Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sädehoito on valittu hoito kiinteitä kasvaimia kuten haimasyöpä, mutta hoidon tehoa rajoittaa säteilyn kestävyys. Kestävyys kemoterapiaa tai sädehoitoa liittyy alentunut mitokondrio hengitystä ja lääkkeitä, jotka stimuloivat mitokondrio hengitys saattaa vähentää säteilyn kestävyys. Tavoitteet Tämän tutkimuksen oli arvioida mahdollisuuksia (-) – epikatekiinia edistää mitokondrioiden hengitykseen syöpäsoluissa ja valikoivasti herkistää syöpäsolut säteilylle. Olemme tutkineet luonnollinen yhdiste (-) – epikatekiinia varten vaikutuksiin mitokondrion hengitystä ja säteilyn kestävyys haiman ja glioblastooma syöpäsolujen käyttäen Clark tyyppi Happielektrodi, klonogeeniset selviytymisen määritykset, ja Western blot -analyysit. (-) – Epikatekiinin stimuloi mitokondrion hengitystä ja hapen kulutusta Panc-1-soluissa. Ihmisen normaali fibroblasteja ei vaikuttanut. (-) – Epikatekiinin herkistetty Panc-1, U87 ja MIA PaCa-2-solut, joiden keskimääräinen säteilyn parannus tekijä (REF) ja 1,7, 1,5, ja 1,2, vastaavasti. (-) – Epikatekiinin ei herkistä normaalia fibroblastisoluja ionisoivalle säteilylle, jossa REF 0,9, mikä viittaa siihen, syöpäsolun selektiivisyys. (-) – Epicatechin parannettu Chk2 fosforylaatiota ja p21 induktio yhdistettynä säteily syövän, mutta ei normaaleja soluja. Yhdessä, (-) – epikatekiinin radiosensitized syöpäsolut, mutta ei normaalien solujen, ja se voi olla lupaava ehdokas haimasyövän hoitoon yhdistettynä säteilyllä.

Citation: Elbaz HA, Lee I, Antwih DA, Liu J, Hüttemann M, Zielske SP (2014) epicatechin stimuloi Mitokondrioiden toiminta ja valikoivasti herkistää syöpäsolut Säteily. PLoS ONE 9 (2): e88322. doi: 10,1371 /journal.pone.0088322

Editor: Gabriele Multhoff, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 07 elokuu 2013; Hyväksytty: 13 tammikuu 2014; Julkaistu: 06 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Elbaz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Angelika Burger yhteinen Postdoctoral Fellowship päässä Karmanos Cancer Institute (SPZ ja MH), käynnistyksen varoja osasto Radiation Oncology, Wayne State University (SPZ), ja NIH myöntää GM089900 (MH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että väliaikaisen patenttihakemuksen (# 61/817226, (-) – epicatechin kuin Cancer Treatment edistävän yhdisteen) on toimitettu. Kirjoittajat ei ole muita kilpailevia intressejä. Kirjoittajat vahvistavat, että tämä seikka ei muuta niiden noudattamista kaikkien PLoS One politiikan tietojen yhteiskäytön ja materiaaleja.

Johdanto

sädehoito sopii monille kiinteitä kasvaimia, koska sen paikallinen solumyrkkyvaikutuksessa. Säteilyn kestävyys, on kuitenkin yhteinen ongelma, joka on vastuussa tuumorien uusiutumista, syöpäpotilailla [1]. Warburg vaikutus, jossa mitokondrion hengitystä on poistaa myös hapen läsnäollessa, ja aerobinen Glykolyysivaiheen stimuloidaan, uskotaan välittävän vastustuskykyä kemoterapiaa ja sädehoitoa kiinteissä kasvaimissa [2], [3]. Ionisoivalla säteilyllä stimuloi mitokondrion hengitystä ja kasvaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto syöpäsoluissa [4].

Aiemmat raportit ovat ehdottaneet pienempi riski syövän potilaille säännöllisesti vievää hedelmiä ja vihanneksia [5]. Flavonoidit ovat kaikkialla läsnä luokka polyfenoliyhdisteiden jotka ovat läsnä hedelmiä ja vihanneksia ja käsittää useita ryhmiä yhdisteitä kuten flavanols, Flavoni, flavonoleista, isoflavoneja, flavanoneista, anthocyanidins ja proantosyanidipitoisuuksilla [4], [6]. Useita positiivisia terveysvaikutuksia, kuten syövän ehkäisyyn liittyvät flavonoideja ravinnosta [7]. Lisäksi, flavonoideja osoitettiin herkistää syöpäsolut kemoterapiaa ja sädehoitoa, mutta useammin on osoitettu olevan säteilyltä vaikutuksia normaaleihin kudoksiin [8] – [11]. (-) – Epicatechin on monomeerinen flavanol joka on luonnollinen yhdiste löydetty paljon hedelmiä ja vihanneksia, erityisesti kaakaon ja vihreää teetä [6], [12], ja sillä on useita suotuisia vaikutuksia ihmisten terveyteen [13]. Tuore tutkimus ryhmämme osoitti, että (-) – epicatechin stimuloi mitokondrion hengitystä ja lisääntynyt mitokondrioiden massa hiirissä [14].

Kyky flavanol (-) – epikatekiinia edistää mitokondrioiden hengitystä ja lisätä mitokondrioiden massa hiirimallissa [14], sekä aikaisemman tutkimuksen osoittaa, että säteily stimuloi mitokondriaalisen hengityksen syöpäsoluissa [4], johtavat meidät oletuksen, että (-) – epicatechin voi herkistää syöpäsolut sädehoito, koska molemmat vastapainoksi Warburg aineenvaihduntaa. Tavoitteet tässä tutkimuksessa olivat tutkia kykyä (-) – epikatekiinia edistää mitokondrioiden hengitykseen syöpäsoluissa ja tutkia kyky (-) – epikatekiinia valikoivasti herkistää syöpäsolut säteilylle. Me täällä osoittavat, että (-) – epicatechin stimuloi sytokromi

c

oksidaasi (COX) aktiivisuutta ja mitokondriaalisen hengityksen haiman syöpäsoluja. Lisäksi, (-) – epikatekiinin herkistetty haimasyöpä ja glioblastoomasoluissa, mutta ei normaalien fibroblastien, säteilylle. (-) – Epicatechin yhdistettynä ionisoivaa säteilyä stimuloi Chk2 (tarkistuspiste kinaasi 2) fosforylaatio, p21 ilmaus, ja lisääntynyt apoptoosi, syöpäsoluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että (-) – epicatechin näyttelyitä potentiaalia parantaa hoitotulokseen syöpäpotilaille kasvattamalla tavanomaisilla sädehoidon.

Materiaalit ja menetelmät

(-) – epicatechin

(-) – epikatekiinin saatiin Sigma-Aldrich, kuten yhdisteen HPLC-puhdistettiin vihreä tee (≥98%: n puhtaus) (# E4018). 2 mm kantaliuosta (-) – epikatekiinin tehtiin PBS: ssä, ja alikvootteja säilytettiin -80 ° C: ssa. Tulokset juuri valmistettua (-) – epicatechin olivat yhdenmukaisia ​​-80 ° C varastot aikana tämän tutkimuksen. Testaus reaktiivisten hapen lajien soluissa (-) – epikatekiini-hajoamistuotteita varastoinnin jälkeen -80 ° C: ssa oli negatiivinen. Natriumpyruvaattia DMEM käytetään soluviljelmää toimii tehokkaana raadonsyöjä mahdollisten hapettimien peräisin Nutraceuticals kuten (-) – epikatekiinia [15].

Solut ja soluviljelmä

Pancin-1-soluissa, MIA PaCa-2-solut, U87-solut ja ihmisen normaalien fibroblastien hankittiin American Type Culture Collection ja niitä käytetään vähän passage (Manassas, VA). U87-solut ovat mallina solulinja ihmisen glioblastoma-astrosytooma. Pancin-1-soluissa ja MIA PaCa-2-solut ovat mallia solulinjat ihmisen haiman epiteelikarsinooman. Fibroblastit mallina solulinja normaalin ihmisen soluja. Soluja viljeltiin ja ylläpidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) (runsaasti glukoosia, jossa pyruvaatti) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 2 mM L-glutamiinia puuttuessa antibiootteja. Fibroblasteja siirrostettiin jälkeen dissosiaatio 0,05% trypsiini /EDTA ja muut solulinjat liukenevat 0,25% trypsiini /EDTA. Solulinjat seulottiin rutiininomaisesti mykoplasmakontaminaation ja todettu olevan negatiivinen.

hapenkulutus

Hapen kulutus tutkittiin mittaamalla COX toimintaa, joka on 90% kaikista solujen hapenkulutus. COX-aktiivisuus analysoitiin Panc-1-solut, joissa on mikro-Clark-tyyppi hapen elektrodi suljetussa kammiossa (Oxygraph System; Hansatech, Norfolk, UK) 25 ° C: ssa. Panc-1-solut ympättiin T-150-pulloihin ja seuraavana päivänä solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla (-) – epikatekiinia 1 tunnin ajan, sitten kerättiin ja liuotettiin 10 mM HEPES (pH 7,4), 40 mM KCI, 1% Tween-20, 1 uM oligomysiini, 1 mM PMSF, 10 mM KF, 2 mM EGTA ja 1 mM Na

3Vo

4. COX-aktiivisuus mitattiin, kun läsnä oli 20 mM askorbaatin ja 200 uM alustan sytokromin

c

lehmän heart (Sigma-Aldrich). Hapen kulutus kirjattiin tietokoneella ja analysoitiin Oxygraph ohjelmiston. Proteiinipitoisuus määritettiin DC-proteiinin iinianalyysikitissä (Bio-Rad, Hercules, CA,). COX aktiivisuus määritellään nanomols O

2 kulutetaan per minuutti per milligramma kokonaisproteiinia.

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

Solut ympättiin T-25 pulloissa 5 x 10

5 solua pulloa kohti. Seuraavana päivänä solut altistettiin 0-200 uM (-) – epikatekiinia 1 h ja sitten säteilytetään 0-8 Gy kanssa Pantak 320 kV orthovoltage yksikkö 0,86 Gy per min ja 10 mA. Kaksikymmentäneljä tuntia säteilytyksen jälkeen, solut trypsinoitiin, laskettiin ja maljattiin ennalta klonaalinen tiheydet. Kaksi viikkoa myöhemmin, solut kiinnitettiin metanoli /etikkahappo-seoksella (07:01), ja värjättiin kristallivioletilla. Colony laskenta tehtiin käsin ja tulokset analysoitiin määrittämällä eloonjääntifraktio kullakin säteilyannoksen. Solujen eloonjääminen käyrät sovitettiin lineaarisesti toisen asteen malli ja säteily lisälaite tekijät (REF), saadaan alueen valvonnassa (ilman lääkettä) käyrä jaettuna ala testin (huumeiden) käyrä [16].

Western blot-analyysi

Solut altistettiin 0-200 uM (-) – epikatekiinia 1 h ja sen jälkeen säteilytettiin 0 tai 6 Gy. Kaksikymmentäneljä tuntia säteilytyksen jälkeen, solut kerättiin ja lyysattiin 1% SDS, Pysäytetään proteaasi ja fosfataasi Inhibitor Cocktail, fosfataasinestäjällä Cocktail 3 (Sigma, Cat. No. P 0044), fosfataasinestäjällä Cocktail 2 (Sigma, Cat. No. P 5726), 10 mM, pH 7,4, 2 mM Na

3Vo

4, 1 mM NaF, ja 1,7 mM Na

4P

2O

7. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-määritystä (Thermo Scientific). Näytteet fosfo-Chk2 (Thr68) ja p21 denaturoitiin keittämällä 2 x Laemmli-puskuria, jota oli täydennetty 10% β-merkaptoetanolia, kun taas näytteet mitokondrioiden proteiinit sekoitettiin 2 x Laemmli-puskuria, jota oli täydennetty 10% β-merkaptoetanolia ja ravisteltiin keinuvivun huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Kolmekymmentä ug proteiinia ladattiin per kaivo käyttäen 4-20% mini-PROTEAN® tgx ™ esivalettuja geelejä (Bio-Rad), ja sitten siirrettiin PVDF-kalvoja käyttäen Trans-Blot Turbo Plus-järjestelmä (Bio-Rad). Siirron jälkeen kalvot estettiin 5% rasvatonta kuivamaitoa 1 h huoneen lämpötilassa, sitten niitä inkuboitiin yön yli ensisijainen anti-P-Chk2 (Thr68), anti-p21, anti-kaspaasi 3 anti-β-aktiini, anti- GAPDH (1:1000-1:5000; Cell Signaling Technologies, Boston, MA), oksidatiivinen fosforylaatio (OxPhos) kompleksi I NDUFB6 alayksikön, OxPhos kompleksi II alayksikköä 70 kDa Fp, OxPhos kompleksi III ydin alayksikkö I, sytokromi c, OxPhox kompleksi IV alayksikkö I, tai OxPhos monimutkaisia ​​V α-alayksikön (1:2000-1:8000; MitoSciences, Eugene, OR). Membraanit pestiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, jossa oli 0,1% Tween-20 (TBS-T), niitä inkuboitiin sekundaarisen anti-hiiri- tai anti-kani-vasta-aineita (1:4000; Cell Signaling Technologies), pestiin jälleen ja inkuboitiin SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraatti altistuminen röntgenfilmiä. Proteiinivyöhykkeet kvantitoitiin käyttäen Määrä Yksi versio 4.6.7 (Bio-Rad).

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Klonogeeniset kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen GraphPad Prism versio 6 (GraphPad Software Science, Inc., San Diego, CA) ja Mann-Whitneyn testi, Studentin t-testi, tai yksisuuntaista ANOVA tarvittaessa. Post-hoc Bonferroni monivertai- suoritettiin merkittävistä ANOVA tuloksiin. Tuloksia pidetään merkittäviä, kun p 0,05. Virhe palkit kuvaavat ± SEM.

Tulokset

(-) – epicatechin stimuloi mitokondrion hengitystä

Olemme aiemmin osoittaneet, että (-) – epicatechin stimuloi mitokondriaalisen hengityksen normaalin hiiren lihas kudokset [14]. Sen tutkimiseksi, (-) – epicatechin voisi stimuloida mitokondrion hengitystä syöpäsoluissa, tutkimme aktiivisuutta COX arvioimalla hapen kulutuksen Pancin-1-soluissa. COX siirtää elektroneja sytokromi

c

(Cytc) molekyyli- hapen, ja ”kulut” mitokondrioissa pumppaamalla protoneja poikki sisemmän mitokondrion kalvon, joita käytetään myöhemmin ATP sukupolvi. Cytc /COX reaktio on ehdotettu nopeutta rajoittava vaihe elektronin kuljetusketjun in vivo [17], [18], näin rajoittaa yleistä nopeutta Soluhengitys. (-) – Epikatekiinin stimuloitu COX-aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla haiman syöpäsoluissa, kun sitä käytetään konsentraatioissa jopa 200 uM (kuvio 1A, p 0,05). 200 uM (-) – epicatechin, mitokondriaalisen hengityksen korotettiin 59% 15,7-25,0 nmol O

2 /min per milligramma proteiinia.

(A) Hapen kulutus sytokromi c oksidaasi (COX) alkaen Panc-1-solut altistettiin eri (-) – epikatekiinia pitoisuudet. Liikevaihto määritellään kulutetaan O

2 (nM) /(min · kokonaisproteiinista (mg)). Soluhengitysnopeus korotetaan (-) – epikatekiinia pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. * P 0,05, verrattuna 0 uM (-) – epikatekiinia. (B) Hapen kulutus sytokromi-c-oksidaasi (COX) ihmisen normaali fibroblasti (HNF) soluja altistettiin 0 tai 100 uM (-) – epikatekiinia. Soluhengitysnopeus ei korotetaan 100 uM (-) – epikatekiinin.

onko stimulointi mitokondrioiden hengityksessä (-) – epicatechin voisi tapahtua normaali, ei-syöpä solutyyppejä, käsittelimme ihmisen normaalien fibroblastien (HNF) kanssa epicatechin ja mitataan COX toimintaa. Ei merkittävää kasvua O

2 kulutuksen todettiin jälkeen 100pM hoidon (Fig. 1 B). Nämä tiedot osoittavat, että (-) – epicatechin valikoivuus stimuloi mitokondriaalisen hengityksen syöpäsoluissa.

(-) – epicatechin herkistää syöpäsolut säteilylle

Lisääntynyt mitokondriaalisen hengityksen takia (-) – epikate- hoito voi kääntää Warburg aineenvaihduntaa ja siten herkistää syöpäsolut säteilylle. Tämän testaamiseksi tutkimme vaikutus (-) – epikatekiinia on klonogeeniset selviytymisen Panc-1, U87 ja MIA PaCa-2 syöpäsolun linjat. (-) – Epikatekiinin tehostaa merkittävästi radioherkkyyttä in Panc-1-solujen annoksilla 2-8 Gy (p = 0,0001, Fig. 2A). Vuonna U87-soluja, (-) – epikatekiinin myös merkittävästi parannettu radioherkkyyttä annoksilla 2-8 Gy (p = 0,0001, Fig. 2B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, että MIA PaCa-2 solulinja, jossa (-) – epicatechin tuottanut merkittäviä säteilylle herkäksi kullakin testatulla annoksella (p = 0,0001, Fig. 2C). Solujen eloonjääminen käyrät sovitettiin lineaarisen toisen asteen malli. In Panc-1-solut, elossa osa 2 Gy oli 98%, kun taas (-) – epikatekiinin käsittely vähensi merkittävästi elossa osa 58% (p = 0,001). Vuonna U87-solut, elossa osa 2 Gy oli 79% ja (-) – epikatekiinia vähensi merkittävästi eloonjääminen 51%: iin (p = 0,021). In MIA PaCa-2-solut, elossa osa 2 Gy oli 67%, kun taas (-) – epikatekiinin käsittely vähensi merkittävästi eloonjääntifraktio 2 Gy 52% (p = 0,029). Parantamiseksi säteilyn indusoiman solukuoleman tai säteilyn parantamiseksi tekijä (REF) oli 1,7 Panc-1, 1,5 U87, ja 1,2 MIA PaCa-2-soluissa. Nämä tiedot osoittavat, että (-) – epikatekiinin herkistää säteilylle syövät useita erilaisia ​​in vitro.

(A) (-) – epikatekiinin herkistää Panc-1-soluja säteilylle, joiden keskimääräinen REF = 1,7 (B) (-) -Epicatechin herkistää U87 soluja säteilylle, joiden keskimääräinen REF 1,5. (C) (-) – epicatechin herkistää MIA PaCa-2-solujen säteilylle joiden keskimääräinen REF = 1.2.

(-) – epicatechin ei herkistää HNF soluja säteilylle

sen testaamiseksi, (-) – epicatechin säteilylle herkäksi on selektiivinen syöpäsoluja, tutkimme vaikutus (-) – epikatekiinia on HNF soluissa. (-) – Epikatekiinin 20 uM ei herkistää HNF soluja säteilylle, jossa REF 0,9 (kuvio 3A). Kumpikaan ei (-) – epikatekiinin yksin väheneminen klonogeeninen eloonjäämistä HNF soluja (kuvio 3B). Nämä tiedot osoittavat, että (-) – epikatekiinin on selektiivinen syöpäsoluja ja siten ei voi lisätä normaalin kudoksen toksisuutta, kun se yhdistetään säteilyllä.

(A) 20 uM (-) – epikatekiinin ei herkistää HNF soluja säteilylle (REF = 0,9). (B) (-) – epicatechin yksin ei estä pesäkkeenmuodostusta HNF (p 0,05).

vaikutus (-) – epikatekiinia on elektroninsiirtoketju (ETC) proteiinin ilmentymisen

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että lisääntynyt mitokondrioiden hengitys kautta (-) – epicatechin hakemus liittyy pieni mutta merkittävä säätelyä ETC proteiinikomplekseille in vivo [14]. Suoritimme Western blot-analyysi kaikille OxPhos komplekseja käyttämällä vasta-aineita avainta alayksikön kunkin kompleksin (NDUFP, 70 kDa: n FP, Core1, COX1, ATP-syntaasi α) in Panc-1-soluja käsiteltiin 0-200 uM (-) – epikatekiinia ennen altistumiseen 0 tai 6 Gy. (-) – Epikatekiinin yksinään ei merkittävästi muuttunut ilmentyminen tahansa ETC proteiinien Panc-1-soluissa (kuvio 4A-B). Yhdistäminen (-) – epikatekiinia 6 Gy oli vähäinen vaikutus monimutkainen I (NDUFP) 200 uM ja monimutkainen III ydin alayksikköä 1 100 uM (kuvio 4A ja C, p = 0,0006). Nämä tiedot viittaavat siihen, että (-) – epicatechin, tässä syöpäsolulinja, ei aiheuta suuria muutoksia mitokondrioiden OxPhos komplekseja tasoja tai sovitella säteilylle herkäksi läpi suuria muutoksia tasojen ETC säätelyalayksiköt.

(A) edustava blot ETC proteiinin ilmentymistä Pancin-1-solut, joita oli käsitelty 0-200 uM (-) – epikatekiinia ja 0 tai 6 Gy. (B) (-) – epikatekiinin ei yksin merkittävästi muuta ETC-proteiinin ilmentymistä. Proteiini tasot normalisoidaan käsittelemättömään kontrolliin. (B) (-) – epicatechin aiheuttama minimaalinen muutokset ETC-proteiinin ilmentymisen, kun se yhdistetään 6 Gy. Arvot normalisoitiin 6 Gy yksin, ja * p 0,05 suhteessa 6 Gy /0 uM (-) – epikatekiinin.

(-) – epicatechin ja säteily stimuloida tarkistuspisteen kinaasi 2 fosforylaatiota ja p21 ilmaus in Pancin-1, mutta ei HNF solujen

fosforylaatio Checkpoint kinaasiproteiini 2 (p-Chk2) treoniini 68 ja yli-ilmentyminen p21 ovat osallisina DNA-vaurioita vastaus ja säteilylle herkäksi [19], [20]. Analysoimme p21 ilmaisun ja Chk2 fosforylaatiota Pancin-1-solut käsiteltiin 0 tai 20 uM (-) – epikatekiinia altistumisen jälkeen 0 tai 6 Gy. (-) – Epicatechin yksinään ei aiheuttanut muutosta p21 tasoja tai Chk2 fosforylaation 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Kuitenkin yhdistelmä (-) – epikatekiinia ja 6 Gy hoito stimuloi p21 ilmentymistä (kuvio 5A, p = 0,0005) ja Chk2 fosforylaation (kuvio 5B, p = 0,042). Ilmentymistä p21 lisääntyi 62% ja P-Chk2 (Thr68) tasot nousivat 43% säteilytettyjä soluja käsiteltiin (-) – epikatekiini, verrattuna soluihin, jotka saavat säteilyä yksin.

(A) (-) – epicatechin stimuloi p21 ilme. Proteiini tasoilla 20 uM (-) – epikatekiinia käsiteltyjen näytteiden normalisoitiin näytteitä käsiteltiin 6 Gy. (B) 20 uM (-) – epikatekiinin stimuloi Chk2 fosforylaatiota. Proteiini tasoilla (-) – epicatechin Käsitellyt näytteet normalisoitiin näytteitä, joita oli käsitelty 6 Gy, ja * p 0,05.

Sitten tutkittiin P-Chk2 ja p21 HNF soluissa hoidon jälkeen (-) – epikatekiinia ja säteily, koska HNF solut eivät radiosensitized (Fig. 3). Toisin kuin Panc-1 syöpäsolujen, yhdistelmä (-) – epikatekiinia plus 6 Gy vähensi p21-ilmentymisen 15% (Fig. 6A, p = 0,03). Chk2 fosforylaatio oli muuttumaton (kuvio. 6B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että (-) – epikatekiinia herkistää säteilylle syöpäsolujen häiriöiden solusyklin ja Checkpoint vastauksia säteilylle.

(A) (-) – epikatekiinin estää p21 ilmentymistä. Proteiini tasoilla 20 uM (-) – epikatekiinia käsiteltyjen näytteiden normalisoitiin näytteitä käsiteltiin 6 Gy, ja * p 0,05. (B) 20 uM (-) – epikatekiinin ei stimuloi Chk2 fosforylaatiota. Proteiini tasoilla (-) – epicatechin Käsitellyt näytteet normalisoitiin näytteitä, joita oli käsitelty 6 Gy.

(-) – epicatechin ja säteily stimuloivat pilkkominen kaspaasi 3 in Pancin-1-soluissa

kaspaasi 3 on kriittinen suorittamisen apoptoosin. Sen mahdollisuuden tutkimiseksi, että (-) – epikatekiinin herkistää syöpäsolut säteilylle indusoimalla apoptoosin, teimme Western blot analyysi pro-kaspaasi 3 ja pilkottiin kaspaasi 3 Panc-1-solut altistettiin 72 tunnin ajan 0 tai 20 μ (-) -epicatechin ja 0 tai 6 Gy säteilyn. Panc-1-soluja altistetaan (-) – epikatekiinin osoittivat lisääntynyttä pro-kaspaasi 3: n ekspressio ja solut, joita käsiteltiin (-) – epikatekiinia ja /tai 6 Gy osoittivat lisääntynyttä kaspaasi 3 pilkkominen verrattuna näytteisiin alttiina 6 Gy yksinään (Fig. 7). Nämä tiedot viittaavat siihen, että (-) – epikatekiinin herkistää säteilylle haimasyövän soluja stimuloimalla kaspaasi 3: n ekspressio ja apoptoosin.

Panc-1 solut altistettiin 0 tai 20 uM (-) – epikatekiinia 1 tunnin ajan, sitten alttiiksi 6 Gy säteilyn, ja inkuboitiin 72 tuntia. (-) – Epicatechin stimuloi prokaspaasia 3 ilmaisun ja pilkkominen.

Keskustelu

(-) – epicatechin stimuloi mitokondriaalisen hengityksen Pancin-1 soluja ilmeistä lisääntynyt hapenkulutus hinnat . Kun taas (-) – epikatekiinia herkistetty glioblastooma ja haimasyövän soluja säteilylle, se ei herkistä HNF solut, mikä osoittaa, että säteilylle herkäksi vaikutus (-) – epikatekiinin on spesifinen syöpäsoluja. (-) – Epikatekiinin stimuloi mitokondrion hengitystä ja esillä säteilylle herkäksi in Panc-1-solujen annoksesta riippuvaisella tavalla. Yhdistäminen (-) – epikatekiinia 6 Gy stimuloi Chk2 fosforylaatiota, p21 ilmaus, ja indusoi suurempaa pilkkominen kaspaasi 3. Näitä vaikutuksia havaittiin edullisesti syöpäsoluissa mutta ei normaaleissa soluissa (HNF).

Tulokset esitetty tässä ovat uusia ja merkittäviä kolmessa suhteessa. Ensinnäkin, (-) – epikatekiinia herkistetty haimasyövän soluja säteilylle. Haimasyöpä on tyypillisesti resistenttejä tavanomaisille hoitotoimenpiteiden [21] ja sädeherkistävä lääkkeet voivat siten olla käyttökelpoisia voittamiseksi tämän terapeuttisen esteen. Toiseksi, useimpia haimasyövän on tunnusomaista Kras mutaatiot [22] ja myös tulokset osoittivat, että (-) – epikatekiinin herkistää säteilylle Kras mutantti Panc-1 ja MIA PaCa-2-solulinjat. Kolmanneksi osoitimme, että (-) – epikatekiinia herkistyneet syöpäsoluihin mutta ei HNF soluja säteilylle, joka on yhdenmukainen aiempien tutkimusten ja osoittaa syöpäsolun valikoivuus [9], [10], [23]. Lisäksi uutuus tuloksemme näkyy osoittaa stimuloitua mitokondrion hengitystä syöpäsoluissa pitoisuuksissa, jotka ovat terapeuttisesti merkityksellisiä ja joita ei ole testattu haiman syöpäsoluja. Hyötyosuus (-) – epikatekiinia kun suun kautta osana elintarvikkeiden uutetta kuten vihreää teetä tai kaakaota saattaa olla ongelma rajallisuuden vuoksi suolen imeytymistä. Tässä tutkimuksessa käytimme puhdistettu (-) – epicatechin yhdistettä ja kuvitella suorempi reitti terapeuttisen annon in vivo, jotka voivat mahdollistaa suuremman plasmassa. Erityisesti aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet biologisia vaikutuksia suun kautta puhdasta yhdistettä [14]. Vaikka tämä tutkimus osoitti vaikutuksen (-) – epikatekiinia on normaalia kudosta, kun taas nykyinen tutkimus ei erot mallien ja solutyyppejä tutkittu ovat syvällisiä ja voi selittää tätä eroa. Aineenvaihdunta, signalointi, ja ETC-isoformit ovat todennäköisesti erilaiset lihassoluja ja fibroblastit.

edistäminen mitokondriaalisen hengityksen haimasyövän soluja ei välttämättä edellytä lisääntynyt ETC proteiinin ilmentymisen. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että COX ratkaisevasti säätelee fosforylaatio sekä katalyyttinen ja säätelyalayksiköt [24]. Näin ollen, stimulaation mitokondriaalisen hengityksen: n (-) – epikatekiinia syöpäsoluissa voisi välittää signaloinnin mekanismi, joka on vielä selvittämättä. (-) – Epikatekiinin on osoitettu estävän MAPK /Erk [25], [26] ja MAPK on osoitettu liittyvän EGFR ja translokoituvat mitokondriot jossa se sitoutuu COX [27] viittaa mahdolliseen signaloinnin mekanismi (-) -epicatechin-säätelyyn mitokondrioiden hengitystä.

yhdistäminen (-) – epikatekiinia säteilyn aiheuttama Chk2 fosforylaatiota Pancin-1-soluissa. Chk2 fosforylaatiota treoniini 68 tapahtuu altistuminen säteilylle osana DNA-vaurioita vastaus [28], [29]. Useat tutkimukset osoittavat osallistumista p21 säteilylle herkäksi vuonna useiden syöpätyyppien [19], [20], [30]. Lisäksi tutkimukset osoittavat, että fosforylaatiota Chk2 treoniini 68 ja lisääntynyt p21 ilmaus vähentää solujen lisääntymistä aiheuttamalla vanhenemista [31] – [33]. Kyky (-) – epikatekiinia stimuloimaan Chk2 fosforylaatioon ja p21 ilmaus voisi mahdollisesti selittää ainakin osittain mekanismi, jolla (-) – epicatechin aiheuttaa säteilylle herkäksi ja eston klonogeeniset selviytymisen Pancin-1-soluissa. Ylimääräisiä, (-) – epikatekiinia stimuloi pilkkominen kaspaasi 3 tai ilman säteilyä ja tämä voisi tarjota toinen selitys säteilylle herkäksi haiman syöpäsoluja.

(-) – epicatechin stimuloi mitokondrion hengitystä ja esti klonogeeniset eloonjäämisen haiman syöpäsoluja. Kun yhdistetään säteilyllä, (-) – epikatekiinin radiosensitized haimasyöpäsoluissa ja glioblastoomasoluissa, mutta ei HNF soluja. (-) – Epicatechin stimuloi Chk2 fosforylaatiota ja p21 ilmentymistä taso saavutetaan säteilystä yksin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että (-) – epicatechin on valikoiva herkistävät syöpäsolujen säteilylle ja tekee siitä lupaava ehdokas uutena hoitomuoto hoitoon haima- tai muita syöpiä.