Krooninen sairaus

tiivistelmä

suuri koko sian ja sen samankaltaisuus anatomiaa, fysiologiaa, aineenvaihduntaa, ja genetiikan ihmisille tekevät siitä ihanteellisen pohjan kehittää geneettisesti määritelty, suuri eläinmallissa syöpä. Tätä varten olemme luoneet transgeeninen ”oncopig” linja koodausta Cre rekombinaasin indusoituva sian siirtogeenien, jotka koodaavat KRAS

G12D ja TP53

R167H, jotka edustavat yleisesti mutatoitunut onkogeeni ja tuumorisuppressoriproteiinia ihmisen syövissä, vastaavasti. Solujen käsittely johdettu näistä oncopigs kanssa adenovirus koodaus Cre (AdCre) johti KRAS

G12D ja TP53

R167H ilmaisua, joka teki solut muunnettava kulttuuriin ja tuumorigeenisia kun Siirto tehty osaksi heikentynyt immuunivaste hiiriin. Lopuksi, injektio AdCre suoraan näihin oncopigs johti nopeaan ja toistettavissa kasvainten kehittymistä mesenkymaaliset. Siirtogeenisiä eläimiä sai AdGFP (vihreää fluoresoivaa proteiinia) ei ollut mitään syöpäkasvaimen muodostumisen tai muuttaa histopatologia. Tämä oncopig linja voisi siten toimia geneettisesti tempervalurautaisten malli mahdollisesti monenlaisia ​​syöpiä, kontrolloimalla ajallinen tai alueellinen genesis, joka pitäisi olla korvaamaton tutkimuksiin haitanneet puute suuren eläinmallin syöpää.

Citation: Schook LB, Collares TV, Hu W, Liang Y, Rodrigues FM, Rund LA, et ai. (2015) geneettinen Sian Model of Cancer. PLoS ONE 10 (7): e0128864. doi: 10,1371 /journal.pone.0128864

Academic Editor: Wilfried A. Kues, Friedrich-Loeffler-instituutti, SAKSA

vastaanotettu 15 joulukuuta 2014; Hyväksytty: 03 toukokuu 2015; Julkaistu: 01 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Schook et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat sisällä paperia ja koko RNA-seq tiedot saatavilla ArrayExpress tietokannassa (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) hakunumerolla E-MTAB-3382.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat seuraavat: Kiina Scholarship neuvosto (CSC): WH; Brasilian stipendiohjelmassa ”Science ilman rajoja” edistää National Counsel tekninen ja tieteellinen kehitys (https://www.iie.org/Programs/Brazil-Scientific-Mobility): FMR, TVC ja FKS; American Cancer Society (https://www.cancer.org/research/applyforaresearchgrant/) (ACS178898): YL; American Cancer Society (https://www.cancer.org/research/applyforaresearchgrant/) (ACS178898): CMC; Yhdysvaltain National Institutes of Health (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm) (CA123031) ja Edward Spiegel Fund on lymfooma Foundation (https://www.lymphomafoundation.org/): CMC; United States Department of Agriculture (USDA) (https://www.csrees.usda.gov/) (AG 58-5438-2-307), Yhdysvaltain National Institutes of Health (https://grants.nih.gov/avustukset /oer.htm) (CA 153.132), Edward William Jane Marr Gutgsell Foundation (https://provost.illinois.edu/about/chairs.html), ja osuuskunnan tutkimusohjelma maatalouden Science Technology Development (https://www.csrees.usda.gov/)(PJ009103); Maaseudun kehittäminen hallinto, Korean tasavalta (https://www.rda.go.kr/foreign/eng/): LBS; ja US National Institutes of Health (U42 OD011140): RSP. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suuri eläinmallissa syövän olisi hyödyllistä asetuksista vaativat koko, anatomia, aineenvaihduntaan tai genetiikkaa heijastava ihmisten, kuten tutkimuksiin invasiivisen kuvaohjatut teknologioita, säteily onkologia, lääkeainemetaboliaan, kirurgikoulutuksen, teknologian kehitys (esim seurantatutkimuksen), vain muutaman [1,2]. Tässä suhteessa sika on ihanteellinen suuri eläin pohjan kehittää tällaista mallia. Nämä ovat suuria nisäkkäitä samanlaisia ​​anatomian ihmisille [1,2]. Molemmat perusinsuliininsa aineenvaihdunta kiihtyy ja niiden xenosensor pregnaania X-reseptori, joka säätelee

CYP3A

ilme, joka vastaa metaboliaan puolet kaikista reseptilääkkeiden [3], ovat myös hyvin samankaltaisia ​​ihmisille [4,5]. Kuten ihmisillä, siat myös vaativat useita geneettisiä muutoksia syövän kehittymiseen [6].

Kehittää sian malli syövän, päätimme kerrata ne mutaatiot, yleisimmin todettu ihmisen syövän. Aiemmin olimme osoittaneet, että ihmisen mutaatiot kun annetaan geeniekspressiotutkimuksissa käyttäen autologisia sian fibroblasteja johti onkogeenien molecularly samankaltainen kuin ihmisillä ja vastaavien patologian [6]. Tässä tutkimuksessa olemme kohdistettu

RAS

geeni, joka on mutatoitunut neljännes kaikista ihmisen syövistä, jossa

KRAS

isoformin ollessa yleisimmin mutatoitunut [7], jolloin saadaan konstitutiivisesti aktiivinen, onkogeeniset proteiini [7], että kokeellisesti aiheuttaa syöpää hiirillä [8] ja ihmisen soluja [9], lisäksi taustalla useita perinnöllisiä syöpien hoitamiseksi [10]. Geeni

TP53

on mutatoitunut kolmasosa ihmisen syövissä [11] vaientaa tämän kasvain tukahduttava reitin, mikä samalla tiedetään edistää syövän sekä hiiren [12] ja sian [13] geneettisten mallien sekä ihmissoluissa [9], ja liittyy syöpään alttius Li-Fraumeni oireyhtymä [14]. Mutaatiot näissä kahdessa geenejä esiintyy konsertissa ihmisen syövissä (COSMIC) [15]. Lisäksi hiiret geneettisesti läpikäydä rekombinaatiota muuttamaan villityypin

Kras

ja

TP53

alleelien kasvaimia ja hallitseva negatiiviset tai null versioita, vastaavasti, nopeasti kehittyä aggressiivinen syövät at sivustoja rekombinaatio [16,17]. Mitä tulee sikoja, sekä onkogeenisiä

Kras

ja dominanttinegatiivivaikutus

p53

edistää kasvaimia muuntaminen normaalien sian soluja kasvaimia tilaan [6], ja siat suunniteltu kanssa mutantti TP53 alleeli ovat alttiita kehittämään lymfoomat ja osteogeenisen kasvaimia [13]. Viimeksi ehdollisesti aktivoitu kasvaimia synnyttävän KRAS mutaatio sioissa on raportoitu [18]. Sinänsä päätimme insinööri sikojen indusoituvan ilmentymisen näistä yleisesti muuntunut ja voimakas onkogeeni ja tuumorisuppressorigeeneille.

Tulokset

luominen oncopigs koodaavat indusoituvia onkogeeninen KRAS ja dominanttinegatiivivaikutus TP53

Jos haluat luoda indusoituvaa sian malli syövän, jota termi ”oncopig”, ensin kloonattiin sian

KRAS

ja

TP53

cDNA päässä Duroc sika (2-14, TJ Tabasco), jota käytettiin sekvensoimaan sian genomin [19]. Kohdennettu mutageneesi käytettiin sitten esitellä onkogeenisen G12D mutaatio sian

KRAS

cDNA. Tämä mutaatio valittiin asparagiinihapon korvaaminen osuus on yli kolmannes mutaatioiden G12 asemassa ihmisen syövissä [7] ja Kyseisellä mutaatio hiiren endogeenisen

Kras

geeni edistää kasvainten synnyssä [8,20] . Samoin R167H mutaatio valittiin sen ihmisen vastaavan (R175H) on yleisesti todettu ihmisen syövissä, [11], samoin kuin syövän alttiuden Li-Fraumeni oireyhtymä [14], ja kun se tuodaan endogeeniseen hiiren [12], tai sian [ ,,,0],13]

TP53

geenin, aiheuttaa kasvaimia. Nämä kaksi cDNA johdettiin sitten Cre-indusoituva vektori, jolloin saatiin ilmentymisrakenne, joka sisälsi CAG-promoottorin, jota seuraa edellä mainitun LSL sekvenssin,

KRAS

G12D

, IRES-sekvenssi jotta bisistroninen ilmaisun

TP53

R167H

ja poly-A-sekvenssin (kuvio 1a). Tämä muotoilu mahdollistaa koekspressoimalla molemmat

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

in näennäisesti tahansa soluissa sika ohimenevä infektio AdCre, mikä periaatteessa pitäisi sallia induktion monenlaisten syöpien tietyissä kudokseen sivustoja ja valitun ajan.

(

) kaavakuva, joka koodaa Cre-indusoituva

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

. (

b

) PCR-analyysi läsnäolo

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

genomisessa DNA eristettiin osoitti kloonatun jälkeläisiä.

Normaali sian alkion fibroblastit [21] transfektoitiin edellä mainittu plasmidi ja transfektoitiin stabiilisti solun kloonit valittiin G418-täydennetty väliaine. Genominen DNA solusta pesäkkeistä käytettiin tarkistaa läsnäolo molempien siirtogeenien (

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

) PCR määritettiin käyttämällä spesifisiä alukkeita nämä opintosuoritusotteet, ja sittemmin laajennettiin lähde ytimiä tumansiirron. Nuclei Näistä soluista eristettiin sitten ja siirrettiin enukleoidaan sian varhaismunasolujen ja alkionkehityksen päällä, prosessin kutsutaan somaattisten solujen tuman siirron (SCNT) [21]. Kaikkiaan 100 tällaista alkiot siirrettiin korvike kylvää, joka tuotti neljä miespuolista oncopig jälkeläisiä (63-1, 63-2, 63-3, 63-4). PCR-analyysi eristetyn genomisen DNA: n käyttäen alukkeita, jotka ovat spesifisiä näiden siirtogeenien vahvisti stabiiliin integroitumiseen

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

cDNA (kuvio 1 b).

Cre aktivointi

KRAS

G12D

ja

TP53R167H

siirtogeenien fibroblasteissa, jotka ovat peräisin oncopigs on muuttamassa

Sen arvioimiseksi, onko

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

siirtogeenien voisi olla aktivoitu edistää kasvaimien syntyyn, ihon biopsiat eristettiin edellä mainituista neljästä oncopig jälkeläisiä, ja käytetään muodostamaan fibroblastien linjat. Nämä yksittäiset solulinjat siirtogeenisistä oncopigs infektoitiin joko koodaava adenovirus markkeri vihreä fluoresoiva proteiini (AdGFP) tai adenovirus, joka koodaa Cre-rekombinaasia (AdCre), ja tuloksena pareittain tartunnan viljelmistä analysoitiin transformoitiin ja tuumorigeenisiä fenotyyppejä. Kuten odotettua, vain AdCre altistuneet solut osoittivat havaittavia määriä

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

mRNA, kuten arvioidaan RT-PCR: llä (kuvio 2a). Lisäksi, oli selvä ero morfologia AdCre solujen kontrolliin verrattuna AdGFP soluja. Erityisesti, entinen menetti karan morfologia ominaisuus joko samoissa soluissa ennen AdCre infektiota tai infektoitiin AdGFP ohjaus virus, ja sen sijaan olivat pienempiä, pyöreämpiä paljon löysästi kiinnitetty levyyn ja se spontaanisti muodostaa pesäkkeitä (kuvio 2

B

). Tämä ero enteili muut fenotyyppi on muuntunut. Tarkemmin, FACS-analyysi paljasti keskimääräisen solusyklin kaikkien neljän riviä lyhennettiin 22 tuntia AdGFP ohjaus väestöstä 13 tuntia AdCre väestöstä (kuvio 2c). AdCre solut myös omasivat keskimääräisen 2,8 kertainen nousu solujen kulkeutumista kaikki neljä riviä koko ajan kuluessa havainnon (kuvio 2d), joka arvioidaan naarmu määrityksen, ja tuotti keskimäärin 143 pesäkettä maljattaessa pehmeässä agarissa verrattuna ei pesäkkeet havaitaan kontrolli AdGFP soluja (kuvio 2e). Olemme päätellä, että fibroblasti linjat kehitetty itsenäisesti johdettu

KRAS

G12D Twitter /

TP53

R167H

oncopig kloonit indusoitiin olevan transformoitu aktivoitaessa ilmentymistä näiden siirtogeenien Cre-rekombinaasilla. AdGFP käsitelty siirtogeenisten solujen yllä fenotyyppejä samanlaisia ​​kuin ei-siirtogeenisten solulinjoissa.

(

) RT-PCR-analyysi

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

mRNA: n ilmentymisen on fibroblastisolulinjat kustakin 4 siirtogeenisten kloonien käsitelty AdCre tai AdGFP. (

b

) vertailu solumorfologian välillä AdCre ja käsittelemättömän verrokin viljeltyjen solujen värjättiin H * p-arvo ≤ 0,05 ; ** p-arvo ≤ 0,01).

Cre aktivointi

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

siirtogeenien fibroblasteissa johdettu oncopigs on tuumorigeenisen

rohkaisemana kehittämällä fenotyyppi on muuntunut, me seuraavaksi arvioitava AdCre voisi aiheuttaa edellä fibroblastien kasvaa kasvaimia tavalla. Näin ollen, AdCre käsitellyt solut, jotka ovat peräisin neljästä toisistaan ​​riippumattomasti johdettu siirtogeenisten oncopigs injektoitiin immuunivajavaisissa naarashiirillä ja injektiokohdan tarkkailtiin kasvainten kehittymisen. Kouraantuntuva kasvaimet olivat saavuttaneet 2000 mm

3 (maksimaalinen sallittu koko) välillä 32 ja 63 päivää injektion-täydellinen penetrance päivää (taulukko 1). Sitä vastoin ei havaittu kasvaimia havaittiin kohdissa, joihin injektoitiin soluja siirtogeenisestä oncopig käsiteltyjen solujen AdGFP yli 130 päivän ajan havainnon (Taulukko 1). Olemme päätellä, että fibroblastit eristetty itsenäinen

KRAS

G12D Twitter /

TP53

R167H

oncopigs indusoitiin olevan kasvaimia synnyttäviä aktivoinnin ilmentymisen näiden siirtogeenien Cre rekombinaasilla. Kasvainmassat johtuvat AdCre aktivoinnin solujen siirtogeenisestä oncopigs (kuvio 3) paljasti kohdassa sekä korkean että matalan suurennus näyttöä kiinteä kasvain (kuvio 3b) ja ei ollut seurausta tulehduksesta tai nesteen kertymistä.

Samanlaisia ​​kasvaimia (a) kehittynyt kaikilta AdCre solulinjoista eikä kasvaimia kehittyi AdGFP solun injektiot; Histologinen analyysi (b) paljasti kasvaimia olla tiheästi solujen non kapseloitu ja infiltratiivinen kasvain. 10x ja aseta 40X H (G-i) H in olevaa kudosta (d-f); tai kun histologinen tutkimus (g-i).

Eri kasvaintyypeille voidaan indusoituu oncopig perustuu pistoskohdan on AdCre

Tutkiakseen, onko injektio AdCre muissa kudoksissa voi johtaa kasvaimia, joka on kives on oncopig-1 sai injektiona AdCre. Jälleen käsin kosketeltavan massa havaittiin 10 päivää injektion jälkeen, että nopeasti kehittynyt kasvain (kuvio 4

c

, 4

f

, 4

i

ja taulukko 2) . Histopatologia tämä kasvain paljastui huonosti eriytetty kasvain todennäköisesti sukupuoleen johto strooman alkuperää. Vastaavasti korvan, vatsan ja kaulan oncopig-3 injektoitiin subkutaanisesti AdCre, mikä johti jälleen kasvainmassoja kaikissa kolmessa sivustoja patologian sarkooma alueellisiin sileän lihaksen eriytyminen (leiomyosarkooma) (kuvio 4

b

, 4

e

, 4

h

ja taulukko 2). Siten anto AdCre toistettavasti aiheuttamaa tuumorigeneesiä siirtogeenisissä oncopigs kussakin injektiokohdassa. Anto AdGFP muiksi oncopigs ei johtanut sukupolven syöpäkasvaimen tai patologian (kuvio 5).

Keskustelu

sika on monia ominaisuuksia, jotka tekevät siitä ihanteellisen alustan kehittää geneettisesti määritelty, suuri eläinmallissa syöpä. Nyt raportoivat luomista siirtogeenisen oncopig linja koodaa Cre rekombinaasia indusoituvan koodaavan siirtogeenin

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

, yleisesti mutatoitunut onkogeeni [7] ja tuumorisuppressoriproteiinia [11], vastaavasti, ihmisen syövissä. Tämä tutkimus on jatkoa meidän edellisestä työstä [6] jossa osoitimme, että mutaatioita geeneissä tunnistettu ihmisen tutkimuksissa kun työnnetään sian geenit eivät johda kasvaimen synnyssä ja patologian että toistettu kasvainten kliinisesti.

validointi sian syöpä eläinmalli on välttämätöntä, että tuloksena kasvaimen massojen validoidaan, mitä havaitaan ihmisten lääkinnässä. Tämä tarve on selvästi julki Cardiffissa [22-24], joissa neoplastiset etenemistä hiirellä rintasyöpään käytetään ihmisen mutaatiot eivät jäljitellä kasvainten klinikalla. Näin ollen tämä tutkimus keskittyi osoittaa, että geneettisesti sian kasvaimia aiheuttaa histopatologisia fenotyyppejä, jotka ulottuvat allekirjoitus fenotyyppejä ja jäljittelee ihmisen syöpiin [24].

Näin sian malli vahvistanut sen osoittaminen, että johdettu fibroblasteista siirtogeenisiä oncopigs käsitelty AdCre osoittivat aktivointi siirtogeenin, joka johtaa kaikki

in vitro

tunnusmerkkejä kasvaimia, kuten transformoitu solu morfologia, lisääntynyt proliferaatio ja migraatio, ja kyky kasvuun kiinnityskohdassa-riippumaton muoti. Yhteisymmärryksessä, nämä solut olivat erittäin tuumorigeenisia kun irrotetut osaksi heikentynyt immuniteetti hiirissä. Tämä vaikutus oli erittäin toistettava, vastaan ​​puhuu hankinta ainutlaatuinen geneettinen tausta altistavia solulinjan tulla muuttaneet, koska sama fenotyypit havaittiin saaduissa fibroblasteissa yhteensä neljä yksittäisten oncopigs. Yhdessä nämä tiedot tukevat päätelmää, että johdettu oncopig fibroblastit ovat indusoitavasti tuumorigeenisia.

Yhdenmukainen kykyä johdettujen oncopig fibroblastien olla tuumorigeenisia, injektio lihakseen AdCre siirtogeenisiin oncopigs johti kehittämään mesenkymaaliset kasvain viittaavia leiomyosarkooma klo injektiokohdassa. Tämäkin tulos oli erittäin toistettava, noudatetaan paitsi eri paikkaan saman sika, mutta myös eri pesuetoverissa oncopigs. Koska leiomyosarkooma ovat sileän lihaksen alkuperää, oletettavasti nämä kasvaimet syntyi infektion tämän lihaksen tyyppisen, ehkä verisuonistossa tai piloerektorilihaksiin. AdCre ruiskutus kivekset synnytti eriytettyä kasvain todennäköisesti sukupuoleen johto strooman alkuperää. Lisäksi, ei valvonta ei-siirtogeenisiä sikoja injektoitu AdCre eikä ohjaus oncopigs injektoitiin AdGFP kehittänyt syöpäkasvaimen tai patologisia muutoksia. Yhdessä nämä tiedot tukevat päätelmää, jonka aktivoinnin solujen in vivo AdCre indusoi kasvainten synnyssä. Lisäksi nämä tiedot viittaavat myös siihen, että induktio rekombinaation muissa kudoksissa,

nähden suhteessa

toimitus AdCre eri keinoin kuin sitoutunut tässä tai tulevaisuudessa kudosten vapaan ilmentymisen Cre siirtogeenin, voidaan johtaa monia muita syöpiä. Sellaisenaan tämä ”oncopig” linja tarjoaa geneettisesti tempervalurautaisten malli mahdollisesti monenlaisia ​​syöpiä, joita pitäisi olla korvaamaton tutkimuksiin haitanneet puute suuren eläinmallin syöpää.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki eläin työ tehtiin noudattaen niitä kansallisia ja kansainvälisiä ohjeita. Kaikki eläinkokeet ja menettelyt hyväksyttiin University of Illinois Institutional Animal Care ja Käytä komitean (IACUC; pöytäkirja numerot 11221 sian ja 12170 hiiren tutkimukset).

kloonaus ja sekvensointi sian

KRAS

ja

TP53

geenien TOPO-sukkulavektoriin

TJ Tabasco sian luuytimen solut eristettiin ja pakastettiin -80 ° C: ssa. Kokonais-RNA uutettiin näistä solujen RNeasy mini kit (QIAGEN, CA), 1 ug joista käänteiskopioitiin cDNA kanssa QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN, CA). Ensembl genomin selaimen käytettiin suunnitella PCR-alukesekvenssit monistamiseen sian erityisiä

KRAS

(ENSSSCG00000000561) ja

TP53

geenejä (ENSSSCT00000019534). Eteenpäin ja taaksepäin-aluke sekvenssejä

KRAS

olivat 5′-CTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT-3 ’ja 5′-TTACATAATTATACACTTTGTCTTTGA-3’, vastaavasti. PCR lämpökäsittelyyn edellytykset

KRAS

vahvistus oli 94 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C: ssa 3 min, ja 65 ° C 1 min, jossa on lopullinen 72 ° C: ssa vaiheessa 10 min. Eteenpäin ja taaksepäin aluketta käytetyt sekvenssit

TP53

olivat 5′-TGCAATGGCGGAGTCGCAG-3 ’ja 5′-TCAGTCTGAGTCAGGTCCTTC-3’, vastaavasti. PCR lämpökäsittelyyn olosuhteet olivat 94 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, ja 68 ° C 1 min ja sen lopullinen 72 ° C vaiheessa 10 min.

ACTB

käytettiin endogeenista ohjaus. Eteenpäin ja taaksepäin-aluketta sekvenssien käytettiin 5′-GACATCCGCAAGGACCTCTA-3 ’ja 5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’, vastaavasti. PCR-olosuhteet olivat täysin samat kuin

TP53

. PCR-monistettiin

KRAS

ja

TP53

cDNA kloonattiin sitten pCR2.1-TOPO vektoreita käyttäen TOPO TA-kloonausvektoriin mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden (Invitrogen, CA) ja cDNA: iden vahvistettu olevan 100% nukleotidin identiteetti sian

KRAS

ja

TP53

(https://useast.ensembl.org/index.html).

mutageneesiä on

KRAS

ja

TP53

cDNA

QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, CA) käytettiin tehdä muutoksia nukleotidisekvenssiin, joka vastaa G12D mutaatio kloonattiin sian

KRAS

cDNA ja R167H mutaatio kloonatun sian

TP53

cDNA. Käytetyt alukkeet tuottaa G12D mutaatio

KRAS

olivat 5′-TGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAG-3 ’ja 5′-CTCTTGCCTACGCCATCAGCTCCAACTACCA-3’. Käytetyt alukkeet tuottaa R167H mutaatio

TP53

olivat 5′-GAGGTGGTGAGGCACTGTCCCCACCAT-3 ’ja 5′-ATGGTGGGGACAGTGCCTCACCACCTC-3’. Mutaatiot varmistettiin sekvensoimalla.

kloonaus

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

cDNA osaksi pIRES vektoriin

Edellä mainitut

KRAS

G12D

cDNA monistettiin PCR: llä alukkeilla 5′-CTAGCTAGCTAGCTGCTGAAAATGACTGAATAT-3 ’ja 5′-CCGCTCGAGCGGTTACATAATTATACAC-3’ 30 sykliä 94 ° C 1 min, 94 ° C 30 sekuntia, 60 ° C 1 min, ja 68 ° C 1 min, ja tuloksena saatu fragmentti kloonattiin Nhel ja Xhol pIRESiin (Clontech, CA ). Edellä mainittujen

TP53

R167H

cDNA monistettiin PCR: llä alukkeilla 5′-ACGCGTGGACGTCTTGGCCATATGCAATGGAGGA3 ’ja 5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCAGTCTGAGTCAGGTCC-3’ 30 sykliä 94 ° C 1 min, 94 ° C: ssa 30 sekuntia, 65 ° C 1 min, ja 68 ° C 1 min, ja tuloksena saatu fragmentti kloonattiin

Sal

I ja

Ei

I-kohtiin pIRES sisälsi

KRAS

G12D

cDNA. cDNA-sekvenssit on

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

vahvistettiin oikein tuloksena vektori sekvensoimalla.

Cloning CAG-promoottorin osaksi loxP-STOP (polyA) -loxP sisältävän vektorin

pkw15 sisältävä plasmidi CAG-promoottorin ja pkw13 plasmidin, joka sisältää loxP-STOP (polyA) -loxP käytettiin vektorin rakentaminen. CAG-promoottorin, eristettiin Spel /MfeI ruoansulatusta ja kloonattiin pkw13 plasmidin Spel /EcoRI-kloonauskohdilla.

rakentaminen indusoituvan

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

oncopig ekspressiovektorin

KRAS

G12D

–

TP53

R167H

-pIRES vektori pilkottiin PvuI ja NheI, ja tuloksena

KRAS

G12D

-IRES-

TP53

R167H

-polyA fragmentit puhdistettiin geelillä ja kloonattiin CAG-LSL-pkw13 vektoreihin PacI /Nhel-sivustoja. cDNA-sekvenssit on

KRAS

G12D

ja

TP53

R167H

lopullisessa vektori vahvistettiin oikein tuloksena vektoriin sekvensointi.

Generation sikiön fibroblastien kantojen

Male sikiön fibroblasteja solujen FFCS () kohteesta Minnesota miniatyyri siat (NSRRC: 0005) kerättiin kuvatulla [25] joitakin muutoksia. Lyhyesti, sen jälkeen poistamalla pää ja sisäelimet, sikiö oli jauhettu ja hajotettiin erikseen 20 ml: aan ruoansulatusta median (Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 15% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS), 200 yksikköä /ml kollagenaasia ja 25 yksikköä /ml DNaseI) 4-5 tunnin ajan 38,5 ° C: ssa ja 5% CO

2 ilmassa. Digestoidut solut pestiin DMEM täydennetty 15% FBS: ää (Hyclone, Logan, UT) ja 10 ug /ml gentamysiini, viljeltiin yön yli, ja sitten kerätään ja pakastetaan -80 ° C: ssa FBS täydennetty 10% dimetyylisulfoksidia (DMSO) ( v /v) ja varastoitiin nestemäisessä typessä.

siirtogeenisten solujen

Early kanavan numero metsäsertifiointijärjestelmän FFCs (P1-2) viljeltiin soluviljelmässä (DMEM, johon oli lisätty 15% (v /v) FBS: ää, 2,5 ng /ml emäksistä fibroblastikasvutekijää ja 10 ug /ml gentamysiini) yön yli ja kasvatettiin 75-85% konfluenssiin. Media korvattiin 4 tuntia ennen transfektiota. Metsäsertifiointijärjestelmän FFCs pestiin 1-2 min fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS; Invitrogen) ja kerättiin 0,05% trypsiini-EDTA: ta (Invitrogen, 1 ml per 75cm

2 pulloon). Solut suspendoitiin uudelleen solujen elatusaineeseen, pelletoitiin 600 x g 10 minuuttia, suspendoitiin uudelleen 10 ml Opti-MEM (Invitrogen), ja kvantitoitiin sitten hemosytometrillä ja pelletoitiin. Solut suspendoitiin uudelleen transfektointiväliainetta (75% cytosalts [120 mMKCl, 0,15 mM CaCl

2, 10 mM K

2HPO4, pH 7,6, 5 mM MgCl

2] [26] ja 25% Opti-MEM [Gibco BRL, Grand Island, NY)]. Solupitoisuus säädettiin 1 x 10

6 solua /ml ja 200 ui solut ko-transfektoitiin elektroporaatiolla käyttäen linearisoitua mutantti

KRAS

ja

TP53

rakentamiseksi, joka sisältää Neo valittavissa kasetti (2 ug). Elektroporaatiota käytetään kolme peräkkäistä 250-V, 1 ms kanttia pulsseja antaa sekä BTX ECM 2001 (BTX, San Diego, CA) on 2 mm: n rako kyvettiin. Elektroporaation jälkeen solut maljattiin 100 mm: n malja 3000 solua per malja soluviljelyelatusainetta. Sen jälkeen, kun 36 tuntia, solut valikoitiin lisäämällä genetisiiniä (G418, 400 ug /ml) 10-14 päivä, kunnes muodostumista solun pesäkkeitä. Genomi-DNA: ta solun pesäkkeistä käytettiin läsnäolon varmistamiseksi sekä siirtogeenien PCR: llä. Nämä solut sitten varastoitiin nestemäisessä typessä käyttöön asti, koska luovuttajan solujen SCNT.

Munasolut kypsymisen, SCNT, ja alkion jälleenrakennukseen

Fibroblast solujen tunnistettu olevan integraation siirtogeenien (

KRAS

ja

TP53

) käytettiin luovuttajan solujen SCNT osaksi enukleoidaan oosyytteihin seuraa sähkö- fuusio ja aktivointi kuten aikaisemmin on kuvattu [27]. Lyhyesti, cumulus-oosyytti solu kompleksit (yhdistelmäehkäisytabletit) saatiin vaiheen I kypsymisen väliaineen ART Inc. (Madison, WI) noin 24 tuntia sadonkorjuun jälkeen. Yhdistelmäehkäisytablettien viljeltiin sitten tuoreeseen vaiheen II kypsymistä väliaine yhteensä 40 tuntia kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 38,5 ° C: ssa. I ja II vaiheen väliaineen toimitti ART Inc. laajennettu yhdistelmäehkäisytablettivalmisteet olivat sitten pyöritettiin 0,1% hyaluronidaasia Hepes-puskuroidussa Tyroden väliaineessa, joka sisälsi 0,01% PVA 4 min poistamiseksi cumulus-solut.