Krooninen sairaus

tiivistelmä

proteiinikinaasi CK2 on usein säädelty vahvistavasti ihmisen syövissä, vaikka mekanismi CK2 aktivaation syöpä on edelleen tuntematon. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet rooli CK2α intronitonta geenin (

CSNK2A1P

, oletettu CK2α pseudogeeniä) patogeneesissä ihmisen syövissä. Löysimme todisteita vahvistusta ja yli-ilmentyminen

CSNK2A1P

geenin ei- pienisoluisen keuhkosyövän ja leukemian solulinjoja ja 25% keuhkosyöpä kudoksia tutkittu. MRNA ekspressiotasoja korreloi kopio numerot

CSNK2A1P

geeni. Olemme myös tunnistaneet uuden polymorfisen variantin (398T /C, I133T) on

CSNK2A1P

geenin ja osoitti, että 398T-alleeli on selektiivisesti monistetaan yli 398C alleeli 101 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kudosnäytteitä verrattuna 48 terveillä (

p

= 0,013 0,05). Me osoitamme ensimmäistä kertaa CSNK2A1P proteiinin ilmentyminen transfektoiduissa ihmisen alkion munuais- 293T ja hiiren alkion fibroblasti NIH-3T3-solulinjat. Molempien alleelien muuttavat näissä solulinjoissa, ja 398T-alleeli näyttää olevan transformoivan kuin 398C alleeli. Lisäksi 398T alleelin hajoaa PML tuumorisuppressoriproteiinia tehokkaammin kuin 398C alleeli ja esittää suhteellisen vahvempi sitoutuminen PML. Knockdown on

CSNK2A1P

geeniekspression erityisiä siRNA lisäsi PML-proteiinin taso keuhkojen syöpäsoluja. Raportoimme, ensimmäistä kertaa, että

CSNK2A1P

geeni on toiminnallinen esikasvaintekijän ihmisen syövissä ja sen toiminnan polymorfismi näyttäisi hajota PML differentiaalisesti syöpäsoluissa. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tärkeä rooli 398T alleelin

CSNK2A1P

ihmisen keuhkosyövän alttius.

Citation: Hung MS, Lin YC, Mao JH, Kim IJ, Xu Z, Yang CT, et al. (2010) toiminnallinen polymorfismin CK2α intronitonta Gene Toistot onkogeeninen roolit Lung Cancer. PLoS ONE 5 (7): e11418. doi: 10,1371 /journal.pone.0011418

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 17 joulukuu 2009; Hyväksytty: 5 kesäkuu 2010; Julkaistu: 02 heinäkuu 2010

Copyright: © 2010 Hung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu National Institutes of Health (093708-01A3) ja Larry Hall ja Zygielbaum Memorial Trust, ja Kazan, McClain, Edises, Abrams, Fernandez, Lyon ja Farrise Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava kuolinsyy syöpään Yhdysvalloissa [1]. Jotkut somaattisen tapahtumien mukana keuhkosyöpä on hyvin tunnettu, mutta jotkut heistä ovat edelleen tuntemattomia [2], [3]. Proteiinikinaasi CK2 (aiemmin tunnettu nimellä kaseiinikinaasi II) on seriini /treoniini proteiinikinaasi, joka fosforyloi yli 300-proteiineja [4]. Se hajoaa tuumorisuppressori proteiineja, kuten PML [5] ja edistää aktiivisuutta ja stabiilisuutta onkogeenisten proteiinien, kuten AKT [6]. Esimerkiksi CK2 edistää PML hajoamista ja CK2 kinaasiaktiivisuuden korreloi käänteisesti PML-proteiinin tasot ihmisen keuhkosyövän [5]. Äskettäin multippelimyelooma solujen eloonjäämistä osoitettiin luottaa korkea aktiivisuus proteiinikinaasi CK2 [7]. CK2 vaikuttaa myös useita soluviestitykseen reittejä, kuten PI3K, NFKB, ja Wnt polkuja [8].

taso CK2α ilmentymistä on tarkoin säädeltyä normaaleissa soluissa [9], ja lisääntynyt CK2α taso ja aktiivisuus on jatkuvasti ollut havaittu erilaisissa ihmisen syövissä [10]. Esimerkiksi korkean tason ja /tai ydinvoiman lokalisoinnin CK2α on merkkiaine huono ennuste potilaille, joilla on akuutti myelooinen leukemia, eturauhassyöpä, ja okasolusyöpä keuhkosyövän [10]. CK2α on katalyyttinen alayksikkö proteiinikinaasi CK2 ja CK2α on raportoitu koodata

CSNK2A1

kromosomissa 20p13 [11].

CSNK2A1

geeni voi toimia onkogeenin ja sen säädeltyyn ilmentyminen voidaan indusoida nisäkasvainten ja lymfoomat siirtogeenisissä hiirissä [12], [13]. Vaikka aktiivisuus

CSNK2A1

geenin on osoitettu olevan koholla ihmisen syövissä, ei kiinteää geneettisiä tai epigeneettisiä todisteita on saatavilla koskien syy korkean aktiivisuuden CK2α syöpäsoluissa [10]. CK2α intronitonta-geeni (tunnetaan myös nimellä CK2α ”pseudogeenin”),

CSNK2A1P

, sijaitsee kromosomissa 11p15.3 ja sen sekvenssi on erittäin homologinen (99%: n identiteetti) ja

CSNK2A1

cDNA sekvenssi [14]. Vaikka

CSNK2A1P

geeni on tiettävästi ilmaistaan ​​karyosyyttistä solulinjassa [15], sen rooli syöpäsolujen kehitykseen ei tunneta. Siksi tutkittiin vahvistusta ja ilmaus

CSNK2A1P

geenin keuhkosyövän ja leukemian solulinjoja ja keuhkosyövän kudoksiin.

Tulokset

Yli-ilmentyminen ja monistus

CSNK2A1P

geeni syöpäsoluissa ja keuhkosyöpä kudoksia

keskittyneet

CSNK2A1P

geeni koska me aluksi löytänyt sitä oli vähän ilmentyy normaaleissa soluissa, mutta oli pääasiallisesti ilmaistu useissa tyyppisiä ihmisen syöpäsolulinjoissa ja tuumorikudokset, mukaan lukien ihmisen T-solu- leukemian solulinjassa Jurkat, joka on tunnettu korkean CK2 aktiivisuus. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR, olemme osoittaneet, että

CSNK2A1P

geeni on myös yli-ilmentynyt kolme NSCLC riviä: H1299, H322 ja A549, mutta vähän ilmentyy normaaleissa soluissa ja kaksi keuhkosyövän solulinjat H1650 ja H460 (Fig. 1A). Lisäksi

CSNK2A1P

mRNA yli-ilmentyy keuhkojen kasvain kudosta seitsemän 29 (-25%) kasvainnäytteestä verrattuna vastaaviin kontrolleihin kudoksiin (Fig. 1 B). Lisäksi FISH-analyysillä samana ihmisen syöpäsolulinjoissa edellyttäen pitävää näyttöä monistamiseen

CSNK2A1P

geeni sijaitsee kromosomissa 11p15.3 (Fig. 1 D). Esimerkiksi neljä kappaletta

CSNK2A1P

geenin havaittiin ihmisen T-solu- leukemian solulinjassa Jurkat, ja kolme kappaletta keuhkosyöpä solulinjat H1299, A549, ja H322. Sen sijaan normaalin lymfosyyttien ja H460-solulinja oli diploidi kopioita

CSNK2A1P

geenin (Fig. 1 C ja D). Tärkeää on, mRNA ekspressiotasoja korreloi kopio numerot

CSNK2A1P

geeni näissä ihmisen syövän solulinjoissa (n = 8; Pearsonin γ = 0,9346;

p

= 0,0007) (Fig. 1 E ). Olemme edelleen suorittaa semikvantitatiivinen RT-PCR arvioida mRNA ilmaus

CSNK2A1

geenin alukkeita. Yli-ilmentyminen

CSNK2A1

geeni havaittiin myös edellä syöpäsolulinjoissa (Fig. 1 F), viittaa siihen, että sen lisäksi, että

CSNK2A1

geeni,

CSNK2A1P

geeni myös on merkittäviä rooleja patogeneesissä keuhkosyöpä. Tasaus alukkeista käytetään semikvantitatiivisella RT-PCR

CSNK2A1

ja

CSNK2A1P geenit

näytettiin täydentävät tiedot (Kuva. S1).

(A) semi-kvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttäen CSNK2A1P alukkeita esittää CSNK2A1P mRNA: n ilmentymisen taso on yhdenmukainen kopio tunnistettuja FISH (3 H1299, 4 Jurkat, 3 H322 ja A549, 2 Wi-38 ja CCL-211 ). (B) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttäen CSNK2A1P alukkeita Näyttää CSNK2A1P mRNA yli-ilmentyy seitsemän (potilas 1 ja 7) ulos 29 (-25%) keuhkokasvaimia verrattuna vastaaviin normaaleihin viereiseen kudokseen. Potilaan 8-14 edustaa näytteitä ilman yli-ilmentyneen CSNK2A1P mRNA. Muut 14 näytettä, joilla on samankaltaisia ​​tuloksia ei ole esitetty. (C)

CSNK2A1P

geeni monistetaan ihmisen T-solu- leukemian solulinjassa Jurkat ja keuhkosyövän solulinjat H1299, A549, ja H322. (D) edustaja kuvaa FISH tutkimuksen tuloksia metafaasien normaalin lymfosyyttien, Jurkat, H322 ja A549 solulinjoissa.

CSNK2A1P

geeni leimattiin Cy3 (punaisella). Kromosomi 11 senttimetrin koetin leimattiin FITC (vihreä). (E) korrelaatio kopioluvun ja mRNA: n ilmentymisen

CSNK2A1P

geeni laskettiin Pearsonin korrelaatiota. (F) Semikvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttäen CSNK2A1 alukkeita esittää CSNK2A1 mRNA: n ilmentymisen taso normaalissa ja syöpäsolulinjoissa edellä. Kaikki semikvantitatiivinen RT-PCR-kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

Alleelispesifisiä monistamiseksi

CSNK2A1P

geenin keuhkosyöpä

määrittämiseksi onko olemassa mutaatioita

CSNK2A1P

ihmisen keuhkosyöpää, sekvensoimme avoin lukukehys

CSNK2A1P

geenin. Vaikka emme löytäneet mutaatioita, olemme löytäneet uuden polymorfismiin kinaasidomeeni (398T /C, joka johtaa aminohappoon muutoksen I133T, Fig. 2A) 18 syöpäsolulinjoissa (taulukko 1) ja 101 ensisijainen keuhkosyöpä kudosnäytteiden (Taulukko 2). Erityinen aminohapon muutos ennustetaan vaikuttavan proteiinin toiminnan, kun lajittelu suvaitsematon alkaen suvaitsevainen (SEULOA) menetelmää käytetään [16]. Kiinnostavaa kyllä, tämä polymorfia näytti tasaisesti normaalia kudosta, mutta kasvaimissa, oli merkitsevästi useammin klo 398T alleelin (Fig. 2C) (Chi-Square test, p 0,05). Lisäksi on 56 heterotsygoottista keuhkosyöpä tutkituissa kudoksissa suhteessa tähän polymorfismi (Fig. 2D), 20 (35,7%) näytteistä osoitti vahvistus tällä alueella, ja 18 (90%) näistä 20 näytteiden 398T alleeli oli valikoivasti monistettiin (Fig. 2E). Tämä selektiivinen vahvistus viittaa siihen, että 398T alleeli voisi tarjota kasvua etulyöntiasema 398C alleeli. Edelleen vahvistaa tulokset DNA: n sekvensointi, tutkimme alleeli-spesifinen monistuminen on 398T alleelin

CSNK2A1P

(koodaa Ile133 variantti) ihmisen kasvaimissa käyttäen kvantitatiivista yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) analyysi, eli TaqMan-pohjainen alleeliset syrjintää määrityksessä. Alleelinen syrjintä data on yhtäpitävä sekvensointi tietoja (Fig. 2B). 101 keuhkojen kasvain näytteet kirjoitetaan, 56 oli heterotsygoottinen suhteen 398C → T polymorfismin, ja olemme analysoineet näiden 56 näytteet alleelispesifinen monistus 398C → T polymorfismin

CSNK2A1P

mukaan TaqMan-analyysi (kuvio . 2B). Kaksikymmentä näytteet osoittivat alleeliset epätasapainoa kahden alleelin välillä, 2 näytteet osoittivat vahvistuksen 398C alleelin (koodaa Thr133) ja 18 näytteet osoittivat vahvistuksen 398T-alleelin (koodaa Ile133). Nämä tulokset osoittavat tilastollisesti merkitsevä alleeli-spesifinen monistuminen on 398T alleelin (

P

0,05, Chi-Square test), joka tarjoaa lisätodisteita roolin tämän alleelin ihmisen keuhkosyöpä. Nämä tulokset sai meidät tutkimaan entistä rooliin variantin

CSNK2A1P

muotoja kasvainten kehittymiseen.

(A) Alleelispesifisiä monistamiseksi 398T alleelin (TTT /C tai TT /C) on joissakin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kudosnäytteistä. T yläpuolella nuolenkärki (nukleotidi 398T, I133,) oikealla on osoitus villityypin geeni. (B) monistaminen

CSNK2A1P

alleelien keuhkotuumoreiden vahvistanut määrälliset Alleelispesifisen yhden polymorfismin (SNP) analyysi. Suhde 398T ja 398C alleelien heterotsygoottisessa keuhkotuumoreiden määritettiin TaqMan-analyysillä käyttäen alleelispesifisiä koettimia, ja ilmaistaan ​​erot CT tasoilla (syklit) positiivisia tai negatiivisia ACt-arvot osoittavat monistus 398T tai 398C alleeli, vastaavasti. 56 näytettä kirjoitetaan, 2 osoitti monistus 398C alleelin yli 0,6 virtamuuntajaa (näytteet T3-4) ja 18 osoittivat monistus 398T alleelin (näytteet T5-23). Kolmekymmentä kuusi näytettä ei osoittanut vahvistusta (edustaja T1-2). Terveillä näytteisiin ei aiheuttanut vahvistusta (N1-3). Normalisoitu keinot ja keskihajonnat kolmen erillisen kokeen näkyvät. (C, D ja E) Alleelispesifisiä monistamiseksi 398T alleelin lisää merkittävästi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kudosnäytteistä. Normaali: aikuisen ihmisen normaalin genomisen DNA: n. Kasvain: no-pienisoluinen keuhkosyöpä kudoksia. * Osoittaa p 0,05 (Chi-square test).

Differential muuttamassa aktiivisuus kaksi

CSNK2A1P

alleelien

Testaa toiminnallinen merkitys 398T → C polymorfismi

CSNK2A1P

geeni, me kloonattu

CSNK2A1

ja

CSNK2A1P

geenejä pcDNA 3,1 /myc-His vektori ja toteutti sarja solujen kasvua, joissa käytetään NIH3T3-solut. Tässä tutkimuksessa, nämä vektorit transfektoitiin transientisti 293T ja NIH3T3-solut ja Länsi-analyysiä käytettiin varmistamaan proteiinin ilmentymistä molempien alleelien

CSNK2A1P

geenin (Fig. 3A). Tulokset osoittavat, että ensimmäistä kertaa, että ilmentyminen

CSNK2A1P

voi tuottaa sen proteiineja.

(A)

CSNK2A1

ja

CSNK2A1P

geenit transfektoitiin transientisti 293T ja NIH3T3-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 mukainen reagenssi valmistajan ohjeiden mukaisesti. 72 tuntia transfektion jälkeen, solut sadon ja koko solun proteiinit uutettiin. Western blot-analyysiä käytettiin vahvistamaan proteiinin ilmentymistä molempien alleelien

CSNK2A1P

geenin. Anti-myc-vasta-ainetta käytetään havaitsemaan CSNK2A1P-Myc tag fuusioproteiineja. (B) Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä. Transfektio

CSNK2A1P

geenin NIH3T3-soluissa johtaa parannettu ankkurista riippuva kasvu, verrattuna tyhjän vektorin ohjaus. Pesäkkeiden määrä NIH3T3-CSNK2A1 ja NIH3T3-CSNK2A1P solut ovat huomattavasti korkeammat kuin NIH3T3-EV-soluja. (C) Pehmeä agar määrityksessä. Stabiili transfektio

CSNK2A1P

geenien NIH3T3-soluissa johtaa parannettu kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun. Sekä NIH3T3-CSNK2A1 ja NIH3T3-CSNK2A1P solut tuottivat merkittävästi enemmän pesäkkeitä kuin NIH3T3-EV-soluissa ei (* p 0,05, t-testi). Kahdesta alleelista on

CSNK2A1P

geeni, 398T-alleeli on muodostettu enemmän pesäkkeitä kuin 398C alleelin teki (** p 0,05, t-testi). Suhteellinen pesäkkeiden muodostumista molemmissa solulinjoissa ilmaistaan ​​prosentteina normalisoidaan tyhjä vektori-transfektoidut kontrolliryhmässä ja esitetään baari ± keskihajonta kolmen erillisen kokeen. (D) kinaasimääritys ilmennetyn CSNK2A1 ja CSNK2A1P proteiinien NIH3T3-soluissa. Ekspressoidut proteiinit olivat immuuni-saostettiin Anti-Myc tag-vasta-ainetta ja kinaasimääritys suoritettiin. Sekä NIH3T3-CSNK2A1 ja NIH3T3-CSNK2A1P soluissa oli merkittävästi korkeammat kinaasin toimintaa kuin NIH3T3-EV-soluissa ei (* p 0,05, t-testi). Kahdesta alleelista on

CSNK2A1P

geeni, 398T alleeli soluihin oli merkittävästi korkeammat kinaasiaktiivisuuden kuin 398C alleelin teki (** p 0,05, t-testi). Suhteellinen kinaasin aktiivisuus ilmaistaan ​​prosentteina normalisoidaan tyhjä vektori-transfektoidut kontrolliryhmässä ja esitetään baari ± keskihajonta kolmen erillisen kokeen. EV: tyhjän vektorin. Wt: CSNK2A1. 398C: CSNK2A1P (I133) 398T: CSNK2A1P (I133T).

pesäkemuodostusta, transfektoimalla

CSNK2A1P

geenien NIH3T3 (NIH3T3-CSNK2A1P) soluissa johtaa tiiviimpään ankkurointi -riippuvaista kasvua verrattuna tyhjän vektorin kontrolli (NIH3T3-EV). Lisäksi olemme syntyy NIH3T3-solujen CSNK2A1 (NIH3T3-CSNK2A1) positiivisena kontrollina. Pesäkkeiden määrä NIH3T3-CSNK2A1 ja NIH3T3-CSNK2A1P solut olivat merkittävästi korkeammat kuin NIH3T3-EV-solut (Fig. 3B). Transfektio

CSNK2A1P

geenin NIH3T3-soluissa johti myös parannettu kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun. Kun pehmeä agar pesäkemuodostusta tuloksia verrattiin, olemme havainneet, että stabiili transfektio

CSNK2A1P

geenien NIH3T3-soluissa johti parannettu ankkurista riippumattomaan kasvuun (kuvio 3C). Sekä NIH3T3-CSNK2A1 ja NIH3T3-CSNK2A1P solut tuottivat enemmän pesäkkeitä kuin NIH3T3-EV-solujen teki. Verrattuna NIH3T3-EV-solut, NIH3T3-CSNK2A1 ja NIH3T3-CSNK2A1P solut tuottivat pesäkkeet, jotka olivat enimmäkseen isompi ja oli levinnyt-out muotoja. Kun kaksi alleelia

CSNK2A1P

geenit verrattiin, olemme huomanneet, että 398T-alleeli on muodostettu enemmän pesäkkeitä kuin 398C alleelin teki. Kinaasin määritys ekspressoidut proteiinit suoritettiin myös (kuvio 3D). 398T-geenituote on suurempi kinaasiaktiivisuuden kuin 398C-geenin tuote ei. Tulokset kinaasimääritys ovat yhdenmukaisia ​​pesäkkeiden muodostumista ja pehmeä agar tietoja.

toiminnallinen polymorfismin

CSNK2A1P

geenien hajoamiseen PML tuumorisuppressoriproteiinia

määrittämään sen mekanismi, jonka avulla 398T alleeli on edullisesti monistetaan keuhkosyöpä näytteissä, tutkittiin vaikutuksia kahden alleelin

CSNK2A1P

geenin kasvaimia estävä PML-proteiinin.

CSNK2A1P

geenejä stabiilisti transfektoitiin NIH3T3 ja NSCLC H1650 solulinjoissa. Western blot-analyysi osoitti alennettua PML-proteiinin tasoa soluissa, jotka on transfektoitu

CSNK2A1P

geenejä. CSNK2A1P 398T-alleeli, joka on samanlainen villityypin CSNK2A1, vähentynyt PML-proteiinin tasoja enemmän kuin 398C alleelin teki (Fig. 4A). Toiseksi meidän selvitettävä, puoliintumisaika PML säädellään eri tavalla mukaan kahden alleelin. Nämä kaksi solulinjaa transfektoitiin

CSNK2A1P

geenin käsiteltiin sykloheksimidillä 0, 2, ja 6 tuntia, ja endogeenisen PML-proteiinin tasot tutkittiin. 398T alleeli vähentynyt puoliintumisaika PML tehokkaammin kuin 398C alleelin teki (Fig. 4B). Kolmanneksi käytimme samanaikainen immunosaostus näyttää suoran ja edullisen sitoutumisen välillä 398T proteiinin ja PML-proteiinin (Fig. 4C).

(EN) PML-proteiini vähenee NIH3T3 ja H1650 stabiileja solulinjoja, jotka transfektoitiin jonka

CSNK2A1

ja

CSNK2A1P

geenejä. Endogeenisen CSNK2A1 proteiinia ja yli-ilmentynyt CSNK2A1 ja CSNK2A1P proteiinit myös esitetty. (B) Hajoaminen PML-proteiinin näkyvämmäksi NIH3T3 stabiileja solulinjoja transfektoitu CSNK2A1 ja CSNK2A1P (I133). Tuntia tunnin kuluttua sykloheksimidikäsittelylle. (C) 293T-solut ko-transfektoitiin PML-V5 ja Myc-merkittyä CSNK2A1 tai CSNK2A1P konstruktioita. CSNK2A1 ja CSNK2A1P (I133) osoittavat vahvempi sitoutuminen PML-proteiinin vastavuoroisesti immunosaostusmäärityksissä. EV: tyhjän vektorin. Wt: CSNK2A1. 398T: CSNK2A1P (I133) 398C: CSNK2A1P (I133T). (D): n ilmentyminen

CSNK2A1P

geenin pienenee H1299 keuhkosyövän solulinjassa transfektion jälkeen

CSNK2A1P

geenin tietyn siRNA. Eivät pienene, ilmaus

CSNK2A1

ja

CSNK2B

geenien havaittiin. (E) Minkään CK2α proteiini taso laskee ja PML-proteiinin tason nousua H1299 keuhkosyövän solulinjaa transfektion jälkeen

CSNK2A1P

geenin tietyn siRNA. N: negatiivinen kontrolli siRNA. CSNK2A1P:

CSNK2A1P

siRNA. Bändi tiheydet normalisoidaan negatiiviseen siRNA transfektoitu ryhmä käyttäen aktiini sisäisenä kontrollina. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

edelleen kysymystä siitä, onko CSNK2A1P mRNA täysin käännetty ja hajoaa PML syöpäsoluissa, me pudotti

CSNK2A1P

geeni H1299 keuhkosyövän solulinjoja siRNA ominaisia ​​

CSNK2A1P

geeni. Valitsimme H1299 keuhkosyövän solulinjassa koska tutkimus (kuvio 1A ja C) osoitti, että

CSNK2A1P

geeni monistetaan, ja yli-ilmennetään tässä solulinjassa.

CSNK2A1P

geenispesifisistä siRNA aiheutti yli 70%: n lasku ilmaus

CSNK2A1P

geeni eikä laskua ilmaus

CSNK2A1

ja

CSNK2B

geenit (Fig. 4D). Mukaisesti vähentynyt ilmentyminen

CSNK2A1P

geenin koko CK2α proteiinin vähentynyt ja PML-proteiinin lisääntynyt käsitellyissä soluissa

CSNK2A1P

siRNA: t verrattuna negatiivisen siRNA transfektoitu kontrolleihin (Kuva. 4E) .

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme tarjonneet, tietojemme mukaan ensimmäinen näyttöä siitä, että

CSNK2A1P

geeni on toiminnallinen esikasvaintekijän ihmisen syövissä . Tukemaan hypoteesia, että

CSNK2A1P

geeni on toiminnallinen proto-onkogeenin, pikemminkin kuin ”pseudogeenin”, olemme tehneet laajan DNA, mRNA: n, proteiinin ja siRNA-analyysi. Tulokset Tämän analyysin antaa ensimmäinen todiste siitä, että mRNA: n ekspression taso korreloi kopioluvun

CSNK2A1P

geenin useissa ihmisen syöpäsolulinjoissa. Lisäksi siRNA kaataa että

CSNK2A1P

geeni väheni yhteensä CK2α proteiinin taso syöpäsoluissa, mikä osoittaa, että

CSNK2A1P

geeni on täysin käännetty syöpäsoluissa. Täten monistus

CSNK2A1P

geeni voi olla onkogeenisen rooli näissä ihmisen syöpäsolulinjoissa. Perusteella tuloksemme, ehdotamme, että kaksi toiminnallista geenit voivat esiintyä ihmisen CK2α perhe,

CSNK2A1

, joka etsii kromosomissa 20p13, ja

CSNK2A1P

, joka etsii kromosomissa 11p15.3.

myös löytäneet uuden polymorfismiin kinaasidomeeni (398T /C, joka johtaa aminohappoon muutoksen I133T, kuvio 2a) 101 ensisijainen kasvaimia. Tämä polymorfia näyttää tasaisesti normaalin kudoksen, mutta kasvaimissa, on huomattavasti yleisempää 398T alleelin (taulukko 2, kuvio 2). 398T alleeli selektiivisesti monistettiin kahdeksantoista 101 keuhkosyöpää kudoksia, mikä viittaa siihen, se voisi tarjota kasvuetua yli 398C alleeli. 398C alleeli monistaminen vain löytyy kaksi 101 keuhkosyöpää kudoksia, mikä viittaa siihen, että se voisi olla sattumaa. Nämä kiehtova perimäluokitukset sai meidät tutkimaan entistä rooliin variantin

CSNK2A1P

muotoja kasvainten kehittymiseen. Näin saatiin kaksi tärkeää havaintojen ensiksi, että 398T alleeli on enemmän transformoivan kuin 398C alleeli, ja toiseksi, että 398T alleeli heikentää tuumorisuppressoriproteiinia PML-proteiinin tehokkaammin kuin 398C alleeli. Esimerkiksi 398T alleeli näytti merkittävästi korkeampi transformoivan aktiivisuutta sekä pesäkkeiden muodostumisen ja pehmeä agar määritykset kuin 398C alleelin (Fig. 3B ja C). Data kinaasimääritys osoitti, että 398T-geenin tuote on korkeampi kinaasiaktiivisuuden kuin 398C geenituotteen (Fig. 3d), mikä viittaa siihen, että 398T-alleeli on enemmän muuttaa alleeli kuin 398C alleeli. Lisäksi nämä tiedot viittaavat siihen, että transformoivan kyky 398T alleelin

CSNK2A1P

pseudogeenin on samanlainen kuin normaali

CSNK2A1

geenituotetta, joten aktiivisempi alleelin pseudogeenin näyttää olevan aktiivisuutta verrattavissa säännöllisesti

CSNK2A1

geeni. Tähän mennessä ei ole geneettistä tai epigeneettiset näyttöä aktivointi CSNK2A1 geenin ihmisen syövässä. Näin Tutkimuksemme tarjoaa ensimmäiset todisteet siitä, että

CSNK2A1P

398T-alleeli, joka on samanlainen kuin

CSNK2A1

geeni, monistetaan ihmisen keuhkosyövän kudoksiin.

PML-geeni alun perin tunnistettiin murtuessa t (15; 17), translokaatio akuutti promyelosyyttinen leukemia [17], ja osoittautui kasvainsuppressorigeenin [18]. Menetys PML on korreloitu huonon kliinisen tuloksen erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä, tukee sen tuumorisuppressorin toiminto [5], [19]. PML edistää defosforyloitumista pRb ja säätelee solujen kohtalo kehitysmaissa neocortex [20]. CK2 säätelee ubikitiinistä välittämää hajoaminen PML ihmisen keuhkosyövän solulinjat [5], [21]. Tämä saattaa olla yksi mahdollisista mekanismeista, joilla 398T alleeli on edullisesti monistetaan keuhkosyöpä näytteissä. Tämä geneettinen polymorfismi on todennäköisesti käyttökelpoinen markkeri voidaan havaita monistamiseen CK2 intronitonta-geenin, koska monoallelic vahvistus uskotaan olevan vastuussa geenivahvistus syövän [22]. Tämä alleelispesifisen vahvistus merkitsee myös sitä, että syöpäsoluja voidaan riippuvainen onkogeenisel- CK2α [23]. Lyhyesti, monistamiseen 398T alleelin

CSNK2A1P

geeni voi osallistua ainakin osittain, patogeneesiin keuhkosyöpään.

CSNK2A1P

geeni on prosessoitua pseudogeeniä sijaitsee kromosomissa 11p15.3 ja on tarkoitus muodostaa retrotranspositioon, ja tunnettu siitä, että ei ole introneja, läsnäolo liitännäis- ohjaa toistoja, ja 3 ’polyadenylaation tail [15]. Kuitenkin, se on vahva promoottori ylävirtaan aloituskodonista (14, 15). Ilmaisu on

CSNK2A1P

geeni on potentiaalisesti tiukemmin säänneltyjä kuin

CSNK2A1

on. Esimerkiksi promoottorialueen

CSNK2A1P

geeni sisältää kaksi TATA laatikkoa ja CAAT box, kun taas ylävirran sekvenssin

CSNK2A1

näyttää siivous-geenin ominaisuudet, esimerkiksi korkea GC-pitoisuus, kun läsnä useiden GC laatikoita ja puute TATA (14, 15). Lisäksi useita tärkeitä transkriptiotekijän sitoutumiskohdat (esim CEBP-, GATA- ja Smad-sitoutumiskohdat) ennustettiin sisällä 5′-alue (1 Kb) päässä

CSNK2A1P

aloituskodonista, mikä viittaa siihen, että

CSNK2A1P

geeni voidaan mahdollisesti indusoida tai tukahduttaa vastaavasti useita päällikön sääntelyviranomaisten kehittävän polkuja. Monistamiseen

CSNK2A1P

geeni voi aiheuttaa yli-ilmentyminen CSNK2A1P proteiinin syöpäsoluissa. Se voi myös olla mahdollista, että

CSNK2A1

geeni on jotenkin epäsuorasti säätelee ilmentymistä

CSNK2A1P

geenin. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan paljastaa mekanismin, jonka kautta

CSNK2A1P

ja

CSNK2A1

geenejä säädellään. Tähän asti noin 10000 käsitellään pseudogeenejä [24] on tunnettu siitä, että ihmisen perimässä, ja jotkut näistä geeneistä on raportoitu ekspressoituvan syöpäsoluja. Esimerkiksi onkogeeninen

CRIPTO3

pseudogeenin on ilmaistu paksusuoli-, rinta- ja keuhkosyöpää [25], ihmisen homologi vacciniaviruksen H1 fosfataasin geenin kloonin 5 (

HVH-5 ​​

) pseudogeenistä on ilmaistuna rintasyövän solulinjoissa [26], ja

Rac1

pseudogeenistä ilmentyy aivokasvaimia [27]. Yhdessä meidän tuloksia, tämä viittaa mahdollisen kasvaimia synnyttävän roolia oletetaan pseudogeenien joidenkin ihmisen syöpien.

Tämä tutkimus oli joitakin rajoituksia. Osoitimme korrelaatio

CSNK2A1P

geenin ja PML-proteiinin vakautta vain kaksi keuhkosyövän solulinjoja in vitro. Näytteet vain 101 keuhkosyöpäpotilaita analysoitiin, 56 joista heterotsygoottinen suhteessa tähän polymorfismia voidaan käyttää analyysiin. Jatkossa tutkimuksissa, on tärkeää sisällyttää muita syövän solulinjat ja syöpä kudoksiin.

tulokset tarjoavat geneettisiä todisteita aktivoimiseksi intronitonta CK2α geeni ihmisen syövässä. Vaikka CK2 aiemmin tiedetään olevan keskeinen toimija syöpä, sen mekanismi aktivaation syöpä ei ollut tiedossa [10], [28]. Tämän takia tiedon puute mekanismi CK2 aktivaation ja Perustamiskokouksessaan toiminta, CK2 on enimmäkseen laiminlyöty keskeisenä kohteena syöpälääkkeet. Koska merkittävää edistystä on tapahtunut rakenteellinen perustaa CK2 esto, on nyt mahdollista kehittää tehokas ja selektiivinen solujen läpäisevä CK2 estäjät [29], [30]. Ymmärtäminen ero sarjoissa

CSNK2A1P

geenipolymorfismien voi antaa meille mahdollisuuden suunnitella erityisiä diagnostisia testejä ihmisen syövän. Tärkeää on, meidän tulokset tukevat käsitystä, että proteiinikinaasi CK2α on houkutteleva kohde syöpähoitojen kuten pienimolekyylisiä estäjiä [10], [31].

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

ihmisen syöpä (Jakurt, H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052, Hela ja H1650) ja normaali keuhkojen (WI-38 ja CCL-211) solulinjat saatiin American Type Culture kokoelmat (Manassas, VA). H290 ja MS-1-solulinjat saatiin NIH (Frederick, MD). Soluja kasvatettiin täydellisessä kasvualustassa (Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine HeLa, A549 ja CCL-211; Eaglen Minimum Essential Medium Wi-38; Roswell Park Memorial Institute keskipitkän varten H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052 ja H1650), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 10 yksikköä /ml penisilliiniä ja 10 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa ja 5% CO2: ta.

kudosnäytteet

tuore kasvainkudoksissa ja viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSLC), jotka olivat käynnissä kirurginen resektio primaarikasvaimen. Tutkimuksen hyväksyi University of California, San Francisco, Institutional Review Board (CHR # H8714-11647-14). Saimme kirjallinen tietoon perustuva suostumus kaikilta osallistujia tutkimuksessamme. Kudosnäytteet pidettiin -180 ° C: ssa nestemäisen typen pakastimet ennen käyttöä, ja lopullinen patologinen diagnoosi varmistettiin patologi yliopistossa Kaliforniassa, San Francisco (UCSF), USA. Normaalin aikuisen genomista DNA muodossa ääreisverenkierron ostettiin BioChain (Hayward, CA).

Fluoresenssi-in situ

fluoresenssi-in situ -hybridisaatio (FISH) koetinta CSNK2A1P (RP11-567I13 , kromosomi 11p15.3) hankittiin BacPac Resources (Oakland, CA). Kromosomi 11 sentromeeriantigeenin leimattiin Vysis CEP 11 SpectrumGreen ™ koetin (Abbott Molecular, Abbott Park, IL). Metaphase dioja valmistettiin käyttämällä standardimenetelmiä ja UCSF Molecular Pathology Core laitokseen. Kaikki hybridisaatiot tekemän UCSF Molecular Pathology Core laitokseen. CSNK2A1P BAC koetin leimattiin Cy3 punaisella lovitranslaatio. Koetin seos valmistettiin standardin protokollan.

DNA: n ja cDNA: n sekvenssianalyysi

Genominen DNA tai kokonais-RNA eristettiin solulinjoista ja kudosnäytteitä käyttämällä DNeasy Veren Tissue Kit tai RNeasy Mini Kit (Qiagen Valencia, CA), tässä järjestyksessä. CSNK2A1P-geeni monistettiin PCR: llä käyttämällä geenispesifisiä alukkeita. Eteenpäin ja reverse-alukkeita, joita käytetään PCR: ää ja sekvensointi: 5′-AGAAAATTGCTCCCCACTCC-3 ’ja 5′-GTGCTGCCAGAGAATGA CAA-3’ vastaavasti. PCR-tuotteet puhdistettiin geelissä käyttäen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Valencia, CA) ja myöhemmin sekvensoitiin MCLab (South San Francisco, CA).

Semikvantitatiivisilla käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR ) analyysi

Yhteensä-RNA solulinjoista ja kudoksista eristettiin käyttämällä liuuttovälinepakkausta, ja DNA eliminoitiin kolonniin hoidon DNaasia (RNeasy Mini kit, Qiagen, Valencia, CA, USA). Semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen SuperScript One-step RT-PCR: Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Yksi askel RT-PCR suoritettiin käyttämällä paria CSNK2A1P-spesifisiä alukkeita (eteenpäin: 5′-AGAAAATTGCTCC CCACTCC-3 ’ja Reverse: 5′-GTGCTGCCAGAGA ATGACAA-3′), CSNK2A1-spesifisiä alukkeita (eteenpäin: 5’-TGGGGACAGAAGATTTATATGA -3 ’ja Reverse: 5′-CTGAAGAAATCCCTGACA TCAT-3′) ja CSNK2B-spesifisiä alukkeita (eteenpäin: 5’-CAGGTCCCTCACTACCGACA -3 ’ja Reverse: 5′-CAGCTGGTAGGCCATCGGAT-3’). PCR-tuotteet varmistettiin suoralla DNA-sekvensoinnilla. Glyseraldehydi-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina.