Krooninen sairaus

tiivistelmä

fotoreseptori-spesifistä reseptoria (PNR /NR2E3 ) on orpo tumareseptori että on ratkaiseva merkitys verkkokalvon kehitykseen ja valoreseptorin ylläpitoon. Sairaus aiheuttavia mutaatioita PNR on pleiotrooppinen vaikutus, tuloksena vaihtelevissa verkkokalvon sairauksien. Äskettäin PNR on liitetty ohjaus solun toimintojen syöpäsoluissa. PNR ilmoitettiin olevan uusi säätelijä ERa ilmaisun rintasyöpäsoluissa, ja korkea PNR ilmentyminen korreloi myönteistä vastausta tamoksifeenihoidon. Lisäksi PNR havaittiin lisäävän p53 vakautta HeLa-soluissa, mikä tarkoittaa, että PNR voi olla terapeuttista tavoite tässä ja muiden syöpien, jotka säilyttävät villityypin p53-geenin. Voidaan helpottaa ymmärtämistä PNR toimintojen syövän, me tunnettu yhdiste 11a, synteettinen, otaksuttu PNR agonisti useissa soluihin perustuvissa määrityksissä. Mielenkiintoista, osoitimme, että 11a ei aktivoida PNR ja sen sytotoksisuus oli riippumaton PNR ilmaisun ilman PNR välittäjänä 11a sytotoksisuuteen. Systemaattinen analyysit sytotoksisten vaikutusten 11a NCI-60-solulinjojen paljasti voimakas positiivinen korrelaatio sytotoksisuuden p53: n kanssa asema, toisin sanoen p53 villityypin solulinjat olivat huomattavasti herkempiä 11a kuin p53 mutatoitu tai null-solulinjat. Lisäksi käyttämällä HCT116 p53 + /+ ja p53 – /- isogeenisiin solulinjoilla me paljasti, että mekanismi 11a aiheuttaman sytotoksisuuden tapahtui läpi G

1 /S faasin solukierron pysähtymisen sijaan apoptoosin. Lopuksi havaitsimme korrelaatio 11a herkkyys p53 asema mutta ei PNR ilmaisua, mikä viittaa siihen, että kasvaimet ilmentävät villityyppistä p53 voisi olla reagoivat tämän yhdisteen.

Citation: Zhao Z, Wang L, Wen Z, Ayaz-Guner S, Wang Y, Ahlquist P, et ai. (2013) systemaattinen analysointi sytotoksisille vaikutuksille Yhdisteen 11a, otaksuttu Synthetic agonistiaktivointi fotoreseptorin-Specific Nuclear Reseptori (PNR), Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (9): e75198. doi: 10,1371 /journal.pone.0075198

Editor: Eric Xu, Van Andelin Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 14, 2013; Hyväksytty: 11 elokuu 2013; Julkaistu: 16 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukevat National Institutes of Health CA125387 on WX, NIH myöntää CA22443 PA ja DOD toivon aikakautta Scholar Award W81XWYH-11-1-0237 jotta WX. PA on tutkija ja Howard Hughes Medical Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nukleaarihormonireseptorit säätelevät erilaisia ​​olennaisia ​​biologisten prosessien kuten kehitys-, erilaistuminen ja solujen eloonjäämistä [1-3]. Niiden toiminta ja ekspressiotasot niitä valvotaan, ja häiriöstä tumareseptoreiden (NR) ja niiden jaksoihin on mukana aineenvaihdunnan sairauksiin ja syövän kehityksen [4-6]. NR ovat toiseksi suurin perheen proteiineja, jotka on kohdistettu lääkkeet [7]. Niistä 48 tumareseptorit tunnistettu ihmisellä noin puolet ovat hyvin ominaista, joiden tiedetään luonnon ligandien. Loput NR ovat ns orpo tumareseptoreista koska niiden fysiologisia ligandeja ei vielä tunneta. Huolimatta vailla luonnollista ligandeja, orpo tumareseptoreista voidaan kohdistaa synteettisten ligandien hoitoon ihmisten sairauksien, esim. synteettiset ROR ja LRH-1 agonistit käyttää hoitamaan metabolisia ja autoimmuunisairauksien [8]. Fluoresoiva polarisaatio määrityksiä, monistettiin luminoiva läheisyys homogeeninen (ALPHAScreen) määritykset, ja aikaerotteisen fluoresenssin energiansiirtoon (TR-FERT) määrityksiä on kehitetty suuren suoritustehon seulonnan (HTS) lähestyy tunnistamaan yhdisteitä, jotka kohdistuvat tumareseptoreista hoitotarkoituksessa [9- 12].

NR2E3 /PNR on orpo tumareseptorin joka ilmentyy voimakkaasti verkkokalvon soluissa [13] ja vaatimattomasti ilmaistuna eturauhasen ja kohdun kudoksissa [14,15]. PNR aktivoi sauvan erityisiä geenien ilmentyminen ja vaimentaa kartion erityinen geeniekspressiota alaspäin säätäminen sykliini D1 ja TBX2 [16-20]. Tämä geenisäätelyn malli määritellään kaksoisrooli PNR välittämisessä kehittämiseen ja ylläpitoon photoreceptors [21]. Mutaatiot PNR on löydetty eri verkkokalvon sairauksien, kuten tehostetusta S-kartio oireyhtymä, autosomaalinen hallitseva ja resessiivinen muodot retinitis pigmentosa, Goldmann-Favre oireyhtymä, ja kokkareista pigmentaarisen verkkokalvon rappeuma [22-27]. Kehittyvät todisteet viittaavat siihen, että PNR voi olla tärkeitä tehtäviä syöpäsolujen säätelemällä p53 vakautta ja estrogeenireseptori alfa (ERa) lauseke. HeLa ja HCT116 p53-positiivisia syöpäsolulinjoja, PNR stabiloi p53 asetyloimalla ja indusoi apoptoosia [28]. Vuonna ERa-positiivisen rintasyövän MCF7 ja T47D, PNR säätelee ERa suoraan sitoutumalla ERa promoottorialueen, mikä lisää ERa-geenin ilmentymisen [29]. Ilmaisu PNR on myös merkittävästi liittyy uusiutumista elinaika ja suotuisa tamoksifeenin vaste ERa-positiivisia, imusolmukenegatiivisista rintasyöpäpotilaiden [29]. Nämä tutkimukset tarkoita, että PNR voi olla terapeuttinen kohde verkkokalvon sairauksien, syöpien säilyttää villityypin p53-geenin, ja ERa-positiivisia rintasyöpiä.

PNR erityisiä agonistit, joko luonnollisia tai synteettisiä, on tunnistettu käyttäen suuren läpimenon seulontamäärityksiin. Koska apo-PNR on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa co-repressorit N-COR, SMRT, ja RetCoR [20,30], synteettinen PNR agonisti yhdiste 11a tunnistettiin käyttäen GAL4 DNA: ta sitovan domeenin PNR-ligandia sitovan domeenin fuusio β-laktamaasi transaktivointimääritys ja NCOR vapautumisen määritys [30,31]. Vaikka 11a testattiin soluun perustuvissa määrityksissä agonistiselle vaikutuksia PNR ja osoitettiin olevan vähän myrkyllinen hallinnassa solulinjoissa, 11a ei ole osoitettu sitovan PNR suoraan. Pikemminkin, viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että 11a ei todennäköisesti ole suoraa PNR agonistia [32]. Tuloksemme yhtyy tähän myöhemmin tehdään. Koska PNR hiljattain osallisena ERa rintasyöpä ja osoitettu säätelevän p53 vakautta, tämä yhdiste voi olla terapeuttista käyttöä. Kuitenkin järjestelmällinen arviointi yhdisteen sytotoksisuuden puuttui että matkapuhelinverkon tavoitteita 11a ei ole vielä määritelty. Tässä tutkimuksessa olemme järjestelmällisesti arvioitu sytotoksisille vaikutuksille 11a NCI-60 solulinjaa [33] ja totesi, että 11 a sytotoksisuus on riippumaton PNR ilmaisun mutta positiivisesti korreloi p53 asema, joilla on korkeampi herkkyys p53 villityypin solulinjoilla kuin p53 null /mutantti solulinjat. Käyttämällä HCT116 p53 + /+ ja p53 – /- isogeenisiin solulinjat, osoitimme, että sytotoksiset vaikutukset 11a johtui lähinnä p53-induced G

1 /S faasin solusyklin pysähtymiseen, vähäisin osuutta apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja 11a hoito

LM2 solulinja oli ystävällinen lahjoitus tri Joan Massagué [34]. HCT116 isogeenisiin solulinjat olivat ystävällinen lahja Dr. B. Vogelstein [35]. Kaikki muut solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). HEK293T-, MCF7, MDA-MB-231, LM2, MDA-MB-468, SKOV3- ja HCT116 isogeenisiin solulinjoja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. A2780 ja OVCAR3 munasarjasyövän solulinjoja ylläpidettiin RPMI-1640 (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. T47D breast cancer solulinjaa ylläpidettiin DMEM /F12 (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Yhdiste 11a ostettiin Pharmabridge Inc. (Pennsylvania Biotechnology Center, Doylestown, PA). 11a jauhe liuotettiin etanoliin ensin ja sitten dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) lopulliseen konsentraatioon 8 mM. Asynchronous solut ympättiin 24 tuntia ennen käsittelyä 11 a, niin että solut olivat noin 50% -60% konfluentteja aikaan 11a lisäksi. Lopullinen pitoisuus 11 nM – uM alue saavutettiin laimentamalla 11a tuoreessa väliaineessa, ja 0,1% DMSO: ta käytettiin kontrollina kussakin kokeessa. All-trans-retinoiinihapon, doksorubisiini, etoposidi, staurosporiini ja 3-aminobentsamidi hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO).

solusyklin analyysiä varten solut pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan, jotta saavutettaisiin G

0 synkronointi. Solujen annettiin sitten palata solukierron täydentämällä DMEM plus 10% FBS, joka sisältää osoitetut pitoisuudet 11a.

Retrovirus pakkaus, infektio ja vakaa solulinjasta sukupolven

pakkaus plasmidit PME-VSVG, pHIT60 ja pLNCX ostettiin OpenBiosystems (Huntsville, AL). Retroviruksia pakattiin HEK293T transfektoiduissa soluissa 3.8 ug PME-VSVG, 1.4 ug pHIT60 ja 3,8 ug pLNCX-GFP tai pLNCX-PNR käyttäen Transit-LT1 reagenssia (Mirus Bio) mukaan valmistajan ohjeiden. Kuusi tuntia transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin. Viruspartikkelit olivat sitten talteen 24-48 tuntia myöhemmin käyttäen 0,45 um: n ruiskun suodattimen (Thermo Scientific).

tartuttaa soluja retrovirukset, virusten sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa tuoretta väliainetta, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Polybreeni lisättiin lopulliseen konsentraatioon 5 ug /ml, jotta voidaan lisätä infektion tehokkuutta. Väliaine vaihdettiin 6 tuntia infektion jälkeen. Solut valittiin G418: aa (800 ug /ml) viikon tuottaa stabiileja solulinjoja ilmentävät GFP tai PNR.

CellTiter Glo luminoiva solujen elinkelpoisuuden määritykset

Tuhat solua kuoppaa kohti ympättiin neljänä 384-kuoppalevylle ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla 11 viikon. Sitten solut altistettiin CellTiter Glo luminoiva solunelinkykyisyysmääritys mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega, Madison, WI). IC

50-arvot laskettiin käyttämällä XLfit

TM-apuohjelma Excel.

lusiferaasireporttiterilla määrityksissä

DR2-ajettu lusiferaasireportteri, TLX ja COUP-TFI plasmidit olivat ystävällisiä lahjoja tohtori Ronald Evans. COUP-TFII plasmidi oli ystävällinen lahjoitus tri Michael Gould. Toinen plasmidit hankittiin OpenBiosystems (Huntsville, AL). Lusiferaasimäärityksiä suoritettiin käyttäen Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI). HEK293T-solut ympättiin 96-kuoppaisen levyn (2 x 10

3 /kuoppa). 24 tunnin kuluttua solut transfektoitiin käyttäen Transit-LT1 (Mirus Bio) ja 20 ng DR2-odotuksiin lusiferaasireportteri, 10 ng β-galaktosidaasi toimittaja, ja 20 ng CMV ekspressiovektorin valvontaa, PNR, TLX, COUP-TFI tai COUP-TFII. Yhdiste 11 a, lisättiin 24 tuntia transfektion jälkeen, ja lusiferaasiaktiivisuus määritettiin inkuboinnin jälkeen vielä 24 tuntia. β-galaktosidaasi-aktiivisuus, jota käytetään normalisoimaan transfektiotehokkuuden.

soluproliferaatiomääritykset

Soluja (2 x 10

3 /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevylle. 24 tunnin kuluttua, eri pitoisuuksia 11 a lisättiin levyille. Soluja viljeltiin 72 tuntia, ja sitten 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (Sigma-Aldrich) -liuosta (20 ui per kuoppa, 4 mg /ml PBS: ssä) lisättiin. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan. Supernatantin hylkäämisen jälkeen, 200 ui DMSO: ta lisättiin, ja absorbanssi mitattiin 540 nm: n suodatinta Victor X5 mikrolevylukijalla (PerkinElmer, Waltham, MA). Arvioitu IC

50-arvot laskettiin käyttäen GraphPad Prism Software (Version 5.04, Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA) ja kolmen parametrin log vs. vastaus epälineaarinen regressio.

Cell Cycle Analysis

Solut kerättiin trypsinaatiolla, sentrifugoidaan ja kiinnitettiin 80% jääkylmää etanolia tipoittain jatkuvan vorteksoimalla. Ennen analyysiä varten solut sentrifugoitiin, ja etanoli poistettiin. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PI /RNAasi-liuosta (50 ug /ml propidiumjodidilla, 50 ug /ml RNaasi A: ta, 0,25% Triton X-100 PBS: ssä). Virtaussytometria-analyysi tehtiin FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA), jossa eksitaatio 488 nm: ssä. Integroitu punainen fluoresoiva histogrammit analysoitiin Modfit LT (Verity House Software, Topsham, ME).

apoptoosimäärityksessä mitattuna anneksiini V /PI-värjäys

Solut värjättiin Alexa-488 anneksiini V ja PI, ja arvioidaan apoptoosin virtaussytometrialla mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen). Lyhyesti, 1 x 10

6 solut pestiin kahdesti PBS: llä ja värjättiin 5 ui anneksiini V ja 1 ui PI (100 ug /ml) 1 x sitomispuskurissa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Virtaussytometria-analyysi suoritettiin FACSCalibur. Sekä varhainen apoptoottinen (anneksiini V-positiivisia, PI-negatiivinen) ja myöhäinen (anneksiini V-positiivisia ja PI-positiivisia) apoptoottisia soluja mukana solukuoleman määrityksen analysoitiin FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR).

Western blot -analyysi

Solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskurilla (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 1% Triton X 100, 1 mM DTT: tä, proteaasi-inhibiittorit ja bentsonaasille) . Sentrifugoinnin jälkeen kokonais-proteiinin määrä määritettiin käyttäen BioRad Protein Assay (BioRad), ja 25 ug proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle 1,5 tuntia 0,35 A. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa, ja inkuboitiin primäärisen vasta-aineen huoneen lämpötilassa 2 tuntia tai yön yli. Sitten kalvot inkuboitiin sekundaarisella vasta-aineella 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja se värjätään SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Scientific, Waltham, MA) on -autoradiografiafilmille. Anti-PNR-vasta kertyi Genemed Synthesis Inc., TX. Kaksi KLH-konjugoituja peptidejä syntetisoitiin Genemed Synthesis Inc.: PETRGLKDPEHVEALQD ja LSQHSKAHHPSQP, joka vastaa ihmisen PNR aminohappoja 331-347 ja 353-365, vastaavasti. Näitä peptidejä käytettiin kaniinien immunisointiin. Antiseerumia affiniteettipuhdistettu jälkeen lopullinen bleed saada anti-PNR spesifistä vasta-ainetta. Anti-p53 ja anti-p21-vasta-aineet on saatu Pierce (Rockford, IL); anti-sykliini D1 ja anti-Hsp90 vasta saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); anti-PARP-vasta saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Quantitative Real-Time PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä HP Total RNA Kit (VWR Scientific, West Chester, PA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 1 ug RNA: ta päinvastaiseksi puhtaaksi käyttäen Superscript II RT mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green väriainetta (Roche Scientific, Basel, Sveitsi) ja CFX96 väline (BioRad, Hercules, CA ). Alukkeet sekvenssit (IDT, Coralville, IA) käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: COUP TFII: eteenpäin, 5′-GCCATAGTCCTGTTCACCTC-3 ’; käänteinen, 5’-GGTACTGGCTCCTAACGTATTC-3 ’; RARB2: eteenpäin, 5’-GTGGAGTTTGCTAAACGTCTG-3 ’; käänteinen, 5’-TCATGGTGTCTTGTTCTGGG-3 ’; NGFI-A: eteenpäin, 5’-CAGCACCTTCAACCCTCAG-3 ’; käänteinen, 5’AGTCGAGTGGTTTGGCTG-3 ’; 18S: eteenpäin, 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 ’; käänteinen, 5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3 ’.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. Tilastollisesti merkittävä GI

50-arvot välillä villityypin, mutatoitunut, ja null p53 solulinjoissa laskettiin käyttäen kaksipuolista parittoman Wilcoxonin Rank Sum testi. Tilastollinen merkitys geenin ilmentymisen qRT-PCR-analyysi ja apoptoosin määritykset laskettiin käyttäen kaksipuolista Studentin t-testi.

Tulokset

11a ei ole agonistivaikutukset kohti PNR solu- perustuvissa määrityksissä

Tutkitaan solufunktiot PNR käytimme yhdiste 11a (rakenne kuvassa 1A), joka on aiemmin kuvattu otaksuttu PNR agonistin syklopropyyliryhmä amidiryhmän raportoitu antaa korkea agonistinen aktiivisuus PNR (EY

50 200 nM) [31]. Yhdiste 11a syntetisoitiin ja

1 H-NMR ja massaspektrometria tiedot (kuviot S1 ja S2) vahvisti oikean molekyylirakenne ja molekyylipaino 11 a. TLX, COUP-TFI ja COUP-TFII ovat samassa ytimen reseptorin alaperhe kuin PNR [36], jotka sitoutuvat suoraan toistuminen GGTCA motiivin kanssa 2-emäsparin etäisyys (DR2) [37]. Sen arvioimiseksi spesifisyyden 11a paluurajakohtaa aktivoinnin PNR ja nämä liittyvät läheisesti orporeseptorien by 11a verrattiin joka DR2 rakentuvassa lusiferaasireportteri määritys (kuvio 1 B ja 1 C). HEK293T-solut transfektoitiin ekspressiovektoreilla PNR [13], TLX [38], COUP-TFI [39], tai COUP-TFII [39], ja DR2-ajettu lusiferaasireportterigeeniin, ja soluja käsiteltiin seuraavaksi 11 käyttäen pitoisuuksina 15 nM 150 nM minimoimiseksi sytotoksinen vaikutus. Klo 15 nM, 11a ei aktivoinut jonkin tumareseptorien testattu. Koska pitoisuus kasvoi, 11a hieman aktivoitu TLX, COUP-TFI ja COUP-TFII annoksesta riippuvaisella tavalla. Kuitenkin PNR aktivoitumisen yhteydessä vain suurimmalla testatulla pitoisuudella ( 150 nM) (kuvio 1 B). Totesimme, että pitoisuudet 11a suurempi kuin 150 nM olivat sytotoksisia ja indusoi vakavaa solukuoleman, mikä rajoitti tarkkuutta lusiferaasireportterigeenin määritys. Tämä tulos osoitti, että 11a ei ole ilmeinen agonistivaikutukset kohti PNR. Koska PNR oli vähiten aktivoitu joukossa neljä tumareseptorien testataan osoitetulla alueella 11a pitoisuuksien (kuvio 1 C), tuloksemme osoittavat, että spesifisyys 11a kohti PNR on alhainen ja agonismilla 11a ei todennäköisesti ole suoraa vaikutusta, kuten on esitetty että NCOR julkaisu tutkimuksessa, jossa 11 a esti myös TRp-NCOR ja RARa-NCOR vuorovaikutusta [32].

(A) kemiallinen rakenne 11a. HEK293T-solut transfektoitiin ilmoitetuilla konstruktit käsiteltiin kolmena kappaleena 0,1% DMSO: ta, 15 nM, 30 nM, 60 nM, 120 nM tai 150 nM 11a. Tulokset ilmaistaan ​​suhteessa lusiferaasiyksiköt normalisoida DMSO-kontrollin ± SD. (B) vertailu eri tumareseptoreista yhä 11a pitoisuuksilla. (C) Vertailu eri annosten 11a eri tumareseptoreista.

Koska 11a aktivoitu PNR liittyviä tumareseptoreista COUP-TFI ja COUP-TFII että DR2 lusiferaasianalyysissä klo suhteellisen alhainen pitoisuus 30 nM (kuvio 1) ja ainoastaan ​​COUP-TFII voitiin havaita kaikissa rintasyövän solulinjoissa [40], tutkimme onko 11a voisi muuttaa ilmaus COUP-TFII loppupään kohdegeenien MCF7 ja T47D, kaksi ERa positiivisen rintasyövän solulinjoissa . COUP-TFII on liitetty erilaisten syöpien sekä onkogeeninen ja kasvaimen tukahduttava vaikutus [41]. Rintasyöpäsoluissa, RARB2 [42,43] ja NGFI-A [44,45] ovat kaksi hyvin tunnettu suora tavoitteet ajan säätelee COUP-TFII. All-trans retinoiinihappo (ATRA) on aiemmin osoitettu lisäävän COUP-TFII mRNA-tasolla sekä parantaa COUP-TFII alavirtaan kohdegeenin ilmentyminen [46]. Todellakin, 1 uM ATRA todettiin lisäävän COUP-TFII mRNA-tasolla noin 1,5- ja 2,5-kertaiseksi MCF7 ja T47D-soluissa, vastaavasti (kuva S3). Mielenkiintoista, vaikka 11a ei lisännyt COUP-TFII mRNA tasot kahdessa solulinjassa, 11a hoito johti säätely ylöspäin COUP-TFII kohdegeenien. Vuonna MCF7 solulinjassa, 0,1pM 11a aiheuttama NGFI-geeni ilmentymisen samalle tasolle kuin 1 uM ATRA. 1 uM 11a aiheuttama NGFI-A ilmaus ~ 5 kertaa yli että 1 uM ATRA (kuvio S3A). Koska NGFI-A: n eks- on liian alhainen, jotta havaitaan T47D-soluissa, mittasimme toinen COUP-TFII kohdegeenin, RARB2. Vuonna T47D solut, ATRA voimakkaasti lisääntynyt RARB2 mRNA-tasolla 30-kertaiseksi. Vaikka 11a myös lisääntynyt RARB2 ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla, suuruus aktivointi ei ollut rinnastettavissa ATRA (kuvio S3B). Nämä tulokset osoittivat, että 11 mahdollisesti säätelee COUP-TFII aktiivisuuden geeneihin ja soluihin spesifisellä tavalla.

Koska 11a indusoidun solukuoleman HEK293T-soluissa korkeilla pitoisuuksilla ja PNR on osoitettu aiheuttavan apoptoosia useissa solutyypeissä [ ,,,0],28], me tutki tarkemmin sitä 11a aiheuttama sytotoksisuus PNR-välittämä. Koska PNR on havaittavissa Western blot -menetelmällä rintasyövän solulinjoissa, useita vakaita PNR yli-ilmentyminen rintasyöpäsolulinjoissa, MCF7, MDA-MB-231, LM2 [34] ja MDA-MB-468-soluja, oli tuotettu (kuvio 2A). MTT Soluproliferaatiomäärityksiä käytettiin sitten määrittämään IC

50-arvot 11 GFP-proteiinia ekspressoivien ohjaus solulinjojen ja PNR-yliekspressoivassa solulinjat. IC

50-arvot soluissa yli-ilmentävät PNR olivat samanlaisia ​​kuin vastaava valvonta solulinjoissa (kuvio 2B-E), jossa IC

50-arvot vaihtelevat 0,05-0,7 uM. Koska PNR yli-ilmentyminen ei vaikuttanut 11a sytotoksisuutta tahansa solujen testattu, tuloksemme osoittavat, että 11-indusoitu sytotoksisuus on todennäköisesti riippumaton PNR näissä soluissa.

(A) Rintasyöpä solut infektoitiin retroviruksilla ilmentävät GFP tai PNR. PNR-ekspressiota havaittiin Western blot ja Hsp90 käytettiin lastaus ohjaus. (B) MCF7, (C) MDA-MB-231, (D) LM2 ja (E) MDA-MB-468-rintasyöpäsolujen käsiteltiin 11 pitoisuuksilla välillä 10

-8-10

-3 M 72 tuntia, ja 11 a IC

50-arvot saatiin MTT solukasvukokeissa.

11a sytotoksisuus korreloi p53: NCI-60 solulinjaa

tutkimiseksi edelleen sytotoksisuusmekanismin että matkapuhelinverkon tavoitteet 11 a, käytimme Developmental Therapeutics Program (DTP) NCI-60 solulinjan seulonta palvelu, julkisesti saatavilla palvelu, joka auttaa määritettäessä yhdisteen sytotoksisuuden paneelissa 60 syöpäsolun linjat, jotta arvioimaan sytotoksisuuden 11a 60 solulinjoissa [47]. 11a sytotoksisuustiedot 58 NCI-60 solulinjat saatiin DTP ja GI

50 tiedot on esitetty kuvioissa S4-S6. Tämä tutkimus koostui 60 solulinjojen 9 eri syöpätyypeistä: leukemia, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, paksusuolen syöpä, CNS syöpä, melanooma, munasarjasyöpä, munuaissyöpä, eturauhassyöpä ja rintasyöpä. Sulphordamine-B (SRB) määritystä käytettiin saamiseksi GI

50 (50% kasvun inhibitio) arvot eri syöpäsolulinjojen. Huolimatta erilaisia ​​solulinjoja mukana, GI

50-arvot 11 laski kapealla alueella (10

-6-10

-5 M). Koska edellisessä tutkimuksessa todettiin, että PNR stabiloi p53 translaation jälkeisen modifikaation HeLa ja HCT116 solulinjat [28], me seuraavaksi tutkittava, onko 11 a herkkyys korreloi p53 ekspressiotaso tai mutaatiostatus. P53-mutaation tila NCI-60-solulinjoissa on aiemmin määritettiin [48]. 58 solulinjat saimme GI

50 tiedot DTP voidaan jakaa kahteen luokkaan: p53 villityypin ja p53 mutatoitunut /null (taulukko 1). Vertaamalla GI

50-arvot kahdessa ryhmässä (kuvio 3), olemme havainneet, että p53: n villin tyypin solulinjat olivat huomattavasti herkempiä kuin p53-mutatoitunut tai null solulinjoja, joiden keskimääräinen GI

50-arvot 12,0 uM ja 19,9 uM (p = 0,039, kaksipuolinen). Nämä tulokset p53 otaksutuksi tekijä 11a aiheuttama sytotoksisuuden.

P53 WT

p53 Mut /Null

solulinjan

väk. (UM) B solulinjassa

väk. (UM) B solulinjassa

väk. (UM) B solulinjassa

väk. (µM)

SR12.70HL-608.27KM1220.90OVCAR-551.50A54916.20K-5623.59SW-62030.50OVCAR-813.30NCI-H46018.20MOLT-47.36SF-26838.20ADR-RES3.16HCT-1165.39RPMI-82261.24SF-2955.27SKOV340.20LOX IMVI7.10EKVX2.84SF-53924.20786-021.10MALME-3M20.90HOP-6219.40SNB-1932.40RXF 39326.30SK-MEL-51.28HOP-9217.60SNB-7518.50SN12C27.50UACC-2573.46NCI-H22616.90U25121.40TK-1029.80UACC-6221.40NCI-H237.49M1416.80PC-312.10A49811.60NCI-H322M54.80MDA-MB-43514.50DU-14537.90ACHN13.70NCI-H52213.60SK-MEL-222.80MDA-MB-23116.50CAKI-114.20COLO 20512.40SK-MEL-2818.50HS578T53.40UO-3116.90HCC-299822.30IGROV124.20BT-5492.00MCF74.35HCT-1516.80OVCAR-315.70T-47D6.34average GI5011.96HT2915.90OVCAR-411.00average GI5019.92Table 1. 11a sytotoksisuutta tulokset 58 solulinjojen NCI60 solulinjassa seulonta.

GI

50-arvot ja p53 tila (WT: villityyppi; Mut /Null: mutatoitunut tai nolla) näkyvät kunkin solulinjan. CSV Lataa CSV

11a GI

50-arvot (uM) piirretään p53 WT ja Mut /Null ryhmien ruutuun kaaviossa. Minimi- ja maksimiarvot, mediaani ja keskimääräisten arvojen näkyvät. Merkitys testaus suoritettiin kaksipuolisella parittoman Wilcoxonin summa testi. *, P 0,05.

Apoptoosi ei ole tärkein mekanismi osuus 11a-välitteisen sytotoksisuuden

tutkia mekanismi 11a indusoidun sytotoksisuuden, valitsimme kolme munasarjasyövän solulinjoissa edustava p53-mutaation tila: SKOV3 (p53-tyhjä), A2780 (p53 villityypin) ja OVCAR3 (p53-mutaatio, p.R248Q) [49]. Näitä soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla 11a (0-1 uM), ja suhde pilkkoa PARP kokonais- PARP käytettiin indikaattorina apoptoosin [50]. Doksorubisiinia käytettiin positiivisena kontrollina apoptoosin indusoimiseksi SKOV3- soluissa (kuvio 4A). Jopa korkeimmat pitoisuudet testataan, 11a vaatimattomasti aiheuttama PARP lohkaisu SKOV3- soluissa, mutta ei A2780 tai OVCAR3 soluja (kuvio 4A). Kuitenkin, pohjapinta taso pilkkoa PARP oli myös suurempi SKOV3- soluissa verrattuna muiden solulinjojen. Kvantitatiivisesti tutkia apoptoottinen vaikutus 11a, anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäys suoritettiin. Yhdenmukainen halkaistut-PARP määrityksissä, 11a vaatimattomasti indusoi apoptoosin SKOV3- soluissa, mutta ei A2780 tai OVCAR3 soluihin käyttäen etoposidi kuin positiivisessa kontrollissa (kuvio 4B ja Kuva S7). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin MCF7 rintasyövän solulinjaa, jossa sekä doksorubisiinin ja staurosporiinille indusoi merkittävän apoptoosin, kun 11a apoptoosia ei testatuilla pitoisuuksilla (kuvio 4C ja 4D). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että apoptoosin ei ole tärkein mekanismi osuus 11a-indusoidun sytotoksisuuden.

SKOV3, A2780 ja OVCAR3 munasarjasyöpäsoluja (A) ja MCF7-rintasyöpäsolut (C) käsiteltiin osoitetulla annoksilla ja 11a tai doksorubisiinin 24 tuntia. Kokosoluliuotteista koetettiin varten PARP pilkkominen käyttäen anti-PARP-vasta Western blot. p-Actin käytettiin latauskontrollina. Musta nuolet osoittavat kannat kuin pilkkoa ja halkaistut PARP. (B) ja (D) 24 tunnin kuluttua hoidon 2 uM 11, solut kerättiin ja värjättiin anneksiini V /PI ja alistettiin virtaussytometria. 50 uM etoposidi (B) tai 1 uM staurosporiini (STS) (D) toimi positiivisena kontrollina apoptoosin. Tilastollinen merkitys näytettiin ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna DMSO-kontrollin.

11 a indusoi G

1 /S solusyklin pysähtymisen p53 riippuvaisesti

koska 11a ei onnistunut indusoimaan merkittävää apoptoosin tahansa testatuista solulinjoista, me arveltu, että 11a-indusoitu sytotoksisuus voi johtua solusyklin pysähtymiseen, mikä voisi aiheuttaa kasvun estämistä määritettynä sulforodamiini B (SRB) kolorimetrinen määritys käytetty NCI-60 solulinjaan sytotoksisuuden seulonta. Edelleen erottaa onko 11a sytotoksisuus korreloi p53 asema, peräsuolen syöpä isogeenisiin HCT116 p53 + /+ ja HCT116 p53 – /- solulinjoja käytettiin [35]. Mielenkiintoista, nämä isogeenisiin solulinjojen näytteillä ero herkkyys 11a. P53 villityypin solulinjan (IC

50 = 0,0337 uM) oli noin 10-kertainen herkempi kuin p53 null solulinja (IC

50 = 0,3188 uM) pilottitutkimuksessa näytön suorittaa pienimolekyylisiä Screening ja Synthesis Facility (SMSSF) ja University of Wisconsin (kuvio 5A). Ero herkkyys vahvistettiin myöhemmin käyttäen MTT proliferaatiomäärityksessä, jossa p53: n villin tyypin solujen (IC

50 = 0,36 uM) olivat herkempiä kuin p53-tyhjä-solujen (IC

50 = 1,76 uM) (kuvio 5B). Jotta voitaisiin edelleen tutkia mekanismi, jolla kaksi isogeenisiin solulinjat osoittivat ero herkkyys 11a, arvioimme apoptoottisen vaikutusten 11a näissä kahdessa solulinjassa. Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla 11 a 24 tunnin ajan, ja apoptoosi mitattiin käyttäen PARP-pilkkominen määritys, jossa PARP pilkkominen suhde osoittaa apoptoottisen tilan. Kuvio 5C osoittaa, että ainoastaan ​​vaatimaton PARP lohkaisu havaittiin joko p53 + /+ tai p53 – /- HCT116-soluissa. Sen tutkimiseksi, PARP ollut merkitystä 11a välittämä sytotoksisuuden, teemme yhteistyötä käsiteltyjen solujen 11a ja 3-aminobentsamidin (3-AB), erityinen PARP inhibiittori [51]. PARP inhibition ei vaikuttanut sytotoksisuus 11a (kuvio 5D), mikä osoittaa, että 11 sytotoksisuus oli riippumaton PARP-aktiivisuutta. Apoptoottisen vaikutuksen 11a tutkittiin edelleen anneksiini V /PI värjäystä. Vaikka staurosporiini aiheutti vakavia apoptoosin, 11a ei aiheuttanut apoptoosia isogeenisissä solulinjoissa verrattuna DMSO-kontrollin (kuvio 5E). Koska PNR-proteiini ei ollut havaittavissa näissä soluissa, olemme yli-ilmentynyt PNR seuraa käsittely 11a. Tuloksemme vahvisti, että apoptoottinen vaikutus oli riippumaton PNR (kuvio 5F).

(A) IC

50-arvot 11 p53 + /+ ja p53 – /- HCT116 solulinjoilla. Solut siirrostettiin neljänä kappaleena 384-kuoppalevyille ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla 11a 7 päivää. Kasvu esto määritettiin CellTiter Glo luminoivien solunelinkykyisyysmääritys. (B) IC

50-arvot 11a tutkittiin MTT solujen elinkelpoisuuden määritykset 72 tunnin inkubaation 11 a. (C) Kaksi solulinjoja käsiteltiin 0, 1, 10, 100 tai 1000 nM 11 24 tunnin ajan ja suoritettiin Western blot käyttäen anti-PARP-vasta-aineen havaitsemiseksi PARP pilkkominen. Hsp90 käytettiin latauskontrollina. (D) Soluja käsiteltiin konsentraatiot 11a läsnä tai poissa ollessa 2 mM 3-aminobentsamidin (3-AB) 72 tuntia ja sitten suoritettiin MTT-määrityksissä. (E) 24 tunnin kuluttua hoidon 1 uM 11a, solut kerättiin ja värjättiin anneksiini V /PI ja alistettiin virtaussytometria. 1 uM staurosporiini (STS) toimi positiivisena kontrollina apoptoosin. Tilastollinen merkitys näytettiin ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna DMSO-kontrollin. (F) kaksi solut transfektoitiin 1 ug: lla GFP tai PNR: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen käsitellään DMSO: ssa tai 1 uM 11 vielä 24 tuntia. Western blot suoritettiin tutkimaan PARP pilkkominen.

Nämä tutkimukset osoittavat, että 11 a saattaa olla enemmän merkittäviä vaikutuksia solusyklin pysähtymisen kuin apoptoosin. Sen tutkimiseksi, 11a aiheuttama solusyklin pysähtymiseen, solut synkronoidaan G

0 /G

1 vaihetta seerumistarvaatio 24 tuntia. Kuvio 6 esittää tulokset solusyklin profiilin analyysi synkroninen HCT116-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 50 nM 11a heti luovutuksen jälkeen seerumin nälkään. Kun soluja käsiteltiin DMSO: ssa, suurin osa soluista oli S-vaiheessa 12 tunnin kuluttua (64% p53 + /+ soluja ja 58% ja p53 – /- solut), ja solut palautetaan G

1 vaihe 24 tuntia myöhemmin. Tämä tulos on sopusoinnussa normaalin solusyklin 24 tuntia näiden isogeenisiin solulinjoista. Kuitenkin, kun synkronoitu p53 villityypin solut käsiteltiin 50 nM 11a, jonka pitoisuus lähellä sytotoksisuuden IC

50 33,7 nM, G

1 /S faasin solukierron pysähtymisen esiintyi jopa 24 tuntia ( kuvio 6B). Hoidon jälkeen 11 a 12 tuntia, vain 10% soluista palasi S-vaiheeseen verrattuna 64% hoidettiin DMSO, ja suurin osa 11a käsiteltyjä soluja pidätettiin G

0 /G

1 vaihe (87%). G

1 /S faasin solukierron pysähtymisen säilyi 24 tuntia (kuvio 6B).