Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on kliinisesti heterogeeninen sairaus, vaihdellen veltto oireeton taudin hyvin aggressiivinen metastaattisen ja hengenvaarallinen tautimuodot. Etäpesäkkeiden edustaa suurta tappava syy eturauhassyövän. Kriittisin kliininen haaste hallinnassa potilaiden on tunnistaa ne yksilöt riski sairastua etäpesäkkeitä. Ymmärtää molekyylimekanismeja eturauhassyövän etäpesäkkeiden ja tunnistaa merkkiaineita, joilla on metastaattinen potentiaali, olemme analysoineet proteiinin ilmentymistä kahdessa syngeenisissä eturauhasen syöpäsolujen linjat PC3-N2 ja PC3-ML2 käyttäen isobaaristen tunnisteita suhteellisen ja absoluuttisen kvantitointi merkinnät ja moniulotteinen proteiinin tunnistaminen teknologia nestekromatografia matriisi laserdesorptio ionisaatio tandemmassaspektrometrian. PC3-N2 on nöyrä metastaattinen taas PC3-ML2 erittäin metastaattinen. Kaikkiaan 1756 proteiinien tunnistettiin analyysien kanssa 130 proteiinien näyttää erilaisia ​​ekspressiotasoja (p 0,01) kahdessa solulinjassa. Näistä 68 proteiinit todettiin merkittävästi säädelty taas 62 ovat merkittävästi säädellä vähentävästi PC3-ML2 soluissa verrattuna PC3-N2 soluja. Ylössäätelyyn plectin ja vimentiinista jotka olivat merkittävästi ilmentyvät eri todensi Western blot ja niiden toiminnallinen tiedot vastaavat invaasion ja muuttoliikettä määritettiin siRNA geenien. Tietääksemme tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa, että säätely ylöspäin vimentiinista ja plectin ilmaisun positiivisesti korreloi invaasio ja etäpesäkkeiden androgeenista riippumattoman PCA.

Citation: Burch TC, Watson MT, Nyalwidhe JO ( 2013) Muuttuva Metastaattinen potentiaalit korreloivat Differential Plectin ja vimentiinista ilmentäminen Syngeeninen androgeeniriippumattomaksi syöpäsolujen. PLoS ONE 8 (5): e65005. doi: 10,1371 /journal.pone.0065005

Editor: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 syyskuu 2012; Hyväksytty: 24 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 22, 2013

Copyright: © 2013 Burch et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat käynnistyksen varoja Itä Virginia Medical School (EVMS) Dr. Julius O. Nyalwidhe. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Euroopassa ja Yhdysvalloissa, Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä miehillä ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvät-kuolemia. Vuonna 2011 oli arviolta 240890 uutta tapausta ja 33720 kuolemantapausta taudista Yhdysvalloissa [1]. Viimeisen 2 vuosikymmeniä, varhainen havaitseminen ja seulonta Eturauhassyövän on pääosin perustuu havaitsemiseen prostataspesifisen antigeenin (PSA) seerumin lisäksi eturauhasen (DRE), ja histologinen arviointi transrectal ultraäänellä (TRUS) opastettu biopsialaitteet [2]. Vaikka suurin osa tapauksista havaitaan varhaisessa vaiheessa, tauti on kliinisesti heterogeeninen, jotka vaihtelevat veltto oireeton taudin hyvin aggressiivinen metastaattisen ja hengenvaarallinen tautimuodot. Yli 7% havaituista tapauksista lopulta kehittää etäinen etäpesäkkeitä [3]. Ennuste näistä miehistä on huono ja niiden keskimääräinen eloonjääminen 24-48 kuukautta [3]. Kriittisin kliininen haaste PCA sairauksien hoidossa on määrittää, mitkä näistä kahdesta eri muotojen taudin potilaalle kehittyy. Yleisin PCA etäpesäke on luun; ~90%: Lla, edenneen PCa on luuston etäpesäkkeitä [4]. Bone metastasized PCA lähes parantumaton ja liittyy vakava sairastuvuus ennen kuolemaa, näihin kuuluvat luukipu, patologiset murtumat, hermopuristuksesta oireyhtymät, ja hyperkalsemia [4]. Tällä hetkellä saatavissa hoitovaihtoehtoja potilaille, joilla on etäpesäkkeitä ovat lievittävä. Ennuste /diagnoosi luun etäpesäkeleesioita parhaillaan määritetään kuvantaa isotooppia luu skannaus, tietokonetomografia (TT), magneettikuvaus (MRI) skannata, tai luun koepala. Tunnistaminen eturauhasen koepalan tai seerumin perustuu biomarkkereiden (t) ennustamiseksi alttiutta miesten kehittää etäpesäkkeitä on mahdollisesti paremmin erottamaan aggressiivisempi metastaattisen tautimuodoille ja siten tarjota parempaa hoitoa ja kliinisen hoidon mahdollisuuksia tauti.

vuosien hyödyllisyyttä PSA biomarkkerina eturauhasen syöpä on ollut kiistanalainen suhteessa sen kyvyttömyys erottaa veltto aggressiivisesta tautimuodoille [5], [6]. PSA liittyy myös korkea väärien positiivisten ja väärien negatiivisten testitulosten, koska tasot saattavat kohota kuin syöpä olosuhteissa eturauhasen, kuten eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) ja eturauhastulehdus [7] – [10]. Äskettäin Yhdysvaltain Preventive Services Task Force (USPSTF) suositteli vastaan ​​PSA-seulontaa PCA kaikissa ikäryhmissä, jonka mukaan hyöty on pienempi kuin haitoista seulonta ja hoito [11]. Tämä kyvyttömyys ennustaa aggressiivisuus eturauhassyövän perustuu ainoastaan ​​vakio viittaavia tekijöitä selvästi korostaa tarvetta tutkia kykyä kasvainta perustuvia biomarkkerit parantaa lopputulosta ennustavat koepala ja ymmärtää molekyylitasolla eturauhassyövän etäpesäkkeiden. Siksi uusia biomarkkerit tarvitaan kiireesti parantamaan diagnostista spesifisyyttä PSA ja ennustaa mahdollisia sairauden etenemisen.

paremmin ymmärtää molekyylitason mekanismeja eturauhassyövän etäpesäkkeiden, on tärkeää tunnistaa markkereita, jotka liittyvät etäpesäkkeitä. Proteomiikka on osoittautunut hyödylliseksi ja menestyksekäs lähestymistapa seulonnassa kasvainten ja metastaasien liittyvät proteiinimarkkereita [12]. On olemassa useita proteomiikka tekniikoita, joita on sovellettu seulonta ja tunnistaa mahdolliset syöpää markkereita. The ’isobaaristen Tägit Suhteellinen ja absoluuttinen kvantitointi ”(iTRAQ) alustan on edut ovat suhteellisen korkea suoritusteho ja se voidaan multipleksoida antamaan tietoa peptidin /proteiinin kvantitointi ja tunnistaminen, kuten raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa [13], [14] . Tässä lähestymistavassa useita näytteitä eri proteomeja vähenevät, alkyloidut proteolyyttisesti pilkottu tuottaa peptidejä. Peptidit on merkitty joukko iTRAQ reagenssien (joka 4 tai 8-Plex-muodossa), yhdistettiin ja fraktioitiin voimakasta kationinvaihtohartsia (SCX). Sitten fraktiot analysoidaan nestekromatografia tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS), ja tuloksena massaspektri antaa sekvenssi-informaatiota (alkaen peptidifragmenttien), ja suhteellinen kvantifiointi (alkaen toimittaja ryhmän ionit).

Kun pyritään tunnistamaan uusia proteiineja, jotka liittyvät metastasointiin ihmisen eturauhassyövän, olemme suorittaneet 4-plex iTRAQ analyysi käyttämällä kahta syngeneeisissä syöpäsolujen linjat PC3-N2 ja PC3-ML2, joka on eri metastaattinen potentiaali. PC3-N2 on nöyrä metastaattinen taas PC3-ML2 on erittäin metastaattinen. Sen jälkeen vertaileva kvantitatiivinen data-analyysi, joukko ehdokkaita havaittiin merkittävästi differentiaalisesti ilmaistut PC3-ML2 solujen verrattuna PC3-N2 soluja. Ehdokkaista kaksi todettu olevan merkittävästi säädellään ylöspäin PC3-ML2 ovat plectin ja vimentiinista. Nämä proteiinit tutkittiin tarkemmin Western blot ja siRNA knockdown. Ilmaisu tasot korreloivat immunohistokemia kuvia normaalista ja adenokarsinooma eturauhasen kudosnäytteitä. Differentiaalisesti säännelty proteiinit tunnistettu tutkimuksessa, mukaan lukien plectin ja vimentiinista, käsitellään osana niiden merkitystä eturauhassyövän etenemiseen.

koemenettelytavat

Materiaalit

Dulbeccon modifioitu Eagle media (DMEM), ja naudan sikiön seerumia (FBS), antibiootteja-antimykootteja, 4-12% NuPAGE® bis-Tris geeleillä ja 2 x Laemmli-puskuria, olivat Invitrogen (Carlsbad, CA). Complete ™ proteaasi-inhibiittorit ostettiin Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN), sekvenssointilaatua trypsiini oli Promega (Madison, WI), ja Immobilon-FL PDVF kalvo oli Milliporesta (Billerica, MA). BCA-proteiinin pitoisuus määrityksessä kit ja proteiini-free salpauspuskurilla olivat Thermo Scientific (Rockford, IL). Ensisijainen vasta-aineita vimentiinista (ab20346), plectin (ab83497) olivat Abcam (Boston, MA), ja plectin (sc-7572), GAPDH (sc-25778), Perk 1/2 (Thr 202 /Tyr 204) SC- 16982, ERK 1/2 (MK1) sc-135900, ja cdc2 P34 (sc 53) olivat Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Cdc2 (Cat # 9112) vasta-aine oli peräisin Cell Signaling Technology. IRDye konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita (vuohen anti-hiiri-IR680 Cat. # 926-3220, vuohen anti kani IR800CW Cat. # 926-32211, vuohen anti kani IR680 (Cat. # 926-32221), aasin anti-vuohi-IR680 (Cat. # 926-32224), vuohen anti mouse IR800CW (Cat. # 926-3220) olivat Li-COR Biosciences (Lincoln, PA) ja Alexa Fluor toissijainen vasta immunofluoresens- konfokaalimikroskopia oli Invitrogen (Carlsbad, CA). Ohjaus siRNA- A (sc-37007), vimentiinistä (h) (sc-29522) ja plectin siRNA (h) (sc-29453) olivat Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

Solulinjat ja Cell Culture

Lapsen PC3 alun perin saatu luuston etäpesäkkeiden potilaalla, jolla ensisijainen eturauhasen adenokarsinooma. kaksi PC3-N2 ja PC3-ML2 alalinjoja ystävällisesti lahjoitti meille Dr. Stearns ”ryhmä Drexel yliopistossa ja kehitettiin kuvanneet Wang ja Stearn [15]. solulinjat pohjalta kehitetty niiden invasiivisuus

in vitro

ja metastaattista potentiaalia

in vivo

. Molemmat solut tuumorigeenisia kun pistetään ihon alle SCID-hiirissä. Kuitenkin N2 solut eivät kyenneet kautta muuttaa Matrigel pinnoitettu kalvo

in vitro

ja aiheuttaa etäpesäkkeitä SCID-hiirissä, kun taas ML2 solut olivat erittäin invasiivisia

in vitro

ja aiheuttamaa luuston etäpesäkkeitä yli 80% tapauksista [15] – [17]. PC3-N2 ja PC3-ML2-soluja viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% antibiootteja 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Sitten solut irrotettiin muovipinta käyttäen 5 mM EDTA PBS: ssä. Ei-entsyymi dissosiaatiota puskurin säilyttää solun pinnan molekyylejä ja solujen elinkykyä.

Protein Extraction ruuansulatuksen ja ITRAQ Leimaus

kokosolulysaattia kokeita PC3-N2 ja PC3-ML2 soluja viljeltiin täydellisessä kasvualusta jopa 80% konfluenssiin. Solut irrotettiin käyttäen 5 mM EDTA: ta PBS: ssä ja pestiin PBS: llä ja pelletti suspendoitiin uudelleen 160 ul: liukenemista puskuria, joka sisälsi 100 mM NH

4HC0

3 ja TFE (01:01 v /v). Näytteet sonikoitiin 20 sekunnin ajan kolme kertaa ja inkuboidaan 60 ° C: ssa 1 h. Lysaatit sentrifugoitiin solujätteen poistamiseksi ja katkeamaton soluja ennen supernatantin kerääminen. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä ja normalisoitiin kunkin näytteen. 100 ug: n eriä näytteet kuivattiin SpeedVac ja altistettiin trypsiinillä pilkkomalla ja peptidin leimauksen iTRAQ reagenssien mukaan valmistajan ohjeiden (iTRAQ Reagenssit Multiplex Kit; ABSciex, Foster City, CA). Lyhyesti, 100 ug proteiinit olivat kuivattiin tyhjössä ja suspendoitiin uudelleen 20 ul: aan liukenemisen puskuria ja 1 ui denaturoivaa ainetta huoneenlämpötilassa. Näytteet pelkistettiin, alkyloitiin ja trypsinoitiin 5 ug muutettu sekvenssointilaatua trypsiiniä (Promega, Madison, WI, USA) 18 tuntia 37 ° C: ssa. Trypsiini pilkottu näytteet leimattiin neljän eri iTRAQ reagenssit liuotetaan 70 ul: aan etanolia huoneen lämpötilassa 1 tunti. Reaktiot pysäytettiin 10 mM glysiiniä. Näytteet olivat seuraavat: PC3-N2 solujen näytteitä 114 ja 115 tageja ja PC3-ML2 näytteitä 116 ja 117 tunnisteita. Tämä strategia antaa sisäisiä teknisiä rinnakkaisnäytteiden kahden näytteen. Kaikki neljä leimattu näytteet yhdistettiin, kuivattiin tyhjössä ja fraktioitiin käyttäen voimakasta kationinvaihtohartsia (SCX) läpi.

2D-LC Separations

ensimmäinen ulottuvuus, SCX-erotukset suoritettiin passivoitu Waters 600E HPLC-järjestelmä, käyttäen 4 x 250 mm polysulfoethyl aspartamidi-pylvääseen (yhtiö PolyLC, Columbia, MD), virtausnopeudella 1 ml /min. Puskuri A sisälsi 10 mM ammoniumformaattia, pH 2,7, 20% asetonitriiliä /80% vettä. Puskuri B sisälsi 666 mM ammoniumformiaattia, pH 2,7, 20% asetonitriili /80% vettä. Gradientti oli puskuria A 100% (0-22 minuuttia näytteen injisoinnin jälkeen), 0% → 40% puskuria B (16-48 min), 40% → 100% puskuria B (48-49 min), sitten isokraattinen 100% Buffer B (49-56 min), sitten 56 min kytketään takaisin 100% A: tasapainottua uudelleen seuraavaa injektiota. Ensimmäinen 26 ml eluenttia (sisältää kaikki läpivirtaus- fraktiot) yhdistettiin yhdeksi fraktioksi, ja sitten 14 vielä 2 ml: n fraktioita kerättiin. Kaikki 15 nämä SCX fraktiot kuivattiin täysin alas tilavuuden vähentämiseksi ja poistamiseksi haihtuvien ammoniumformiaattia suolat, sitten uudelleen 9 ul: aan 2% (v /v) asetonitriili, 0,1% (v /v) trifluorietikkahappoa ja suodatettiin ennen käänteisfaasi C18 nanoflow-LC erottaminen. Sillä toinen ulottuvuus erottaminen käänteisfaasi nanoflow LC, kukin SCX fraktio automaattisesti ruiskutettiin Chromolith CapRod pylväs (150 x 0,1 mm, Merck) käyttämällä 5 ul injektiosilmukka on Tempo LC MALDI Tarkkailu järjestelmä (ABI-MDS /Sciex) . Puskuri C: ssa oli 2% asetonitriiliä, 0,1% trifluorietikkahappoa, ja puskuri D oli 98% asetonitriiliä, 0,1% trifluorietikkahappoa. Eluutiogradientin oli 95% C /5% D (2 ui per minuutti virtausnopeudella 0-3 minuutin ajan, sitten 2,5 ui per minuutti 3-8,1 min), 5% D → 38% D (8,1-40 minuuttia), 38% D → 80% D (41-44 min), 80% D → 5% D (44-49 min) (edellytykset). Virtausnopeus oli 2,5 ul /min gradientin aikana, ja yhtä virtaus MALDI matriisin lisättiin pylvään jälkeisen (7 mg /ml uudelleenkiteytettiin CHCA (α-syaani-hydroksikanelihappo), 2 mg /ml ammoniumfosfaatti, 0,1% trifluorietikka- happoa, 80% asetonitriiliä). Yhdistetty eluaatti automaattisesti täpläksi ruostumattomasta teräksestä MALDI tähyslevyä 6 sekunnin välein (0,6 ui per spot), yhteensä 370 paikkoja kohti alkuperäistä SCX osa.

massaspekrometria Analysis

näyte täplät kuivattiin ja kalibrointiaineella täplät (ABI 4700 Mix) lisätään jokaiseen levyyn manuaalisesti. MALDI tähtäyslevyä (15) analysoitiin tietokannan riippuvaisesti ABI 5800 MALDI TOF-TOF kalibroinnin jälkeen. Massaspektrometria (MS) spektrit saatiin kustakin näytteestä paikalla käyttäen Äskettäin päivitetty oletuskalibrointi käyttäen 500 laser laukausta per paikka. Levy laajuinen tulkinnan automaattisesti suoritettiin valita korkein huippu kunkin havaittu m /z-arvon myöhemmin tandem MS /MS-analyysi. 2500 laser laukausta laserin teho 4200, jossa törmäys aiheuttama dissosiaatio (CID) kaasua ilmaa 1,2-1,3 x 10

-6 Torr kerättiin kutakin MS /MS-spektri. Kun MS ja MS /MS-hankinta, spektrien kaikista 15 levyt näytteessä käytettiin proteiinin tunnistamiseen ja määrän käyttäen Paragon algoritmin toteutettu Protein Pilot 4.0 ohjelmisto (ABI-Sciex) [18]. Spektrit vastaavuushaku ihmisen alaryhmä (plus yleinen epäpuhtaudet) ja NCBI ei tarpeeton tietokannan ketjutetaan käänteinen ”houkutuslintuna” versio samasta tietokannasta käyttämällä uusinta näiden FASTA tietokantojen saatu http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/entrez?db=Taxonomy cmd = search termi =. (Ref Seq Human tietokanta 20120204 sisältävät sekvenssit 29766 proteiinisekvenssien plus 389 yhteisiä lab epäpuhtauksia. Proteiini Pilot hakuparametrit olivat: metyylimetaanitiosulfonaatin (MMTS) alkyloida kysteiinitähdettä, 4-Plex iTRAQ muutos lysiiniä ja N-pään tunnistusmerkillä keskittyen biologisia muutoksia ja aminohapposubstituutioita käyttäen perinpohjaisesti vaivaa. Valheellinen Discovery Rate (FDR) arviointi määritettiin samanaikaisesti etsimällä ketjutettujen houkutuslintuna tietokantaan [19].

Pathway Analysis

Data tuotetaan proteomiikka massaspektrometrianalyysissä analysoitiin Ingenuity Pathway Analysis (IPA, kekseliäisyyttä System, Redwood city, CA, www.ingenuity.com). Ingenuity Knowledge Base työkalua käytettiin tunnistamaan biologisen toiminnan ja kanoninen polkuja, jotka sisältävät ja ottamaan säädellään eri tavalla proteiineja. IPA on säännöllisesti päivitettävä tietokanta, joka käyttää nykyistä tietämystä saatavilla geenien, proteiinien, normaali solu- ja patologisia prosesseja, signalointi ja metaboliareitit, tarvitaan reitin rakentamiseen.

Protein valmistelu Validation

PC3-N2 ja PC3-ML2 soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja irrotettiin käyttäen 5 mM EDTA PBS: ssä. Proteiinin uutto, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja hajotettiin muutettu RIPA-puskurissa [50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,25% natriumdeoksikolaattia], joka sisälsi proteaasi- estäjä cocktail (Complete, Mini, Roche) 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Näytteet sonikoitiin 1 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 14000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti kerättiin. Yhtä suuret määrät proteiinia (BCA Protein Assay Kit, Pierce) kustakin näytteestä erotettiin 4-12% Tris-glysiini-natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelillä (SDS-PAGE), jota seurasi Western blot siirto PVDF. Länsi-analyysi, elektroforeesi proteiinit siirrettiin PVDF-membraanille, blokattiin Odyssey estopuskuria (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA), tutkittiin primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin vastaavien IRDye konjugoidun toissijainen vasta-aineilla ja käyttäen Odyssey infrapuna imaging System (Li-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska).

transfektio ja vaiennettu plectin ja vimentiinista siRNA

siRNA duplexes käytettiin vaientaa plectin ja vimentiinista ilme. Ei-kohdistaminen 20-25 siRNA duplex käytettiin negatiivisena kontrollina. SiRNA-dupleksit transfektoitiin PC3 solulinjat siRNA transfektioreagenssin mukaisesti valmistajan ohjeiden Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Transfektion jälkeen 72 tuntia, solut altistettiin Western blot ja immunofluoresenssianalyysillä havaitsemiseksi tehokkuuden vimentiinista ja plectin knockdown ja määrittää vaikutukset Knockdown maahanmuutto- ja invasiivisia solujen ominaisuuksia.

konfokaalimikroskopia analyysi

PC3-N2 ja PC3-ML2-solut ympättiin 6-kuoppaisille maljoille, jotka sisältävät lasipeitelevyihin ja viljeltiin 10% FBS /DMEM 2 päivää. Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, kiinnitettiin jääkylmällä metanoli 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen kiinteä solut pestiin PBS: llä ja värjättiin ensisijaisen vasta-aineita plectin, vimentiinin, ja CDK2 yön yli 4 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-aineet poistettiin ja solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, ennen kuin värjäämällä Alexa Fluor konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. TOPRO tahra oli mukana toissijainen vasta-aineita tumavärjäystä. Toissijainen vasta-aineet ja ydin- tahrat pestiin pois ja kansi luistaa asennetaan diat Vector Shield alustalla, joka sisälsi DAPI tahra (Vector Labs, Burlingame, CA), ja sinetöity kynsilakka. Fluoresenssikuvia tutkittiin ja siepattiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Thornwood, NY).

proliferaatiomääritystä

PC3-N2 ja PC3-ML2 solut 24-kuoppaisilla levyillä tiheydellä 2 x 10

4 solut ja transfektoitu ei-kohdistuksen ja plectin /vimentiinista erityisiä siRNA lopullisessa pitoisuudessa 20 nM. Sekä liitteenä ja kelluvat solut kerättiin sen jälkeen sentrifugoimalla pienellä nopeudella ja trypsination. Solut värjättiin trypaanisini, ja määrä trypaanisini-positiiviset solut laskettiin päivinä 2, 4, 6 tuntia transfektion.

Scratch Pitoisuus /haavan paraneminen invaasiomääritys

migraatio kyky kahdessa solulinjassa arvioitiin haavan paranemista määrityksessä. Lyhyesti, PC3-N2 ja PC3-ML2 solut maljattiin 6-kuoppaisilla levyillä tiheydellä 2 x 10

5-solut ja transfektoitu ei-kohdistuksen ja plectin /vimentiinista erityisiä siRNA lopullisessa pitoisuudessa 20 nM 72 tuntia. Keinotekoinen haava huolellisesti luotu 0 h käyttäen 200 ui pipetin kärki raapia Konfluenttien yksisolukerroksen kolmena kappaleena kullekin tilalle. Solut pestiin PBS: llä ja viljeltiin 10% FBS-DMEM: ssä 5% CO 2 ja 37 ° C: ssa. Mikrovalokuva otettiin heti raapiminen (aika 0 h) ja 24 tuntia myöhemmin alle 10 × objektiivilinssin käyttämällä käännettyä Zeiss AxioObserver.A1 faasikontrastimikroskoopissa (Zeiss, Oberkochen, Saksa). Siirtyminen etäisyydet kolmesta kaivosta mitattiin ja keskiarvo ja keskivirhe arvoista verrataan ohjaus- ja plectin ja vimentiinista pudotus soluja.

Trans-hyvin Migration Analyysit

tutkimiseksi invasiivisuus on kahdessa solulinjassa, kalvon invaasion viljelysysteemin käytetään seuraavasti. Solut, jotka esikäsitelty ohjaus siRNA tai vimentiinista ja plectin siRNA: t olivat nälässä yön yli DMEM, jossa oli 0,5% FBS: ää, minkä jälkeen ne trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM, joka sisälsi 0,5% naudan seerumialbumiinia. Solut (1 x 10

5) lisättiin alkuun kammioihin 24 kuopan transwell levyille (Corning, 8 um huokoskoko), ja DMEM 10% FBS ja LPS lisättiin pohjalle kammioihin. Alakammioissa täytettiin kasvualustalla, joka sisälsi joko 0,5% FBS kontrollina tai sisältävät 10% LPS attraktantti. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Lopussa itämisaika, yläpinnan kalvo pyyhittiin puuvilla-kärki asetin poistamaan ei-vaeltavien solujen. Solut, jotka muuttivat alapuoli kalvo kiinnitettiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja visualisoida ytimiä. Solut kvantifioitiin laskemalla viiden suuritehoinen kentiltä 100-kertainen suurennus, ja välineet kunkin kammion määritettiin kolmena kappaleena. Prosenttia invaasio oli edustettuna solujen keskimääräinen lukumäärä vaeltavat kalvon läpi varten plectin ja vimentiinista vaiennettu soluja verrattuna ei-kohdistuksen siRNA.

Korrelaatio Plectin ja vimentiinista Expression Ihmisperäisiä Proteome Atlas

Human Protein Atlas-tietokanta näyttää ilme ja lokalisointi malleja proteiinien suuri osa ihmisen kudosten ja elinten painottaen strategioista validointi immunohistokemiaa perustuvan proteiinin ilmentymisen kaavoja syövän tutkimushankkeita. Lopullisena tavoitteena projektin sisältävät luominen tietokannan proteiinin ilmentymisen kuvioita normaaleissa ihmisen kudoksissa, soluissa ja syövän, ja hyödyntämällä tuotettu vasta-aineiden ja proteiinien ilmentyminen tietoja työkalujen käyttöä kliinisesti käyttökelpoinen biomarkkerit [20], [21] kantavassa tietokanta sisältää korkean resoluution kuvia selityksineen oikeaksi todistettu patologia. Ihmisen proteiini Atlas käytettiin seulomaan ilmentymisen plectin ja vimentiinin keskitytään immunohistokemia normaalin ja syöpä- eturauhasen kudosta. Nämä vertailevat analyysit yhdessä tuotetut tiedot esillä olevassa tutkimuksessa luo perustan tulevien hypoteesi ajettu tutkimuksia näiden proteiinien osuutta eturauhassyövän taudin etenemistä.

Tilastollinen analyysi

Jokaisessa näissä kokeissa tehtiin kolmena kappaleena. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhettä (S.E.M.). Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 13.0 tilasto-ohjelmalla (SPSS, Inc. Chicago, IL, USA).

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

tunnistaminen ilmentyvät eri proteiinit PC3-N2 ja PC3-ML2 solulinjojen käyttäminen iTRAQ nimeäminen ja 2D LC-MS /MS

Olemme analysoineet proteomiin syngeenisten eturauhasen syöpäsolu PC3-N2 ja PC3-ML2 2D LC-MS /MS: llä käyttäen iTRAQ, tuottaa tietoa erilaisesti ilmaisi proteiineja. Yleinen kokeellinen työnkulku esitetään Täydennyskuvio S1. Kaikkiaan 1756 ei-tarpeeton proteiinit toistuvasti tunnistettiin kahtena iTRAQ merkintöjen ja 2D LC-MS /MS-analyysit, 95%, jotka tunnistettiin 2-peptidin tulitikut. Väärä löytö määrä (FDR) proteiinien tunnistus perustuu etsimiseen vastaan ​​käänteinen tietokanta oli 1%. Yksityiskohtaiset tiedot, mukaan lukien tiedot peptidisekvenssejä, proteiini kvantifiointiin mennessä keskimäärin iTRAQ suhde, sekä erillisiä ja yhteisiä peptidien ryhmän kanssa proteiinien tunnistetuista proteiineista on esitetty taulukossa S1. Tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien PC3-N2 ja PC3-ML2, joka voi liittyä eteneminen ja metastaasit, proteiinin ilmentymisen profiilit kahden solulinjojen verrattiin. Proteiinit, jotka täyttivät seuraavat kriteerit varmuudella pitää ilmentyvät eri proteiineja: (i) proteiinit toistuvasti tunnistetaan päällekkäisiä kokeita; (Ii) proteiinien tunnistettujen perustuu on≥2 peptidit; (Iii) proteiinien osoitti keskimäärin suhde-kertainen change≥1.5 or≤0.667 että kaksoiskokeista kahden solulinjoista (

t

testi,

p

0,05). Käyttämällä näitä kriteereitä, 130 proteiinit havaittiin ilmentyä erilailla PC3-N2 ja PC3-ML2 soluissa. Näistä proteiineista, 62 havaittiin olevan säädelty samalla 68 olivat alassäädetty. Näiden nimet 130 proteiinit ja niiden ekspressiotasot on esitetty taulukossa S1. Jotkut MS /MS-spektri käytetään tunnistus- ja kvantitointi PLEC1 ja VIM huomattavasti korkea suhde-kertaiseksi muutoksia PC3-ML2 solujen verrattuna PC3-N2 linjat on esitetty kuvioissa S 2A ja S 2B. MS /MS-spektri GAPDH, joilla ei ollut kertaiseksi muutoksia kahdessa solulinjassa on esitetty kuvassa S 2C. EphA2 on esimerkki proteiini, joka on säädellä vähentävästi PC3-ML2 vs PC3-N2 ja tämä esitetään kuviossa S 2D. Korkea vastaavuutta havaittiin kahden toimittaja ioni intensiteettiä tietyn peptidin lähes kaikissa peptidien tunnistettu. Keskimääräinen kertamuutosta proteiinia saatiin käyttäen kaikkia peptidejä tunnistaa, että proteiini. Siksi meidän proteiini tunnisteiden ja määrän ovat johdonmukaisia ​​ja korkea luottamus. Tämä alaryhmä 130 säädellään eri tavalla proteiineja käytettiin kaikille seuraaville bioinformatiikan analyysi, biologinen merkinnät ja tulkinta.

Pathway Analysis

käyttäminen Ingenuity ohjelmiston säädellään eri tavalla proteiinit osoitettu Sijainti solussa molekyyli- ja solufunktiot, ja niiden mahdollinen osallistuminen sairaudet ja häiriöt. Kuviot 1A, B ja C näyttää niiden solukomponenttien lokalisointi, niiden solu- ja molekyylitason toiminnot sekä keskeiset sairaudet ja häiriöt, jotka ne edustavat vastaavasti. Taulukot S2 ja S3 yhteenveto eri toiminnalliset luokat ja niiden p-arvot. Tuloksemme osoittavat, että säädellään eri tavalla proteiinien välillä syngeenisten eturauhassyövän solulinjoissa ovat pääasiassa mukana syövän, dermatologisten tautien, geneettiset häiriöt, maha-suolikanavan sairaus, ja immunologinen sairaus. Käyttämällä IPA tietopohjaa työkalu, olemme tunnistaneet alkuun verkkojen ja kanoninen reittejä, joissa esitetään tärkeimmät mahdollisten toimintojen proteiineja, joita ekspressoituu differentiaalisesti kahdessa solulinjassa. Kuten taulukossa S4 ja kuvio S3, alkuun verkko on solujen morfologia, sidekudoksen kehityksessä ja toiminnassa, ja solujen liikkumista.

Ingenuity tietopohjaa analyysiä käytettiin määrittämään osa-solu lokalisointi, molekyyli- ja biologiset toiminnot ja taudin prosesseja, jotka liittyvät proteiinit, jotka ovat differentiaalisesti säädeltyjä PC3-N2 ja PC3-ML2 soluja. Numerot proteiinien on esitetty x-akselilla ja taulukoissa S2 ja S3.

validointi ilmentyvät eri proteiinien Merkitty Proteomiikka

Niistä 130 proteiineja, joilla on muuttunut ilme, me keskityttiin kahteen proteiineja plectin ja vimentiinista, jotka olivat hyvin merkittävästi yläreguloituja PC3-ML2 vs PC3-N2. Lisäksi niiden ekspressiotasot ei ole hyvin tutkittu eturauhassyövän. Western-blottaus suoritettiin havaitsemiseksi ilmaisullisia tasoja kahden proteiinin kolmena kappaleena kokeissa. Kuten kuviossa 2 on esitetty, PLEC1 ja VIM ekspressiotasot ovat merkittävästi lisääntyneet PC3-ML2 vs PC3-N2, joka on yhdenmukainen MS-analyysiä tietoja. Suhteellinen ekspressiotasot plectin normalisoitu ja vimentiinista kanssa GAPDH tasolla osoitetaan vieressä Western blotting kuvan. Täydentäviin analyyseissä, Immunofluoresenssimääritykset tarkistaa tehokas kaatamalla että plectin ja edelleen vahvistaa Massaspektrometriasta tiedot kuten kuvassa 3 paneelissa A, jossa intensiteetti plectin värjäytymistä osoitettu merkittävästi erittäin ilmaistaan ​​PC3-ML2 verrattuna PC3-N2. Samalla havaittiin, että vimentiinista knockdown-soluja (kuvio S4) B

Yhteensä solulysaateista (40 ug) N2 ja ML2 solut altistettiin SDS-PAGE: lla. Erotetut proteiinit analysoitiin Western blot -analyysillä havaitsemiseksi plectin ja vimentiinin, kuten on kuvattu. GAPDH havaitseminen sisällytettiin latauskontrollina.

Soluja käsiteltiin kontrolli-siRNA tai Plectin geenispesifistä siRNA 3 päivää ja sitten kiinteä, inkuboitiin kaniinin polyklonaalista anti-plectin ja hiiren monoklonaalinen anti-CDK2 ensisijainen vasta-aineet ennen ”värjäytymistä” Alexa Fluor konjugoitu aasin anti-kani-vasta-aineita (vihreä), vuohen anti-hiiri-vasta-aineita (punainen) ja tumaväriä TOPRO (sininen). Paneeli A esittää kuvien ohjaus siRNA transfektoituja soluja ja paneeli B esittää Plectin siRNA transfektoiduista soluista.

Plectin ja vimentiinista knockdown Estää leviämisen PC3-ML2 Cell Lines

tutki plectin ja vimentiinista edistää solujen lisääntymistä eturauhassyövässä käyttäen RNAi tekniikkaa. Sen jälkeen käyttöönoton plectin ja vimentiinista siRNA osaksi PC3-ML2 soluja 72 tuntia, tukahduttaminen plectin ja vimentiinista vahvistettiin Western-blottauksella, kun taas kontrolli ei-suunnattu siRNA ei ollut merkittävää vaikutusta endogeenisen plectin ja vimentiinista lauseke (kuva 4). Ilmentyminen plectin ja vimentiinista vähenivät 72% ja 99,9% vastaavasti verrattuna kontrolleihin (

p

0,05). Suhteellinen ilmentyminen GAPDH kontrolleissa ja plectin /vimentiinista suunnattu siRNA knockdowns ovat identtisiä. Leviämisen PC3-ML2 solut tutkittiin solun laskemalla 2-6 päivää kuluttua siRNA hoidon. Meidän tiedot osoittavat, että solujen lisääntyminen väheni merkittävästi sekä plectin ja vimentiinin pudotus (kuvio 5). Tiedot täydentävät määritykset eivät osoita merkittäviä eroja elinkelpoisuus molemmissa solulinjoissa (kuvio S5).

Soluja käsiteltiin ohjaus siRNA, plectin tai vimentiinistä geenin tietyn siRNA. Kokosoluliuotteista (40 ug) ML2 solut altistettiin SDS-PAGE: lla.