Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimus tarjoaa ainutlaatuisen lähestymistavan aktivoida altaaseenpantujen pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA) käyttäen epäsuoraa UV lähettämää valoa lähi-infrapuna (NIR) -to-UV upconversion prosessi saavuttaa korkean alueelliset ja ajalliset geeni häiriökuvioita. siRNA-molekyylejä vastaan ​​anti-apoptoottisen geenin

surviviinin

on pantu altaaseen valoherkkiä molekyylejä (4,5-dimetoksi-2-nitroasetofenonia, DMNPE), joka teki niistä väliaikaisesti toimimattomia. NIR-to-UV NaYF

4: Yb, Tm upconversion nanohiukkasten (UCPs) toimi pakettiautoa ja aktivaattoreita häkissä siRNA molekyylien hiiren virtsarakon syövän solut (MB49 solulinja). Upconverted UV-valolla 355 nm säteilevä NIR-säteilytetty UCPs, joka hyvin samaan aikaan aallonpituus tarvitaan Uncage DMNPE. Näin ollen UV-valo toimi kytkin Uncage toimitetun siRNA-molekyyli, minkä johdosta täysin toimiva kohdistamaan terapeuttisen vaikutuksen virtsarakon syövän soluissa. Saavuttaa korkeimman RNA-interferenssi hyötysuhde, olosuhteet kuten aika jälkeen solujen sisäänoton, magnetointiaika, UCPs keskittyminen ja laser teho optimoitiin. Tulokset osoittivat, että 200 ug /ml nanohiukkasten pitoisuus yhdistettynä 12 tunnin inkubaation MB49-solujen ja virityksen NIR laserilla 100 mW teholla 15 minuuttia, kunhan ihanteellinen häiriön tehokkuutta ja vahvin induktio MB49 solukuoleman. Meidän havainnot osoittavat potentiaalia biologinen soveltamisesta UCPs hoidettaessa virtsarakon syöpää uusi terapeuttinen lähestymistapa.

Citation: Guo H, Yan D, Wei Y, Han S, Qian H, Yang Y, et al. (2014) esto hiiren virtsarakon syövän Cell Growth

In vitro

by Photocontrollable siRNA Perustuu upconversion loisteputki nanopartikkelit. PLoS ONE 9 (11): e112713. doi: 10,1371 /journal.pone.0112713

Editor: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 08 elokuu 2014; Hyväksytty: 14 lokakuu 2014; Julkaistu 25 marraskuuta 2014

Copyright: © 2014 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee osittain avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 31100688, nro 21471043), International Science Teknologia yhteistyöohjelma Kiinan (nro 2014DFA31890), tieteellinen tutkimus säätiö Palautetut Overseas Kiinan Scholars, State Opetusministeriö ja valtion Key Laboratory of Veterinary etiologisia Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Kiinan Academy of Agricultural Sciences (SKLVEB2013KFKT010). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on yleisin maligniteetti urogenitaaliseen maailmanlaajuisesti. Huomattavaa tutkimustyötä on omistettu kehittää uusia ja tehokkaita hoitomuotoja virtsarakon syöpään. Lisäksi tavanomaisen hoidon menetelmiä, kuten leikkaus, kemoterapia ja sädehoito, geeniterapia pidetään tehokas vaihtoehto hoitoon tumors.Hence, RNA-interferenssi (RNAi), joka on luonnossa esiintyvä mekanismi solujen geenien, osoittaa hyvät mahdollisuudet hoitoon virtsarakon syöpä [1], [2], [3]. RNAi sisältää sitovan pieniä häiritseviä RNA: n (siRNA) ja RNA-indusoidun hiljentäminen kompleksi (RISC), joka sitten ohjaa tuhoaminen lähetti-RNA (mRNA), joka on komplementaarinen antisense-juosteen siRNA. Target-erityisiä RNAi voi kaataa geenin korkea spesifisyys ja selektiivisyys, mikä tarjoaa tärkeä väline henkilökohtaista syövän hoidossa.

RNAi koneet aloitetaan yleensä heti siRNA tulee soluun, ja vaikutukset geeni hiljentäminen voidaan havaita pian sen jälkeen. Kuitenkin nopea ja hallitsematon RNAi rajoittaa hyödyllisyys geeniterapian. Näin ollen on pyritty kehittämään spatiotemporally indusoituvan RNAi. Eräs lupaava lähestymistapa on ”häkissä” RNAi, jossa käytetään siRNA modifioitu fotolabiili suoja ryhmä, joka estää sen toiminnan. Koska aktiivisuus ”häkissä” siRNA nojaa valoa liipaisin (kuten UV-valo), tämä lähestymistapa sallii välit, ajoitus ja valvoa aste geenien ilmentymisen, First kuvannut Kaplan vuonna 1978, tämä menetelmä on käytetty erilaisissa sovelluksissa [4]. Tässä tutkimuksessa valitsimme 4,5-dimetoksi-2-nitroasetofenonia (DMNPE), 2-NB (2-nitrobentsyyli) luokan fotolabiilit suoja ryhmä, häkin siRNA minimaalinen vuotamisen ja maksimaalinen uncaging tehokkuutta.

viime vuosina upconversion loisteputki nanohiukkasten (UCPs) on yhä käytetään fluoresoivina markkereita ja geenien kuljettamiseen. UCPs osoittaa hyvää biologinen yhteensopivuus ja mitään immunogeenisyyttä kuin geenin jakelujärjestelmä, ja ne voidaan turvallisesti erittyy jättämättä jäämiä elimistössä. UCPs voidaan tehokkaasti toimittaa siRNA tai DNA kohdesoluihin tai kudosten ja välttämään hajoaminen nukleaasien veren seerumin. Lisäksi verrattuna perinteisiin loisteputki markkereita, kuten orgaanisia väriaineita ja kvanttipisteiden, UCPs on alhainen myrkyllisyys, hyvä kemiallinen vakaus, korkea fluoresenssin intensiteetti, korkea vakaus, ja suuri Stokesin siirtymä kun käytetään fluoresoivina markkereita. UCPs ovat innoissaan lähi-infrapuna (NIR) valoa, joka vaikuttaa vähän häiriöitä ja hajonta auto-fluoresenssi kudoksista ja soluista, ja siten tarjota matalan tausta ja korkea signaali-kohinasuhde [5].

NIR valo pääsee tunkeutumaan kudoksiin syvemmälle kuin näkyvän valon, ja sellaisenaan, UCPs voidaan käyttää fluoresoivia merkkiaineita tai optisessa hoidossa syvälle kudoksiin. Siksi UCPs on hyvät mahdollisuudet fluoresoivina markkereita ja geeninkuljetusvektoreja kliinisessä havaitsemiseksi, käsittelemiseksi, ja analyysi biologisten molekyylien [6], [7], [8], [9]. NaYF4: Yb, Er /Tm osoittaa korkein hyötysuhde NIR näkyvän /upconversion fluoresenssi ja voi tarjota aallonpituuksilla UV-valoa infrapunavaloa. Näin ollen, NaYF4: Yb, Tm, käytettiin photocaged siRNA kantajaa tässä tutkimuksessa.

surviviinin

on yksi vahvimmista estäjien osallistuvien proteiinien apoptoosin. Koska suuri ero sen ilmaisun välillä normaalin ja pahanlaatuisen kudoksissa ja sen syy rooli syövän etenemisessä surviviiniperäiset on tutkittu kohteena syövän hoitoon ja sen tuumorimarkkeri [10], [11], [12], [ ,,,0],13]. Tässä, surviviini valittiin kohdegeenin selvittääkseen tehokkuutta RNAi-pohjainen geeniterapia virtsarakon syövän hoitamiseksi. Tarkemmin surviviiniperäiset siRNA häkissä kanssa DMNPE yhdistettiin UCPs kantajana. Aktivointi siRNA saavutettiin säteilyttämällä 980 nm NIR laser ja esto virtsarakon syövän solujen kasvua arvioitiin. Tuloksemme antavat uusia näkökulmia käytön UCPs geeniterapiassa.

Materiaalit ja menetelmät

1. Cell

MB49-PSA soluja, jotka saatiin Dr. Ratha Mahendran alkaen Lääketieteellinen tiedekunta (NUS, Singapore) [7], [9], viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmapiiri modifioidussa Eaglen väliaineessa (MEM, Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco), joka sisälsi 100 yksikköä /ml G-penisilliini (BBI) ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia (BBI).

2 . Aminoryhmän modifioitu UCPs ja UCPs /siRNA-DMNPE kompleksin muodostumisen

NaYF

4: Yb, Tm nanocrystals ja monodispersinen piidioksidilla päällystettyä NaYF

4: Yb, Tm (NaYF4: Yb, Tm @ piidioksidi, UCPs) syntetisoitiin ja karakterisoitiin kuvatun menetelmän Guo et ai. (2010) [7] ja Qian et al. (2009) [9]. UCPs muutettiin käyttäen aminoryhmä kuvatun menetelmän Guo et ai. (2011). DMNPE (Invitrogen) käytettiin häkin siRNA seuraten valmistajan protokollaa, ja UCPs /siRNA-DMNPE kompleksit tehtiin, kuten on kuvattu aikaisemmin Guo et ai. (2011) [14]. Suhde UCPs ja siRNA määritettiin mittaamalla zeta-potentiaali käyttäen Nano-ZS ZEN 3600 (Malvern Instruments Ltd, UK) 25 ° C: ssa. UV-absorptiospektri kerättiin käyttäen BIOMATE 3S UV-näkyvän spektrofotometrillä (Thermo Scientific) 25 ° C: ssa.

3. Soluunottoa UCPs eri ajankohtina

MB49-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin 24 tuntia. Solut käsiteltiin heti nanohiukkasten 100 ug /ml ja kerättiin eri aikapisteissä (15 min, 1 h, 6 h, 24 h). Lastatut solut nanohiukkasten kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan huoneenlämpötilassa (RT) ja pestiin sitten kahdesti 1 x PBS: llä 5 minuutin ajan. Tumat vastavärjättiin 0,1 ug /ml DAPI (Sigma) 5 min ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen kaksi pesua 1 x PBS: llä 5 min kukin. Nanohiukkasten ladattu kiinteän jälkeen solut visualisoida konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (Nikon C1 konfokaali) varustettuna jatkuvan aallon 980 nm laser magnetointilähdettä.

4. Kvantifiointi UCPs oton

Solut ympättiin 75 cm

2-pulloihin 1 x 10

6 /ml viljelyn jälkeen 24 h. Solut käsiteltiin heti nanohiukkasten 100 ug /ml ja kerättiin eri aikoina piste 0, 15 min, 1 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h ja 72 h. Solunsisäinen otto nanohiukkasten arvioitiin mittaamalla kokonaismäärän nanohiukkasten soluissa käyttäen induktiivisesti kytkettyä plasma optinen emissio spektrometri (ICP-AES).

5. Transfektio Viljeltyjen solujen

MB49-PSA-solut transfektoitiin UCPs /siRNA-DMNPE kompleksin kuvatun menetelmän Guo et ai. (2011) [14]. Lyhyesti, UCPs /siRNA-DMNPE kompleksi inkuboitiin solujen eri ajankohtana kuin ilmoitettu. 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. Lopussa itämisaika, solut olivat innoissaan kanssa tai ilman 980 nm laser käyttäen 980 nm: n VA-II diodi pumpataan SSD (DPSS) laser lähde.

6.

In vitro

elinkelpoisuuden /sytotoksisuus kokeissa

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä Cell Titer 96 vesikerros liuosta määritystä (Promega, Madison, WI). MB49-solut ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 5 x 10

3 solua kuoppaa kohti. Yhden päivän jälkeen viljelmässä, UCPs /siRNA-DMNPE kompleksi lisättiin kuoppiin. Soluja inkuboitiin eri ajankohtana esitetyllä ja sen jälkeen viritetään käyttämällä 980 nm: n laser- tai ei. Kun oli inkuboitu vielä 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 20 ui reagenssia lisättiin suoraan kuoppiin ja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Määrä formatsaanituotteen on muodostettu kuten on esitetty 490 nm: n absorbanssi on suoraan verrannollinen elävien solujen lukumäärään viljelmässä. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Solujen elävyys (%) suhteessa kontrolliin kuoppiin, jotka sisältävät soluviljelyelatusainetta ilman nanocrystals laskettiin [

]

expt /[

]

ohjaus x 100%, jossa [

]

expt on absorbanssi testinäytteen ja [I]

ohjaus on absorbanssi kontrollinäyte.

7. Detection surviviinin ilmentymisen immunoblot-analyysillä

MB49-solut ympättiin kuuden kuoppalevylle ja niitä viljeltiin, kunnes yhtymäkohdassa oli 80% ja 90% (mikä tapahtui sen jälkeen, kun noin 24 h). Siinä vaiheessa, UCPs /siRNA-DMNPE kompleksi lisättiin ja soluja inkuboitiin eri ajankohtana kuten on osoitettu. Sitten solut säteilytettiin kanssa tai ilman 980 nm laser ja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 24 tuntia. Solut kerättiin käyttäen kylmää solujen hajotusreagenssia (Pierce) kohti valmistajan protokollaa. Proteiinit solulysaatit erotettiin SDS-PAGE 12% akryyliamidigeelejä käyttämällä epäjatkuvaa puskurijärjestelmää. Ne siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle (Pierce) siirtopuskurissa (20 mM Tris-HCl, 190 mM glysiini, 20% metanoli, pH 8,3) käyttäen Mini Trans-blot-siirto-järjestelmä (Bio-Rad) 100 V: ssa 1 h. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,05% Tween-20 (TBST), huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin anti-surviviiniperäisten-vasta-ainetta (Santa Cruz, 1:200 laimennus) RT 1 h. Kolmen pesun jälkeen TBST: ssä, kalvoja inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua anti-hiiri-vasta-ainetta (Sigma, 1:8000 laimennos) RT: ssa vielä 1 tunnin ajan. Kolme uutta pesua TBST tehtiin ennen NC kalvo visualisoitiin ECL-liuosta (Pierce).

8. Tilastollinen analyysi

Kalvot skannattiin kuten harmaasävy 8-bittisten kuvien ja tiheys bändit määritettiin ImageJ software.The data suhteellisen määrän western blot esitellään ja tilastollisen analyysin ryhmien välisen varianssin oli suorittamat SPSS Statistics 19.0 ohjelmisto. Merkittävä ero kaikki tilastolliset testit asetettiin 0,05 (p 0,05).

Tulokset

Tässä tutkimuksessa NaYF

4: 25% Yb, 0,3% Tm NIR-to UV UCPs käytettiin kantaja-häkissä siRNA: ita, jotka aktivoidaan NIR-to-UV ylösmuunnetaan valo (Kuva. 1). Kuten on esitetty kuviossa 2B, syntetisoitu nanohiukkasten hallussaan ydin-kuori-rakenne, joka koostuu NaYF

4 nanocrystal ydin ja piidioksidia kuori. Kiinnitä häkissä siRNA: t, The UCPs muutettiin aminoryhmällä, jotka tekevät sen pinta on positiivinen varaus. Modifioitu nanohiukkasten kuviossa 2C ovat enemmän hajallaan kuin kuviossa 2B, joka voi johtua sähköstaattinen repulsio aiheuttamia positiivisia varauksia nanohiukkasten pinnalle. Kaiken nanohiukkasten havaittiin hyvin dispergoida veteen, jolloin muodostuu kirkas kolloidinen liuos ja esillä vahva upconversion fluoresenssin (Fig. 2A).

fluoresenssispektrit modifioimattoman nanohiukkasten (A); morfologia modifioimatonta nanohiukkasten (B) ja amino-funktionalisoitujen nanohiukkasten (C) TEM: llä havaitaan.

kompleksi muodostumista amino-modifioitu UCPs siRNA tutkittiin mittaamalla nanozeta mahdollisia. UCPs ja siRNA sekoitettiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. UCPs /siRNA kompleksit pestiin useita kertoja PBS: llä ja suspendoitiin sitten PBS-puskurissa. Mittaus zeta-potentiaalit osoitti, että positiivinen varaus UCPs vähitellen neutraloitiin negatiivinen varaus siRNA kasvaessa nanohiukkasten /siRNA suhde (Fig. 3A). Kuitenkin, solujen pinnoilla ovat negatiivisesti varautuneita neutraalissa olosuhteissa (pH 7,0). Näin ollen kapasiteetin maksimoimiseksi on UCPs antaa niin paljon siRNA kuin mahdollista ja optimaalisen solun oton tehokkuutta UCPs /siRNA monimutkainen, käytimme nanoparticle:siRNA suhde 10:02 (mol:mol) kaikissa

in vitro

kokeita. Jotta voidaan arvioida tehokkuutta siRNA uncaging mukaan UCPs, niiden absorbanssi mitattiin. Kuten on esitetty kuviossa 3B, DMNPE-häkissä siRNA paljasti tunnusomaisen huippu 355 nm: ssä DMNPE ja huippu 260 nm: ssä kuin siRNA, joka osoitti kiinnitys DMNPE ryhmien siRNA-molekyylejä. Sillä DMNPE-häkissä siRNA-molekyylejä, ilman säteilyä yli 980 nm NIR laser, osoitti sekava spektri. Se arvioi, että on häiriöitä välillä päästöjen UCPs ja että DMNPE. Kuitenkin UCPs /siRNA-DMNPE merkittävä lasku 355 nm huippu havaittiin säteilytettäessä NIR light.Hence, on uskottava, että NIR-to-UV UCNs voi Uncage siRNA molekyylien heräte NIR valoa.

(A) konfokaali kuvantaminen upconversion fluoresenssin MB49 solut ladattiin 100 ug /ml nanohiukkaset. Heräte 980 nm NIR laser synnyttämä vihreä ja punainen näkyvä fluoresenssi. Tumat vastavärjättiin DAPI (sininen fluoresenssi). Kaikki kuvat saatiin samoissa asetukset, jotka on sallittu laskenta suhteellinen fluoresenssin voimakkuus differentiaalisesti sisältävistä soluista. (B) solunsisäinen oton nanohiukkasia ladattu soluissa ICP-AES yttrium sisällöstä.

tason määrittämiseksi solun oton UCPs, UCPs /siRNA tai UCPs passiivisesti ladattiin MB49 soluihin inkuboimalla ne 100 ug /ml nanohiukkasten eri kestoja. Kuten kuvassa 4A on esitetty, kaksi suodatinta on käytetty kuvaamaan vihreän ja sinisen fluoresenssin päästöjä. Tumat vastavärjättiin DAPI osoittaa, että lähes kaikki solut ladataan. Progressiivinen kasvu havaittiin upconversion fluoresenssin nanohiukkasten ladattu solujen ajan. Kuitenkin, fluoresoiva intensiteetti UCPs /siRNA-kompleksin MB49-soluissa oli voimakkaampi kuin UCPs yksin 6 h inkuboinnin jälkeen. Tämä osoitti, että MB49 solut oli otettu UCPs /siRNA kompleksit voimakkaammin kuin UCPs ajan lisääntyminen, mikä saattaa johtua siitä, että pintavarauksen nanohiukkasten. Lisäksi mittasimme solunsisäistä ottoa nanopartikkelien ladattu soluissa ICP-AES yttrium pitoisuuden ja havaittiin samanlainen suuntaus kasvu nanohiukkasten sisäänoton soluihin ajan (Fig. 4B). Kuitenkin, määrä UCPs soluissa saavutti huippunsa ja pysyi sitten tasapaino.

(A) Zeta potentiaali UCPs /siRNA-DMNPE kompleksin mol /mol suhteet 10:01, 10:02, 10 :3, 10:04, ja 10:05; (B) absorbanssi spektrofotometrisesti siRNA, DMNPE-häkissä siRNA ilman säteilytystä, ja UCPs /siRNA-DMNPE aktivoitu tai ilman NIR säteilytys.

Voit selvittää optimaaliset olosuhteet siRNA häiriön jälkeen NIR-laservirityksellä , kokeet perustettu eri edellytyksiä ajankohtina transfektion jälkeen, virityksen kertaa, keskittyminen komplekseja, ja laser voima. Kuten on esitetty kuviossa 5, häiriöt tehokkuus lisääntyi inkubaatioaika nanohiukkasten solujen kanssa. Solun elinkelpoisuus väheni merkittävästi UCPs /siRNA-DMNPE hoidon jälkeen virityksen NIR ligh. Kuitenkaan ollut lähes mitään muutosta solun elinkelpoisuuden ilman NIR heräte (Fig. 5A) .Similarly, 12 h sen jälkeen, kun hoidon kanssa tai ilman NIR herätteen, ilmentymisen taso suvivin proteiinin väheni merkittävästi ja melkein pysyi samalla tasolla 24 h , jossa ehdotetaan lisäystä häiriöitä tehokkuutta (kuvio. 5B) .Tämä saattaa johtua kasvaa soluunottoa nanopartikkelien ajan, ja se on yhdenmukainen tulosten kanssa esitetään kuviossa 4. Kuten kuviossa 6 on esitetty, häiriöt tehokkuus lisääntyi ajan magnetointi. Erityisesti surviviiniperäiset ilmaisu väheni merkittävästi, kun solut innoissaan NIR valoa yli 15 min. Kuvio 7 esittää, että häiriön teho kasvoi pitoisuuden kasvu nanohiukkasia, ja siten häiriöitä tehokkuus kasvoi myös määrä siRNA surviviiniperäisiä. Sen vaikutuksen määrittämiseksi laserin teho häiriöiden tehokkuutta, soluja inkuboitiin UCPs tai UCPs /siRNA-DMNPE, joka on erilainen kuin ne, joita käytettiin edellisessä kokeessa. Kuten on esitetty kuviossa 8, häiriön tehokkuus kasvoi myös kasvua laserteho, erityisesti 500 mW. Kuitenkin surviviiniperäiset ilmaisu myös vähentynyt UCPs kontrolliryhmässä 500 mW, joka ehdotti, että UCPs voivat aiheuttaa soluvaurioita kerran viritetään NIR valoa suurella teholla. Näin ollen, sen perusteella, edellä esitetyt tulokset, optimaaliset olosuhteet (12 tunnin inkuboinnin 15 min magnetointi, 200 ug /ml nanohiukkasten pitoisuus, ja 100 mW laser tehoa) käytettiin tarkistaa maksimaaliseen häiriöön tehokkuutta.

UCPs /siRNA-DMNPE lisättiin MB49 soluihin UCPs konsentraatio on 100 ug /ml. Solut viritetään käyttäen NIR laservaloa (100 mW), 15 min eri ajankohtina. Solut kerättiin 24 tunnin jälkeen valoa hoidon. RNAi häiriöitä tehokkuus määritettiin immunoblottauksella (A) ja MTT-määrityksellä (B). Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin ja tulos kokeen yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja näytteiden eri kohtelu samalla piste. (* P 0,05, ** P 0,01).

UCPs /siRNA-DMNPE lisättiin MB49 soluihin UCPs konsentraatio on 100 ug /ml. Solut innoissaan käyttäen NIR laservaloa (100 mW) eri heräte kertaa. Solut kerättiin 24 tunnin jälkeen valoa hoidon. RNAi tehokkuus määritettiin immunoblottauksella (A) ja MTT-määrityksellä (B). Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin ja tulos kokeen yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty. Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja näytteiden välillä, joilla on samankaltaisia ​​heräte kertaa (* P 0,05, ** P 0,01).

Eri pitoisuuksia UCPs /siRNA-DMNPE lisättiin MB49 soluihin 12 tuntia. Solut innoissaan NIR laservalolla (100 MW) 15 min. Solut kerättiin 24 tunnin jälkeen valoa hoidon. RNAi tehokkuus määritettiin immunoblottauksella (A) ja MTT-määrityksellä (B). Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin ja tulos kokeen yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja näytteiden samanlaisia ​​pitoisuus (* P 0,05, ** P 0,01).

UCPs /siRNA-DMNPE lisättiin MB49 soluihin UCPs pitoisuutena 100 ug /ml . Solut innoissaan käyttäen NIR laservalon eri teho 15 minuuttia. Solut kerättiin 24 tunnin jälkeen valoa hoidon. RNAi tehokkuus määritettiin immunoblottauksella (A) ja MTT-määrityksellä (B). Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin ja tulos kokeen yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja näytteiden samanlaisia ​​laser teho (* P 0,05, ** P 0,01).

Vahvista, onko kaikki ehdot ovat optimaaliset, siRNA häiriö koe suoritettiin käyttäen UCPs ja UCPs /siRNA-DMNPE monimutkainen. Kuten on esitetty kuviossa 9, lähes mitään vähenemistä Surviviiniproteiini havaittiin tyhjä kontrolliryhmässä virittämisen jälkeen tai ilman NIR light.Howeve, häiriöitä tehokkuus UCPs /siRNA-DMNPE oli korkea virittämisen jälkeen NIR-valoa. Lisäksi UCPs vaikuttaa myös surviviinin ilmentymiseen jossain määrin, joka voi johtua useista tekijöistä, jotka liittyvät laserit ja nanohiukkasia.

UCPs /siRNA-DMNPE lisättiin MB49 soluihin UCPs konsentraatio on 100 ug /ui. Solut olivat innoissaan käyttäen NIR laservaloa (100 mW), 15 min 12 h inkuboinnin jälkeen. Solut kerättiin 24 tunnin jälkeen valoa hoidon. RNAi tehokkuus määritettiin immunoblottauksella (A). Tasot Surviviiniproteiini suhteessa kuin aktiinin kanssa tai ilman NIR aiheuttama magnetointi on esitetty. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin ja tulos kokeen yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja ilmoitettu näytteiden (* P 0,05, ** P 0,01).

Keskustelu

Gene sääntely on tärkeä elävät järjestelmät, koska geeniekspressiotasot olla tärkeä rooleja geenifunktioiden. Menetelmät ohjaukseen geenien ilmentymisen (up- tai alassäätöä) mullistanut kehitysbiologian ja geeniterapia. Viimeaikainen kehitys photocontrollable geeniekspression erittäin lupaava lisääntynyt spatiotemporal valvoa modulaatio geenien ilmentymisen. Tässä tekniikassa kopiointiaktivaattorit /plasmidin geenien ilmentymisen tai siRNA RNAi ovat häkissä, jossa valoherkkä molekyylejä, jotka tekevät ne väliaikaisesti toimimattomia. Tämä prosessi, jota kutsutaan photocaging, voidaan tehdä eri tavoin, joista yleisin on muuttamassa valitsemalla emäsparia tai kemiallisia sidoksia altaaseenpanoilmoitukseen molekyylin. Säteilytettäessä UV-valolla, muutos on tuhottu, jolloin uudelleen aktivoimalla nukleiinihapot takaisin niiden toiminta [15], [16], [17]. Tällä tavalla erittäin suuri spatiaalinen ja ajallinen valvoa geeniekspressiomalleja voidaan saavuttaa. Kuitenkin, useimmat nykyiset valoaktiivisten järjestelmät soveltuvat ainoastaan ​​

in vitro

sovelluksissa, koska UV-valon, joka on erittäin haitallista, on tarpeen uncaging prosessin. UV-valo myös on huono kudos tunkeutumissyvyys, joten on mahdotonta hyväksyä

in vivo

ja kliiniseen käyttöön. Lisäksi vaikka käyttö siRNA RNAi osoittaa suurta potentiaalia hoito, siRNA helposti hajottavat RNaasi veren seerumin ja ovat siten sopimattomia

in vivo

käytössä. siRNA nukleotidit ovat suhteellisen pieniä, ja lyhyt, vaikka kemiallisen muuntamisen parantamiseksi siRNA vakautta. Näitä nukleotideja voidaan erittyy kautta virtsateiden jälkeen absorbanssi veressä. siRNA on myös voitettava endoteelin esteitä päästä kohdesoluihin eri eliöiden. Täten järjestelmän kehittäminen tehokkaaseen ja turvallinen toimitus siRNA soluihin on erittäin tärkeää. Tähän mennessä toimitus järjestelmiä siRNA ovat olleet nonvirus- ja virusten perustuva jakelu järjestelmät; entinen sisältää liposomien, nanohiukkaset, kationiset polymeerit, misellejä ja muut järjestelmät perustuvat näihin muotoihin. Koska virus perustuva jakelu järjestelmissä näytteille joitakin haittavaikutuksia, kuten mahdollisten immunogeenisuutta ja tuumorigeenisyystesti geeniterapiassa, ne eivät sovellu siRNA toimitusta. Siksi tällä hetkellä nonvirus perustuva jakelu järjestelmät siRNA tutkitaan. Tässä tutkimuksessa NaYF

4: 25% Yb, 0,3% Tm NIR-to-UV UCPs käytettiin kantajina häkissä siRNA. NIR valo, jota käytettiin virittämään UCPs, voivat tunkeutua biologisen kudoksen yli näkyvää tai UV-valon, mikä mahdollistaa käytön UCPs kantajina syvissä kudoksissa.

valolabiilit suojaus ryhmät voidaan jakaa kahdenlaisia: epäspesifinen altaaseenpanoilmoitukseen ryhmä liittyy satunnainen altaaseenpanoilmoitukseen siRNA fosfaattiselkärankaan [18], kun taas toinen ryhmä liittyy erityisiä eristäviä 5′-fosfaatin siRNA: iden [19]. Epäspesifinen ryhmät ovat vakaampia kuin erityisryhmille. Lisäksi epäspesifinen ryhmät on helppo syntetisoida kemiallisesti tai biokemiallisilla menetelmillä, mikä vähentää tuotantokustannuksia häkissä siRNA. Tässä tutkimuksessa siRNA oli häkissä käyttämällä DMNPE. DMNPE kuuluu 2-NB altaaseenpanoilmoitukseen ryhmä ja sen johdannaiset ovat yleisimmin käytetty ja hyvin tunnettu panemista molekyylejä [20]. NIR-to-UV UCPs spektrissä päästöjen huippu 350 nm, joka osuu varsin hyvin aallonpituus tarvitaan Uncage DMNPE. Lisäksi NIR valo imevät itseensä vain heikosti biologisten kudosten, joka takaa maksimaalisen NIR valon absorbanssi UCPs ja lisää menetelmän herkkyyttä.

tarkistaa optimaalinen ajankohta NIR magnetointi soluissa, solun sisäänoton of UCPs havaittiin fluoresenssimikroskopialla ja ICP-AES. Määrä UCPs soluissa lisääntyi aluksi aikaa, mutta laski sen jälkeen 24 tunnin kuluttua istuttamisen jälkeen. Tämä osoittaa, että alkuvaiheessa inkubointi UCPs on kriittinen. Ottaen huomioon solujen elinkykyä, valitsimme 12 h jälkeinen inkubaatio UCPs NIR aiheuttama heräte. Tulokset meidän myöhemmin vahvistivat, että tällä kertaa kohta on ihanteellinen saavuttaa korkea RNA-interferenssi. Vaikka NIR valo on vähemmän sytotoksinen kuin UV-valo, käyttö korkea laser voimaa ja pitkän magnetointiaika voi aiheuttaa merkittävää sytotoksisuutta ja alemman RNAi tehokkuutta. Näin ollen vain 15 min magnetointiaika käytettiin ja laserin teho oli kiinnitetty 100 mW. Lisäksi, koska UCPs aiheuttaa vahinkoa soluille suurina pitoisuuksina, pitoisuus UCPs asetettiin 200 ug /ml. Korkea RNAi hyötysuhde tutkimuksessa havaittujen validoitu soveltuvuutta näiden parametrien meidän kokeita.

Johtopäätökset

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että NIR-to-UV UCPs voi toimia pakettiautoa ja aktivaattorit häkissä nukleiinihappoja. Säteilytys UCPs soluissa ylöskonvertoidun UV-valoa säteilevä NIR johti uncaging kuormitetun molekyylien, tehden niistä täysin toimiva isäntäsoluissa. Lisäksi esillä hyvässä valossa levinneisyys kudoksissa syvällistä valoaktivointia, NIR valon aiheuttamien heräte tarvitaan NIR-to-UV upconversion prosessi aiheutti vähäisiä valon aiheuttaman vaurion ja biologisia näytteitä. Luontainen fluoresenssiominaisuuksiin näiden nanohiukkasten ansiosta päästöt, jotka johtivat vapautumiseen caged siRNA ja helpottaminen geenin häiriöitä. Siten UCPs voi tarjota alustan sovelluksiin, joissa kaukosäädin RNAi ja geeniterapian syövän. Lisäksi meidän havainnot osoittavat hyödyllisyys monivärinen upconversion luminesenssi UCPs niin monipuolinen ja tehokas työkalu kehittyneitä sovelluksia kuvantaminen, biodetection, ja geeniterapia.