Krooninen sairaus

tiivistelmä

munasarjojen ja haiman syövät ovat kaksi kaikkein aggressiivinen ja tappava syöpiä, joiden johto kasvot vain rajallinen hoitovaihtoehtoja. Tyypillisesti nämä kasvaimet levitä salakavalasti mukana ensimmäisen epätyypillisiä oireita, ja yleensä vaihda lääke resistenssifenotyyppi nykyisen lääketeollisuuden armamentarium. Siten uusien lääkkeiden kehittämiseen toimivat kautta eri vaikutusmekanismi on selvä prioriteetti. Tässä olemme raportoivat ensimmäistä kertaa, että aminosteroid johdannainen RM-133, joka on kehitetty laboratoriossamme, näyttää lupaava aktiivisuus kaksi mallia aggressiivisten syöpien, nimittäin munasarjojen (OVCAR-3) ja haiman (PANC-1) syöpiä. IC

50 arvoa RM-133 oli 0,8 uM ja 0,3 uM OVCAR-3 ja PANC-1 solulinjoilla viljelmässä, vastaavasti. Farmakokineettisten tutkimusten RM-133 käyttäen 11 eri ajoneuvoja, valitsimme kaksi ajoneuvoa: vesipitoinen 0,4% metyyliselluloosaa: etanoli (92: 8) ja auringonkukkaöljyä: etanoli (92: 8)

in vivo

tutkimuksissa . Käyttämällä ihonalaisen RM-133 kanssa metyyliselluloosapohjaisia ​​ajoneuvo, kasvu PANC-1 kasvainten ksenosiirrettyjä ja nude-hiirissä estyi 63%. Varsin mielenkiintoisesti, RM-133 ihon alle kanssa metyyliselluloosapohjaisia ​​tai auringonkukka perustuvat ajoneuvot vähensi OVCAR-3 ksenografti kasvua 122% ja 100%: lla. Päättymisen jälkeen RM-133 käsittelyä käyttäen metyyliselluloosapohjaisia ​​ajoneuvon, OVCAR-3 kasvaimen kasvun estämistä pidettiin ≥ 1 viikko. RM-133 oli myös hyvin siedetty koko eläin, ilman mitään selvää merkkiä toksisuudesta jotka on havaittu ksenograftin tutkimuksissa.

Citation: Kenmogne LC, Ayan D, Roy J, Maltais R, Poirier D (2015) Aminosteroid Johdannaiset RM-133 Näyttää

in vitro

ja

in vivo

antituumorivaikutus in Human munasarjojen ja haimasyöpä. PLoS ONE 10 (12): e0144890. doi: 10,1371 /journal.pone.0144890

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 25 syyskuu 2015; Hyväksytty 24. marraskuuta 2015 Julkaistu: 14 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Kenmogne et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Canadian Institutes of Health Research (CIHR, POP-I), Quebec Breast Cancer Foundation (QBCF), Société de valorisaatio de la recherche at Quebec (SOVAR), lääketieteellisen tiedekunnan Université Laval, ja Centre de Recherche en Endocrinologie Moleculaire et Oncologique et Génomique Humaine (CREMOGH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät JR, RM, ja DP tämän käsikirjoituksen ovat seuraavat kilpailevia intressejä: 2 – (N-substituoidut piperatsinyyli) steroidijohdannaisilla: Patent 13/130621 (US); Patenttihakemuksissa 2744369 (Kanada) ja 09828506,7 (Eurooppa). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Koska merkittävä kansanterveysongelma maailmanlaajuisesti, syöpä vastaa yksi neljästä kuolemista Yhdysvalloissa ja Kanada [1,2]. Munasarjojen ja haiman syövät kaksi aggressiivisia syöpiä, jotka jakavat ominaisuudet leviämisen salakavalasti kun näyttö epätyypillisiä oireita, ja helposti siirtymässä lääkeaineen resistenssifenotyyppi. Munasarjasyöpä on heterogeeninen sairaus, joka kärsii vuosittain 225000 naista maailmassa [3-5]. Se on kaikkein vaarallisin joukossa gynecologic pahanlaatuisia johtuen sen oireeton luonnosta sen alussa etiologiasta, ja tehokkuuden puute diagnoosimenetelmien [2,5]. Tämän seurauksena 75% naisista jo esitellä itsensä pitkälle edennyt munasarjasyöpä (vaiheet III IV International Federation of naistentautien ja synnytysten luokitus), kun ensimmäinen diagnosoitu [3,6-9]. Näiden naisten, 5 vuoden pysyvyys vaihtelee 25%: sta 35% [3,10] ja kultakannasta hoito on kirurginen debulking ja kemoterapia perustuu yhdistelmään paclitaxel- ja platina-pohjaiset hoidot [6,11-13 ]. Vaikka ensimmäinen vastaus munasarjasyövän hoitoon on suotuisa, suurin osa potilaista muuttua vastustuskykyisiksi nykyisin käytössä hoitoja ja yli 90% kohdistuu relapses 18 kuukauden jälkeen [14,15]. Toisaalta, haimasyöpä, joka on maailman neljänneksi tappava syöpä, on aggressiivinen kasvain, joilla oli erittäin huonon ennusteen [1,2,16]. Sen 5 vuoden pysyvyys on vain 6% [1] takia myöhään alkudiagnoosin, nopea sairauden etenemisen, ja kestävyys solunsalpaajahoitojen nykyisin käytössä [17]. Koska haiman kasvaimet ovat ominaista laaja paikallinen invaasio ja varhaisen imusuonten sekä hematogenous etäpesäkkeitä [18], vain harvat potilaat ovat ehdokkaita resektio, ja siksi systeeminen gemsitabiini kemoterapian on tällä hetkellä eniten käytetty hoitomuoto [19]. Huolimatta viimeaikaisista parannuksista lääkekehityksessä, pituus ja elämänlaatua haimasyövän potilaat eivät ole parantuneet [20]. Näin ollen on kiireellinen tarve kehittää uusia lähestymistapoja hallintaan näiden sairauksien, jotka ovat kaikkein aggressiivinen ja tappava syöpien ja on rajoitettu hoitovaihtoehtoja, erityisesti potilaille, joilla on leikattavissa haimasyöpä, joiden yleiskunto nopeasti heikkenee [16,20, 21].

edellä esitetty osoittaa, että uudenlaisten terapeuttisten aineiden kautta vaikuttavan eri toimintamekanismeja kriittisesti tarvitaan torjumaan suuri ongelma lääkeresistenssin kohtasi nämä kaksi syöpätyyppien, ja siksi parantaa eloonjäämisaste potilaiden. Yhdiste RM-133 (kuvio 1) on aminosteroid joka on kehitetty laboratoriossamme [22]. Se on osoittanut lisääntymistä estävä aktiivisuus useissa syöpäsolulinjoissa (HL60 ihmisen promyelosyyttinen leukemia-solut, T-47D ihmisen rintasyöpäsoluissa, WEHI-3 hiiren myelomonosyyttileukemia soluja, ja LNCaP ihmisen eturauhasen syöpäsolujen) ja IC

50-arvot vaihtelevat 0,1 2 uM [23]. RM-133 osoitti myös alhainen kohtalainen riski lääkeaineinteraktioita perustuu sen heikon estämällä maksan entsyymien CYP3A4 ja CYP2D6 [23]. Vuonna Edellä

in vivo

määrityksessä, RM-133 esti 57% kasvua HL60 kasvaimen ksenosiirrettyjä nude-hiirissä [22]. Alustavassa tutkimuksessa toimintamekanismin tämän perheen aminosteroids, analogin RM-133 estetty HL60 solut G0 /G1 vaiheeseen ja indusoi apoptoosin [24].

Tässä me raportoimaan lupaava syövän vastaista aktiivisuutta RM-133 ihmisen adenokarsinooman OVCAR-3-solujen, joka on mallina lääkeresistenssin tutkimuksen munasarjasyöpä [25], ja ihmisen haiman karsinooma (PANC-1) solua. Raportoimme myös farmakokineettisiä tutkimuksia RM-133 mukana eri ajoneuvoja, sekä sen antituumorivaikutus malleissa munasarjojen ja haiman syövät, nimittäin OVCAR-3 ja PANC-1 kasvainten ksenosiirrettyjä paljaisiin hiiriin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen munasarjojen (OVCAR-3), ja haiman (PANC-1) syöpäsolut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja ylläpidetään räjähdysmäinen kasvu 5% CO

2 kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa. OVCAR-3 soluja kasvatetaan rutiininomaisesti RPMI-1640-väliaineessa (Sigma, St. Louis, MO), jota oli täydennetty 20% FBS: ää, L-glutamiinia (2 mM), antibiooteilla (100 IU penisilliiniä /ml ja 100 ug streptomysiiniä /ml), insuliini (50 ng /ml), ja estradioli (1 nM). Sillä OVCAR-3 Soluproliferaatiomäärityksiä keskipitkällä käytettiin identtisiä, lukuun ottamatta jättäminen estradioli. PANC-1-solut ylläpidettiin DMEM-korkean glukoosin (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada), joka sisälsi L-glutamiinia (2 mM) ja antibiootteja (100 IU penisilliiniä /ml ja 100 ug streptomysiiniä /ml), ja jota oli täydennetty 10% FBS: ää . For PANC-1 soluproliferaatiomääritykset, jälkimmäinen ylläpito väliaine korvattiin DMEM /F12, joka sisälsi saman täydentää.

Solujen elinkelpoisuus määritykset

soluproliferaation määritys suoritettiin kolorimetrisellä menetelmällä käyttämällä 3 – (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS) (Cell Titer 96 Aqueous, Promega, Madison, WI). Mikrotiitterilevyn 96-kuoppaisille levyille (Becton-Dickinson Company, Lincoln Park, NJ), ympättiin 1 x 10

4 solua /kuoppa suspendoitiin 100 ul: aan alustaa ja esi-inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. Kantaliuos RM-133 valmistettiin EtOH: ssa (1 x 10

-2 M) ja laimennettiin koeväliaineessa, joka lisättiin kuhunkin kuoppaan hetkellä nolla. Sen jälkeen, kun 72-tunnin inkuboinnin MTS (20 ui liuosta, jonka valmistaja) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyä inkuboitiin 4 tunnin ajan. MTS muunnetaan vesiliukoista värinen formatsaaniksi dehydrogenaasien läsnä metabolisesti aktiiviset solut, ja siten, MTS-määritys mahdollistaa välittömän määrittämisen absorbanssi liukoisen formatsaanituotteen suoraan soluun väliaineessa ja siten mittaus elävien solujen.

490 väliaineen määritettiin käyttäen 96-kuoppalevyn lukijaa INFINITE 200 PRO-sarja (TECAN, Männedorf, Sveitsi). IC

50 arvoa RM-133 määritettiin molempien solulinjojen käyttäen GraphPad Prism 7 -ohjelmisto (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

Eläimet

Kaikki

in vivo

kokeet hyväksynyt meidän Institutional Animal Care ja Käytä komitea (comités de suoja des animaux de l’Université Laval) ja suoritettiin ohjeiden mukaisesti Kanadan neuvoston Animal Care. Vierassiirrännäisille, homotsygoottinen ♀

nu /nu

nude-hiirten (24-42 päivää vanhoja) hankittiin Charles River Inc. (Saint-Constant, QC, Kanada) ja koteloitu (neljästä viisi) vinyyli mikro- eristetty ilmanvaihto häkeissä, joissa on ilman kannet, jotka pidettiin laminaarista ilmavirtausta huput ja ylläpidetään taudinaiheuttajista-rajoittavia ehtoja. Aikana akklimatisaatio ja tutkimusjaksona Eläimiä pidettiin alle kontrolloiduissa olosuhteissa 22 ± 3 ° C, 50 ± 20% suhteellisessa kosteudessa ja valoa asetettu 12 h /vrk (valo klo 07:15). Jyrsijöiden ruoka (jyrsijän ruokavalio # T.2018.15, Harlan Teklad, Madison, WI) ja vettä tarjotaan

halun

. Sillä

nu /nu

nude-hiirissä, ruokaa ja vettä steriloitiin ennen annostelua eläimille. Standard Balb /c-hiiriä käytettiin farmakokineettisiä tutkimuksia. Eläimet nukutettiin isofluraanilla ja tapettiin saattamalla kaula sijoiltaan.

vaikutus RM-133 OVCAR-3 ksenografteissa ja huumeiden plasman nude-hiirissä

Ensimmäinen osa.

Kaksikymmentä -Kaksi ♀

nu /nu

nude-hiirten (22-24 g) inokuloitiin sc 5 x 10

6 OVCAR-3 soluja (0,1 ml kasvualustaa, joka sisälsi 30% Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA)) molempiin kylkiin kunkin hiiren kautta 2,5 cm pitkä 22-neula. Kun 11 päivää, tuumoreita kantavaa hiirtä jaettiin sattumanvaraisesti kahteen ryhmään 11 ​​hiirten kukin mukaan kasvaimen kokoa, eli kontrolliryhmään (

n

= 12 kasvaimet) ja käsitellyn ryhmän (

n

= 15 kasvaimet). RM-133 annettiin s.c. päivittäin 60 mg /kg 0,1 ml propyleeniglykolia: EtOH: ssa (92: 8). Kontrolliryhmän eläinten ryhmä sai 0,1 ml pelkästään vehikkeliä. Kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa käyttäen paksuus. Kaksi kohtisuorassa halkaisijat (

L

ja

W

) mitattiin, ja kasvaimen alueella (mm

2) laskettiin käyttäen kaavaa (

L

/2 ) x (

W Twitter /2) x π. Eläimet punnittiin eri väliajoin kokeen aikana.

Toinen osa.

Vuoden lopussa ksenografti kokeilu, ja saadakseen alustavat farmakologiset tiedot, hiiret hoitoryhmissä jaettiin 4 alaryhmiä 2-3 hiirten kukin, injektoitiin RM-133 (60 mg /kg) ja tapettiin 3, 7, 12 tai 24 h. Samanaikaisesti hiiret kontrolliryhmässä myös jaettu 4 alaryhmiin, käsiteltiin RM-133 (60 mg /kg) kuin käsitellyissä hiirissä, ja tapettiin samoilla aikaväleillä. Veri kerättiin hiiristä sydänpunktiolla, ja plasman RM-133 määritetään nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS), kuten aiemmin on raportoitu [23]. Kasvaimia hiirissä hoidetussa ryhmässä kerättiin ruumiinavauksessa, yhdistettiin, homogenoitiin tunnetun menettelyn [26] ja määrä RM-133 määritettiin LC-MS /MS: llä.

plasmakonsentraatio RM -133 hiirillä eri injektio annoksina

Kahdeksan ♀ Balb /c-hiiriä, jotka painoivat noin 20 g erotettiin 4 ryhmään. Hiirtä kussakin ryhmässä saivat yksittäisen s.c. injektio RM-133 (30, 60, 120 tai 480 mg /kg). Ajoneuvon käytettiin propyleeniglykolia: EtOH: ssa (92: 8) ja injektiotilavuus oli 0,1 ml kaikille pitoisuuksia lukuun ottamatta 480 mg /kg, jossa 0,2 ml käytettiin. Veri kerättiin sydänpunktiolla 12 h, ja plasman RM-133 määritettiin LC-MS /MS kuten yllä.

Analyysi eri ajoneuvojen RM-133 annon

Yksitoista erilaisia ​​ajoneuvoja tutkittiin sc injektio [27-35]. Näitä ajoneuvoja määritellään seuraavasti: ajoneuvon # 1 [propyleeniglykolia: EtOH (92: 8)]; Ajoneuvon # 2 [vesipitoista 0,4% metyyliselluloosaa: EtOH: ssa (92: 8)]; Ajoneuvon # 3 [risiiniöljyä: EtOH: bentsyylialkoholi: bentsyylibentsoaatti (65: 10: 10: 15)]; Ajoneuvon # 4 [auringonkukkaöljyä: EtOH (92: 8)]; Ajoneuvon # 5 [auringonkukkaöljyä: tetrahydrofuraani (92: 8)]; Ajoneuvon # 6 [vesipitoisella 25% β-syklodekstriiniä: EtOH: ssa (92: 8)]; Ajoneuvon # 7 [seesamiöljy: EtOH: bentsyylibentsoaatti: bentsyylialkoholi: Tween 80 (89,8: 7,8: 1: 1: 0,5)]; Ajoneuvon # 8 [soijaöljyä: EtOH (92: 8)]; Ajoneuvon # 9 [RPMI: EtOH (92: 8)]; Ajoneuvon # 10 [suolaliuos: dimetyylisulfoksidi (DMSO): Tween 80 (89,5: 10: 0,5)]; ja ajoneuvon # 11 [suolaliuos: bentsyylialkoholi: karboksimetyyliselluloosa: Tween 80 (98,2: 0,9: 0,5: 0,4)]. Kahdeksan ajoneuvojen tuottaa parhaan RM-133 liukoisuutta (# 1-8) injektoitiin s.c. (0,1 ml) ilman testiyhdistettä (RM-133) suvaitsevaisuutta ja käyttäytymiseen arviointiselvitysten, tarkkailemalla hiiriä 0,25, 1, 3, 7, 23, 26, 28, 30, ja 96 h injektion jälkeen. Lopuksi, RM-133 injektoitiin s.c. kerran 120 mg /kg /0,1 ml paras seitsemästä siedetty ajoneuvoja (# 1,2,4-7) osaksi ♀ Balb /c-hiiriä (4 ryhmää kohti), ja hiiriä ensi seurattiin verinäytteen sydänpunktiolla jälkeen 3 ja 12 h. Plasman RM-133, määritettiin sitten LC-MS /MS, kuten yllä.

vaikutus toistettiin s.c. injektiot RM-133 käyttämällä 3 ajoneuvot

Ten ♀ Balb /c-hiiriä, jotka painoivat noin 23 g erotettiin 3 ryhmään. Ryhmä 1 (3 hiirtä) käsiteltiin s.c. RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, kahdesti päivässä (AM ja PM), joka toinen päivä) vesipitoisessa 0,4% metyyliselluloosaa: EtOH (92: 8). Ryhmä 2 (3 hiirtä) käsiteltiin s.c. RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml, kahdesti päivässä (AM ja PM), joka toinen päivä) auringonkukkaöljyssä: EtOH (92: 8). Ryhmä 3 (4 hiirtä) sai vain yhden injektion RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml) vesipitoisessa 25% β-syklodekstriiniä: EtOH: ssa (92: 8) ja ne lopetettiin 24 tuntia myöhemmin. Hiiret ryhmissä 1 ja 2 sai yhteensä 8 pistosta 4 päivää ja tapettiin päivänä 8. Hiiret käyttäytymistä seurattiin koko kokeen ajan, ja makroskooppisen tarkkailu elinten suoritettiin kun ruumiinavaus.

Effect of RM-133 OVCAR-3 ksenografteissa käyttämällä kahta valittujen ajoneuvojen

Fourty ♀

nu /nu

nude-hiirten (22-24 g) inokuloitiin 5 x 10

6 OVCAR-3 solua kylki, 30% matrigeeliä, joka sisälsi kasvatusliuosta (0,1 ml). Jälkeen 23 päivää, tuumoreita kantavaa hiirtä jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään 8-9 hiiret kussakin. Ryhmä 1 (12 kasvaimet) käsiteltiin s.c. RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, kerran (AM) joka toinen päivä) auringonkukkaöljyssä: EtOH (92: 8), ja ryhmä 2 (13 kasvaimet) käsiteltiin s.c. RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, kahdesti päivässä (AM ja PM), joka toinen päivä) vesipitoisessa 0,4% metyyliselluloosaa: EtOH (92: 8). Kaksi ohjaus hiiri ryhmää, joista kukin edustaa 12 kasvaimia, sai vain ajoneuvoihin. Kuten edellä on mainittu, tuumorin alueella mitattiin kahdesti viikossa ja painon seurataan.

vaikutus RM-133 PANC-1-ksenografteja

Kaksikymmentä naaras

nu /nu

nude -hiiriä (22-24 g) inokuloitiin 5 x 10

6 PANC-1 solua kylki, 30% matrigeeliä, joka sisälsi kasvatusliuosta (0,1 ml). Kymmenen päivää inokulaation jälkeen, tuumoreita kantavaa hiirtä satunnaistettiin 2 ryhmään 10 hiirtä kussakin. Hiiret ensimmäiseen ryhmään (

n

= 16 kasvaimet) käsiteltiin s.c. RM-133 (240 mg /kg, kahdesti päivässä (AM ja PM), joka toinen päivä) 0,2 ml: ssa vesipitoista 0,4% metyyliselluloosaa: EtOH (92: 8). Hiiret toisella (kontrolli) ryhmässä (

n

= 18 kasvaimia) sai ajoneuvon vain. Aiempien ksenografteissa, tuumorin alueella mitattiin ja hiiri kehon painoa seurattiin.

synteesi ja valmistelu RM-133

aminosteroid RM-133 (2β- [1- (kinoliini-2 karbonyyli) pyrrolidiini-2-karbonyyli]

N

piperatsiini-5α-androstaani-3α, 17β-dioli) syntetisoitiin, tunnettu siitä, ja puhdistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Puhtaus RM-133: n havaittiin olevan 99,5% määritettynä korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (Laite: Shimadzu (Kioto, Japani); Kolonni: Altima, HP, C18-AQ, 4,6 x 250 mm, 5 um, Liuottimet A gradientti metanoli /vettä (70:30), jolloin 100% metanolia; UV-detektio 190 nm: ssä). Sillä

in vivo

hoitoja, RM-133 suspendoitiin ajoneuvon päivää ennen sen injektiota hiiriin ja säilytettiin 4 ° C: ssa jatkuvasti sekoittaen, kunnes se käytetään.

Tilastot

Duncan-Kramer testiä käytettiin analysoida tietoja, ja tilastollista merkittävyyttä hyväksyä

P

0.05 [36].

Tulokset ja keskustelu

RM-133 on sytotoksinen kohti ihmisen OVCAR-3 ja PANC-1-soluissa

vaikutuksen arvioimiseksi RM-133 leviämisen OVCAR-3 ja PANC-1 syöpäsoluja, jälkimmäinen inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa RM-133: ssa 72 tuntia, ja IC

50 lääkkeen mitataan. RM-133 oli selvästi lisääntymistä estävä aktiivisuus testatun solulinjoissa, jossa IC

50-arvot 0,8 ja 0,3 uM OVCAR-3 ja PANC-1, vastaavasti (kuvio 2). IC

50-arvot 0,1-1 uM alueella saadut täällä olivat samanlaisia ​​kuin aikaisemmin mitattu paneelin ihmisen syöpäsolujen linjat tämän perheen aminosteroids [23].

IC

50-arvot laskettiin 0,8 uM (OVCAR-3), ja 0,3 uM (PANC-1). Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. Virhepalkit ovat pienempiä kuin symboleja.

OVCAR-3-solulinja oli peräisin potilaan vastustuskykyiseksi solunsalpaajille, ja on sen vuoksi mielenkiintoinen malli tutkia lääkeresistenssin [25]. Se, että RM-133 osoitti voimakasta lisääntymistä estävä aktiivisuus malli (OVCAR-3) tunnettu chemoresistance, sekä PANC-1-soluissa, sai meidät tutkimaan tarkemmin

in vivo

aktiivisuus RM 133 kahdessa -tuumoriksenografti mallia käyttäen näitä kahta syöpäsolun riviä.

RM-133 inhiboi OVCAR-3 tuumoriksenografteja

Female nude-hiirten ympättiin molempiin kylkiin kanssa OVCAR-3-soluissa. Hiiret, joilla oli tuumoreita, satunnaistettiin 2 ryhmään: yksi ryhmä käsiteltiin RM-133 (60 mg /kg) ja toinen (kontrolli) sai ainoastaan ​​ajoneuvon (propyleeniglykoli: EtOH: ssa (92: 8)). Kasvaimia kontrolliryhmässä kasvoi selvästi nopeammin kuin käsiteltiin aminosteroid (kuvio 3A). Alkaen päivänä 15 lääkehoidon ja loppuun saakka koejakson, RM-133-käsiteltyjen kasvainten tuli huomattavasti pienempi kuin kontrolliryhmässä, jossa on 60%: n ero näiden kahden ryhmän välillä mitattuna hoidon päättyessä. Koska mahdollisesti myrkyllisten tietyn yhdisteen riippuu sen pitoisuus ja altistumisaika [37], ja kuten kuolleisuuden, kliinisten oireiden ja painon muutokset ovat tärkeimpiä indikaattoreita sen myrkyllisyydestä [38], on huomattava, että yli 21- päivän hoitojakson ajan, RM-133, ei ollut ilmeistä vaikutusta painoon (kuvio 3B) eikä ilmeinen toksisuus (esim poikkeava käyttäytyminen, kuolema).

OVCAR-3-solut (5 x 10

6 solua sekoitetaan 30% matrigeeliä) istutettiin sc molempiin kylkiin hiirillä. Hiirillä kasvaimen injisoitiin kerran päivässä s.c. RM-133 (0 tai 60 mg /kg kehon paino) 0,1 ml: aan propyleeniglykolia: EtOH: ssa (92: 8), ja 21 päivää. Kasvaimen koko (A) ja hiirten kehon painon (B) on tallennettu. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM. **: RM 133-hoidetussa ryhmässä on merkittävästi erilainen ohjaus (P 0,01).

lopussa on OVCAR-3-ksenografti kokeessa, sekä valvonta- ja RM-133-käsitellyissä ryhmissä erikseen sai yhden sc annos RM-133 (60 mg /kg). Verta kerättiin sen jälkeen, kun 3, 7, 12, ja 24 h, ja lääkeaineen pitoisuus plasmassa mitattiin LC-MS /MS: llä. Ajankul- RM-133 plasman oli samanlainen ryhmien A ja B Lääke näytteillä klassinen lääkettä luovuttavia profile [39], jossa boluksena toimituksen RM-133, jota seuraa jatkuva lasku sen plasmassa (kuvio 4 ). Suurin keskimääräinen plasmassa (460 ng /ml) havaittiin 3 h injektion jälkeen, ja se oli laskenut 81 ng /ml 24 tunnin kuluttua. Nämä tulokset osoittavat, että RM-133 ei kerry vereen 21 päivän aikana-ksenografti kokeilu. Kasvaimet hiiristä hoidettiin RM-133 kerättiin myös ruumiinavauksessa mittaamiseksi määrän RM-133. Tämä myöhemmin oli läsnä sisällä kasvaimen pitoisuutena 1,2 uM (773 ng /g), joka vastaa suunnilleen pitoisuutta RM-133, joka inhiboi 50% OVCAR-3 solujen lisääntymistä (IC

50 = 0,8 uM) . Tämä tulos on sopusoinnussa 60%: n vähennys kasvaimen koon etenemistä havaittiin ensimmäisen OVCAR-3-ksenografti kokeessa. Näin ollen, RM-133 ei ole kohdistettu riittävän sisällä kasvaimen täysin estää sen kasvua.

RM-133 (60 mg /kg) 0,1 ml: aan propyleeniglykolia: EtOH: ssa (92: 8) injektoitiin s.c. osaksi

nu /nu

nude-hiirissä. Ryhmä A: hiiret olivat aikaisemmin saaneet päivässä 21 päivän RM-133 60 mg /kg; B-ryhmän: hiiret eivät aiemmin altistuneet lääkeaineen.

RM-133 plasmassa osoittaa logaritminen riippuvuus määrästä ruiskutetaan

Aiemmissa kokeissa RM-133 on osoittanut maksimaalinen antituumorivaikutuksen 57% vastaan ​​HL60 ksenografteissa [32], joka on verrattavissa 60% estäminen mitatusta tässä raportissa kohti OVCAR-3 ksenografteissa. Lopussa on OVCAR-3-ksenografti kokeessa RM-133 pitoisuus plasmassa mitattiin 12 tunnin kuluttua yhden bolusinjektiona 60 mg /kg (0,1 ml) ryhmien A ja B (kuvio 4) oli 178 ja 91 ng /ml vastaavasti. Tämä tulos sai meidät tutkimaan annoksen plasmassa suhde yksittäisen s.c. injektio RM-133 käyttämällä erilaisia ​​yhdisteen annokset. Kuten kuvassa 5, plasman (167 ng /ml) saavutetaan, kun injektio 30 mg /kg on vain 17% injektoidusta määrästä, ja tämä prosenttiosuus laski edelleen suuremmilla annoksilla RM-133. Siten suuntaus annoksen tason suhteen viittaa siihen, että lisäämällä RM-133-annos johtaa tasanteelle, mikä todennäköisesti johtuu matalien plasman liukoisuutta tai huono hyötyosuus RM-133 ajoneuvoa käytetään (propyleeniglykoli: EtOH ( 92: 8)). Kuitenkin annos 480 mg /kg 0,2 ml ajoneuvoa ei suvaitse hiiriä (kuvio 5), joka ilmenee liike epämukavuutta. Näiden havaintojen pelkästään vehikkeliä (0,2 ml propyleeniglykolia: EtOH: ssa (92: 8)) annettiin hiirille. Kuten epäillään, reaktiot olivat samat eläimet, mikä osoittaa, että itse ajoneuvoon (propyleeniglykoli: EtOH: ssa (92: 8), 0,2 ml), oli syypää. Suurin volyymi siedetty oli seuraava määrätietoisesti kuin 0,1 ml. Nämä havainnot saivat meidät tutkimaan vaihtoehtoisia ajoneuvoja, jotka mahdollistavat korkeammat, RM-133 plasmassa minimaalisella haittavaikutuksia.

RM-133 mitattiin LC-MS /MS 12 h kuluttua kerta s.c. injektio Balb /c-hiirissä, käyttäen propyleeniglykolia: EtOH: ssa (92: 8), kuten ajoneuvoon. Tilavuus injektio 0,1 ml, paitsi suurimman annoksen käytetään (480 mg /kg), jossa 0,2 ml käytettiin. Volyymi 0,2 ml, ja ilman RM-133, tuottanut joitakin liike epämukavuutta.

Ajoneuvo optimointi: seulonta vaihtoehtoisia ajoneuvojen optimaalisen RM-133 annon

Ei-vesipitoisissa liuottimissa kuten dimetyylisulfoksidi ja polyetyleeniglykoli, pesuaineet (esim Tween, kasviöljyt, jne.) ja liuotusaineita (esim β-syklodekstriiniä, metyyliselluloosa) tarjoamaan strategista mahdollisuuksia parantaa yhdisteen liukoisuus Lääkekehitysprosessi [30, 39]. Tästä syystä 11 eri ajoneuvoja, joita käytettiin aiemmin steroideihin johdannaisia ​​tutkittiin. Ensinnäkin, joka perustuu liukoisuutta RM-133 kunkin ajoneuvon (taulukko A S1 File), kahdeksan ajoneuvoa valittiin toisen kierroksen tutkimuksen. Jälkimmäisessä kokeissa hiiret saivat yhden s.c. injektio jokaisen huumeeton ajoneuvon suvaitsevaisuuden ja käyttäytymisen arviointi (taulukko B S1 File). Perustuen havaintoihin eri injektion kertaa (0,25-96 h), me poistaa ajoneuvon # 3 (risiiniöljy-pohjainen). Itse asiassa annon jälkeen ajoneuvon # 3 yksin, hiiret näytetään monet epämukavuutta oireita (kutina, hyppy, ja pienikokoisuus), ja seuraavat neljä päivää, hiiret esitteli haavoja keskimäärin ~ 24 mm

2 klo injektiokohdassa.

kolmasosa kokeessa seitsemän parhaan siedetty ajoneuvot, jotka sisältävät RM-133 injektoitiin sc hiirillä (120 mg /kg) ja verinäytteet kerättiin sen jälkeen kun 3 ja 12 h RM-133 plasmassa mittaus (taulukko 1). Korkeimmat RM-133 plasmassa saavutetaan 3 tunnin saatiin ajoneuvon # 6, jonka jälkeen (tässä järjestyksessä) ajoneuvojen # 5, # 2, # 1, # 7, # 4 ja # 8. Kuten odotettua, RM-133 pitoisuus plasmassa oli vähentynyt 12 h kuluttua, mutta ajoneuvon # 6 edelleen tuotti korkeimman jälkeen, kun tämä väli. Sen sijaan ajoneuvon # 8 tuottivat alhaisin plasman molemmissa aikavälein. Tulosten perusteella on saatu kolmesta Edellä kuvattujen (taulukot A ja B S1 File, taulukko 1), päättelimme, että (i) RM-133 oli niukkaliukoinen ajoneuvoon # 5 (pieni kokkareita), (ii) että ajoneuvot # 1 ja # 7 johtanut ihovaurioita ja ajoneuvon # 8 tuottivat alin plasman analysoidun asetettu. Toisaalta, ajoneuvon # 6 johtivat suurimpaan plasman asetettu, kun taas ajoneuvojen # 2 ja # 4 ei osoittanut mitään haitallista vaikutusta hiiriin. Meillä on siis valittujen ajoneuvojen # 2, # 4 ja # 6 suorittaa ylimääräinen sietokykytutkimus.

vaikutus toistuvasti ihon alle injektiot RM-133 3 valittujen ajoneuvojen (koositoleranssitesti) B

RM-133 annettiin hiirille joka toinen päivä käyttäen ajoneuvot # 2, # 4 ja # 6. Eläimiä käsiteltiin viikon ajoneuvoja # 2 ja # 4, mutta vain kerran ajoneuvon # 6. Hiiret käyttäytymistä seurattiin kokeen aikana, ja makroskooppisen havainnointi elinten suoritettiin ruumiinavauksessa (taulukko C S1 File). Kymmenen tunnin kuluttua s.c. injektio ensimmäisen annoksen RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml) vesipitoisessa 25% β-syklodekstriiniä: EtOH: ssa (92: 8) (ajoneuvon # 6), hiiren liikkuvuus oli huomattavasti vähentynyt. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, heidän yleinen kunto oli huonontunut entisestään, joita nähdään yksinäisyydestä, nestehukka, mikroftalmia, bristling, kiihtyi hengitys ja vatsan turvotus. Näiden havaintojen perusteella, me äkillisesti lopetetaan koe ajoneuvon # 6, 24 h injektion jälkeen. Ruumiinavauksessa kaikki hiiret, jotka ryhmä osoitti aivoverenvuotoon keuhkot, täynnä vatsat yhdessä tyhjiä suolistossa, ja 75% näytteille hieman suuremmassa munuaisiin. Kun korreloi hiirellä kuolemien aikaisemmin mainittiin annettaessa ajoneuvon # 6 yksin, nämä havainnot selvästi, että syklodekstriini-pohjainen ajoneuvo ei suvaitse hiiriä, ja ajoneuvon # 6 joten hänet hylättiin meidän seulonta tutkimuksista.

Mielenkiintoista ja noudattaen havaintoja koe suoritettiin ajoneuvoja vain, ei ole haitallisia vaikutuksia todettiin, kun hiiriä hoidettiin RM-133 ajoneuvoilla # 2 ja # 4. Koska öljyinen ajoneuvon # 4 (auringonkukkaöljyä: EtOH (92: 8) syntyy rakkuloita pistoskohdan, rajoitimme hoito kertainjektiona RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml /joka toinen päivä) varten -ksenografti kokeita. kuitenkin vesipitoinen vehikkeli # 2 (vesipitoista 0,4% metyyliselluloosaa: EtOH: ssa (92: 8)) saa suorittaa useita injektioita (240 mg /kg /0,2 ml, BID /joka toinen päivä) ilman haitallisia vaikutuksia hiirillä. ruumiinavauksessa , elimet eivät osoittaneet mitään havaittavaa poikkeavuutta. Siten sekä ajoneuvojen # 2 ja # 4 otettiin mukaan vertailun vuoksi, että

in vivo

tutkimuksia RM-133 antituumorivaikutus.

antituumoriaktiivisuus RM -133 on OVCAR-3 ksenografteissa käytetään kahta eri ajoneuvoa

kun auringonkukka-pohjainen ajoneuvo (kuvio 6A), RM-133 alkoi estää kasvaimen kasvua 20 päivän kuluttua, mutta vaikutus alkoi olla merkittävää vasta 28. päivänä . loppuun mennessä hoidon (40 päivää), RM-133 oli täysin estetty (eli 100%) OVCAR-3 kasvaimen kasvua. kuitenkin öljyinen luonne ajoneuvon # 4 syntyy iso rakkuloita, mikä vaikeuttaa myös kasvain mittauksia. Kun RM-133 hoito lopetettiin vuorokautena 40, koska ajoneuvon aiheuttama vaikutus, tuumorin kasvu jatkui ja mitään merkittävää eroa pidetään voimassa kahden ryhmän välillä seitsemän päivää sen jälkeen hoidon päättymisestä (kuvio 6A). Jälkimmäinen Tulokset osoittavat, että aminosteroid RM-133 on vastuussa kasvaimen kasvun inhibitioon. Ei merkittävää eroa painon välillä havaittiin käsittelemätön (kontrolli) ja käsiteltiin (RM-133) ryhmässä (kuvio 6B). Lisäksi myrkyllisyyttä ei oire joko havaittiin tutkimuksen aikana tai ruumiinavauksessa.

OVCAR-3-solut (5 x 10

6 solua sekoitetaan 30% matrigeeliä) inokuloitiin s.c. molempiin kylkiin hiirillä. Kasvain hiiriin ruiskutettiin s.c. RM-133 (240 mg /kg) tai pelkkää vehikkeliä (0,2 ml auringonkukkaöljyä: EtOH: ssa (92: 8)) joka toinen päivä. Kasvaimen koko (A) ja hiirten kehon painon (B) on tallennettu. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM **: RM-133-hoidetussa ryhmässä on merkittävästi erilainen ohjaus (P 0,01). *: RM-133-hoidetussa ryhmässä on merkittävästi erilainen ohjaus (P 0,05).

Kun metyyliselluloosapohjaisia ​​ajoneuvo, kasvaimen kasvu tuli merkitsevästi erilainen käsiteltyjen ja kontrolliryhmien jo päivänä 15 (kuvio 7A), ja tämä ero säilyi loppuun asti koejakson (päivä 35). Itse asiassa, RM-133 käsittelyä tehokkaasti kumottu nopea kasvu OVCAR-3 kasvaimia, jonka pinta-ala pienensi aminosteroid. 28 päivän jälkeen, RM-133 oli täysin estetty (100%) kasvaimen kasvua, ja oli edelleen laskenut kasvaimen koon 78% sen alkuperäisestä arvosta hoidon päättyessä (35 päivää). Hoidon jälkeen keskeytyksen, RM-133 on edelleen säilyttänyt täydellinen saarto syövän etenemisen kunnes vähintään 12 päivän kuluttua hoidon päättymisestä (kuvio 7A). Mielenkiintoista, ei epänormaalia käyttäytymistä eikä kuolemaa kirjattiin yli 35 päivän hoitojakson ajan, RM-133. Lisäksi ajoneuvo # 2 ei vaikuttanut painon mukaan (kuvio 7B) tai johda ilmeistä myrkyllisyyttä oire koko kokeellinen ajan sekä ruumiinavauksessa.

OVCAR-3-solut (5 x 10

6 solut sekoitetaan 30% matrigeeliä) istutettiin sc molempiin kylkiin hiirillä. Tuumoreita hiiriin ruiskutettiin s.c.