkomisen jälkeen

PFI

MI kun taas toinen poisto-alleelin (del), joka on vain yksi ATTG sen promoottorin ei katkennut (kuvio 1.a). Lisäksi pilkkomisen jälkeen

Hae

III,

2758GG

genotyyppi tuotti 316 emäsparin ja 108 emäsparin kaistan taas 2758AA genotyyppi tuotti yhden 424 emäsparin kaistan, ja heterotsygootit näytetään kaikki 3 bändejä (Kuva 1 B).

(a)

PFI

MI ruoansulatusta bändi profiilia

NFκB1

geeni 2% agarosegel. Kaista 1 Gene hallitsija 100 emäsparin Low Range Ladder, kaistat 2 ja 7 del /ins heterotsygoottianalyysiin genotyyppi, kaistat 4 ja 6

ins /ins

genotyyppi, Lanes3, 5

del /del

genotyyppi. (B)

Hae

III ruoansulatusta bändi profiilia

NFκBIA

2% agarosegel. Kaista 1 Gene hallitsija 100 emäsparin Low Range Ladder, kaistat 3, 5 homotsygoottinen G /G genotyyppi, kaistat 2 ja 6 homozygoottisia A /A-genotyyppi, kaistat 4, 7 heterotsygoottinen A /G-genotyypin.

Euroopan

NFκB1-94ins /delATTG

(rs28362491) ja

NFκBIA 2758A G

(rs696) polymorfismit liittyvät riski satunnaista CRC

genotyyppi ja alleeli jakaumat

NFκB1-94ins /delATTG

(rs28362491) ja

NFκBIA 2758A G

(rs696) polymorfismit joukossa tapausten ja kontrollien on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. havaittu genotyyppi taajuudet näiden kahden polymorfismien olivat kaikki yhteisymmärryksessä Hardy-Weinberg tasapainon verrokeilla (

P

0,05). Kuten taulukosta 2, sillä rs28362491, jakelua yhteistyössä hallitseva geneettinen malli (del /del vs. ins /ins vs. del /ins), ja hallitseva malli (ins /ins + del /ins vs. del /del) vaihteli merkitsevästi CRC tapausten ja kontrollien (ins /ins: OR = 1,70; 95% CI = 1,29-2,25;

P

0,01; del /ins: OR = 1,33; 95% CI = 1,03 -1,74;

P

0,01; ins /ins + del /ins: OR = 1,47; 95% CI = 1,14-1,86;

P

0,01, vastaavasti). Sillä rs696, oli merkittävä ero jakautuminen rs696 genotyyppien välillä CRC tapausten ja kontrollien (

P

0,01). Merkittäviä eroja havaittiin myös jakelun väistyvä mallin rs696 (GG vs. AA + AG) välillä CRC tapausten ja kontrollien (OR = 1,38; 95% CI = 1,14-1,66;

P

0,05) . Johdonmukaisesti, merkittävää yhteyttä todettiin kahden SNP ja riski satunnaista CRC.

ositus analyysi yhdistyksen yhdistettyjen

NFκB1

ja

NFκBIA

polymorfismien kanssa riski CRC

analysoitava tarkemmin yhdistetyn genotyypin

NFκB1

ja

NFκBIA

polymorfismit tutkimalla ikä, sukupuoli, tupakointi, alkoholin, BMI, kasvain sivusto, ja perhe historia syövän logistinen regressio. Yhdistimme

NFκB1

ja

NFκBIA

polymorfismien lukumäärän perusteella variantin (riski) alleelit (eli

2758GG

ja

-94ins /ins + del /ins

). Kuten taulukosta 3, verrattuna

NFκB1-94 del /del

ja

NFκB1IA 2758AA + AG

genotyyppi, yksi variantti yhdistettynä genotyypin kantajia, jotka olivat 60-vuotiailla oli korkeampi riski CRC (OR = 1,57; 95% CI = 1,04-2,38) (

P

0,05). Lisäksi kerrostuminen analyysi paljasti, että yksilöiden kaksi versiota oli huomattavasti suurempi riski CRC keskuudessa potilasalaryhmissä vuotiaiden 60-vuotiaita (OR = 2,18; 95% CI = 1,37-3,44) (

P

0,01) naiset (OR = 2,36; 95% CI = 1,35-4,10) (

P

0,01), tupakoimattomia (OR = 2,05; 95% CI = 1,30-3,22) (

P

0,01), ei koskaan juovat (OR = 1,87; 95% CI = 1,23-2,84) (

P

0,01), henkilöille, joilla on normaali painoindeksi (OR = 1,80; 95% CI = 1.21- 2,69) (

P

0,01) ja ne, joilla on suvussa syöpä (OR = 4,57; 95% CI = 1,34-15,6,

P

0,05).

MiR-449A

jäljittelee tukahdutti toimintaan

NFκBIA

2758 A G-polymorfismi

edelleen analysoineet 3’UTR

NFκBIA

2758 A G-polymorfismi tietokoneella algoritmia ja totesi, että polymorfismi voi vaikuttaa miRNA sitova.

MiR-449A

ja

miR-34b

, jotka ovat mukana monenlaisia ​​biologisia toimintoja, todettiin olevan sitoutumiskohdan sisällä 3′-UTR

NFκBIA

2758 A G polymorfismi (kuva 2a). Voit selvittää alleelispesifinen vaikutus

NFκBIA

2758 A G vaihtoehtoa aktiivisuudesta 3’UTR ja onko tämä polymorfismi vaikuttaa miRNA sitova, transfektoimme CRC solulinjat SW480, HT29, ja HCT116 kanssa toimittaja kantavia plasmideja

2758G

tai

2758A

alleeli miR jäljittelee tai inhibiittorit (kuva 2a). Huomasimme, että ilman miR jäljittelee tai inhibiittorit, verrattuna

2758A

alleeli,

2758G

alleeli näytteillä laski lusiferaasiaktiivisuudet (

P

0,05) (kuvio 2b).

MiR-449A

jäljittelee voisi vähentää suhteellista lusiferaasiaktiivisuudet

2758A

alleeli, kun

miR-449A

estäjät merkittävästi ajan säännellä suhteellista lusiferaasiaktiivisuudet

2758A

alleeli kaikissa kolmessa solulinjoissa (

P

0,01 HT29;

P

0,05 SW480 ja HCT116) (kuva 2b). Toisaalta,

miR-34b

jäljittelee ei aiheuta mitään havaittavia vaikutuksia suhteelliseen lusiferaasiaktiivisuudet

2758G

alleelin näissä solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että

2758G

alleelin 3’UTR

NFκBIA

vähentää normalisoitu lusiferaasin aktiivisuus verrattuna

2758A

alleeli, todennäköisesti vastaa alennetaan mRNA vakautta tai translaation tehoon ja että

miR-449A

on kyky sitoa ja osittain tukahduttaa lusiferaasiekspressio kautta

NFκBIA

3’UTR segmentti, kun kannat

2758A

alleeli on

NFκBIA

2758 A G-polymorfismi.

(a) Oletettu kohdepaikan

miR-449A ja miR-34b

hyvin säilyneitä

NFκBIA

mRNA 3’UTR. (B) psiCHECK-2 Dual lusiferaasimäärityssysteamiä kolmessa solulinjoissa: SW480, HT29 ja HCT116. Solut transfektoitiin toimittaja plasmideilla yksinään tai ko-transfektoitiin microRNA. Lusiferaasin ilmentyminen mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Lusiferaasiaktiivisuutta kutakin konstruktia normalisoitui vastaan ​​sisäisen valvonnan Renillan lusiferaasin. Sarakkeet, keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta; baareja, SD. *,

P

0,05 vertailut kunkin solulinjan toiminnan välillä reportterigeenirakenteilla.

ry

NFκBIA3’UTR

polymorfismit kanssa NFκBIA proteiinin ilmentymistä

Olimme kiinnostuneita myös tutkivat,

NFκBIA3’UTR

polymorfismien (

2758A G

) liittyvän kohonneeseen tai vähentää ilmentymistä NFκBIA proteiinin . Keräsimme 32 pariksi kasvain ja peritumoraalista kudoksia käsittelemättömästä CRC potilaiden eri genotyypit. Immunoblottauksella analyysi paljasti, että tasot NFκBIA (NFκBIA /β-aktiini-proteiinin suhteen) on peritumoraalista kudosten 12 tapausta

2758AA

genotyyppi oli 0,80 ± 0,09, ja ne, 8 tapausta

2758AG

genotyyppi oli 0,63 ± 0,11, jotka molemmat olivat merkittävästi korkeammat kuin muissa 12 tapausta

2758GG

genotyyppi (0,47 ± 0,06) (varianssianalyysi testi,

P

G

. NFκBIA proteiinin ekspressiotasot normalisoitiin kuin β-aktiini laskemalla suhteellisia ekspressiotasoja. Yksittäiset genotyyppi nimitys: For 2758A G, kaistat 1-3, 9-11, 17-20, 25-26, AA genotyyppi (n = 12); kaistat 4-6,12-14, 21-24, 27-28, GG-genotyyppi (n = 12); kaistat 7-8, 15-16, 29-32, AG-genotyyppi (n = 8).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet yhdistysten

NFκB1-94del /insATTG

ja

NFκB1IA 2758A G

polymorfismien kanssa riski CRC eteläisen Han-kiinalaisia ​​väestöstä. Huomasimme, että sekä

NFkB1-94del /ins ATTG

ja

NFkBIA 2758A G

polymorfismien liittyi suurentunut CRC. Sillä

NFkB1

–

94del /insATTG

polymorfismi, jossa

-94del /del

ohjearvon, huomasimme, että

-94 (ins /ins + del /ins) B genotyyppi liittyi tilastollisesti merkitsevästi suurempi riski CRC. Sillä

NFKBIA 2758A G

polymorfismi, jossa

2758 (AA + GA) B ohjearvon, Huomasimme myös, että

2758GG

genotyyppi liittyi tilastollisesti merkittävästi lisääntynyt riski CRC. Lisäksi kun arvioimme

NFkB1

ja

NFKBIA

polymorfismien yhdistelmänä, huomasimme, että yhdistetyn

2758GG

ja

-94ins /ins + del /ins

genotyyppi liittyi merkitsevästi suurentunut CRC verrattuna ilman

2758GG

ja

-94ins /ins + del /ins

genotyyppi, ja tämä riski oli jyrkempi nuorempien kuin 60 vuotta naisilla, ei koskaan juovat, tupakoimattomia, henkilöitä, joilla on normaali BMI ja ne, joilla suvussa syöpää. In vitro määrityksissä, Huomasimme myös, että verrattuna

2758A

alleeli,

2758G

variantti alleeli näytti vähentynyt merkittävästi mRNA vakautta ja /tai translaation tehoon. Lisäksi olemme havainneet, että NFkBIA tasoja merkitsevästi korkeampi peritumoraalista kudoksissa potilailta on

2758AA + AG

genotyyppien kuin

2758GG

genotyyppejä, mikä viittaa siihen, että

2758A G

polymorfismi on potentiaalisesti toimiva ja polymorfismin

2758A G

at 3’UTR

NFkBIA

voivat vaikuttaa geenin ilmentymisen. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus selvittää, onko

NFkB1

ja

NFkBIA

polymorfismi ja niiden yhteenlaskettu polymorfismi liittyi riski CRC.

On useita rivejä todiste havaintomme.

NFKB

1 väyliä näyttävät kriittinen rooli useissa ihmisen patologioiden säätelemällä geenien transkriptiota osallisena immuunivasteen, solujen lisääntymistä, ja apoptoosin [13]. On osoitettu, että muutoksia on

NFKB

1 ilmentyminen on tärkeä rooli solujen suojaamiseksi apoptoosilta [40].

NFKB

1-aktiivisuuden on havaittu eri syöpätyyppien [41], mukaan lukien rintasyövän [42] ja CRC [21], myötävaikuttaa kasvaimen angiogeneesiä ja etenemiseen [43]. On myös monia kokeelliset tiedot viittaavat siihen, että NFκB1 /IKB reitti voi osallistua kasvainsolun invaasiota samoin [44]. Siksi variantit

NFκB1

ja

NFκBIA

geenejä, jos toiminnallinen, voidaan odottaa vaikuttavan solukuoleman, ja siten, syövän syntymistä.

Useat yhdistys tutkimuksissa on raportoitu, että

NFκB1

ja

NFκBIA

polymorfismien liittyy kehittämiseen tulehduksellisten ja muiden tautien, mukaan lukien haavainen paksusuolentulehdus, Gravesin tauti, ja diabetes, ja alttius kasvaimet, mukaan lukien melanooma, virtsarakon syöpä ja CRC eri etnisten ryhmien [32], [36], [45], [46], [47], [48].