Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant mikro-RNA (miRNA) ilmentyminen on patogeneesiin syövän. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-17-92 klusteri on yli-ilmentynyt useissa syöpätyypeissä. Kasvaimia synnyttävän toiminnon kypsä miRNA koodaa miR-17-92 klusteri on tunnistettu 5 ’varren kuusi esiasteita. Kuitenkin toiminta miRNA tuotettu 3′-haaran näiden lähtöaineiden edelleen tuntematon. Tämä tutkimus osoittaa, että miR-17 * pystyy tukahduttamaan kriittisten ensisijainen mitokondrion antioksidanttientsyymejä, kuten mangaani superoksididismutaasi (MnSOD), glutationiperoksidaasia-2 (GPX2) ja tioredoksiini reduktaasi-2 (TrxR2). Transfektio miR-17 * osaksi eturauhassyöpä PC-3-solujen vähentää merkittävästi tasoilla kolmen antioksidantin proteiineja ja toimintaa lusiferaasireportterigeenin valvonnassa miR-17 * sitovia sekvenssejä, joka sijaitsee 3’-alueet kolmesta kohdegeenien . Disulfiraami (DSF), joka on dithiolcarbomate lääkkeen osoitettu olevan syövän vastainen vaikutus, indusoi tason kypsän miR-17 * ja solukuoleman PCa soluja, jotka voidaan vaimentaa transfektoimalla antisense miR-17 *. Lisääntyvä miR-17 * taso PC-3-soluissa Tet-on perustuva ehtolauseke järjestelmä merkittävästi tukahduttaa sen tumorigencity. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-17 * voi estää kasvainten muodostumiseen eturauhassyövän estämällä mitokondrion antioksidanttientsyymejä.

Citation: Xu Y, Fang F, Zhang J, Josson S, St. Clair WH, St. Clair DK (2010) miR-17 * Estää tuumorigeenisyystesti Eturauhassyöpä estämällä Mitokondrioiden Antioksidantit Entsyymit. PLoS ONE 5 (12): e14356. doi: 10,1371 /journal.pone.0014356

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 20 lokakuu 2010; Julkaistu: 22 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health avustuksen CA115801 William H. St. Clair ja myöntää CA 049797 ja Daret K. St. Clair. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Micro RNA (miRNA), ~22 nukleotidin RNA-molekyylejä, jotka yleensä tukahduttavat käännös kohde RNA: iden, on mukana eri osa physiogenesis ja synnyssä [1] – [2]. MIR-17-92 klusterin koodaa kuusi miRNA, mukaan lukien miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1, ja miR-92, jotka on monistettu enemmän syöpätyyppien kudosten kuin vastaavat normaalit kudokset [3] – [5]. Esikasvaintekijän c-MYC up-säätelee transkription miR-17-92 klusteri ja johtaa alas-säätely E2F1 by miR-17 [6], on PTEN jonka miR-19 [7], sekä RB1 by asennuspalveli- 20a [8], viittaa siihen, että miR-17-92 toimii onkogeenistä tekijä. Tähän mennessä suurin osa miRNA tunnistettu, joilla on kyky muuttaa fenotyyppiä ja syövän kehittymisen syntyvät 5 ’varren miRNA esiasteita. Kuitenkin tuotanto ja toiminta 3 ”varsi miRNA (miRNA *) jäävät hämäräksi.

vapautuminen redox tila on mukana erilaisissa pathogeneses kuten syövän. Reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotetaan happea aineenvaihdunta on detoksifioi useita antioksidantti reittejä [9]. Mitokondrioiden antioksidanttientsyymejä, kuten mangaani superoksididismutaasi (MnSOD), glutationi-riippuvaisten peroksidaasi (GPX) ja thioredoxin- riippuva peroksidaasi (TrxR2), käsittävät ensisijaisesti puolustusjärjestelmää mitokondrioita ja ovat välttämättömiä vieroitus vastaan ​​ROS [10] – [12]. Seuraus korkea aineenvaihdunta nopeasti kasvavien syöpäsolujen on nopea sukupolven matkapuhelinverkon ROS. Syöpäsolut edellyttävät siksi korkea antioksidantti puolustusjärjestelmää selviytymään korkea ROS tuotanto [13], [14]. Täten selektiivinen esto antioksidantti järjestelmät on vaihtoehto syövän väliintulon.

Eturauhassyöpä (PCA) on yleinen sairaus Pohjois-Amerikan miehillä. Koska PCa kehittää kastraatio kestävä fenotyyppi, tasot antioksidantti proteiinien lisätään ja korreloivat hankkia valmiuksia, kuten omavarainen kasvu, vähennetään apoptoosin, jatkuva angiogeneesi, parannettu invaasio ja etäpesäkkeiden sekä syöpäsolun vastustuskykyä hoitoon [15 ] – [17]. Tässä tutkimuksessa käytämme neljää toisiaan täydentävää lähestymistapaa tunnistaa välittäjiä kasvaimen painava vaikutus miR-17 *. Tulokset osoittavat, että tukahduttaminen mitokondrioiden antioksidanttientsyymejä on mekanismi tuumorisuppressorigeenin funktio miR-17 *. Tämä on ensimmäinen raportti, joka paljastaa yhteyden oksidatiivisen stressin ja tuumorisuppressorigeenin roolia miRNA tuotetun 3’käsivarsi miR-17-92 klusteri.

Tulokset

miR-17 * tukahduttaa kolme mitokondrioiden antioksidantti proteiineja

Useat tutkimukset ovat raportoineet, että miR-17 ilmentyy voimakkaasti pahanlaatuiset kasvaimet mukaan lukien PCA mutta taso sen kumppanin, miR-17 *, on yleensä alhainen syöpiä [18 ]. Tämä todiste ennustaa, että tasot miR-17 ja miR-17 * ovat säädellään eri tavalla ja että suhde kahden miRNA saattavat olla tärkeitä sääntely erilaista kohdegeenien aikana tuumorigeneesin. Ilmaisut Molempien miRNA eri eturauhasen soluissa, sisältää normaalit epiteelin, strooman, virus- muuttaneet, androgen reagoiva ja androgeenista riippumaton PCa soluja, kvantitoitiin reaaliaikaisen RT-PCR. Taso miR-17 ja suhde miR-17 miR-17 * PCA soluissa olivat korkeammat kuin tasot ei-syöpäsoluja (Fig. 1A). Etsimällä miRbase, huomasimme, että MnSOD, Gpx2 ja TrxR2, kolme tärkeää mitokondriaalisen antioksidantti proteiineja, jotka ovat välttämättömiä vieroitus O

2

.- ja H

2O

2, ovat mahdollisia kohteita miR -17 *. Voit tarkistaa, että miR-17 * pystyy tukahduttaa antioksidantti proteiineja, kypsä miR-17 * transfektoitiin PC-3-solut, joilla on alhainen endogeenisen miR-17 *. Ilmaisua kolmen antioksidantin proteiinit pelkistettiin transfektoitu miR-17 * annoksesta riippuvalla tavalla. Kun taas transfektio ohjaus miRNA ja antisense miR-17 * ei ollut mitään vaikutusta tavoitteet (Fig. 1 B), oksidatiivisen stressin ärsykkeille kuten sytokiinit voivat indusoida

SOD2

geenin aktivaation kautta NF -κB signalointireitin [19]. Transfektio miR-17 * merkittävästi tukahdutettu TNFa-indusoidun

SOD2

ilmentymisen annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 1C). Sen varmistamiseksi, että vähentäminen antioksidantti proteiinien miR-17 * välittyy translaation tukahduttaminen, 3′-transloimattomat alueet, mukaan lukien oletetun miR-17 * kohdistaminen sivustoja koodaavien geenien kolmen antioksidantti entsyymejä, kloonattiin alavirtaan reportterigeeni. Ajoneuvo ja miR-377 kohdistaminen sivusto sijaitsee 3’untranslated alueella

SOD1

geeni sisällytettiin vehikkelikontrollina ja nonself negatiivisen kontrollin. Kuten on esitetty kuviossa. 1D, kloonattu miR-17 * kohdesekvenssien ovat välttämättömiä tukahduttamisesta reportteri vastausten transfektoitujen miR-17 *.

, tasot miR-17 ja miR-17 * ilmaistuna PCa ja säätökennotyyppi linjat mitattiin RT-PCR: llä. Suhde miR-17 miR-17 * kussakin solulinjassa esitetään. B ja C, transfektointi miR-17 * PC-3-solujen validoimiseksi tehtävänsä tukahduttaa ilmaisun antioksidantti proteiinien ja vähenevät TNF-välitteisen MnSOD induktio. D, tukahduttava vaikutus miR-17 * on antioksidantti proteiineihin arvioidaan kvantitatiivinen lusiferaasireportterilla määritys. RNU24 ja β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan normalisoida miRNA tasolla (A), proteiini tasot (B ja C). Kuvat normalisoituivat sisäisen valvonnan ja sitten normalisoidaan PrEC (A), jonka ohjaus miRNA (B), ja missään TNF-hoidon (C). β-gal-aktiivisuus normalisointiin käytettiin lusiferaasireportterigeenin toimintaa (D). Kolme näytettä (n = 3) käytettiin kokeissa ja kertamuutoksia Western blot on esitetty. * (P 0,05) ja ** (p 0,01) osoittavat merkitykset verrattuna säätimet: PrEC (A), ohjaus miRNA (B) ja (D), ja käsittelemättömät näytteet (C).

DSF indusoi miR-17 * ilmentymisen

DSF on dithiolcarbomate lääke, joka on osoitettu tukahduttaa syöpä fenotyypit indusoimalla apoptoottisen reitin [20]. Huomasimme, että DSF estää kolme antioksidantti proteiinit PCA soluissa. Sen jälkeen, kun PC-3 ja DU-145-soluja käsiteltiin DSF 24 h, vähentää tasojen antioksidantti proteiinien vastasi merkittävästi pitoisuuksien DSF (Fig. 2A). Kuitenkin mRNA-tasot antioksidantti geenejä ei ole muuttunut DSF-käsitellyissä soluissa (Fig. 2B). Mielenkiintoista on, että RT-PCR ja Northern blot osoittaa, että DSF indusoi miR-17 * mutta sillä ei ole vaikutusta ekspressiotasot miR-17 (Fig. 2C). Induktion miR-17 * by DSF vahvistaa lisäksi toimittaja vastauksia, joita säännellään miR-17 * kohdennussekvenssiä (Fig. 2D). Lisäksi sen varmistamiseksi, että negatiivinen vaikutus DSF ilmenemistä antioksidantti proteiinien välittyy induktion miR-17 *, PC-3-solut transfektoitiin antisense HSA-miR-17 * seuraa DSF käsittely. Tulokset osoittavat, että antisense-HSA-miR-17 * pystyy vähentämään DSF vaikutus (Fig. 2E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vähentäminen antioksidantti proteiinien DSF tapahtuu, ainakin osittain, kautta miR-17 * välitteinen translaation tukahduttaminen.

PCA solut käsiteltiin DSF ilmoitetuilla pitoisuuksilla. Tasot kolmen antioksidantin proteiinit mitattiin Western blotit. B, mRNA-tasot kolmen antioksidantin geenit kvantitoitiin RT-PCR: llä. C, tasot miR-17 ja miR-17 * in DSF-käsiteltyjen solujen määrä määritettiin RT-PCR: llä. MIR-17 * tasot vahvistettiin Northern blotit. D, vaikutus DSF-indusoidun miR-17 * on toimittaja vasteet määritettiin. E sen jälkeen, kun transfektoituja anti-miR-17 *, PC-3-soluja käsiteltiin DSF. Vaikutus anti-miR-17 * palauttamiseen antioksidantti proteiineihin kvantifioitiin Western blotit. β-aktiini käytettiin normalisoimaan proteiinien tasoja (A), (E), ja mRNA (B). Kansi muutokset on merkitty. RNU24 käytettiin normalisoimaan tasot miR-17 ja miR-17 * (C). β-gal-aktiivisuus normalisointiin käytettiin lusiferaasireportterigeenin toimintaa (D). Kolme näytettä (n = 3) käytettiin kokeissa (lukuun ottamatta Northern blot). * (P 0,05) ja ** (p 0,01) osoittavat merkitykset verrattuna ei DSF hoitoa (A), (C), (D), ja niitä verrattiin ei DSF eikä miRNA transfektoiduissa näytteissä, (E).

miR-17 * indusoi solukuoleman PCa soluissa

Määritä DSF myrkyllisyys PCA soluihin, PC-3 ja DU-145-soluja käsiteltiin DSF ja viljeltiin kunnes muodostuneiden pesäkkeiden. Koska solutiheys käytetään pesäkkeiden muodostumisen analyysi oli 100-kertaa vähemmän kuin tiheys kuviossa. 2, pitoisuusalueella DSF vähennettiin 100-kertaisesti pesäkemuodostusta kokeita. Tulokset hengissäsäilymisosuus osoittavat, että PCa solut ovat erittäin herkkiä DSF. Yli 95% soluista oli kuollut käsittelemällä 1 uM DSF (Fig. 3A). Tarkistaa, onko miR-17 * edistää DSF-välitteistä solukuolemaa, PC-3-solut transfektoitiin miR-17 * ja anti-miR-17 * ennen DSF hoitoa. Yhdyskunnan eloonjäämiseen analyysi osoittaa, että miR-17 * parantaa toksisuutta DSF, kun taas anti-miR-17 * voi pelastaa solut DSF vaikutus (Fig. 3B). Edelleen varmistaa, että vähentäminen antioksidantti proteiinien on merkittävä syy toksisuutta miR-17 *, PC-3-solut ko-transfektoitiin miR-17 * ja cDNA ektooppisesti ilmentävät kolme antioksidantti proteiineja, jotka eivät ole alttiita asennuspalveli- 17 * sääntelyä. Sytotoksisuus analyysi trypaanisiniekskluusiolla määritys osoittaa, että ilmentymisen kolmen antioksidantin geenien pelastaa solun elinajan toksisuutta miR-17 * (Fig. 3C). Vastaavat tasot antioksidantti proteiinien transfektoitujen PC-3-solut varmistettiin Western-blotit (Fig. 3d).

A PCa solut käsiteltiin DSF ilmoitettuina pitoisuuksina pesäkkeiden eloonjäämisen analyysiä. Muodostuneet pesäkkeet laskettiin ja piirrettiin log mittakaavassa. B, PC-3-solut transfektoitiin miR-17 * ja ohjaus miRNA ennen DSF hoitoon. Vaikutukset miR-17 * ja antisense miR-17 * on yhdyskunnan eloonjäämiseen määritettiin. C ja D, miR-17 * on kotransfektoidaan konstrukteja ilmentymisen kolmen antioksidantin proteiineja. Yli-ilmennetty antioksidantti Proteiinit vahvistettiin Western blotit β-aktiini normalisoinnin ja kertamuutoksia on merkitty (D). Suojaavia vaikutuksia transfektoitujen antioksidantti entsyymien soluja vastaan ​​miR-17 * toksisuudesta määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä (C). Kolme näytettä (n = 3) käytettiin kokeissa. * (P 0,05) ja ** (p 0,01) osoittavat merkitykset kuin verrattuna kontrolliin miRNA näytettä (B) ja verrattuna vehikkelikontrolliin näytettä (C), (D).

asennuspalveli- 17 * estää tuumorigeenisyyden Eturauhassyövän

vaikutuksen määrittämiseksi miR-17 * kasvaimen kasvua, sekvenssi kypsän miR-17 * kloonattiin Tet-on perustuvat lentiviraalinen ekspressiovektoriin. Lentivirus ilmentävät miR-17 * oli transduktoi- osaksi PC-3-soluja, ja stabiili solulinja, jossa on Tet-on perustuvat RFP ilmentymisen todettiin. Vaikutus miR-17 * kolmesta antioksidantti proteiinit alle Tet-on indusoituva olosuhteissa vahvistettiin Western blotit (Fig. 4A). Hiiren ksenografti kasvain mallia käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi miR-17 * kasvaimen kasvua. Kun klooni injektoidaan subkutaanisesti nude-uroshiirillä, ilmentyminen miR-17 *

in vivo

aiheutettiin antamalla Dox sisälsi vettä. Ajoneuvon kontrolli otettiin mukaan ohjata toksinen vaikutus Dox. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, keskimääräinen aika kasvaimet päästä 500 mm

3 ajoneuvon ohjaus ja miR-17 * ilman Dox kontrolliryhmissä on 12-13 päivä (ajoneuvon hallinnan ilman Dox, 12,2 ± 2,1; auton ohjaus Dox, 12,3 ± 2.8, ja miR-17 * ilman Dox, 12,6 ± 2,8). Huomattavaa on, että päivien varten miR-17 * kanssa Dox ryhmä tavoittaa 500 mm

3 kasvaimen koko on 24 ± 4,9, joka on kaksi kertaa niin kauan kuin verrokkiryhmässä. Jatkuvasti mitata kasvaimen kasvua, hiiret kontrolliryhmässä ryhmissä pidettiin 18 päivää injektion jälkeen, kun kasvaimen koko saavutti suurimman sallitun koon 2000 mm

3. Kasvain kasvu kuvassa. 4C osoittavat, että kasvaimen kasvu miR-17 * kanssa Dox ryhmän viivästyi huomattavasti verrattuna kasvaimen kasvun kontrolliryhmiin. Voit tarkistaa, onko ilmaus miR-17 * johtavat pienempään antioksidantti proteiinien miR-17 * ilmaisi tuumorikudoksia, tasot miR-17 * ja toimintaa antioksidantti entsyymien kasvaimen kudokset määrällisesti. Vastaavat kohonneeseen miR-17 * on Dox-hoidetussa ryhmässä, toimintaa kolmen antioksidanttientsyymejä vähenivät merkitsevästi verrattuna käsittelemättömän ryhmän (Fig. 4D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen miR-17 * PC-3 solujen vähentää tuumorigeenisyyteen, ainakin osittain, estämällä mitokondrioiden antioksidantti toiminto. Tämä tulos viittaa siihen, että toisin kuin onkogeenisen vaikutus miR-17, miR-17 *: lla on tuumoria tukahduttavan rooli PCa soluissa.

A, on-miR-17 * kloonattiin Tet-on lentivirus vektori ja vakaasti transected osaksi PC-3-solut. Klooni testattiin RFP seulonnan mukaisesti Dox- induktiivinen olosuhteissa ja sitten varmistettiin mittaamalla ilmentyminen kolmen kohdegeenien käyttäen Western-blotteja, joissa β-aktiini normalisointi. B ja C, luotu klooni injektoitiin nude-hiirissä määrittää sen kasvainten muodostumiseen. Ajoneuvo kontrolli oli mukana. Päivien määrä tarvitaan kasvaimen koon päästä 500 mm

3 on esitetty (B) ja laskettiin kasvaimen kasvuvauhti (C). D, kokonais-RNA ja proteiinit eristettiin kasvainkudoksessa ja taso miR-17 * ja vastaavaa toimintaa kolmen antioksidantin proteiinit kvantitoitiin. Kolme näytettä (n = 3) käytettiin testauksessa syntyy miR-17 * indusoituva klooni (A). Yhdeksän vehikkelikontrollieläimiin (n = 9) kanssa tai ilman DOX hoitoa ja kahdeksantoista miR-17 * ilmaistuna eläimet (n = 18) kanssa tai ilman DOX hoitoa käytettiin testata vaikutusta miR-17 * kasvaimen kasvuun (B), (C), (D). * (P 0,05) ja ** (p 0,01) osoittavat merkitykset verrattuna ilman DOX ohjaus (A) ja (C).

Keskustelu

miRNA yleensä toimii posttranskriptionaalisella repressori, jonka ajatellaan olevan tärkeä mekanismi geenisäätelyn. miRNA biogeneesissä sisältää kanoninen ensisijainen miRNA transkriptio, Drosha /Dicer välittämän pilkkoutumisten ja kertautuvat etuoikeutetut valinta kautta Argonaute (AGO) proteiinit [21]. Kun yksi säie valitaan tukahduttamisesta tavoitteiden, sen kumppani säie oletetaan hajoavan [22]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat havainneet sekä miR-17 ja miR-17 * monenlaisissa ihmisen kudoksissa [23]. Kaikissa testatuissa solulinjoissa, tuloksemme osoittavat, että miR-17 * on läsnä alhaisemmalla tasolla kuin miR-17. Kuitenkin tasot molempien miRNA ovat korkeammat PCa soluja kuin kontrollisoluissa (tuloksia ei ole esitetty). Koska taso miR-17 on suurempi kuin miR-17 * suhde miR-17 miR-17 * PCA-soluissa on lisääntynyt, mikä viittaa siihen, että miR-17 on edullisesti valittu nauha, vaikka molemmat miR-17 ja miR -17 * esiasteita puhtaaksi. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että AGO1 välittää miRNA tuotantoa Drosophila, kun AGO2 liittyy miRNA * tuotantoon [24]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla AGO säätelee miRNA biogeneesin on määritettävä paljastaa etuoikeutetut kertyminen miRNA säikeiden eri olosuhteissa.

Tuloksemme osoittavat, että miR-17 * tukahduttaa kasvainten muodostumiseen Eturauhassyövän soluja, mikä viittaa siihen, että toiminto Mir-17 * on vastakkainen onkogeenisen toiminta miR-17. Ilmentäminen miR-17-92 klusteri on tarkoin säädeltyä vasteena solujen väliset ja solun ympäristöissä. Transkriptio tämä klusteri on säädelty c-Myc Hapettavissa olosuhteissa [25] ja alas-säädellä p53 hypoksiaolosuhteissa [26]. Mielenkiintoista, DSF, joka on dithiolcarbomate, indusoi vain taso miR-17 * eikä miR-17. Tämä selektiivinen induktio on sopusoinnussa kasvain tukahduttava vaikutus miR-17 * ja on sopimukseen aiemman toteamisesta DSF indusoi apoptoosin syöpäsoluissa [20]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että DSF voi olla tehokas syöpälääke, osittain induktion miR-17 *.

miRNA-pohjainen geenin repression katsotaan olevan ratkaiseva säätimen ohjaamiseksi solun kohtalon. Se on kuitenkin monimutkainen säätöjärjestelmä, koska yksi geeni voidaan säätää useita miRNA ja yksi miRNA on monia eri tavoitteita. Yleensä vaikutus miRNA geenien asetus riippuu tietyssä kudoksessa tyyppejä, kehitys statukset tai ärsykkeitä. Siten tunnistaminen miRNA tavoitteiden on kriittinen määritellä todelliset toiminnot miRNA fysiologisissa tai patologisia tiloja. Tutkimuksemme osoittaa, että miR-17 * on negatiivinen säätelijä kolmesta tärkeästä antioksidanttientsyymejä sijaitsevat mitokondrioissa. Nämä antioksidantti entsyymit ovat pääkomponentit ensisijaisen antioksidanttisysteemiä ja ne toimivat yhdessä turvallisesti poistaa ROS syntyy mitokondrioissa. Inhibitio Näiden proteiinien pitäisi näin ollen kertyminen ROS, jolloin sytotoksisuuteen. Tulosten perusteella näyttää uusi terapeuttinen lähestymistapa parantaa solukuoleman miR-17 * kohdistaminen. Lisäksi äskettäisessä tutkimuksessa osoitettiin, että miR-17 kykenee hiljentää HIF-1α ilme, transkriptiotekijä ylläpidosta redox homeostaasin ja solujen eloonjäämistä hypoksisissa olosuhteissa [27]. Yhdessä nämä havainnot ennustaa, että suhde miR-17 miR-17 * voi olla tärkeä rooli sääntelyn solujen redox tilan.

Vaikka Warburg vaikutus, korkea aerobinen Glykolyysivaiheen kasvaimissa, on havaittu eri syöpätyyppien, syövät ovat toiminnallisia mitokondrioita, ja mitokondriaalisen hengityksen on tarpeen syövän solujen proliferaatiota [28]. Lisäksi syöpäsolut on korkea ROS ja myös ilmaista korkea antioksidantti proteiinien myrkyllisyyden koholla hinnat ROS sukupolvi [29]. Esimerkiksi MnSOD ilmentyy korkealla tasolla aggressiivinen PCa soluissa, joka on välttämätön suojelu Eturauhassyövän soluja vastaan ​​säteilyn aiheuttamien ROS [30]. Näin ollen, liipaisu pro-apoptoottisten signalointireittien kohdistamalla mitokondrioita antioksidantti entsyymejä voidaan myös pitää syövän terapeuttinen strategia. Tuloksemme, jotka osoittavat, että miR-17 * eston mitokondrioiden antioksidantti proteiinien tukahduttaa kasvainten muodostumiseen Eturauhassyövän soluja in vivo, tarjoavat kokeellista näyttöä proof-of-concept joka miRNA * voi toimia tuumorisuppressorina estämällä mitokondrion puolustusvalmiuteen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja solujen myrkyllisyys analyysi

PrEC, ihmisen eturauhasen epiteeli- ensiöparit (Cambrex Corp.), ja kyseistä luottoa, ihmisen eturauhasen strooman soluja (Clonetics), kasvatettiin PrEBM väliaineessa (Lonza). PZ-HPV-7, HPV-18 transformoidut ihmisen eturauhasen epiteelisoluissa (American Type Culture Collection, ATCC), kasvatettiin Keratinosyyttien-SFM-alustassa (Invitrogen). Ihmisen epiteelikarsinooma solujen LNCaP, DU-145 ja adenokarsinooma PC-3-solut (ATCC) kasvatettiin RPMI-alustassa (Invitrogen), joka sisälsi 10% FCS: ää (Hyclone). Pesäkkeenmuodostus määritystä käytettiin määrittämään myrkyllisyyden miR-17 * PCA-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille alhaisina tiheyksinä. Indusoimaan miR-17 * ilmaisu, PCa solut käsiteltiin DSF pitoisuutena alueella 0-1 uM 24 tuntia. Pesäkkeet pestiin 1 x PBS: llä ja värjättiin kristalliviolettimäärityksessä väriainetta. Elossa fraktio laskettiin suhde muodostuneiden pesäkkeiden määrästä ja solujen lukumäärä tehokkaasti päällystetty. Trypaanisiniekskluusiolla määritystä käytettiin määrittämään suojaavia vaikutuksia lisääntynyt antioksidanttientsyymejä myrkyllisyydestä miR-17 *. Solut kotransfektoitiin miR-17 * ja ekspressiorakenteiksi kolmen antioksidantin geenejä. Viljelyn jälkeen 48 tuntia, transfektoidut solut värjättiin 0,4%: trypaanisinivärin ja laskettiin käyttäen Vi-Cell-solujen elinkelpoisuus analysaattori (Beckman Coulter).

Micro RNA ilmaisu reportterimääritys

sen testaamiseksi, miR-17 * säätelee ilmentymistä kohde- geenien 3′-alueiden kohdegeenien, joka sisältää otaksutun miR-17 * sitoutumiskohtia kloonattiin välillä

Sac

I ja

Hind

III sivustoja pMIR-reportteri vektorin (Ambion). Luotu miRNA ilmaisu toimittaja konstruktit kotransfektoitiin β-gal sisäisen valvonnan vektorin (Ambion) osaksi PC-3-soluja käyttäen lipofektamiinia (Invitrogen). Viljelyn jälkeen 36 tuntia, solut kerättiin; lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen Luciferase Assay Kit (Promega); ja β-gal-aktiivisuus mitattiin käyttäen kloorifenolit red-a-D-glactopyranoside mononatriumsuola substraattia (Roche Molecular Biochemicals). Suhteellinen lusiferaasi vasteet arvioitiin β-gal-normalisoitu lusiferaasiaktiivisuutta.

Expression of miR-17 *

lisätä miR-17 * tason PCA soluissa, miR-17 * molekyylejä ja valvonta (Ambion) transfektoitiin soluihin käyttämällä Oligofectamine (Invitrogen). Indusoimaan miR-17 * ilmentymisen PCa, solut käsiteltiin disulfiraamin (Sigma), jonka konsentraatio on 0-100 uM 24 tuntia. Vakaasti ilmentämään miR-17 * PCA-soluja, kypsät miR-17 * sekvenssin kesti Drosha ja Dicer pilkkomiskohdat kloonattiin Tet-on indusoitavissa lentivirusvektori, TRIPZ (Open Biosystems) käyttäen Xho I: n ja EcoRI-sivustoja. Sekvenssi insertin sisältävän miR-17 * (esitetty alleviivaus) on CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGAACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACAAGTGCCTTCACTGCAGTCTGCCTACTGCCTCGGAGAATTC. Kloonatun miR-17 * pakattiin käyttäen translentiviral pakkausjärjestelmä (Open Biosystems). MIR-17 * lentivirus konsentroitiin ja titrattiin ennen transduktio soluihin alle 2 ug /ml puromysiiniä selektiivisissä olosuhteissa. MIR-17 * klooni edelleen valittu Tet-on indusoituvan ilmentymisen punainen fluoresoiva proteiini (RFP) tag käyttäen väliainetta, joka sisälsi 1 ug /ml doksisykliiniä (Dox). Stabiili klooni todennettiin seulomalla ilmentyminen tavoitteet käyttäen Western-blotteja.

ilmentäminen antioksidanttientsyymejä

pelastaa solun elinajan toksisuutta miR-17 *, cDNA rakentaa ilmentämiseen kolme antioksidantti proteiinit transfektoitiin PC-3-solujen ennen DSF hoitoa. Ektooppisesti ilmaistuna antioksidantti proteiineja ei vaikuta on-miR-17 *, koska cDNA-konstruktit eivät ole 3′-untranslational alueilla, joissa sitoutumiskohdat tunnistetaan varten on-miR-17 * sitova.

Eläimet

Neljä viikkoa vanhoja koiraspuolisia NCRNU (nu /nu kateenkorvattomia nude) hiiret hankittiin Taconic (Hudson, NY). 10

6 solua sekoitetaan matrigeelin (BD Biosciences) injektoitiin oikeaan kylkeen hiirten. Injektoitu hiiret jaettiin kahteen ryhmään: kaksi päivää ennen injektiota, yksi ryhmä hiiriä alkoi juoda vettä, joka sisälsi 2 mg /l doksisykliiniä ja kontrolliryhmän edelleen juoda säännöllisesti vettä. Kasvaintilavuudet laskettiin käyttäen normaalia kaavaa (A × B

2 x 0,52, A ja B edustavat lävistäjä kasvain pituudet).

Western blotit

Proteiinit uutettiin viljellyistä soluista ja tuumorikudoksissa, kuten aiemmin on kuvattu (11) ja 100 ug uutettiin proteiineja elektroforeesi 8% (w /v) SDS-PAGE-geelissä, siirrettiin nitroselluloosakalvolle, minkä jälkeen sitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita MnSOD (Upstate Biotech). , Gpx2 (Abcam), TrxR2 ja β-aktiini (Santa Cruz Biotech). Western blotit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla järjestelmä (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).

Reaaliaikainen PCR (RT-PCR) B

rikastuttaa miRNA RNA valmisteluun, kokonais-RNA eristetään viljellyistä soluista ja tuumorikudokset käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion). Kvantifiointiin miR-17 ja miR-17 *, RNA analysoitiin käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit sisäisen valvonnan RNU6B, RNU24 ja RNU48 (Applied Biosystems). Kvantifioimiseksi mRNA tasoja miR-17 * kohdegeenien RNA analysoitiin käyttäen TaqMan Reverse Transcription Reagenssit (Applied Biosystems) ja RT-PCR: llä Universal ProbeLibrary Set (Roche Applied Science). RT-PCR suoritettiin TaqMan Universal PCR Master Mix käyttäen LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science).

Northern blotit

taso miR-17 * kvantifioitiin käyttäen miRtect-IT miRNA Labeling ja Detection kit (USB Corp.) mukaisesti valmistajan protokollan.

Entsyymiaktiivisuus määritys

MnSOD toimintaa mitattiin nitrosinitetratsoliumia (NBT) -bathocuproin sulfonaatti (BCS) vähentäminen eston menetelmää. Natriumsyanidia (2 mM), käytettiin inhiboimaan Cu /ZnSOD aktiivisuus [31]. GPX-aktiivisuus mitattiin käyttämällä reaktioseoksessa, joka koostui 0,2 mM H

2O

2, 1,0 mM GSH, 0,14 U glutationireduktaasin (GR), 1,5 mM NADPH, 1,0 mM natriumatsidia ja 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 7,4) ja 1 mg /ml supernatanttia proteiinia [32]. TrxR aktiivisuus mitattiin käyttämällä tioredoksiinista Reduktaasiaktiivisuuden Assay Kit (Redoxica) mukaisesti valmistajan protokollan.

Tilastotiedot analysoi

Useita toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kullekin joukko tietoja. Kuvat Pohjois pyyhkii ja Western blotit kvantitoitiin käyttäen Carestream Molecular Imaging ohjelmisto (Carestream Health Inc.). Tilastollinen merkitsevyys analysoitiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA ja Tukeyn monivertailutesti, jota seuraa data-analyysi, jossa Graphpad Prism.