Krooninen sairaus

tiivistelmä

hoitovaihtoehtoja myöhäisessä vaiheessa eturauhasen ja paksusuolen syöpä ovat rajalliset, ja on kiireellinen tarve kehittää tehokkaampia ja kohdennettuja Uusien hoitomuotojen , joka alkaa tunnistaminen ja validointi uusia terapeuttisia kohteita. Viimeaikaiset kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että kudos estäjä matriksimetalloproteinaasi-1 (TIMP-1) tasot ovat koholla syöpäpotilaan plasmassa ja kohonnut TIMP-1 arvot liittyvät huonompi kliinisiä tuloksia. On kuitenkin epävarmaa, TIMP-1 toimii pelkkänä biomarkkeri syövän etenemisen tai on funktionaalinen rooli syövän etenemiseen ja voi toimia syövän terapeuttinen tavoite, joka on tärkein tavoite tämän tutkimuksen. Tässä osoitamme, että strooman ihmisen eturauhas- ja paksusuolen syöpä ilmaista korkeampi TIMP-1 verrattuna normaaliin kollegansa ja lisääntynyt ilmentyminen TIMP-1 edistää

in vivo

kasvun molempien syöpätyyppeihin. Osoitamme ensimmäistä kertaa, että lisääntynyt TIMP-1 ilmentymisen stimuloi kertyminen syöpään liittyvän fibroblastien (valuuttalisiin) eturauhasen ja paksusuolen syöpä kudoksiin ja että TIMP-1 tehostaa eturauhasen CAF proliferaatio ja migraatio

in vitro

ja edistää ERK1 /2 kinaasiaktivaatiota näissä CAF soluissa. Tuloksemme vahvistaa uuden edistävää vaikutusta TIMP-1 syövän etenemisessä ja kertyminen valuuttalisiin joka puolestaan ​​antaa pro-kasvain microenvironment. Yhdessä nämä tulokset vahvistetaan potentiaalin TIMP-1 uutena kohteena syövän hoidossa ja taustalla oleva mekanismi pro-kasvain aktiivisuus TIMP-1.

Citation: Gong Y, Scott E, Lu R, Xu Y, Oh WK, Yu Q (2013) TIMP-1 Edistää kasaantuminen Cancer Associated fibroblasteja ja syövän etenemisessä. PLoS ONE 8 (10): e77366. doi: 10,1371 /journal.pone.0077366

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 02 syyskuu 2013; Julkaistu: 15 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Gong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Yhdysvaltain armeijan Medical Research (Department of Defense) avustuksen, W81XWH-10-1-0321. Rahoittajat ei ole roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Prognoosi metastasoituneen kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) on edelleen heikko, joiden elinajan mediaani on alle 2 vuotta. Hoitovaihtoehtoja loppuvaiheessa eturauhassyöpä ovat rajalliset ja on kiireellinen tarve kehittää tehokkaampia ja kohdennettuja Uusien hoitomuotojen [1-5]. Aikana syövän etenemistä, on tärkeää, että syöpäsolut kunnolla vuorovaikutuksessa ja menestyksekkäästi muuttaa niitä ympäröivän isäntä mikroympäristön. Syöpäsolut ovat vuorovaikutuksessa niiden mikroympäristön läpi solun pinnan adheesioreseptoreina ja reseptorit soluväliaineen (ECM) ja muuttaa niiden ympäristö pitkälti toimintaa matriisin metalloproteinaasien (MMP). MMP avainrooleja halventava ECM ja bioaktiivisuuksiin MMP säätelevät kudoksen metalloproteinaasien estäjiä (TIMP: t) [6]. On neljä jäsentä TIMP perheen, kudos estäjä matriksimetalloproteinaasi-1 (TIMP-1), -2, -3, ja -4. TIMP voi estää toiminnan kaikkien MMP mutta vaihtelevalla tehokkuutta kohtaan eri MMP. MMP tärkeitä rooleja kasvaimen levittämiseen ja etenemisen ja ne on perustettu terapeuttisia kohteita eri syöpätyyppien [6-8]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että TIMP kuten TIMP-1 näyttö syöpälääkkeen toimintaa [9-13]; kuitenkin, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, paradoksaalista pro-kasvain vaikutus TIMP-1 [6,14-16]. TIMP voi vaikuttaa syövän etenemistä on MMP-riippuvaista ja MMP-riippumattomalla tavalla, vaikka taustalla olevan mekanismin jälkimmäistä ei ymmärretä hyvin [17,18].

Monet laajakirjoinen MMP-inhibiittorit (MMPIs) kehittämä lääkeyhtiöiden testattiin prospektiivisessa kliinisessä tutkimuksessa ja tulokset ovat olleet tasaisesti pettymys. Lopullisia mekanistinen käsitys tällaisesta virheestä on perustettu. On kuitenkin todennäköistä johtui ymmärtämättömyys erillisten bioaktiivisuuksiin ja tehtäviä eri MMP, joka on sittemmin arvostettu paremmin niiden pro- ja /tai anti-kasvain toimintaa [6,19-22]. Nämä pettymystä myös korostaa paremmin ymmärtämään biologian syövän terapeuttisia kohteita ennen kliinisiä tutkimuksia. Viime aikoina useat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että TIMP-1 tasot syöpäpotilaan plasmassa ja syöpä kudokset ovat erittäin koholla ja kohonnut TIMP-1 arvot liittyvät huonompi kliinisiä tuloksia monissa syövän tyypit kuten eturauhas- ja paksusuolen syöpä [23-34]. On kuitenkin epäselvää, TIMP-1 toimii pelkkänä biomarkkeri syövän etenemisen tai toimintojen edistää syövän etenemisen samoin; ja näin voisi toimia tärkeänä syövän terapeuttinen kohde. Näitä kysymyksiä käsitellään tässä tutkimuksessa.

Tässä osoitamme, että strooman ihmisen eturauhas- ja paksusuolen syöpä ilmaista korkeampi TIMP-1 verrattuna normaalin kollegansa ja että lisääntynyt ilmentyminen TIMP-1 edistää

in vivo

kasvuun sekä syövän tyypit. Lisäksi osoitamme, että TIMP-1 tehostaa eturauhasen CAF proliferaatio ja migraatio

in vitro

taas pudotus TIMP-1 estää eturauhasen CAF proliferaatio ja migraatio. Lisäksi, TIMP-1 edistää aktivaation ERK1 /2 kinaasin näissä valuuttalisien. Samalla osoitetaan, että lisääntynyt ilmentyminen TIMP-1 stimuloi kertyminen syöpään liittyvän fibroblastien (valuuttalisiin) eturauhasen /paksusuolensyöpä kudoksiin. Yhdessä tuloksemme vahvistaa uuden edistävää vaikutusta TIMP-1 on syövän etenemiseen ja CAF kertymistä, potentiaalia TIMP-1 uutena syövän terapeuttisen kohteen, ja taustalla oleva mekanismi TIMP-1 vaikutukset.

Materiaalit ja menetelmät

Patient Cancer Näytteet, Cells, ja reagenssit

Ihmisen eturauhasen ja paksusuolen syöpä näytteitä saatiin Cooperative Human Tissue Network (CHTN) yliopistossa Pennsylvania ja Ohio State University. Ensisijainen eturauhassyövän liittyy fibroblastien (PCAFs) saatiin Asterand USA (Detroit) ja viljeltiin mukaan valmistajan ohjeiden. Ihmisen eturauhasen fibroblastit olivat peräisin ScienCell (HPrF, Carlsbad) ja viljeltiin fibroblastien Medium (FM, ScienCell). PC3, PC3 /M, DU145, 22RV1, LNCaP, Vcap, RWPE-1 ja WPE1-NB26-65 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ja HCT116 ja HT-29 ihmisen paksusuolen syövän soluja NCI (DTP, DCTD kasvain Repository) ja ATCC (Manassas) ja ylläpidetään seuraavien tarjoajien suosituksiin. Ihmisen eturauhassyöpä LAPC-4-solut saatiin ATCC-patentissa Depository.

Anti-V5-epitoopin (Invitrogen), -TIMP-1, -alfa sileän lihaksen aktiini (R D Systems.

käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR), ekspressiorakenteet, ja Virus transduktio

Täyspitkä TIMP-1 cDNA: t tuotettiin PCR: llä ja kloonattiin yhdessä niiden COOH-terminaalin v5 -epitooppi tunnisteita retrovi- ekspressiovektoriin pQCXIP (BD Biosciences) kuvatulla [35,36]. Kaikki ekspressiokonstruktit todennettiin DNA-sekvensoinnilla. Retroviruksia muodostetaan käyttämällä näitä ekspressiokonstruktien ja pVSVG in GP2-293 soluissa noudattamalla valmistajan ohjeita (BD Biosciences).

Ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (PC3, 22RV1, ja LAPC-4) ja ihmisen paksusuolen syövän soluja (HCT116 ja HT-29) oli transdusoitu retrovirusten tyhjänä retrovirus- ekspressiovektoriin (kontrolleina), tai TIMP- 1. Infektoidut solut on valittu niiden resistenssin puromysiinin ja yhdistettiin populaatioiden lääkeaineille eturauhas- ja paksusuolen syövän soluja ilmentymisen ohella tai ilman eksogeenisen v5-epitooppimerkityn TIMP-1 käytettiin kokeissa. Anti-V5-mAb (Invitrogen) käytettiin havaitsemaan ulkosyntyisen TIMP-1 (TIMP-1v5).

reaaliaikaiset kvantitatiiviset PCR (qPCR) B

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä Trizol reagenssia (Life Technologies, Carlsbad,) ja käytettiin cDNA: n syntetisoimiseksi Superscript III platinaa yhden askeleen qPCR kit ( Life Technologies). QPCR analyysit ihmisen TIMP-1-mRNA ilmaisu suoritettiin Taqman geenien ilmentyminen määritys (Hs00171558_m1) on ViiA7 reaaliaikainen PCR kone Taqman Universal 2 x master mix (Life Technologies). Geeni ekspressiotasot normalisoituivat endogeeninen aktiini ohjaus (aluke-rajoitettu koetin, Life Technologies).

ELISA-analyysi

TIMP-1 eturauhassyövässä soluviljelysupernatantit ja potilaiden seerumit mitattiin ihmisen TIMP-1 ELISA Duoset (R 0,05.

Tulokset

Serum TIMP-1 tasot ovat koholla eturauhassyöpäpotilailla miehiin verrattuna ilman syövän

Seerumin TIMP-1: n on raportoitu olevan koholla rinta-, maha-, paksusuolisyövän ja useita muita syöpätyyppejä. Tässä tutkimuksessa vertasimme seerumin TIMP-1 tasot 140 eturauhassyöpäpotilaille eri sairauksien vaiheissa ja 16 koirasta ilman tiedossa näyttöä eturauhassyövän lukien, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu sandwich ELISA. Tuloksemme osoittivat, että eturauhassyövän potilailla oli keskimäärin seerumin TIMP-1 pitoisuus 351,4 ng /ml, huomattavasti korkeampi kuin keskimääräinen pitoisuus 211,0 ng /ml nähty miehillä eturauhassyöpä palvelukseen peräisin urologian klinikan (

p

0,001) (kuvio 1A).

. Seerumin TIMP-1 on merkittävästi kohonnut eturauhassyöpäpotilailla (

p

0,001) mitattuna sandwich-ELISA (R 0,05. C-E. Kasvuluvut ihonalaisen eturauhasen kasvaimia peräisin PC3 (C), 22RV1 (D), ja LAPC-4 (E) soluja, jotka ilmentävät TIMP-1v5 tai transdusoitu tyhjän ekspressiovektorilla (valvonta) kuten paneelit. Kasvuluvut ilmaistaan ​​keskiarvona kasvaintilavuudet (mm

3) +/- SD. Kuusi hiirtä käytettiin kullekin transdusoitujen eturauhasen soluissa.

*

p

0,05.

TIMP-1 edistää kertyminen syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisiin) in vivo

saada tietoa mahdollisista mekanismin taustalla kasvua edistävän vaikutuksen TIMP-1 eturauhassyövässä teimme immunohistokemia (IHC) analyysit tuumorisektioiden niistä johdetut

in vivo

kokeiluja ja havaittiin, että tuumorisektioiden peräisin eturauhasen syöpäsolujen lisääntynyt ilmentyminen TIMP-1 näyttö lisääntynyt määrä valuuttalisien (kuva 3-top ja keskimmäinen paneeli). Valuuttalisiin todettiin käyttäen anti-alfa-sileän lihaksen aktiini (SMA) vasta-aine, joka on rutiininomaisesti käytetään korostamaan valuuttalisiin [40-42]. On hyvin tunnettua, että valuuttalisiin tärkeä rooli edistämisessä syövän etenemiseen ja välittävä terapeuttisia vastus [43,44] ja että valuuttalisiin liittyy suurentunut riski kasvaimen invaasion ja metastaasin [45-47].

Kasvain osat olivat peräisin PC3 /22RV1-ohjaus solujen ja PC3 /22RV1-TIMP-1-soluissa. Leikkeet värjättiin H 0,05.

Vahvista vaikutuksen TIMP-1 valuuttalisiin teimme samanlainen IHC analyysejä tuumorisektioiden johdettu

in vivo

tutkimuksissa HCT116 koolonsyöpien tai ilman lisääntynyt ilmentyminen TIMP-1. Olemme havainneet, että verrattuna siihen, kasvaimia, jotka ovat peräisin HCT116-kontrollisolut (kuvio S2A-C), lisääntyneen ekspression TIMP-1 (HCT116-TIMP-1) edistää kertyminen paksusuolen valuuttalisiin tuumoreissa (kuvio S2D-F). Yhdessä nämä tulokset tarjoavat ensimmäisen tukea uutta roolia TIMP-1 säätelemään CAF tunkeutumisen ja /tai laajentamiseen.

TIMP-1 edistää eturauhasen CAF solujen proliferaatio ja migraatio ja aktivoi Erk1 /2-kinaasien

paljastaa solumekanismin joka TIMP-1 edistää CAF keskittymisen ja syövän etenemisen

in vivo

, ensin arvioi vaikutukset medium (CM) johdettu 22RV1-ohjaus ja 22RV1-TIMP-1 solujen eturauhasen CAF proliferaatio ja migraatio. Olemme havainneet, että CM peräisin 22RV1-TIMP-1-soluja tehokkaammin edistää eturauhassyövän proliferaatiota ja transwell siirtyminen, kun sitä verrataan CM peräisin 22RV1-kontrollisolut (kuvio S3). Edelleen onko puhdistetaan TIMP-1 voidaan käyttää samankaltaisia ​​vaikutuksia eturauhasen valuuttalisiin, suoritimme lisäkokeita käyttäen puhdistettua ihmisen TIMP-1. Olemme havainneet, että TIMP-1 merkittävästi edistänyt leviämisen eturauhasen CAF mutta ei eturauhassyöpäsolujen (kuvio 6 AC), ja että TIMP-1 tehostaa merkittävästi liikkuvuutta näiden valuuttalisiin (kuvio 6D), mikä viittaa siihen, että TIMP-1-välitteisen kertymistä eturauhasen valuuttalisiin on todennäköisesti seurausta sekä suurempaa tunkeutumista ja laajeneminen eturauhasen valuuttalisiin sisällä kasvaimia.

A-C. Eturauhasen valuuttalisiin tai eturauhasen syövän solut ympättiin 2 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena. Eturauhassyöpä solu ja eturauhasen CAF leviämisen analyysit suoritettiin päivittäin käyttäen joukko 96-kuoppalevyillä käyttäen Esiseos WST1 (Takara) valmistajan ohjeita.

*

p

0,05. D. Eturauhasen valuuttalisiin arvioitiin niiden liikkuvuutta koko transwell esteen aikana 30 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa 250 ng /ml TIMP-1. 0,5 x 10

6 solua /ml eturauhasen valuuttalisiin sijoitettiin yläkammiot Transwell inserttien (Costar) kolmena kappaleena. Edustavat kuvat eturauhasen CAF solujen vaeltaneet kautta siirtokuoppaan inserttejä on esitetty. Eturauhasen valuuttalisiin vaeltaneet kautta siirtokuoppaan teriä 20 satunnaisesti valittua 200 x mikroskooppikentäs- laskettiin.

*

p

0,05. A-D, tulokset osoittavat edustavien avulla +/- SDS kolmen rinnakkaisen yksi kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

edelleen varmistamiseksi TIMP-1 vaikutukset eturauhasen valuuttalisiin, me pudotti TIMP-1 eturauhasessa valuuttalisiin (kuvio 7A) käytetään kahta eri shRNAs (Open Biosystems). Huomasimme, että TIMP-1 Knockdown estää eturauhasen CAF proliferaatio ja migraatio merkittävästi (kuvio 7B-C), mikä viittaa siihen, että TIMP-1 on tärkeä rooli säätelyssä CAF käyttäytymistä, joka puolestaan ​​moduloinnissa syövän etenemistä. Tämä käsite tuki lisäksi meidän havainto, että eturauhasen valuuttalisiin mutta ei eturauhassyövän solut ilmentävät korkeampaa TIMP-1-reseptorin, tetraspanin CD63. CD63 on glykosyloitu kalvoproteiini näyttämällä heterogeeninen molekyylipaino (kuvio 8A). TIMP-1 on havaittu aktivoivan pro-selviytymisen signalointia sitoutumalla CD63 /integriini-beeta-1-kompleksin rintojen epiteelisoluissa [49,50]. Olemme havainneet, että TIMP-1 parantaa ERK1 /2 aktiivisuus seerumia eturauhasen valuuttalisiin mutta ei syöpäsolujen (kuvio 8B-C), mikä viittaa siihen, että

in vivo

vaikutuksia TIMP-1 eturauhassyövän soluissa saattaa olla kohdistama kautta vaikuttavia eturauhasen valuuttalisiin välillisesti (kuva 9).

. Suhteellinen taso TIMP-1 eturauhasessa valuuttalisiin tartunnan ei-kohdistuksen shRNAs tai shRNAs vastaan ​​TIMP-1 arvioitiin ELISA ja tulokset osoittivat, että kaksi TIMP-1 shRNAs pudotti TIMP-1 ilmentymisen ~ 70% ja ~ 50%, vastaavasti. B. Eturauhasen valuuttalisiin ympättiin 4 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena ja eturauhasen CAF leviämisen analyysit suoritettiin päivittäin käyttäen joukko 96-kuoppalevyillä käyttäen Esiseos WST1 (Takara).

*

p

0,05. C. Eturauhasen valuuttalisiin arvioitiin niiden liikkuvuutta koko transwell esteen aikana 30 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa 250 ng /ml TIMP-1. 1 x 10

6 solua /ml eturauhasen valuuttalisiin sijoitettiin yläkammiot Transwell inserttien (Costar) kolmena kappaleena. Eturauhasen valuuttalisiin vaeltaneet kautta siirtokuoppaan 20 satunnaisesti valittua 200 x mikroskooppikentäs- laskettiin.

*

p

0,05.

. Expression of CD63-proteiinia erilaisissa ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, ihmisen eturauhasen fibroblasteissa (HPrF), ja ihmisen eturauhasen valuuttalisiin (PCAFs) määritettiin western-blottauksella käyttämällä anti-CD63-vasta-aine, joka tunnistaa heterogeeninen glykosyloitu CD63-proteiinia. Aktiini käytettiin verrokkina Proteiinilisäyksen (alempi kuva). B-C. Seerumin puutteessa eturauhasen CAF-soluja (B) ja 22RV1 syöpäsolujen (C) on mukana seerumittomalla väliaineella (SFM), tai SFM joka sisälsi 250 ng /ml TIMP-1 3 ja 12 tuntia. Solut hajotettiin ja proteiinit analysoitiin Western-blottauksella käyttäen anti-fosfo-ERK1 /2 tai anti-fosfo-AKT-vasta-aineita (ylempi paneeli), tai anti-ERK1 /2 tai anti-AKT-vasta-aineita (alapaneelit).

: Lisääntynyt ilmentyminen TIMP-1 kasvainsolujen ja valuuttalisiin johtaa lisääntyneeseen CAF proliferaatio ja migraatio sitoutumisen kautta TIMP-1 on TIMP-1-reseptorin, CD63 ekspressoituu valuuttalisiin, joka johtaa kertymiseen of valuuttalisiin sisällä syövän kudoksissa.