Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) katsotaan olevan vastuussa synkkä ennuste syöpäpotilaita. Kuitenkin tiedetään vähän molekyylitason mekanismit hankinta ja ylläpito CSC kiinteistöjen syöpäsoluissa, koska niiden harvinaisuus kliinisissä näytteissä. Olemme tässä aiheuttama CSC ominaisuuksia syöpäsoluissa avulla määriteltyjä tekijöitä. Me retroviraalisesti käyttöön joukko määritellään tekijöiden (

Oct3 /4

,

Sox2

ja

Klf4

) ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, mitä seuraa kulttuurin perinteisiin seerumia sisältävässä väliaineessa , ei ihmisalkioiden kantasolujen välineellä. Sitten arvioitiin CSC ominaisuudet soluissa. Paksusuolen syövän soluja transdusoitiin kolme tekijää, osoittivat merkittävästi parannettu CSC ominaisuuksien kannalta markkerigeenin ekspressiota, pallo muodostumista, chemoresistance ja kasvainten muodostumiseen. Olemme nimenneet solut CSC ominaisuudet aiheuttama tekijät, osajoukko transdusoidut solut, kuten indusoitu CSCS (iCSCs). Lisäksi olemme perustaneet uutta teknologiaa eristää ja kerätä iCSCs perustuu eroihin aste väriaine-effluxing aktiivisuutta lisälaite. Ksenografteissa johdettu meidän iCSCs olleet teratomas. Erityisesti, toisin kuin kasvaimia vanhempien syöpäsolujen ICSC perustuvien kasvainten jäljitellä todellisen ihmisen paksusuolen syövän kudoksissa mitä tulee niiden immunohistologisilla havainnot, jotka osoittivat, paksusuolen linjaa erilaistumista. Lisäksi olemme vahvistaneet, että fenotyypit meidän iCSCs olivat toistettavissa sarjasiirteillä kokeita. Tuomalla määritelty tekijöitä, tuottamaamme iCSCs kanssa sukua spesifisyys suoraan syöpäsolujen, ei

kautta

indusoidun pluripotenttien kantasolujen tilassa. Uuden menetelmän avulla voimme saada runsaasti aineksia CSCS että ei ainoastaan ​​ovat parantaneet tuumorigeenisyyteen, mutta myös kyky erilaistua kerrata tietyntyyppistä syöpä kudoksiin. Meidän menetelmä voi olla suurta hyötyä täysin ymmärtää CSCS ja kehittää uusia hoitoja kohdistamista CSCS.

Citation: Oshima N, Yamada Y, Nagayama S, Kawada K, Hasegawa S, Okabe H, et al. (2014) induktio Cancer Stem Cell asuntoja koolonkarsinoomasoluissa tietyillä kertoimilla. PLoS ONE 9 (7): e101735. doi: 10,1371 /journal.pone.0101735

Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 helmikuu 2014; Hyväksytty: 10 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 09 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Oshima et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli mahdollista ansiosta Balzan palkinnon Shinya Yamanaka (https://www.balzan.org/en/about-us/balzan-prize-milan), ja tukee Research Assistance Tulorahoitus Shinryokukai General Incorporated Association (https: //www.shinryokukai.com/) (TA), joka on voittoa alumniyhdistykselle Kobe yliopiston lääketieteellisessä ja Grants-in-Aid tutkimusviranomaisen Japanista Society for Promotion of Science (JSPS; http: //www.jsps.go.jp/english/index.html): 10J06242 (NO), ja NO oli JSPS Tutkimushenkilöstön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen, ja tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Kilpailevat edut: eI ja TA ovat jäseniä ilman palkkaa Shinryoku-Kai General Incorporated Association, joka on ei voittoa alumniyhdistykselle Koben yliopiston lääketieteellisessä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Syöpä kantasolut (CSCS) on ehdotettu olevan vastuussa huonon ennusteen potilaita, joilla on erilaiset syövät koska niiden ominaisuuksia ja käyttäytymistä, kuten korkeampia terapeuttisia vastus ja toistumisen [1] – [3]. Näin ollen, CSCS pidetään mahdollisena terapeuttisena kohteena. Perustaa uusia hoitoja kohdistaminen CSCS, on tärkeää valaista molekyylitason mekanismit hankinta stemness in CSCS. Nämä ovat kuitenkin vielä epäselviä, koska CSCS ovat harvinaisia ​​solupopulaatio syöpäkudoksen, ja harvinaisuus CSCS vaikeuttaa tunnistaa ja kerätä ne.

Näin luodaan CSCS

in vitro

syöpäsolujen ja tutkimalla niiden ominaisuuksia pidetään käyttökelpoinen menetelmä poistamaan tämän ongelman. Useat tutkimukset [4] – [6] kertoi, että solut joidenkin CSC ominaisuudet, kuten parannettu kasvainten muodostumiseen oli indusoituva. Mutta ne eivät viittaa onko soluilla on erilaistumista kyky kerrata tietyntyyppisiin syöpä kudoksiin. Näin ollen on edelleen epäselvää, on mahdollista tuottaa CSCS, että juuri vastaavat ensisijaista syövän kantasoluja.

osalta hankinta stemness, että indusoitujen pluripotenttien kantasolujen (iPSCs), todettiin että ektooppinen ekspressio vain kolme tai neljä transkriptiotekijöiden (

Oct3 /4

,

Sox2

ja

Klf4

kanssa tai ilman

C-MYC

) voi aiheuttaa kantasolujen ominaisuuksia somaattisten solujen kun ESC viljelyolosuhteet käytetään [7], [8]. Nämä geenit voivat myös suoraan indusoida hermo kantasolujen (NSC) ominaisuudet somaattisten solujen avulla neuro-alalla viljelyolosuhteet [9]. Näin ollen, nämä geenit on kyky indusoida eri stemness somaattisissa soluissa, riippuen viljelyolosuhteissa. Siksi me arveltu, että nämä geenit voivat myös aiheuttaa CSC ominaisuuksia syöpäsoluissa.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme transdusoitu

Oct3 /4

,

Sox2

ja

Klf4

ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa alla vanhempien soluviljelyolosuhteissa ja analysoi transdusoidut solut ja niihin liittyvät CSC ominaisuudet

in vitro

ja

in vivo

. Näin ollen asetettu kolmen geenit voivat aiheuttaa CSC ominaisuuksia osajoukko koolonkarsinoomasoluissa, ja pystyimme keräämään solut aiheuttama CSC ominaisuudet perustuvat niiden eron väriaine-effluksiaktiivisuus. Kerätty solut osoittivat koolonin linjaa spesifisyys

in vitro

ja

in vivo

. Indusoituneen CSCS tuotetaan tällä menetelmällä voi auttaa selvittämään molekyylitason mekanismit hankinta ja ylläpito CSC kiinteistöjen syöpäsoluissa ja kehittää CSC-kohdistaminen terapia.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Cell Culture

Ihmisen peräsuolen syövän solulinjat (SW480 ja DLD-1) on syötetty Cell Resource Center for Biomedical Research, Tohoku University. Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Nacalai Tesque, Kioto, Japani), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Life Technologies, Carlsbad CA, USA) ja penisilliiniä (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml) (Life Technologies), ja niitä käytetään varhain kanavan kokeissa.

RNA: n eristys ja määrällisiä käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä polymeraasiketjureaktiolla

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Plus Mini Kit ( QIAGEN, Hilden, Saksa), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 1pg näyte kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttämällä Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche, Basel, Sveitsi), mukaisesti valmistajan protokollia. Quantitative käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä polymeraasiketjureaktiolla (qRT-PCR) suoritettiin FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche) ja analysoitiin Step-One reaaliaikainen PCR-järjestelmän (Life Technologies). Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1.

virtaussytometria

yksisolususpensio viljellyistä soluista immunovärjättiin hiiren anti-ihmis-CD133-vasta-aineen (klooni: AC133, Miltenyi Biotec, Auburn CA , USA), hiiren anti-humaani-CD44-vasta-ainetta (klooni: G44-26, Becton, Dickinson and Company [BD], Franklin Lakes NJ, USA) tai hiiren anti-humaani-ABCG2-vasta-ainetta (klooni: 5D3, BioLegend, San Diego CA, USA). Pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen PBS: llä, joka sisälsi 2% FBS: ää, ja kuolleet solut leimattiin 2 ug /ml propidiumjodidia (PI, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA). Yksisolukerrosviljelmänä paraformaldehydistä-kiinnitettyjä soluja läpäiseviksi 0,2% Triton-X (Sigma), ja immunovärjättiin hiiren anti-ihmisen CD26-vasta-ainetta (klooni: M-A261, BD) ja kanin anti-humaani-LGR5 (klooni: EPR3065Y , Abcam, Cambridge MA, USA). Kaikissa virtaussytometrialla (FCM) kokeissa, isotyypin vasta-aineita, jotka vastaavat kutakin vasta-ainetta, käytettiin kontrolleina. Näytteet analysoitiin FACS Aria II instrumentti (BD).

Western blotting

Solut hajotettiin M-PER Nisäkkäiden Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific, Rockford IL, USA ). Solulysaatit altistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE). Sen jälkeen elektroforeettisen siirtämisen proteiinien immunoblottaus hiiren anti-ihmisen ALDH-vasta-aine (klooni 44 /ALDH, BD), jota seurasi piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, suoritettiin. Sen määrittämiseksi kemiluminesenssi, LAS 4000-järjestelmän (Fuji elokuva, Tokio, Japani) käytettiin.

Cell Cycle Analysis

solut kiinnitettiin 70% etanolilla PBS: ssä 4 ° C yön yli. Soluja käsiteltiin ribonukleaasi sulattaa RNA: ta ja värjättiin 50 ug /ml PI. Solut analysoitiin virtaussytometrialla (FACS Aria II).

5-FU-chemoresistance analyysi

solujen elinkykyä jälkeen 5-fluorourasiili (5-FU, Kyowa KIRIN, Tokio, Japani) altistus mitattiin WST-8 kolorimetristä määritystä (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Kumamoto, Japani). Yhteensä 5 x 10

3-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille päivänä 10, ja väliaine korvattiin DMEM: llä, joka sisältää 1 tai 50 ug /ml 5-FU: 24 h ymppäyksen jälkeen. Kun oli inkuboitu 48 tunnin ajan, absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin käyttäen mikrotiitterilevyn lukijaa. Solun elinkelpoisuus laskettiin suhteena absorbanssiarvot samasta näytteestä inkuboitiin DMEM ilman 5-FU 48 tuntia.

Sphere muodostumisen määritys

Solut siirrettiin Ultra Low kiinnityslevyt (Corning Incorporated, Corning, New York, USA) seerumittomassa DMEM, joka sisälsi 10 ng /ml bFGF: ää (Wako, Osaka, Japani), 10 ug /ml ihmisen insuliinia (SHOK, Miyagi, Japani), 100 ug /ml ihmisen transferriiniä (Roche) ja 100 ug /ml BSA: ta (Nacalai Tesque), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa 10 päivää.

Dye effluksiaktiivisuus Analyysi

väriaine effluksiaktiivisuus analyysi suoritettiin aikaisemmin kuvatulla menetelmillä [10] – [12], jossa joitakin muutoksia. Solut kerättiin DMEM, joka sisälsi 2% FBS: ää ja 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Soluja inkuboitiin DMEM, joka sisälsi 2% FBS: ää ja 1 mM HEPES kanssa Hoechst33342 (Life Technologies) 5 ug /ml kanssa tai ilman samanaikainen antaminen verapamiili (Sigma-Aldrich) 50 tai 250 uM 90 minuuttia 37 ° C, ja hellävaraisesti ylösalaisin 30 minuutin välein. Inkuboinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 2% FBS: ää ja 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Solut vastavärjättiin 2 ug /ml PI merkitä kuolleita soluja, ja vietiin läpi 35 um verkkosuodatin, niiden säilyttäminen jäissä virtaussytometriaa ja lajittelu. Solut analysoidaan ja lajitellaan FACS Aria II. Hoechst-väriaine viritettiin UV- laserilla (355 nm), ja fluoresenssi mitattiin sekä 670/50 suodattimen (Hoechst Red) ja 450/50 suodatin (Hoechst Blue).

In Vivo tuumorigeenisyyden tutkimus

yhteensä 1 x 10

6, 3 x 10

5 tai 1 x 10

5 solua 100 ul: ssa seerumitonta PBS injektoitiin subkutaanisti molemmat selkä kylkiin immuunipuutteiselle nude mouse (KSN /Slc hiiri, SLC, Shizuoka, Japani). Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla 0,5 × P × L

2 (L: pituus, W: leveys). Kokeet tarkistanut ja hyväksynyt Animal Ethics ja tutkimuskomitea, Kyoto University (Luvan numero: 11537, 12237, 13217), ja suoritettiin vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti. Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

sarjasiirteillä

sarjasiirteillä kokeita, lajitellut solut viljeltiin yhdeksän-16 päivää (ensimmäinen kulttuuri) lajittelun jälkeen, niin yhteensä 3 x 10

6 solua ihon alle ruiskutettiin immuunivajaisiin nude-hiiriin. Kasvaimet (ensimmäinen kasvaimet) irrotettiin, kun ne saavuttivat halkaisija on yli 10 mm, ja ne patologisesti analysoitiin. Leikattu kasvaimet myös entsymaattisesti hajotettiin yksisoluiset suspensiot jonka gentleMACS Dissociator ja Human Tumor dissosiaatio Kit (Miltenyi Biotec), mukaan valmistajan protokollia. Dissosioidut solut injektoidaan subkutaani- nude-hiiriin oltuaan viljeltiin kuusi-kymmenenpäivää (toinen kulttuuri), ja analysoitiin FCM perustuu niiden väriaine effluksiaktiivisuus päivinä kuudesta kahteentoista jälkeen dissosiaatiota. Menettely toistettiin kolme kertaa, kunnes neljäs viljellyt solut dissosiaatiota Kolmas kasvainten saatiin.

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut leikkeet peräisin ksenografteista värjättiin anti-ihmisen sytokeratiini 20 (CK20) hiiren monoklonaalinen vasta-aine (klooni: Ks20.8, laimennus 1:25, Dako, Glostrup, Tanska), anti-ihmis-sytokeratiini 7 (CK7) kanin monoklonaalista vasta-ainetta (klooni: SP52, pitoisuus; 0,536 ug /ml, Roche) tai anti-ihmis-caudal tyypin homeobox 2 (CDX2) hiiren monoklonaalinen vasta-aine (klooni: AMT28, laimennus 1:500, Leica Biosystems, Wetzlar, Saksa) avidiini-biotiini-immunoperoksidaasimenetelmällä. Mikroaaltouuni antigeeni haku suoritettiin. Immunosytokemiaa, viljellyt solut, jotka oli kiinnitetty 4% paraformaldehydillä, värjättiin anti-CK20-vasta-ainetta (klooni: Ks20.8, laimennus 1:100) tai anti-CDX2-vasta-aine (klooni: CDX2-88, esilaimennettu, Abcam) ja vastavärjättiin Hoechst33342 (Life Technologies) tunnistaa kaikki ytimet.

tulokset

transduktio

Oct3 /4

,

Sox2

ja

Klf4

osaksi koolonisyöpäsolulinja

transdusoitu

Oct3 /4, Sox2, Klf4

, tai seos, jossa on kolme (jäljempänä, OSK) osaksi SW480 ihmisen paksusuolen syöpäsolu siima retrovirusvektorit [7] (ks Methods S1), ja myös Mock vektorin (tyhjä vektori) käytettiin verrokkina. Nämä solut kutsutaan O-SW480, S-SW480, K-SW480, OSK-SW480 ja M-SW480, vastaavasti. Emosoluilta myös kutsutaan Wt-SW480. Tässä tutkimuksessa soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää ja arvioitiin päivänä 10 transduktion jälkeen (kuvio. S1A). Olemme vahvistaneet retrovi- transduktion ja mRNA: n ilmentymisen transdusoitujen geenien (kuvio. S1B ja S1C). M-SW480-soluissa,

Klf4

oli endogeenisesti ilmaisivat, kun taas

Oct3 /4

ja

Sox2

ei havaittu. Erotettavissa morfologisia muutoksia havaittiin kullekin viivalle, joka syyksi niiden transdusoiduilla geeni (t) (Fig. S1D).

Expression of aiemmin raportoitu merkkiaineita liittyvät paksusuolen CSCS ja suoliston kantasolujen transdusoiduissa-SW480 solut

arvioimiseksi kantasolujen tilan transdusoidut solut, arvioimme ekspressiotasot aiemmin raportoituja mahdollisia markkerigeeni, vaikkakin kiistaa [13], [14], paksusuolen CSCS ja suoliston kantasoluja, kuten kuten

CD133

[15], [16],

CD44

[17], [18],

CD26

[19],

ALDH1

[ ,,,0],20],

ABCG2

[21] ja

LGR5

[22], jonka qRT-PCR: llä (Fig. 1A). Niistä solulinjat, vain OSK-SW480-soluissa oli merkittävästi lisääntynyt mRNA-ekspressiotasot kaikkien geenien verrattuna M-SW480-soluja (n = 3).

(A) qRT-PCR aiemmin raportoitu markkereita liittyviä paksusuolen CSCS ja suoliston kantasolujen transdusoidut SW480-soluissa. Kaikki merkinnät ilmentyivät OSK-SW480-soluissa. MRNA: n ilmentymisen tasot normalisoitiin kuin

GAPDH

. Suhteellinen ekspressiotasoja verrattuna M-SW480 on esitetty. (B) proteiini ekspressiotasot CSC merkkiaineiden transdusoidut SW480-soluissa määritettynä virtaussytometrianalyysin (FCM) analyysi. Tiedot kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta osoittivat, että määrä CD133-, CD44-korkea, CD26- ja ABCG2-positiiviset solut olivat merkittävästi lisääntynyt OSK-SW480-soluissa. Edustaja piste tontit kunkin merkin on esitetty kuvassa S2. (C) proteiini ilmentymistä ALDH1 on transdusoidut SW480-soluja määritettiin Western blot -analyysillä. Paneeli esitetään edustavat data kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) soluproliferaatioon

in vitro

. Yhteensä 3 x 10

5-solut maljattiin kuuden kuopan levyille päivänä seitsemän ja laskettiin päivänä 11. määrä OSK-SW480-soluissa oli pienempi kuin M-SW480-soluja (n = 3). (E) Solut G1 /0 vaiheessa havaittiin FCM analyysi päivänä 11. prosenttiosuus soluja G1 /0 vaihe merkittävästi lisääntynyt O-, K- ja OSK-SW480-soluissa (n = 3) . (F) 5-FU-chemoresitance analyysi. Elinkelpoisuuden OSK-SW480-soluja, kun läsnä on 5-FU oli merkittävästi suurempi kuin M-SW480-solujen sekä 1 ja 50 ug /ml pitoisuuksia 5-FU: ta (n = 3). Elinkelpoisuus M-SW480-soluja kussakin pitoisuudessa oli asetettu 100%. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan: SD. * P 0,05, ** P 0,01, Dunnettin testi.

Seuraavaksi arvioitiin proteiinin ilmentymisen tasot markkereita (Fig. 1 B, 1 C ja S2). FCM-analyysi osoitti, että OSK-SW480-soluissa oli merkittävästi lisääntynyt proteiinin ekspressiotasot CD133, CD26 ja ABCG2. Useimmat transdusoidut solut ilmaistu CD44, mutta määrä soluja, jotka ilmentävät korkeampaa CD44 nostettiin noin kaksi-kertaisesti OSK-SW480-soluja verrattuna M-SW480-soluja (n = 3) (kuviot. 1B ja S2). OSK-SW480-solut osoittivat taipumusta on lisääntynyt ekspressiotaso LGR5, mutta tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuviot. 1B ja S2) (n = 3). Western blot-analyysi osoitti, että ilmentymistaso ALDH1 lisättiin vain OSK-SW480-soluja (Fig. 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, OSK on kyky herättää CSC allekirjoitusten osajoukko SW480-solujen.

leviämisen ja solukierron transdusoiduissa SW480-soluissa

seuraava arvioitiin solujen kasvua

vuonna vitro

. Määrä OSK-SW480-solujen 96 tunnin kuluttua kylvö 3 x 10

5-soluissa oli merkittävästi pienempi kuin M-SW480-soluja (p 0,01, n = 3) (Fig. 1 D). Pidempi havainto osoitti myös johdonmukaisia ​​tuloksia (Kuva. S3). Sen tutkimiseksi, mikäli transdusoituun geenit vaikuttavat solusyklin, teimme solusyklin analyysi FCM DNA värjäys käyttäen propidiumjodidi (Fig. 1 E). Prosenttiosuus soluja G1 /0 faasi oli noin 10% korkeampi O-, K- ja OSK-SW480 viljelmiä kuin M-SW480-soluja (n = 3).

Herkkyys kemoterapia-aineiden

tutkimiseksi syöpälääke herkkyys soluja, vertasimme eloonjäämisluvut solujen käsittelyn jälkeen 1 tai 50 ug /ml 5-FU 48 tunnin ajan, jonka WST-8 kolorimetristä määritystä (Fig. 1F). Vuonna OSK-SW480-soluja, eloonjäämisprosentti oli noin 20% suurempi kuin M-SW480-soluja sekä pitoisuuksia 5-FU: ta (n = 3). Tämä tulos viittasi siihen, että OSK-SW480-solut sisälsivät solut hankittiin chemoresistance 5-FU.

Sphere muodostumista määrityksessä

Aiemmin on raportoitu, että CSCS oli suurempi kyky muodostaa sferoideja alle kulttuurin alhainen kiinnitys astiat ja seerumivapaassa väliaineessa [2], [16]. Tutkia palloja muodostavan kyky meidän transdusoidut solut, teimme alalla muodostumisen määritys (Fig. 2A). M-SW480-soluja, tuskin havaittiin mitään pallosia. Sen sijaan, että O-, K- ja OSK-SW480 kulttuureissa, havaitsimme ilmeisen suurempi määrä pallojen (keskiarvo: 47, 23 ja 50, vastaavasti, n = 3), mikä osoittaa, että

Oct3 /4, Klf4

ja OSK osaltaan sferoidi muodostumista osajoukko SW480-soluja.

(A) Rakeiden muodostuminen määrityksessä. Yhteensä 1 x 10

4 solut maljattiin alhainen kiinnitys ruokia päivänä 10 ja viljelty seerumia 10 päivän ajan. Vuonna O-, K- ja OSK-SW480 kulttuureissa määrä pallosia lisääntyi merkitsevästi verrattuna M-SW480-soluissa. Virhepalkit osoittavat SD (n = 3). Mittaviivat: 100 pm. (B) toinen tuumorigeenisyyden solujen istuttamisen jälkeen ihonalaisen alueilla immuunivajaisiin nude-hiirissä. Yhteensä 1 x 10

6 solua (vasen paneeli) tai 3 x 10

5-soluissa (oikea paneeli) subkutaanisesti injektoituna molempiin kylkiin immuunivajaisiin nude-hiirten päivänä 10. kasvainten tilavuus on johdettu K- ja OSK-SW480-soluja olivat ilmeisesti suurempi kuin sen p-, M-, O- ja S-SW480-soluja molemmille määrä injektoida soluja. Punaiset palkit osoittavat mediaani tuumorin tilavuuden. ** P 0,01, NS: ei merkittävää, Dunnettin testi (paitsi †: U-testi).

tuumorigeenisyystesti

in vivo

Tutkia tuumorigeenisyyden transdusoitujen solujen, me ihonalaisesti 1 x 10

6 tai 3 x 10

5-soluja immuunivajaisiin nude-hiiriin selän alueen molemmin puolin, ja sitten mitataan ilmaantuvuutta ja kasvainten tilavuuden neljän viikon kuluttua varten 1 x 10

6 solua ja kahdeksan viikkoa 3 x 10

5 solujen siirron jälkeen, tässä järjestyksessä (Kuva. 2B). Yhteenveto kasvaimen esiintymistiheys on esitetty taulukossa 1. K- ja OSK-SW480-soluissa tuotettu kasvaimia 100%: n paikoista, kun taas muut linjat syntyy kasvaimia 75% ja 25% tapauksista solun määrä 1 × 10

6 ja 3 x 10

5-soluissa, vastaavasti. Havaitsimme huomattavasti suurempi määrä kasvaimia K- ja OSK-SW480 cell-ruiskutetaan hiiriin verrattuna injektoitu muilla radoilla, niin solussa määrinä, eli 1 x 10

6 ja 3 x 10

5 solua (Fig. 2B).

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että OSK riittävän indusoi kaikki aiemmin raportoitu CSC ominaisuudet tarkastelimme

in vitro

ja

in vivo

, kun taas yksikään geeni oli riittävä aiheuttamaan kaikki nämä ominaisuudet. Olemme nimenneet solut CSC ominaisuuksia OSK-SW480 kulttuurien aiheuttama CSCS (iCSCs).

effluksiaktiivisuus varten Hoechst33342

Aiemmissa raporteissa [2], [10], [12 ], [23], [24], FCM käyttäen Hoechst33342 merkintöjä verapamiilin (VM), joka on ATP-Binding kasetti (ABC) kuljettajan inhibiittori oli tehokas tapa parantaa erilaisia ​​kantasolujen kaltaisia ​​soluja, mukaan lukien syöpäsolut . Tässä määrityksessä katsottiin, että varsi kaltaisia ​​soluja (niin kutsuttu Side Väestö soluja) ei leimattiin Hoechst33342 ilman VM, mutta leimattiin Hoechst33342 antamisen kanssa VM.

varmistunut, että 5 ug /ml Hoechst33342-effluxing soluja, jotka katosivat samanaikainen antaminen 50 uM VM M-SW480 kulttuuri (Fig. 3A). Asetamme portti, jossa väestö oli mukana, ja kutsutaan solujen portissa ilman VM ”V0-solut” (Fig. 3A, vasen paneeli), jota seuraa analyysi muilla radoilla. Lukumäärä V0-solujen merkittävästi lisääntynyt O- ja OSK-SW480 viljelmät (3,9% ja 5,0%, tässä järjestyksessä) verrattuna M-SW480 kulttuuri (2,6%) (Fig. 3A, oikea paneeli). Erityisesti ainutlaatuinen solut, jotka oli merkitty tunnisteilla by Hoechst33342 vaikka läsnä oli 50 uM VM, oli ilmeinen OSK-SW480 kulttuureissa. Me kutsutaan näitä soluja ”V50-solut” (Fig. 3A, vasen paneeli). Hoidon 250 uM VM johti katoaminen solujen portin, joka osoittaa, että V50-solut olivat herkkiä 250 uM VM (Fig. 3B, vasen paneeli). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että saimme uuden kerättävissä solupopulaation: V50-solujen erittäin voimakas väriaine-effluksiaktiivisuus indusoidaan OSK-SW480 kulttuureissa.

(EN) OSK-SW480-solujen sisältyi solupopulaatio leimaamaton 5 ug /ml Hoechst33342 kanssa samanaikainen antaminen 50 uM verapamiilia (VM). Olemme nimenneet solut leimaamaton mukaan Hoechst33342 ilman VM ja 50 uM VM V0-soluissa ja V50-soluissa, vastaavasti. Vasemmassa paneelissa esitetään edustavat dot tontit leimattuja ja leimaamattomia soluja päivänä 10 transduktion jälkeen. Oikeassa paneelissa esitetään tulokset kolmen erillisen kokeen. V0 alapopulaation nostettiin O- ja OSK-SW480-soluissa. V50-solut ilmeisesti nähty OSK-SW480 kulttuureissa. Virhepalkit osoittavat SD (n = 3). * P 0,05, ** P 0,01, Dunnettin testi. (B) Dye effluksiaktiivisuus päivänä 10 (vasen paneeli) ja päivänä 28 (oikea paneeli) transduktion jälkeen. V50-solut hävisivät alle hoidon samanaikaisen annon 250 uM VM jopa OSK-SW480-soluissa. Osuutta OSK-V50-solujen väheni ajan.

Vahvistus toisen koolonisyöpäsolulinja

Vahvista nykyiset tulokset, tutkimme toinen koolonisyöpäsolulinja, DLD- 1, joissakin kokeissa, mukaan lukien arvioinnit solun kasvunopeus

in vitro

, tuumorigeenisuus

in vivo

ja Hoechst33342 effluxing ominaisuudet (Kuva. S4). Vuonna DLD-1-solut, kasvuvauhti on OSK-DLD-1-soluissa oli pienempi kuin p- (vanhempien) ja Mock-DLD-1-solut (p 0,01, n = 3) (Kuva. S4A) . Tuumorigeenisyyden 1 x 10

5 solua oli suurempi OSK-DLD-1-soluissa verrattuna p- ja Mock-DLD-1-soluissa (kuvio. S4b, taulukko S2). V50-soluja myös nähtävissä OSK-DLD-1, mutta ei Mock-DLD-1, viljelmät (Fig. S4C).

kerääminen iCSCs peräisin OSK-SW480

tutkia, onko CSC ominaisuudet aiheutettiin OSK-SW480 viljelmät johtuivat V50-soluissa, me lajitellaan ja analysoi V50-soluissa ja ei-V50-solujen läsnä ollessa 50 uM VM in OSK-SW480-soluissa, ja V0- solut ja ei-V0-solujen puuttuessa VM ja ei-V50-soluissa, kun läsnä on 50 uM VM M-SW480 kulttuureissa. Nämä solut kutsutaan OSK-V50, OSK-nonV50, M-V0, M-nonV0 ja M-nonV50, vastaavasti.

lajittelun jälkeen fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelija (FACS) päivänä 10, kaikki linjat olivat tämän jälkeen viljeltiin 10 päivää DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää. OSK-V50-solut osoittivat morfologia samanlainen kuin leimallisesti havaittiin OSK-SW480-solut päivänä 10 (Fig. 4A, Fig. S1D). Sen sijaan OSK-nonV50 solut osoittivat morfologia on samanlainen kuin M-V0, M-nonV0 ja M-nonV50 solut (Fig. 4A). Solu kasvuvauhti OSK-V50-soluissa oli merkittävästi pienempi kuin muiden linjojen (p 0,01, n = 3) (Fig. 4B), mikä laski suhteessa (-0,1%) V-50-solujen 28 päivää transduktion nykyisessä kulttuuri tilassa (kuvio. 3B, oikea paneeli).

V50-solujen OSK-SW480 (OSK-V50) solut lajiteltiin FACS. Non-V0-, V0- ja ei-V50-solujen M-SW480-soluja (M-nonV0, M-V0 ja M-nonV50, vastaavasti) ja ei-V50-solujen OSK-SW480-soluja (OSK-nonV50 ) on myös lajitellaan ja käytettiin kontrolleina. Nämä solut olivat kaikki myöhemmin viljeltiin. (EN) morfologiat solujen viljeltiin 10 päivää lajittelun jälkeen. Morfologia OSK-V50-soluissa oli samanlainen kuin leimallisesti havaittiin OSK-SW480-soluissa (kuvio. S1D, vuorattu ympyrä). Sen sijaan, morfologia OSK-nonV50 soluissa oli samanlainen kuin M-V0, M-nonV0 ja M-nonV50 soluja. Mittaviivat: 100 pm. (B) toinen soluproliferaatioon

in vitro

. Yhteensä 3 x 10

5 soluja viljellään 14-18 päivä lajittelun jälkeen ympättiin ja laskettiin 96 tuntia myöhemmin. Solujen lukumäärä oli merkitsevästi pienempi OSK-V50 soluissa kuin kaikissa muissa linjat. Virhepalkit osoittavat SD (n = 3). ** P 0,01, Scheff testi. (C) kasvainten muodostumiseen solujen immuunipuutteisilla hiirillä. Yhteensä 3 x 10

5 tai 1 x 10

5 solua ihon alle injektoitiin immuunivajaisiin nude-hiiriin päivänä 18 lajittelun jälkeen. Kasvaimen tilavuus ja esiintymistiheys mitattiin kahdeksan viikon kuluessa injektion. Vain OSK-V50-soluissa tuotettu selvää kasvainten sekä injektoidun solujen määrä, kun taas ei havaittu kasvaimia saatiin M-nonV0, M-V0, M-nonV50 ja OSK-nonV50 soluja. Ilmaantuvuus kasvain muodostumisen OSK-V50-soluissa oli 4/4 sekä pistetään solujen määrä. Punaiset palkit osoittavat mediaani kasvaimen tilavuus.

kasvainten muodostumiseen on OSK-V50 solujen immunodefisienttien hiirillä oli ilmeisesti suurempi suhteen koon ja kasvainten kuin muita solulinjoja, mukaan lukien OSK-nonV50 solut (Fig. 4C).

yhdessä nämä tiedot osoittavat, että OSK-V50-solut osoittivat CSC ominaisuuksia, vaan että OSK-nonV50 soluja ei, osoittaen, että CSC ominaisuudet indusoitu OSK-SW480-solujen johtuivat V50-solupopulaatio.

Colonic sukujuuret erilaistumista OSK-V50 soluissa

in vitro

OSK-V50-soluissa sekä M- V0 solut olivat positiivisia CDX2, master säätelijä suolen epiteelisolujen erilaistumisen [25], ja CK20, paksusuolen differentiaatiomarkkeri [26], immunovärjäyksellä (Kuva. 5A). Näin OSK-V50 soluissa säilyy paksusuolen linjaa fenotyyppi ja erilaistumista kyky

in vitro

(Kuva. 5A).

(A) Immunosytokemia varten CDX2 ja CK20 proteiinia. OSK-V50-solut olivat positiivisia CDX2 ja CK20, sekä M-V0 soluissa. Solut vastavärjättiin Hoechst33342. Mittaviivat: 100 pm. (B) fenotyyppiset monimuotoisuus morfologia ja liikkuvuus johdannaisten OSK-V50 soluissa. Valokuvat ovat time-lapse kuvia M-V0 ja OSK-V50 soluissa. Lajitellut solut myöhemmin viljeltiin viisi päivää ja sitten havaittiin kuuden tunnin välein 42 tunnin ajan. Time-lapse kuvantaminen paljasti, että oli suurempi monimuotoisuus sekä morfologian ja liikkuvuutta OSK-V50-soluissa (alempi paneeli) verrattuna M-V0 soluja (ylempi paneeli). Alkuperäinen suurennos, × 20. Elokuvat M-V0 ja OSK-V50-solut näkyvät Video S1 ja Video S2 vastaavasti.

fenotyyppiset monimuotoisuutta johdannaisia ​​OSK-V50

tuottaa heterogeenisyys syöpä kudoksiin on yksi merkittävä CSC ominaisuudet [1] – [3]. Tämän ominaisuuden tutkimiseksi meidän eristettyjä soluja, me analysoitavaa 23 päivää lajittelun jälkeen (Kuva. S5). OSK-V50-soluissa, toisin kuin kaikki muut solut, voisi tuottaa V50-solujen ja sekä monipuolisia eri osa solujen suhteen aste Hoechst-effluxing toiminto (Kuva. S5).

me seuraavaksi suoritetaan

in vitro

nopeutus kuvantaminen M-V0 ja OSK-V50-soluissa 42 tunnin (kuvio. 5B, Methods S1). M-V0 solut koostuivat pienistä pyöreän ja kara-muotoisia soluja, ja muodostivat pesäkkeitä, jotka sisältävät solujen selkeät reunat. OSK-V50-solut koostuivat soluista eri morfologit, kuten polygonal-, lyhyt-, cuboidal-, spindle- ja laakean soluja, jotka muuttivat morfologit ajan, ja muodostunut kiinteä asennetut pesäkkeitä, jotka sisältävät solujen epäselvä reunoilla . Lisäksi OSK-V50-soluissa oli korkeampi solun liikkuvuus kuin M-V0-soluissa (kuvio. 5B, videot S1 ja S2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että OSK-V50-solut voivat tuottaa suuremman monimuotoisuuden kannalta morfologia ja liikkuvuus verrattuna M-V0 soluissa.

Colonic sukujuuret erilaistumista OSK-V50 soluissa

in vivo

vieressä histologisesti arvioinut kasvaimia johdettu M-SW480 ja OSK-V50 soluissa immuunivajaissa hiirissä (Fig. 6).