Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM), syövän kantasoluja (CSC) markkeri yli ilmaistaan ​​epiteelisyövissä ja retinoblastooma (RB). Me valmistaa EpCAM kohdistaminen aptameeri-siRNA-kimeeran ja tutkitaan sen anti-kasvain omaisuutta ja EpCAM solunsisäinen domeeni (EpICD) välittämän signaloinnin epiteelin syöpää. Anti-kasvain teho EpCAM Aptameerin-siEpCAM chimera (EpApt-Siep) arvioitiin qPCR, pohjoinen ja Western blotting in WERI-Rb1- RB solulinja, ensisijainen RB kasvainsoluja ja MCF7- rintasyövän solulinjaa. Antituumorivaikutus of EpApt-Siep tutkittiin

in vivo

käyttäen epiteelin syöpä (MCF7) hiiret ksenograftimallissa. Mekanismi ja reittejä mukana antituumorivaikutus tutkittiin edelleen käyttäen proteiinijärjestelmien ja qPCR. EpApt-Siep -kimeeraa käsitelty

in vitro

mukaan dicer entsyymi. Hoito WERI-RB1 ja MCF7-solujen EpApt-Siep paljasti tilastollisesti merkitsevä alas säätely EpCAM ilmentymisen (P 0,005) ja samanaikainen väheneminen solujen lisääntymistä. Vuonna ensisijainen RB soluja viljeltiin RB kasvaimista, EpApt-Siep vaiennetaan EpCAM, estivät merkittävästi (P ​​ 0,01) solujen lisääntymisen ja aiheuttamaa sytotoksisuutta. Knockdovvn EpICD ilmaistu RB primaarikasvainten johti tukahduttaminen pluripotenttisuuden markkereita, Sox2, Oct4, Nanog, ja CD133.

In vivo

tutkimukset osoittivat täydellistä kasvaimen kasvua regressio ilman myrkyllisyyttä eläimillä (P 0,001) ja kasvaimen kudokset osoittivat merkittäviä downregulation (P 0,05) ja EpCAM, MRP1, ABCG2, stathmin surviviiniperäiset ja säätelyä ATM ( P 0,05), joka johtaa apoptoosin luontaisen reitin pienin muutos sytokiineja. Tuloksemme paljasti, että EpApt-Siep mahdollisesti hävittää EpCAM positiiviset syöpäsolut kautta CSC merkki tukahduttaminen ja apoptoosin, säästäen normaalia EpCAM negatiivinen viereisten solujen.

Citation: Subramanian N, Kanwar JR, Kanwar RK, Sreemanthula J, Biswas J , Khetan V, et ai. (2015) EpCAM aptameeriin-siRNA Chimera Tavoitteet ja Regress epiteelisyöpäsolujen. PLoS ONE 10 (7): e0132407. doi: 10,1371 /journal.pone.0132407

Editor: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), ITALIA

vastaanotettu: 08 lokakuu 2014; Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 15 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Subramanian et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat saatavilla paperilla. Lisäksi raaka kuvia käytetään kokoamiseen luvut talletetaan Figshare (Linkki: figshare.com/s/cb264ee0178b11e5be5906ec4b8d1f61).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat BARC 2010/35/19 /BRNS ja osittain Department of Biotechnology- Indo-Australian myöntämiskäytän- BT /Indo-Aus /06/08/2011 ja COE-Grant BT /01 /CE1B /11 /V /16-ohjelman tuki RB.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ilmoittavat, että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM) on tunnettu syövän kantasolujen (CSC) markkeri ilmentyy solun pinnalla ja pitää kasvain liittyvä antigeeni [1]. EpCAM on yliekspressoitu epiteelikasvaimissa kuten rintasyövän ja lapsuusiän silmäsyöpä kuten retinoblastoomasolulinjassa (RB) [2-4]. EpCAM liittyy lisääntynyt solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion sekä rintasyövän ja RB [5, 6] .EpCAM proteiinia jaotellaan solunulkoista domeenia (EpEx), transmembraanidomeeni (EpTM) ja solunsisäinen alue (EpICD). Se on tärkeä rooli in kasvaimia synnyttävän opastinjärjestelmillä EpCAM proteolyysin ja EpICD translokaation tumaan [7, 8] .Proteolysis of EpCAM johtaa EpICD muodostaen monimutkaisia ​​withFHL2, β-kateniinin ja Lef1. Tämä monimutkainen sitoutuu theLef1 sitoutumiskohtaan kohdegeenien ja säätelee niiden transkriptio [7] .EpICD tiedetään miehittää promoottorialue ja positiivisesti säädellä Sox2, Oct4 ja Nanog joka edistää itseuudistumisen ja pluripotenttisuuden syöpäsolujen [9].

EpCAM pidetään ihanteellisena terapeuttinen tavoite syövän hoitoon eron vuoksi sen alueellista jakautumista normaalin ja syöpäsoluja. EpCAM yliekspressoituu apikaalisella pinnalla kasvainsolujen [10], ja minimaalisesti että basolateraaliseen pinnan normaalien epiteelisolujen ja mutaatioita ei ole kuvattu EpCAM sikäli syöpäsoluissa [11]. Useita anti-EpCAM vasta kuten edrecolomab ja adecatumumab luotiin kohdistaa syövän ja Kliinisissä tutkimuksissa [12]. Parantaakseen edelleen terapeuttista potentiaalia EpCAM kohdentaminen, aptameerit enemmän spesifisyys ja korkeampi affiniteetti etsittiin [13].

Aptameerit ovat synteettinen oligonukleotidi (RNA /ssDNA) tai peptidi molekyylejä, jotka sitoutuvat tiettyyn kohde suurella affiniteetilla johtuen niiden kolmiulotteisiksi rakenteiksi [14]. Ne syntetisoidaan laaja molekyyli- kirjastoista jonka valintaprosessin sanottu systeeminen kehitys ligandien eksponentiaalinen rikastus ”(SELEX) [15, 16]. Sekä RNA ja ssDNA aptameerejä kehitettiin vastaan ​​solupinnan EpCAM [13, 17]. Koska EpCAM RNA aptameerin osoitettiin saada sisäistää endosytoosin, olisi kyettävä antamaan siRNA soluun kun kimerisointi. Useita aptameeriin-siRNA kimerisointi strategiat tutkittiin kohdentamiseksi syöpäsoluja. RNA aptameerit vastaan ​​pintamerkkiaineita kuten PSMA, EGFR, BAFF-R, integriinit ja DNA aptameeriin vastaan ​​nukleoliinin raportoitu tuottaa siRNA eri syövän mallien (yhteenveto S1 taulukko).

toimivuus Aptameerin-siRNA kimeerinen konstruktioita voitaisiin selittää kolmessa vaiheessa, kuten (i) sitova ja sisäistämisen, (ii) dicer käsittely ja (iii) RNAi välittämää hiljentäminen [18]. Aikaisemmin olemme osoittaneet kohdentaminen RB käyttämällä aptameeriin-doksorubisiini (EpDT3-DOX), joka sitoutuu solun pinnan EpCAM toimittaa doksorubisiini [19]. Tässä ensimmäistä kertaa, olemme rakentaneet EpCAM RNA aptameeriin-EpCAM siRNA chimera (EpApt-Siep) saavuttaa tavoitellut EpCAM geenien in EpCAM positiivisissa soluissa. Raportoimme myös ensimmäistä kertaa, että EpICD on yliekspressoitu RB, ja kaatamalla EpCAM johtaa alas-säätely CSC markkereita, kuten Sox2, Oct4 ja Nanog ilme. Olemme myös suorittaa

in vivo

-tutkimukset ksenograftimallia nude-hiirissä, joissa MCF7 rintasyöpä solulinjassa, kuten proof of concept kiinteiden epiteelisyövissä joka ilmentää EpCAM. Korkean antituumorivaikutus oli saavutettu käyttämällä EpApt-Siep kimeerinen konstrukti ilman toksisuutta. Lisäksi olemme tutkineet mekanismi mukana solukuoleman ja soluproliferaation inhibointi on tuumoriksenografteja tutkimalla täydellinen apoptoottisten ja sytokiinien molekyylien avulla proteiinijärjestelmien.

Methods

valmistustekniikka kimeerisen konstruktin ja

in vitro

dicer pilkkominen määritys

EpApt-Siep rakennettiin kuvatulla Dassie

et

.,

al

. 2009 [20]. Sekundaarirakenteen konstruktin tutkittiin RNA rakenne v5.3 [21] ja Mfold ohjelmisto [22]. Suunniteltu konstrukteja kaupallisesti syntetisoitiin Dharmacon Inc. (GE biotieteiden, Lafayette, CO).

In vitro

dicer määritys suoritettiin osoittamaan, että EpApt-Siep -kimeeran parhaillaan käsitellään dicer entsyymin vapauttamiseksi siRNA kimeerisestä aptameeri käyttämällä yhdistelmä dicer kit (rekombinantti ihmisen dicer Enzyme Kit Cat No: T510002) seuraten valmistajan ohjeita. Reagoinut tuotteet ajettiin elektroforeesilla ja analysoitiin UV transilluminaattori (yksityiskohtainen protokolla annetaan S1 File).

Solulinjat ja ensisijainen RB soluviljelmässä ja aptameeriin oton tutkimus

Human RBcell linja (WERI-RB1) , Breast Cancer solulinja (MCF7) hankittiin riken solupankki RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japani) oli mukana tutkimuksessa. Solulinjat olivat vapaita mykoplasmakontaminaation, varmennettuna LookOut Mycoplasma Kit (Sigma Aldrich, Bangalore). MCF7 andWERI-RB1 soluja viljeltiin Dulbeccon modifioituun Eaglen media (DMEM) ja Rosewell pysäköidä Memorial Institute (RPMI-1640) mediarespectively 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Life Technologies, Bangalore, Intia). Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO 2: incubator.RB kasvaimen näytteitä enukleoidaan silmän palloja kerättiin osana hoitoa ja hyödyntää tutkimuksen tarkoituksena anonyymisti. Yleinen kirjallinen suostumus saatiin vanhemmilta /vartijoita potilaasta enucleation. Tutkimus suoritettiin mukaisesti julistuksen Helsingin, Vision Research Foundation, hyväksynnän saatuaan eettisen alakomitean (Institutional Review Board) on Sankara Nethralaya silmäsairaalassa [Eettiset puhdistumaan. ei. 240-2010-P]. Ensisijainen RB kasvainsoluja saatu enukleoidaan silmät hajotettiin käsin trituroimalla, ja niitä viljeltiin RPMI-väliaineessa, joka sisälsi 20% FBS: ää. RPMI ja DMEM ostettiin Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, Bangalore, Intia). Ottoa FITC leimattu EpApt-Siep by MCF7 ja WERI-RB1 soluja tutkittiin käyttämällä virtaussytometria ja fluoresenssimikroskopialla seuraava protokolla annetaan S1 File.

In vitro

tehoa EpApt-Siep solussa linjat

teho EpApt-Siep arvioitiin

in vitro

käyttämällä MCF7 ja WERI-RB1 solulinjoissa. Lyhyesti, 2X10

5-soluja käsiteltiin EpApt-Siep tai transfektoitu siEpCAM 48 tuntia, RNA: n eristämistä ja sen jälkeen Northern blot, qPCR mRNA: n analyysiä ja Western-blottauksella proteiinin tasot (S1 File).

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR, pohjoinen ja Western blotting

vaikutuksen analysoimiseksi siEpCAM ja EpApt-Siep on EpCAM ilmaisun, qPCR ja Pohjois-blottaus suoritettiin käyttäen kokonais-RNA. qPCR suoritettiin normalisoimalla kohdegeenin ß-2-microgloublin (B2M) by SYBR green perustuva menetelmä käyttäen alukesekvensseissä lueteltuja S2 taulukossa. Northern blotting suoritettiin elektroforeesi kokonais- RNA: isessa formaldehydi-agaroosigeelissä, transblotatuilla käyttäen SSC-puskuria, koettimena biotiinileimattua anti-sense EpCAM-RNA-koettimella ja kehitettiin käyttäen kemiluminesenssi menetelmällä. Western blottaus suoritettiin analysoida EpCAM proteiinin taso käyttämällä vakioyhteyskäytäntöä anti-EpCAM (c-10) vasta-aine (yksityiskohtainen protokolla annetaan S1 File).

immunohistokemia

immunohistokemia (IHC) oli suoritettiin käyttäen Novolink polymeeriä löydöistä järjestelmä (Leica Biosystems, Bangalore, Intia) antamien ohjeiden käyttämällä valmistajan de-paraffinized ihmisen RB kudosleikkeiden. Lyhyesti, antigeeni haku suoritettiin käyttäen painekattilaa menetelmää, sitten kudoksen peroksidaasi esto ja ensisijainen esto oli suoritettu seurasi inkubointi anti-EpICD-vasta-aine (IMGENEX, Intia). Polymer perustuva tunnistus käyttämällä DAB kromogeenillä tehtiin, kuivatut kalvot kiinnitettiin ja pisteytettiin ekspressiotasoja (yksityiskohtainen protokolla annetaan S1 File).

MTT soluproleferaatiomäärityksessä

Yhtä suuret määrät MCF7 ja WERI -Rb1 soluja (10000 per kuoppa) ympättiin vastaavasti 96-kuoppaiselle levylle. 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin 400 nM aptameeri-siRNA-kimeeran. Solut transfektoitiin myös käyttämällä lipofektamiinia 2000 (Invitrogen Lifescience, Bangalore, Intia) ja 200 nM EpCAM siRNA (Qiagen, Saksa). Käsitellyt solut inkuboitiin 48hat 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa. 48 tunnin kuluttua MTT: tä (Sigma Aldrich, Bangalore, Intia) on lisättiin tuoretta väliainetta lisättiin soluihin ja inkuboitiin 4 tunnin ajan. Muodostuneet kiteet liuotettiin DMSO: hon ja absorbanssi luettiin aallonpituudella 570 nm käyttäen SpectraMax-spektrofotometriä.

In vivo

kasvaimen vastainen teho EpApt-Siep epiteelin syövän ksenograftimalli

tutkia

in vivo

tehoa EpApt-Siep, MCF7 epiteelin syöpä malli valittiin, koska

in vitro

teho oli parempi kuin WERI-RB1 solulinjassa. Tämä tutkimus suoritettiin tiloissa Syngene- International Pvt. Ltd., kaupallisesti. Kaikkia eläimiä hoidetaan tavalla minimoida tai poistaa kipua ja kärsimystä käyttämällä isofluraania perustuu anesthetization. Eläinten hoito oli noudattaen suositusten komitean tarkoitus ohjaus ja valvonta eläinkokeiden (CPCSEA), Intian hallituksen ja yhdistyksen arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care International (AAALAC). The ’Lomake B’ suorittamiseksi eläinkokeiden tarkasteli ja hyväksynyt Syngene- International Pvt. Ltd, institutionaalisten Animal eettisen komitean (IAEC pöytäkirja hyväksyntä nro: Syngeeni /IAEC /430 /10-2013). Eläimet pidettiin kontrolloiduissa ja aseptisissa kunnossa ja varustettu maissintähkistä, RO vesi autoklavoitiin mielin määrin ja valoisa /pimeä sykli 12h jokaisen. MCF7cells suspendoitiin pitoisuudessa 5×10

6cells 200 ul seerumitonta väliainetta, joka sisälsi 50% Matrigel, ja injektoidaan subkutaanisesti takana kateenkorvattomiin nude-Foxn1

nuovariectomized naaraspuolisia hiiriä, 7-8 viikkoa vanhoja istutettiin 17β- estradioli pellettejä. Kun kasvaimet tuli kouraantuntuva, eläimet jaettiin satunnaisesti ryhmitelty perustuu kasvaimen (TV≈80mm

3) ja annostelu aloitettiin. Hoitoaikataulu seurasi annetaan S3 taulukossa. Kehon painot ja kasvaimen tilavuus mitattiin kerran joka kolmas päivä ja% painon muutos laskettiin. Aikana uhri, veri kerättiin isofluraanianestesiassa kaikista ryhmistä kliiniseen arviointiin maksan toimintaa (ASAT, ALAT) munuaisten toiminta (BUN, urea), ääreisveren kokeena varten ero valkosolujen. Kasvain kudokset ja elimet irrotettiin ja analysoitiin histo-patologisesti hemotoksyliini- ja eosiini värjäystä.

Protein matriisia apoptoottisia markkereita ja sytokiinien

Proteome profilointi tehtiin tutkia mekanismi EpApt-Siep rakentaa välittyy antituumorivaikutus ja tutkia sen vaikutusta apoptoosin alkaminen ja tulehdusvasteen. Proteiini taulukot-Human apoptoosin array, luettelo # ARY009 ja hiirisytokiini array paneeli A luettelo # ARY006 (R

in vitro

dicer välittämä käsittely ja soluunottoa

EpCAM aptameeriin siRNA-kimeeran valmistettiin seuraamalla aikaisemmin optimoituja rakenteita PSMA Aptameerin siRNA kimeerinen konstrukti [20]. Edellisessä tutkimuksessa, varsi ja silmukka aptameeriin kimeeran lohkon swap näytteillä paremmin hiljentäminen verrattuna muihin kimeerisiä muotoja. Siksi nykyisessä tutkimuksessa olemme valmistettu aptameeriin kimeera laajentamalla aptameeriin sekvenssi siRNA sekvenssin 5′-päässä ja 3′. Muokattujen EpApt-siRNA suorittaa siRNA kohdistaminen EpCAM. Varsi ja silmukka rakenne suunniteltiin käsin sisällyttämällä siRNA sekvenssin kohdistaminen EpCAM. Lisäksi aptameerit-siRNA suorittaa nukleaasiresistenteiksi muutos (2’F) on pyrimidiinit. 5′-päästä aptameeriä oli lopussa leimattu FITC seurata aptameeriin sitova ja sisäänotto soluihin ja 3′-päässä aptameeriä kanna kaksi uridiini ulokkeita, joka auttaa tunnustamista ja lastaus dicer entsyymin [23]. EpApt ja rakennettu aptameeriin kimeerisiä rakenteita ennustettiin käyttämällä RNA rakenne v5.3 ja Mfold ja esitetty kuvassa 1A ja 1B. EpApt tuet sitoutumisessa EpCAM, sisäistämistä ja päästäminen sytoplasmassa. EpApt-Siep vaikutuksen alaisena dicer, generates21bp siRNA, joka lataa osaksi RISC monimutkainen, orchestrates esto käännös EpCAM mRNA pilkkominen.

. EpCAM aptameeriin sekundaarinen rakenne ennustuksen Mfold verkossa. B. EpCAM aptameeriin siRNA kimeerinen konstrukti kuljettavat siRNA kohdistaminen EpCAM (EpApt-Siep) on taitettu käyttäen Mfold verkossa ja aptameeriin näkyy sinisenä kentästä ja siRNA sisällä punainen laatikko. C. EpCAM aptameerin siRNA kimeerinen konstrukti inkuboitiin rekombinantti dicer entsyymiä 37 ° C: ssa 18 tuntia. Reaktiot suoritettiin ilman dicer kontrollina reaktiota. Polyakryyliamidigeelielektroforeesi reaktioiden kanssa ja ilman dicer entsyymiä ajettiin 15% geelillä ja värjättiin EtBr. Käsitelty 21 bP siRNA ja käsittelemättömät konstrukti havaittiin. D. EpCAM aptameerin siRNA kimeerinen konstrukti lisättiin WERI-RB1 ja MCF7-soluja sitomispuskuriin ja analysoitiin virtaussytometrialla. Peittokuva kaavio osoittaa ottoa kimeerisen aptameerin. E. Scatter graafinen esitys ottoa EpApt-Siep jonka RB solulinja, WERI-RB1 ja RB primaarikasvaimen solut. F. EpCAM aptameeriin siRNA kimeerinen konstrukti lisättiin ensisijainen RB solut media ilman seerumia 2 tuntia 37 ° C seurasi pesu 1 x PBS. Mikroskooppinen kuvat otettiin 20X objektiivin alle vaiheessa ja FITC kanavien ohjaus pelkät solut ja solujen EpApt-Siep. Data edustaa keskiarvo ± SD. Kokeet toistettiin 3 kertaa itsenäisesti samanlaisia ​​tuloksia. ** P-arvo on 0,01-0,001; * P-arvo on +0,05-,01.

toiminnallisuus syntetisoitu EpApt-Siep, dicer tunnustaminen on tarpeen. Tämä testattiin suorittamalla

in vitro

dicer pilkkominen määrityksessä. EpApt-Siep konstrukti inkuboitiin ihmisen rekombinantti-dicer: ssa 18 tuntia ja sen jälkeen elektroforeesilla agaroosigeelillä. Tulokset paljastivat 21 bP ja 19merproducts vastaavat siRNA ja Aptameerien vastaavasti (S1 Kuva). Tämä vahvistettiin ajamalla ei-denaturoivaa PAGE, pilkottiin fragmentteja ~ 20-22bp pituus saatiin (kuvio 1C). Olemme edelleen pyrittiin tutkimaan rakenteen pysyvyyttä fysiologisissa jäljitteleviä olosuhteissa. Konstrukti johti minimaalinen hajoaminen ( 10% hajoamista) till 72h median ilman ja 10% FBS vastaavasti. Konstrukti 100% FBS oli vakaa asti 96h, vaikka lievää hajoamista oli ilmeistä 48 h ajan. Siten konstruktioita voisivat olla stabiileja fysiologisissa matkivat olosuhteissa till 72h (S1A kuvio).

soluunottoa tutkimukset EpApt-Siep tarvitaan perustelemaan sisäistämisen Aptameerin kautta reseptorivälitteisen endosytoosin. EpCAM aptameeri (EpDT3 /EpApt) on jo selvitetty reseptorin endosytoosin [13] .Earlier tutkimukset ja nykyisen tutkimuksessa käytettiin EpCAM sekoituskoodin aptameeri (ScrApt), ja 2′-OMe- modifikaatio EpApt selkäranka estää sitoutumisen EpCAM [13 19]. Samanlainen EpApt-Siep, ScrApt kimeeran (ScrApt-Siep) rakennettiin. ScrApt-Siep upon kimerisointi johti ei-spesifinen sitoutuminen MCF7-solut (S1B kuvio) ja ei tutkittu tarkemmin. Löysimme suurempi soluunottoa EpApt-Siep rakentaa MCF7 kuin WERI-Rb1cells (kuvio 1 D). Ensisijainen RB-soluissa ja WERI-RB1 solulinja osoitti ottoa chimera. Ensisijainen RB solujen havaittiin esiintyy enemmän sitovia hyötysuhde kuin solulinjojen, koska korkeampi EpCAM ilmaisun kasvaimissa (kuvio 1 E). Vuodesta mikroskooppisen tutkimuksissa 75% ensisijaisen RB solut osoittivat otto EpApt-Siep (kuvio 1 F).

EpApt-Siep hiljentää EpCAM erityisesti solulinjoissa ja ensisijainen RB kasvainsolujen

Tavoitteena erityinen toimitus, siRNA sukupolvi ja hiljentäminen kyky tutkittiin käyttäen WERI-RB1 ja MCF7-solulinjat. Koska ilmaus taso EpCAM on suurempi MCF7-soluissa kuin WERI-RB1 [24], kimeerinen konstrukti ensin arvioitiin vaiennettaisi EpCAM MCF7-soluissa. Pohjoinen blottaus tulokset osoittivat hiljentäminen on EpCAM noin 40% EpApt-Siep käsiteltyjä soluja ja noin 25% Siep transfektoiduissa soluissa normalisoitu 28s rRNA (kuvio 2A ja paneeli oikeus siihen). Kvantitatiivinen analyysi mRNA ilmentymisen qPCR osoitti paremmin esto EpCAM ilmaisun, -1,8 ja -3,4 kertainen downregulation (73% ja 90%: n inhibition mRNA ilmaisun) MCF7 solulinjassa (P 0,01) ja -1,4 ja -1,0 kertainen downregulation (63% ja 51% inhibitio mRNA tasoilla) WERI-Rb1cell linja (P 0,05) (kuvio 2B). EpCAM downregulation havaittiin myös proteiinin tasot (kuvio 2C), WERI-RB1 solut osoittivat 47% ja 43%, ja MCF7-näytteillä 65% ja 49% downregulation EpCAM-proteiinin (P 0,05) (kuvio 2D). Käsittelemätön pohjoinen ja Western blotit esitetään S2 File.

. EpCAM mRNA-tasot havaittiin kokonais-RNA valvonnan, Siep ja EpApt-Siep käsiteltyjen MCF7-solujen Northern-blottauksella. Kokonais-RNA: lle suoritettiin elektroforeesi formaldehydi agaroosigeelielektroforeesilla, siirrettiin ja kehittää kemiluminesenssin perustuva menetelmä. EpCAM kohdistaminen siRNA käytettiin syntetisoimiseksi koetin. Sen oikeassa, densitometrian analyysi bändit tehtiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja piirretään kuvaaja, jossa% mRNA: n ilmentymisen vastaan ​​28s rRNA. B. EpCAM mRNA-tasot kvantitoitiin SYBR green perustuu qPCR cDNA valvonnan Siep ja EpApt-Siep käsitelty WERI-RB1 ja MCF7-soluissa. C. Western-blottaus suoritettiin Siep transfektoitu ja EpApt-Siep käsiteltiin WERI-RB1 ja MCF7-soluja varten EpCAM ja b-tubuliinia. EpCAM kohdistaminen siRNA käytettiin syntetisoimiseksi koetin. D. densitometrian analyysi western blotting bändejä suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoja ja piirretään kuvaaja kanssa% proteiinia (EpCAM) lauseke normalisoida p-tubuliinia. E. Prosentuaalinen solujen lisääntymistä kvantifioitiin suorittamalla MTT määrityksen valvontaa Siep transfektoitu, EpApt-Siep, EpApt ja ScrApt käsiteltiin WERI-RB1 ja MCF7-soluissa. Kuvaaja osoittaa, että% soluproliferaation normalisoitu hallita soluihin. Data edustaa keskiarvo ± SD. Kokeet toistettiin 3 kertaa itsenäisesti samanlaisia ​​tuloksia. ** P-arvo on 0,01-0,001; * P-arvo on +0,05-,01.

vaikutusta kimeerisen konstruktin testattiin RB primaarikasvaimen solujen hiljentäminen. Toiminnallinen /metabolinen activityof primäärisiä soluja wasevaluated bytransfecting pGFP plasmidi. 24 tuntia transfektion enemmistö soluista osoittivat erittäin korkean ilmentymisen (S2A kuvio). Tämä vahvisti metabolisesti aktiivinen tila primäärisiä soluja, me sitten pyrki vaikutuksen analysoimiseksi EpApt-Siep ja Siep näissä soluissa. Ensisijainen kasvainsolut estivät EpCAM ilmaisun -0,5 kertaiseksi ja -2,4 kertaisesti siRNA ja kimeerinen konstruktio käsiteltiin soluissa (S2B kuvio). Solu sytotoksisuus mitattuna LDH testi osoitti 37% ja 35%: n nousu LDH-aktiivisuus, kun hiljentäminen of EpCAM käyttämällä siRNA ja EpApt-Siep. EpApt-Siep rakentaa merkitsevästi (P ​​ 0,01) vaimentua EpCAM mRNA-tasot ja aiheutti sytotoksisuutta ensisijainen RB kasvainsoluissa (S2C kuvio). Solujen proliferaatiota lukea ulos metabolinen aktiivisuus mitattiin MTT-määrityksellä. TheWERI-RB1 ja MCF7-solut osoittivat merkittävää soluproliferaatiota inhibitio EpApt-Siep, kun EpApt tai ScrApt yksinään eivät osoittaneet mitään vaikutusta solujen lisääntymistä (kuvio 2E).

EpICD perusterveydenhuollossa RB kasvaimia: sääntely syövän kantasolujen solumarkkereiden

EpCAM on osoitettu yli-ilmentyvän syövän aloittamista soluissa tai syövän esisolujen /kantasoluja (CPC /CSCS) [25-27]. Mekanismi takana Tämän hotellin säätelee intramembrane proteolyysin EpCAM johtaa EpICD vapautumista ja syrjäyttää sen tumaan [7] Meillä raportoitu läsnäolo EpCAM aikaisemmin vuonna 2004 ja nykyisessä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan ilmentymistä EpICD perusterveydenhuollossa RB kasvaimia [28]. IHC Tulokset osoittivat voimakasta tumavärjäystä ja intensiteetti tumavärjäystä vaihteli kasvaimet tutkittu. Kasvaimet osoitti 40-60% soluista positiivisia ja joissakin tapauksissa osoittivat 70-80%: lle positiivisten solujen tumavärjäystä. Normaali verkkokalvo tutkittiin ei paljastunut ilmeistä tumavärjäystä (kuvio 3A). Intensiteetti ja prosentuaalinen jakautuminen EpICD positiivisten solujen kasvain on esitetty taulukossa 1.

. Immunohistokemia normaalin verkkokalvon leikkaus, joka esittää mitään ilmeistä EpICD tumassa, RB kudosleikkeiden osoittaa voimakasta värjäytymistä ydin. Ilmentyminen EpICD on aikuinen havaittiin ytimen kasvainsolujen, kuten on esitetty valkoisilla nuolilla. B. kertainen muutos mRNA tasoilla Sox2, Oct4, Nanog, CD44S, CD133 ja Surviviinispesifisiä (BIRC5) kvantitoitiin SYBR green perustuu qPCR päässä Siep ja EpApt-Siep käsitelty WERI-RB1 solujen ja normalisoidaan p-2-mikroglobuliinin kuten taloudenhoito geeni. C. kertainen muutos mRNA tasoilla Sox2, Oct4 ja Nanog kvantitoitiin SYBR green perustuu qPCR päässä Siep ja EpApt-Siep käsiteltyjen MCF7-solut ja normalisoidaan p-2-mikroglobuliinin kuten siivous gene.Data edustaa keskiarvo ± SD. Kokeet toistettiin 3 kertaa itsenäisesti samanlaisia ​​tuloksia. ** P-arvo on ,01-,001; * P-arvo on +0,05-,01.

Vapautuneet EpICD muodostaa tumaproteiinin kompleksin vuorovaikutuksessa FHL2, β-kateniinin ja Lef1 välittää geenin transkriptioita ja tukien solujen lisääntymisen. Sääntely EpICD ilmenemistä pluripotenttisuuden merkkiaineiden raportoitu aikaisemmin [9] ja olimme kiinnostuneita tutkimaan modulaatioon EpCAM takana ilmaus Oct4, Sox2, Nanog, CD133, CD44s. Olemme lisäksi tutkineet surviviinin ilmentymiseen tasojen päälle vaiennettu EpCAM RB solulinjassa, WERI-RB1. EpCAM hiljentäminen käyttämällä siRNA transfektio tai EpApt-Siep osoittivat korkeampia downregulation Sox2, Oct4 ja Nanog siRNA transfektoiduissa soluissa verrattuna EpApt-Siep, kun taas CD133, CD44s ja surviviini tasot enemmän vaimentua in EpApt-Siep transfektoiduissa soluissa (kuvio 3B ). Olemme lisäksi tutkineet ilmaus Sox2, Oct4 ja Nanog MCF7-soluissa ja löysi downregulation Sox2 ja Nanog muttei Oct4 upon hiljentäminen EpCAM käyttämällä siRNA tai EpApt-Siep rakentaa (kuvio 3C). Näin pystyimme selvittämään sääntelyn kantasolujen merkkiaineiden EpCAM kautta EpICD.

EpApt-Siep taantua rintasyöpä:

In vivo

ksenografti tutkimus

Anti-kasvain vaikutus EpApt-Siep tutkittiin käyttäen rintasyövän

in vivo

mallissa. MCF7-soluja injektoitiin poistettiin munasarjat molemmilta puolilta nude-hiirissä täydennetty ulkoinen estrogeeni. Annostus EpApt-Siep suoritettiin toinen päivä alkaen day0 ja day14 ja day20, eläimille annosteltiin, 24 myöhemmin n = 4 lopetettiin jokaisesta ryhmästä. Kasvain kasvukinetiikat osoitti merkittävää vähentämistä (P 0,01) kasvaimen tilavuus, auton hallinnan osoitti 584mm

3, kun taas käsitelty eläin osoitti 52mm

3 kasvaimen keskimääräisen tilavuuden. Loput n = 4 hikkelikontrolliryhmään ja EpApt-Siep ryhmä, joille annostus day22 ja day24, edelleen tutkittiin till day33. Keskimääräinen kasvaimen volyymit day33, ajoneuvojen kontrolliryhmän ja EpApt-Siep olivat 922mm

3 ja 64mm

3 vastaavasti. Tuumorikasvun profiili sekä ryhmien tänä aikana on esitetty kuviossa 4A. Että% kasvaimen kasvun inhibitio (TGI) ja EpApt-Siep ryhmä on testattu annostaso havaittiin olevan 102% (Day33,

#indicates p 0,001). On day33, hiiret (kuvio 4B) tapettiin ja tuumorit poistettiin leikkauksella (kuvio 4C), jota seurasi analyysi ilmentymisen EpCAM ja syövän kantasolujen merkkiaineita, apoptoottisten päättäjät ja lääkkeille resistentti proteiinit tehtiin.

Kasvain kasvukinetiikat MCF7 Vieraslajisiirteen käsitelty EpApt-Siep. Nainen karvattomia hiiriä (Hsd: Kateenkorvattomiin Nude-Foxn1

nu, poistettiin munasarjat molemmilta puolilta) sijoitettuna Yksilöllisesti Ventilated Häkit (IVCs) käytettiin tässä tutkimuksessa. Tuumorigeenisyyden MCF7 solujen hiirissä on estrogeenista riippuvainen. Kaksikymmentä tuntia ennen MCF-7 cell injektio, eläimet istutettiin 17β-estradioli pellettien (0.36mg /pelletti, 60 päivän release, Innovative Research of America, Sarasota, FL) osaksi selkäpuolen lapaluun alueelle hiiriin käyttäen troakaari. MCF-7 tuumorisoluja (5 x10

6 solua /eläin) injektoitiin ihon alle kyljissä eläimiä. 7-10 päivän kuluttua injektion soluja, eläimet satunnaistettiin perustuu kasvaimen tilavuus (TV≈80mm3) ja annostelu aloitettiin. Kuvaaja, joka esittää (A) Kasvaimen tilavuus Vehikkeliverrokkiryhmä injektoitiin PBS ihon alle lähelle kasvaimen, EpApt-Siep injektoitiin ihonalaisesti lähelle kasvaimen joka toinen päivä. Oranssi nuolet osoittavat EpApt-Siep annettu injektio ja sininen Tähti osoittaa, jona uhri. Päivänä 21 ja 33, koska kokeellinen ja eettisistä syistä eläinten molemmista ryhmistä lopetettiin 50% kulloinkin. Valokuvia edustavan hiiren (B), ja leikattiin kasvaimet (C) ajoneuvon hallinnan ja käsitellyissä ryhmissä. D. Muutokset proteiinin ekspression Western-blottauksella proteiinien uuttamalla edustaja kudoksesta verrokkihiirten tai hiirillä, joita hoidettiin EpApt-Siep (0.6nmol) ja päättyy 21 ja 33 päivää vastaavasti (sen oikealla, kaavio edustaa suhteellinen ekspressio laskettiin ImageJ ohjelmisto. E. Kaavio muutokset MCF7 ksenografti- kasvainkudoksessa EpCAM, CD44s, CD24 ja MRP1 mRNA-tasot hoidon jälkeen kanssa EpApt-Siep rakentaa. vehikkelikontrolli käytettiin normalisoida kertaiseksi ilmaisun ja β-2 Mikrogiobuliinin käytettiin sisäisen valvonnan. F. Kaavio muutokset STMN, BIRC5, Bcl2, Bax ja ATM-mRNA-tasot hoidon jälkeen kanssa EpApt-Siep aptameeriin rakentaa normalisointi tehtiin sekä ajoneuvon ohjaus /ei hoitoryhmässä. Data edustaa keskiarvoa ± SE

in vivo

kokeessa (n = 8) ja keskiarvo ± SD muissa kokeissa. kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja merkitys laskettiin t-testillä. # P 0,001; ** P-arvo on 0,01-0,001; * P-arvo on 0,05-0,01.

vaikutus EpApt-Siep konstruktin ekspressio EpCAM ja muiden CSC markkereita tutkittiin välillä ajoneuvon hallinnan ja käsitellyn ryhmän (n = 2) kasvaimen osat kerätään day21 ja day33 vastaavasti. Voit tarkistaa vaikutuksen EpCAM hiljentäminen aiheuttama EpApt-Siep rakentaa, ilmaus EpCAM analysoitiin Western blot klo proteiini tasolla, lisäksi ABCG2 proteiinia mukana. Densitometrian analyysi osoitti 55% ja 60% EpCAM proteiinia downregulation in day21and day33 ryhmässä, kun taas ABCG2 proteiini osoitti 60% ja 85% downregulation vuonna day21 ja day33 vastaavasti EpApt-Siep käsiteltyjen näytteiden verrattuna ajoneuvon ohjaus (kuvio 4D).