Krooninen sairaus

tiivistelmä

Dexamethasone (Dex) käsiteltiin Severe Combined Immunodeficiency (SCID) hiiriä kuvattiin aikaisemmin kehittää ruoansulatuskanavan adenokarsinooma jälkeen massiivinen infektion

Cryptosporidium parvum

heti 45 päivää infektion jälkeen ( PI). Meidän tavoitteena oli määrittää vähimmäismäärän ookystien kykenee indusoimaan infektio ja siten ruoansulatuskanavan kasvaimet tässä mallissa. Hiiret altistettiin kalibroitu ookystien suspensioina, jotka sisältävät tarkoitettu annoksia: 1, 10, 100 tai 10

5 ookystien

C. parvum

Iowa-kantaa. Kaikki annokset olivat infektoiva eläimille mutta lisäämällä ookystien haaste johtaa kasvuun hiirissä infektiivisyys (P = 0,01). Ookystien leviämistä havaittiin 7 päivää P.I. istuttamisen jälkeen yli 10 ookystien, ja sen jälkeen 15 päivää hiirissä yhdellä ookystien. Ryhmissä altistettiin alempi inokulaatit, loinen kasvuvaihe oli merkitsevästi korkeampi (p = 0,005) verrattuna hiiriin inokuloitiin suurempia annoksia. 45 päivän kuluttua P.I. kaikki ryhmät hiiriä keskiarvo oli ookystien irtoaminen parempia 10000 ookystien /g ulostetta. Vaikuttavin havainto tässä tutkimuksessa oli osoitus siitä, että

C. parvum

aiheuttama ruoansulatuskanavan adenokarsinooma voi johtua infektio pienillä annoksilla

Cryptosporidium

, vaikka vain yksi ookystien: hiirissä ympätty pienillä annoksilla, neoplastisia vaurioita havaittiin jo 45 päivää P.I. sekä vatsassa ja ohut- ja umpisuolen alue, ja nämä vauriot voivat kehittyä invasiivisen adenokarsinooma. Nämä havainnot osoittavat suuri vahvistus vaikutus loisten hiirikudoksissa altistuksen jälkeen pieninä annoksina, sillä varmistettiin kvantitatiivinen PCR. Kyky

C. parvum

hiirien yhden ookystien ja kehittää ruoansulatuskanavan adenokarsinooma viittaa siihen, että muista nisäkäslajeista, mukaan lukien ihmiset voivat myös olla alttiita tämän prosessin, erityisesti silloin, kun ne immuunijärjestelmä on vakavasti heikentynyt.

Citation: Benamrouz S, Guyot K , Gazzola S, Mouray A, Chassat T, Delaire B, et ai. (2012)

Cryptosporidium parvum

Infektio SCID-hiirissä Infected Only One ookystien: qPCR arviointi Parasite Replication kudoksissa ja kehittäminen Digestive Cancer. PLoS ONE 7 (12): e51232. doi: 10,1371 /journal.pone.0051232

Editor: Gordon Langsley, Institut national de la Sante et de la Recherche médicale – Institut Kochi, Ranska

vastaanotettu: 16 syyskuu 2012; Hyväksytty: 31 lokakuu 2012; Julkaistu: 13 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Benamrouz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Erityistukea saatiin katolinen Institute of Lille (ICL) sisältäen avustusta Sadia Benamrouz. Tätä työtä tukivat ministeriön Research, Ranska (EA3609 /4547 Université de Lille 2), Federatiivisen Institute of Research 142 (Institut Pasteur de Lille), ja Ranskan National Research Agency (myöntää No. ANR-09-ALIA-009 ja ANR-10-ALIA-004). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cryptosporidium

lajeja maailmanlaajuisesti levinnyt Apicomplexan loistauti protists että tartuttavat lähinnä ruoansulatuskanavassa kalaa, sammakkoeläimet, matelijat, linnut ja yli 150 nisäkäslajia lukien ihmisten [1]. Tartunta tulokset nauttimisesta

Cryptosporidium

ookystien kulutuksen kautta fecally saastuneen ruoan tai veden kautta tai suoraan henkilön

–

to-henkilön tai eläimen kahdenkeskinen kosketuksissa [2]. Vakavuus taudin potilailla vaihtelevat oireettomista tappavia kryptosporidioosin riippuen tartunnan aiheuttavan lajin, niiden päällä infektion, iästä ja immuniteetti isännän. Infected immunokompetenteilla henkilöillä usein kehittyy akuutti suolistotulehdus, kun immuunipuutteisilla yksilöitä tullut kroonisesti ja toisinaan kuolettavasti vaikuttanut [2].

Tällä hetkellä yli 20

Cryptosporidium

lajeja pidetään voimassa [3], ja kaksi suurta lajit,

Cryptosporidium parvum

ja

C. hominis

, vastaavat suurimmasta ihmisen tapauksissa kryptosporidoosia [4]. Suuri tarttuva voima

Cryptosporidium

isolaatteja ihmisistä tai eläimistä peräisin ilmoitettiin [5]. Siten terveillä vapaaehtoisilla ilman serologisia todisteita aikaisemman infektion

Cryptosporidium

, suun kautta annoksella 30

C. parvum

ookystien aiheuttama infektio [5]. Sama ryhmä ilmoitti, että

Cryptosporidium hominis

ID50 oli 10 ookystien [4]. Lisäksi se on myös raportoitu, että yksittäinen ookystien on

C. meleagridis-

voi tuottaa patentti infektion steroidi-käsitellyiltä C57BL /6-hiirten [6].

Tutkiakseen biologisen ja patologinen väliset erot

Cryptosporidium

lajeja tai kantoja ja edistää ymmärtämistä dynamiikan infektion, Certad ja yhteistyökumppanit kehittäneet toistettavissa eläinmallissa kroonisen kryptosporidioosin käyttäen Dex-käsiteltyjen aikuisten SCID [7]. Eläimet inokuloitiin joko

C. parvum

joka parasitises suolistossa, tai

C. muris

joka on tropismista vatsaan hiirillä. Yllättäen he löysivät tällä mallilla, että inokulaatti 10

5 ookystien

C. parvum

mutta ei

C. muris

kykeni indusoimaan kehittämiseen invasiivisen ruoansulatuskanavan adenokarsinooma [7]. Kuitenkin, mikä on Pienin määrä ookystien, jotka kykenevät tuottamaan sekä infektion ja ruoansulatuskanavan neoplasia tässä mallissa? Kysymys on tärkeä sikäli kuin tätä mallia voidaan käyttää tutkimaan fenotyyppiset ominaisuudet

Cryptosporidium

näytteitä eristettiin ihmisen ulosteet tai ympäristöön (lähinnä vettä ja ruokaa), jossa ookystien määrät voivat usein olla hyvin alhainen. Jotta paremmin kuvaavat eläinmallissa, selvitimme kyvystä juuri eristettyjä

Cryptosporidium

ookystien aiheuttavan sekä patentti- infektio ja ruoansulatuskanavan kasvainmuutoksia kun annettiin hyvin pienellä annoksella.

Materiaalit ja menetelmät

Cryptosporidium parvum

ookystien

C. parvum

IOWA ookystien ostettiin Waterbo

RNE ™, Inc.

(New Orleans, Louisiana). Kantaliuosta ookystien säilytettiin toimitus väliaineessa (fosfaattipuskuroitu suolaliuos tai PBS: penisilliiniä, streptomysiiniä, gentamysiini, amfoterisiini B: tä ja 0,01% Tween 20: tä) 4 ° C: ssa käyttöön asti. Absence bakteerien ja sienten varmistettiin testaamalla ookystien suspendointijärjestelmiä Plate Count-agar (37 ° C, 1 viikko) ja Sabouraud levyt (37 ° C, 1 viikko).

Animal lähde

CB17-SCID 6-7 viikkoa vanhat naaraspuoliset hiiret saatiin siirtomaa kasvatetaan ja valvotaan säännöllisesti arvioimiseksi infektiot (mukaan lukien

Helicobacter

spp.) Pasteur Institute of Lille (Ranska). Eläimet pidettiin aseptisissa olosuhteissa eristimen koko kokeiden kuten aikaisemmin on kuvattu [7], [8], [9], [10]. Eläinkokeet suoritettiin eläimen laitoksen Pasteur Institute of Lille (tutkimus akkreditointinumero, A59107). Kokeellinen protokolla hyväksyttiin Ranskan alueellisen eettisen komitean (hyväksymisnumero CEEA 112011). Arviointi osa eläimen kunnosta tehtiin säännöllisesti havaita kärsimystä. Kliiniset oireet, jotka voivat muodostaa päätepisteen mukana, mutta eivät rajoitu: nopea tai etenevä laihtuminen, heikentäviä ripuli, karkea turkki, kyyryssä ryhti, uneliaisuus tai kaikki edellytykset häiritsee päivittäisiä toimia (esim syö tai juo, liikkuminen, tai poistaminen) .

koesuunnittelu

SCID hiirille annettiin 4 mg /l deksametasoninatriumfosfaatin (Dex) (Merck, Lyon, Ranska) juomaveden kautta [7], [11]. Deksametasonihoidon alkoi kaksi viikkoa ennen suullista istuttamisen

Cryptosporidium

ookystien (katso alla) ja se säilyi koko kokeilun. Dex-lisätty vesi korvattiin kolme kertaa viikossa.

ookystien inokuloitiin hiirille suun-mahaletkulla käyttäen 18-20 gauge syöttöputket. Kukin hiiri siirrostettiin 200 ui PBS: ää, joka sisälsi eri määrän ookystien: 1, 10, 100 tai 10

5. Kutakin annosta 4-8 hiiriin istutettiin (ryhmä 1 ryhmän 4). Negatiivinen kontrolli hiiret inokuloitiin PBS: llä (n = 4) tai inokulaatti 10

5 lämmöllä inaktivoitua ookystien (90 ° C, 15 min) (n = 4). Sen jälkeen letkulla hiiriä asutettiin steriileissä rajattu häkeissä. Tartunnan saaneet hiiret yksilöllisesti välttää fyysistä kontaktia ja minimoida tartuntariski Ristikontaminaation ja negatiivinen kontrolli hiiriä ryhmitelty. Hiiriä seurattiin 100 päivää sen P.I. arviointiin tarttuvuuden ja neoplastisten leesioiden kehitystä.

valmistaminen kalibroitu ookystien suspensioiden

ookystien pitoisuus

C. parvum

Iowa kantaliuos varmistettiin mittaamalla kolmena kappaleena 10 ul-eriin. Näytteet ottanut jakeet pantiin usean hyvin dia, annetaan kuivua ja kiinteiden metanolilla. Suora immunofluoresenssimäärityksellä (DFA) käyttäen FITC-konjugaatti anti

Cryptosporidium

monoklonaalinen vasta-aine (Cellabs Pty. Ldt., Croissy-Beaubourg, Ranska) oli tehty. Kuopat tutkittiin suurennoksella x 400 ja fluoresoivien ookystat laskettiin 10 satunnaisesti valittua mikroskooppikentästä. Ennen istuttamisen ookystien elinkelpoisuus kantaliuosta arvioitiin trypsiinin taurokolaatti excystation testi [12]. Joka perustuu excystation määrä (50%) sarjalaimennoksia tehtiin valmistella kaikki annokset. Annokset ≤100 ookystien valmistettiin 6 alikvootteja 200-ul: 5 alikvootit todennettu voidaan arvioida mahdollisia eroja aiotun inokulaatin ja viimeinen näyte ympättiin hiiriin. Tarkastaminen määrä ookystien kustakin näytteestä tehtiin suodatus näytteitä läpi 0,4 um 25 mm musta polykarbonaattia suodatin. Sitten DFA tehtiin suodattimen, kuten aiemmin on kuvattu. Koko suodatin asennetaan sitten lasilevylle, jossa Citifluor kiinnitysväliaine (Biovalley). Ookystien läsnä koko suodattimen pinta laskettiin (suurennoksella 400) käsin scan epifluoresenssimikroskoopilla (Axioplan 2, Zeiss). Keskimääräinen infektiivisten ookystien laskettiin tarkastamisen jälkeen erät on esitetty taulukossa 1.

ookystien irtoaminen arviointi

arvioimiseksi ookystien leviämistä aikana

Cryptosporidium

infektio, juuri erittyy ulosteen pelletit kerättiin kolme kertaa viikossa. Kukin hiiri siirrettiin yksittäisen puhdas häkki aikana 30-60 min. Ulosteet pantiin mikroputkeen ja painotettu ennen lisäksi ja homogenointi steriiliin MilliQ veteen. Havaitseminen ja kvantifiointi ookystien irtoaminen tehtiin immuno-magneettisella erotuksella (IMS) käyttäen Dynabeadsilla anti

Cryptosporidium

(Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska) mukaan toimittajan suositusta ja kuten aikaisemmin on kuvattu [8] , [10]. Ookystien suspensio oli makaamaan immunofluoresenssikokeita ja leimattu FITC-konjugaatti anti

Cryptosporidium

monoklonaalinen vasta-aine (Cellabs Pty.Ldt., Croissy-Beaubourg, Ranska). Numerointi ookystien suoritettiin koko pinnan jokaisen kaivon suurennos x 400 määrä ja loisten ilmaistiin grammaa kohti ulostetta. Tarttuvuus ilmaistiin osuutta eläimistä, jotka saivat tartunnan kullakin annoksella.

Histologinen analyysi ja immunohistokemia

määräajoin tai kun merkkejä välittömän kuoleman ilmestyi, hiiret surmattiin kivuttomasti CO

2 hengitysteitse . Vatsa ja ohut- ja umpisuolen alueet poistettiin kustakin hiirestä, kiinnitettiin 10% neutraaliin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Jaksot 5 pm paksu värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla (Leica Autostaineriin-XL, Rueil-Malmaison, Ranska) tai käyttää immunohistokemiaa.

Vauriot eri sivustoja pisteytettiin mukaan ”nimikkeistössä histologisen arviointi Suolen kasvaimia jyrsijä ”, ja verrattuna” Wienin luokitus ”epiteelin neoplasia ruoansulatuskanavan ihmisille”, kuten aiemmin on vähäisin muutoksin [8], [10]. Lyhyesti: 0, ei vauriota; 1, tulehdus ja /tai regeneratiivista muutoksia; 2, huono laatu intraepiteliaalinen neoplasia (LGIEN); 3, korkealaatuista intraepiteliaalinen neoplasia (HGIEN), karsinooma in situ (rajoitettu epiteelin) tai intramucosal adenokarsinooma (invaasion lamina propriaan tyvikalvon läpi rauhasten). 4, submukoosinen adenokarsinooma kun rauhaset läpäisevät muscularis limakalvon; 5, invasiivisia adenokarsinooma kanssa hyökkäyksen kautta muscularis osaksi subserosa.

Seuraavat histokemiallisen ja immunohistokemiallista analyysit suoritettiin käyttäen BenchMark XT värjäytymistä moduuli (Ventana lääketieteellinen järjestelmä, Meylan, Ranska).

Volgens-Gomori tahra (retikuliinin) [13] käytettiin arvioimiseksi tyvikalvon eheyden. Hiiren monoklonaalinen vasta-aine ja sytokeratiini (laimentamaton) (AM071-5 M; Biogenex, Alankomaat) käytettiin merkitä epiteelisoluihin. Lihassyiden värjättiin käyttäen anti-alfa-sileän lihaksen aktiini monoklonaalinen vasta-aine (laimennus 1:100) (M0851; Dako, Tanska). Leikkeet tutkittiin käyttämällä Leica DMRB mikroskooppi varustettu Leica digitaalikamera kytketty Imaging Research Jäljitys analyysijärjestelmää (Jäljitys ohjelmisto, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta).

kvantifiointi loisten hiirikudoksessa

DNA uutetaan formaliinilla kiinnitetyt paraffiiniin upotetut kudosnäytteet.

parafiini embeded kudosten ohut- ja umpisuolen alue 17 hiiret olivat saatavilla molekyylitason analyysia. DNA uutettiin seos 2 osien 25 um kunkin kudoksen lohkon. Histologinen osat käsiteltiin käyttäen ksyleeniä ja etanolia parafiinin poisto ja sitten nesteytyksestä. Häiritä ookystista, näytteet pakastettiin (-80 ° C, 5 min) ja sulatettiin (99 ° C, 4 min) kuusi kertaa ja oli viime sonikoitiin 1 min ajan. Sitten DNA uutettiin käyttämällä NucleoSpin kudoksen (Machery Nagel, Düren, Saksa) valmistajan ohjeiden paitsi, että proteinaasi K digestio suoritettiin yön yli.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR) määritykset.

Kaksi TaqMan kehitettiin:

Cryptosporidium

Taqman määritys ja talon hiiren Taqman-määritys. Alukkeet ja TaqMan-koettimella on käytetty

Cryptosporidium

qPCR määrityksessä olivat ilmoittamien Fontaine ja Guillot (2002) [14], että sijoitettu sisällä erityistä 452 ep: n sekvenssi (GenBank AF188110) läsnä yhtenä kopiona genomin. Eteenpäin ja käänteisalukkeet monistettiin 138 emäsparin fragmentti. Fluoresoiva TaqMan-koetin leimattiin 5′-päähän 6-karboksi-fluorescine (FAM) reportterivärin ja 3 ’päättyy musta aukko sammuttaja 1 väriainetta (BHQ 1). Hiiren Taqman määritys, tavoite oli beeta-aktiini-geeni (GenBank AC144818), yhden kopioluvun taloudenhoito geeni. Eteenpäin (5’-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3 ’) ja reverse (5′-CTGAGAAGCTGGCCAAAGAGA-3′) suunniteltiin alukkeet monistamaan 68-pb fragmentti. Fluoresoiva-TaqMan-koettimella (5’-CCCAGGTCAGTATCCCGGGTAACCC-3 ’) leimattiin 5′-pääty heksakloori-6-karboksifluoreseiini (HEX) reportterivärin ja 3’ päättyvät BHQ-1 vaimenninväri.

kukin monistaminen suoritettiin 25-pl reaktioseosta, joka sisälsi 1 x iQ ™ Supermix (Bio-Rad, Ranska), 400 nM kutakin

Cryptosporidium

alukkeen tai 200 nM kutakin aktiinin aluketta, 100 nM

Cryptosporidium

koettimena tai 50 nM beeta-aktiinikoettimella ja 5 ui DNA-näytettä. QPCR reaktiot suoritettiin Roottorin Gene 6000 väline (Corbett Research, Qiagen, France) ja sisälsi alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 15 min, mitä seurasi 49 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 s ja hehkutus /laajennus 60 ° C 1 min ajan. Fluoresenssimittaus tehty välittömästi kunkin hehkutus /pidennysvaiheesta.

Kaikki näytteet mitattiin kolmena kappaleena jokaisessa määrityksessä ja negatiivisia kontrolleja ilman malliin sisällytettiin kuhunkin PCR aikavälillä. Kiertämiseksi vaikutuksen PCR-inhibiittorit, kukin DNA-uutetta testattiin puhdas tai laimennettuna 10 ja 100-kertaisesti. Vahvistusta ja data-analyysi suoritettiin Roottorin-Gene 6000 ohjelmisto.

kvantifiointi standardeja ja normalisoituminen loisia kudoksissa.

Erityisiä ulkoisia standardeja rakennettiin sekä tavoitearvon kiinnostavia geenejä kloonaamalla fragmentti plasmidiin.

Cryptosporidium

ja kudosten standardi käyrät sitten tuotettu kuusi sarjalaimennoksia plasmidi-DNA tunnetuilla määriä panos kappale, kussakin reaktiossa. Lineaarinen regressio standardien laimennussarjan ja laskemalla vastaava R

2 arvot suoritettiin käyttäen Rotor-geenin ohjelmisto. Tarkkuus absoluuttisia perustuu oletukseen, että DNA: n monistuksen tehokkuus on samankaltainen standardin ja tutkitut näytteet. Testata mahdollinen vaikutus plasmidi-DNA genomisessa DNA: n kvantifiointiin, lineaarisuuden ja tehokkuus sekä qPCR määritykset arvioitiin myös sekä genomista

Cryptosporidium

ja hiiren DNA. Määrä

Cryptosporidium

genomin ja hiiren beeta-aktiini-geenin kopioita monistusreaktiot lasketaan automaattisesti ohjelmiston Viittaus ulkoiseen plasmidi standardin käyriä. Tarkkaa vertailua loisen infektion kudosnäytteistä, määrä yhteensä isäntä-DNA kussakin näytteessä normalisoitiin TaqMan qPCR hiiren beeta-aktiini-geenin. Quantitative loinen taakka Aineisto siis ilmaistiin suhteena

Cryptosporidium

genomin numero yli hiirigenomissa määrä kunkin näytteen. Kuitenkin helpoin vertailu näytteiden vaihtelut näytteessä kuorman korjattiin normalisoituminen

Cryptosporidium

genomin kopioiden 10

6 beeta-aktiini kopiota.

Tilastollinen analyysi

Fisherin testiä (kaksisuuntainen) käytettiin analysoimaan tarttuvuuden (vertaamalla ryhmien tartunnan annoksilla huonompi 10 tai suurempi 10 ookystille) tai loinen kuormia kudoksissa. Varianssin analyysiä (ANOVA) suoritettiin tilille vaikutusten merkityksellisiä tekijöitä (siirrosten, päivä Pl) ja niiden välinen vuorovaikutus päivittäin ookystien erittymiseen. Tietojen analysointi suoritettiin tilasto-ohjelmalla Graphpad. Merkitys määriteltiin P 0,05.

Tulokset

Jotta voitaisiin arvioida infektion alttius hiiriä altistettiin kalibroitu suspensioina, jotka sisältävät eri aiottua annosten määrä ookystien ulosteeseen arvioitiin säännöllisesti. Kaikki annokset sisältävät eri määriä ookystien paljasti olevan infektoivia Dex saaneilla SCID mutta lisäämällä ookystien annokset johtaa kasvuun tason tarttuvuutta (P = 0,01). Kaksi 7 hiiret (28,5%) inokuloitiin aiottu annos 1 ookystien, 6/8 hiirtä (75%), joka vastaanottaa aiottu annos 10 ookystien, ja kaikki hiiret inokuloitiin aiotun annoksilla 10

2 ja 10

5 elinkelpoinen ookystien kehittynyt krooninen infektio kunnes eutanasia (45-100 päivää PI). Mikään negatiivinen kontrolli hiiret poistetaan ookystien suun kautta ymppäyksen joko PBS: ää tai 10

5 lämpöinaktivoitua ookystien (taulukko 1).

rakenteessa ookystien erityksen eri ryhmien on esitetty kuviossa. 1. Päivänä 7 P.I. ookystien leviämistä havaittiin hiiriä ryhmissä 2, 3 ja 4 (altistettiin 10, 100 ja 10

5 ookystien), mutta ei eläinten ryhmässä 1 (altistettiin yhden ookystien). Parasite irtoaminen eläinten tästä jälkimmäiseen ryhmään havaittiin ensimmäisen kerran 15 päivän kuluttua P.I. ANOVA koko datajoukon osoittivat, että päivänä P.I. ja inokulaatti koko vaikuttaa merkittävästi geometriset keskiarvot ookystien sheding (P = 0,02 ja 0,005, tässä järjestyksessä): klo 75 päivää PI, hiiret inokuloitiin aiotun annoksina 1, 10, 100 ja 10

5 ookystien oli kertomalla 3,3 , 3,25, 2,26 ja 1,45 log vastaavasti verrattuna alkuperäiseen inokulaatti. Sen jälkeen, kun 45 päivää infektion jälkeen, kaikki ryhmät hiirillä on keskiarvo ookystien irtoaminen parempia 10000 ookystien /g vahvistaa suuri lisääntymisnopeus loisen kasvun pienemmillä annoksilla.

Kokeellinen inokuloitiin aiotun annoksilla 1 , 10, 100 ja 10

5 ookystien. Jokainen piste edustaa yhtä hiirtä, rivit ollessa geometriset keskiarvot ookystien irtoaminen per ryhmä. Vain eläimille ookystien irtoaminen tarkalla hetki päivässä ovat edustettuina. Yksikään hiiristä infektoitunut yhdellä ookystien vapauttaa loiset kunnes päivä 15 (ks materiaali ja menetelmät ookystien irtoaminen arviointi).

jälkeen histologinen tutkimus kudosten, ruoansulatuskanavan uudisvaurioiden (taulukko 1) havaittiin kaikissa Dex saaneilla SCID-hiiriin tartunnan

C. parvum

riippumatta ymppi (kuvio 2).

. Invasiivinen adenokarsinooma antropyloric alueella (nuolet) Hiirten 100 päivää P.I .. Bar = 1250 pm (hematoksyliinillä ja eosiinilla). B. Invasiivinen adenokarsinooma antropyloric alueen hiiren 100 päivää P.I. osoittaa loisia sisällä rauhaset (nuolet). Bar = 50 um (hematoksyliinillä ja eosiinilla). C. Adenooma on ohut- ja umpisuolen alueella hiiren 45 päivää P.I .. Bar = 625 um. D. Laadukas intraepiteliaalisten neoplasia on ohut- ja umpisuolen alueella hiiren 45 päivää P.I. lukuisia loisia (nuoli) sisällä rauhaset. Bar = 25 pm (hematoksyliinillä ja eosiinilla).

vatsaan, neoplastisia leesioita lokalisoitu antropyloric alueella ja havaittiin jo päivä 45 P.I. kaikissa ryhmissä tartunnan hiirillä. Päivänä 45 P.I. nämä leesiot kuvattiin huono laatu intraepiteelinen neoplasia (LGIEN) tai invasiivisia adenokarsinooman ryhmille 1 ja 2, sekä korkealaatuista intraepiteliaalinen neoplasia (HGIEN) tai invasiivisia adenokarsinooman ryhmille 3 ja 4 (taulukko 1). Päivänä 100 PI, havaitsimme läsnäolo adenokarsinooma submucosa tunkeutuvat ulkoisten muscularis kerroksen Antro-pylorique alue hiiren siirrostettiin yhden ookystien (kuviot 2A, 2B).

ileo- umpisuolen alue, jossa aiottu annoksilla 1 ja 10 ookystat polypoid limakalvo (adenooma), joka sisältää LGIEN ja HGIEN vaurioita havaittiin vastaavasti 45 ja 100 päivää PI (Kuviot 2C, 2D). Suuremmilla inokulaatin (100 ookystaa) HGIEN havaittiin aiemmin (päivä 45 P.I.). Retikuliini- värjäys ja sytokeratiinia immunologiseen merkintöjä sallitaan vahvistuksen HGIEN: pirstoutunut tyvikalvon ja neoplastisten epiteelisolujen lamina propia havaittiin. Nämä muutokset, jotka ovat tyypillisiä intramucosal adenokarsinooma, havaittiin hiirillä ryhmän 3, kun vain 80 päivää PI. Uudisvaurioiden näytti olevan vaikeampia vatsassa kuin ohut- ja umpisuolen alueelle.

kvantitatiivinen analyysi

Cryptosporidium

DNA ohut- ja umpisuolen kudoksia, 17 hiiret valittiin. Standardi käyrät tuotetaan sekä

Cryptosporidium

ja beeta-aktiini osoitti toistettavan lineaarinen suhde Ct-arvon ja log muuttaneet määrä kopio yli lähes viisi kertaluokkia DNA laimennus. Korrelaatiokerroin saatu lineaariregressioanalyysillä kolmen itsenäisen kokeen oli R

2 = 0,99 sekä

Cryptosporidium

ja hiiri plasmideja. DNA: n monistuksen tehokkuus oli 99%

Cryptosporidium

ja 89% hiiren. Standardikäyrät suoritettiin myös

Cryptosporidium

genomista DNA: ta sekä hiiren genomista DNA: ta. Molempien, piirtämällä delta Ct-arvoja (Ct plasmidi-DNA: – Ct genomista DNA: ta) vastaan ​​logaritmi laimennuskertoimet johti käyrän kaltevuus pienempi kuin 0,1 (dataa ei ole esitetty), mikä osoittaa, että plasmidi-DNA voidaan käyttää määrittämään genomisen DNA: .

määrä

Cryptosporidium

ja määrää hiiren DNA kunkin näytteen kvantitoitiin interpoloimalla vastaavasta Ct-arvot standardin käyriä

Cryptosporidium

DNA ja ja hiiren beeta-aktiini-geenin. Tasot loinen DNA kudoksissa tutkittiin eläimiä on esitetty taulukossa S1. Kaikkiaan 14 15: sta tutkittiin ympätty hiiret kolonisoituu

Cryptosporidium

.

loista kuorma kudoksissa hiirien ympätty korkeampi inokulaatin (10

5) oli korkeampi verrattuna hiiret ympättiin pienillä annoksilla (≤100 ookystaa) (p 0,001). Kuitenkin, kun verrataan kudos kuormat samalla P.I. (45 päivää) pienimmän ja maksimaalinen inokulaatti, hiiri nro 12, ympätty 100000 kertaa enemmän ookystien kuin hiiri nro 1, oli vain 3,6 kertainen enemmän loinen kuormia. Ei

Cryptosporidium

DNA löydettiin yhdellä hiiren (nro 7) inokuloitiin 10 ookystien (taulukko S1). Tämä hiiri kehitettiin ei infektiota eikä uudisvaurioiden, mikä vahvistetaan myös IMS-DFA.

6 näytettä,

Cryptosporidium

qPCR ollut positiivinen kaikilla 3 rinnakkaisnäytteiden olettaen Poisson jakauma mallin, kun havaitaan hyvin pieni kopio numerot kohde. Tällaisille näytteiden saadut Ct-arvot olivat välillä 39 ja 40 merkitsee sitä, että PCR-reaktio sisälsi teoreettisesti 1 genomin kopio. Itse asiassa detektioraja määrityksen päästiin ja emme voi yrittää kvantifiointiin kanssa hyväksyttävän tason tarkkuus ja luotettavuus. Ajot

Cryptosporidium

qPCR testattiin näytteitä alhaisemmalla laimennuskohtaan saadakseen pienempi Ct-arvoja. Epätodennäköistä, niitä ei validoitu johtuen negatiivinen PCR tulos (Ct puuttuminen) tai koska keskimääräinen siirtymät Ct eivät tuota odotettua muutosta (noudattaen 10-kertainen laimennus).

Histologinen iholeesiot liittyy aina loiset, koska se havaittiin mikroskoopilla (kuviot 2B, 2D) ja qPCR (taulukko S1). DNA havaitseminen loisia qPCR vahvistavat, että vaikka hiirten alhaisin loisia kuormien kudoksissa oli neoplastisia vaurioita. Kumpikaan loiset eikä vaurioita havaittiin negatiivinen kontrolliryhmissä (hiiret inokuloitiin PBS ilman loisia tai lämpöinaktivoitua ookystien) (taulukot 1, S1).

Keskustelu

Esillä olevat havainnot osoittavat, että Dex saaneilla SCID hiiret ovat alttiita tartunnalle erittäin alhainen

C. parvum

inokulaatin koot 1 ja 10 ookystat. Nämä ympätty kalibroitu annokset arvioitiin useita kertoja mikroskooppinen tarkkailu (katso materiaalit ja menetelmät ja taulukko 1). Tämä eläinmallissa Dex käsiteltyjen SCID hiirillä on korkea herkkyys

C. parvum

infektio ja voi olla erittäin hyödyllistä arvioida esiintyminen loinen kliinisissä tai ympäristön näytteitä joista ookystien hinnat voivat olla hyvin pieni (esim vesijohtovettä, syötävien kasvisten, hyönteiset).

Vertasimme tulokset toimitettavien tietojen kanssa aiemmin toisen eläinmallissa kortikoideja käsitellyiltä C57BL /6N hiiriä infektoitunut yhdellä ookystien samaa

C. parvum

Iowa eristää [15]. He löysivät 17% tarttuvuudesta istuttamisen jälkeen yhden ookystien verrattuna 29% tutkimuksessamme [15]. Koska nämä kirjoittajat myös keskusteltu, eri syyt voivat selittää sen, että ei jokainen hiiri tuli tartunnan yhdellä loinen [15]: ookystien ei ollut läsnä inokulaatin johtuen Sarjalaimennosten menetelmässä ookystien voisi jäädä mittari syöttöaukko aikana inokulaation ookystien ei päässyt suolistoon tai se ei ollut kannattava aikaan rokotus (a elinkelpoisuus on 50% mitattiin massasuspension).

Lisäksi tutkimuksessamme eläimillä altistettiin alhainen siirrosainetta kehittynyt krooninen infektio ja karistanut ookystat ilman kiinteää tai lasku vaiheessa loppuun kokeen.

malli immunosupressed C57BL /6 aikuisen hiiren [15] testattiin myös leviämistä

C. meleagridis-

(lajien linnut) ja 50% hiiristä altistettiin yhdellä

C. meleagridis-

ookystien saivat tartunnan [16]. Kuitenkin huolimatta syvä immunodepression SCID-hiirten, monistettiin edelleen Dex annostelu-, nämä eläimet olivat ilmeisesti ei alttiita isolaatit muiden

Cryptosporidium

lajeja kuten

C. meleagridis-

(julkaisemattomat havainnot),

C. hominis

(ihmisistä) tai

C. molnari

(kalasta

Sparus auratus

) [10]. Näin ollen, kuten se on kuvattu muita opportunisti parasiittitauteja, immunosuppressio voi olla ei riitä rikkoa lajirajan (tai isäntä-lajikohtaisuus) [17].

Kuitenkin, vaikuttavin havainto Tässä työssä on osoitus siitä, että tartunta pienillä annoksilla, vaikka vain yksi ookystien on

C. parvum

voivat johtaa kehitystä ruoansulatuskanavan invasiivisia adenokarsinooma. Osoitimme aikaisemmin, että mallimme Dex-käsiteltyjen SCID hiirillä oli hyödyllistä arvioida kykyä

C. parvum

aiheuttaa ruoansulatuskanavan adenokarsinooma eläimillä inokuloitiin annoksilla välillä 10

5 ja 10

8 ookystien [7], [8], [10], mutta vähimmäismäärä ookystien kykenee indusoimaan tällaisia ​​vaurioita ei ollut tiedossa vasta nyt. Itse asiassa, koska se oli aikaisemmin havaittu, kun infektio korkeampi inokulaatit (10

5-10

7)

C. parvum

Iowa-kantaa [7], [10], tässä tutkimuksessa uudisvaurioiden (LGIEN ja HGIEN) havaittiin jo päivä 45 P.I. sekä vatsassa ja ohut- ja umpisuolen alueelle Dex käsiteltyjen SCID altistettiin tarkoitettu annoksilla 100, 10 tai jopa yhden ookystien, ja nämä muutokset voivat myös kehittyä invasiivisen adenokarsinooma etenee kaikkien kerrosten läpi mahalaukun ja ohut- ja umpisuolen alue.

Tasaisen, havaitsimme, että hiirillä ympätty alhainen inokulaatit parasiitin eritys lisääntyi nopeasti saavuttaen keskiarvo ookystien irtoaminen yli 10000 ookystien /g ulostetta 45 päiväksi PI. näyttää siltä, ​​että muutamat ookystien ympätty hiirille oli tärkeä kerto- ja että kasvu ookystien ympätty annoksina nostaa tarttuvuutta, mutta ei välttämättä leviämistä loisten ja patologinen tulos.

koeinfektioita immunokompetenttien eläimiä, eri havainnot ovat on raportoitu. Karjaa, istuttamisen jälkeen niin vähän kuin yksi punasolujen tartunnan

Babesia bovis

, toinen Apicomplexan loinen oli lisäämistä prepatent aikana (kuten myös havaittu) mutta korkea sairastuvuus ja kuolleisuus eläinten ei muuttunut verrattuna tartunnan saaneiden korkeampi inokulaatit [18]. Nämä havainnot ovat ristiriidassa näiden infektioiden kanssa haemoparasite

Theileria parva

, jossa infektio nautaeläimet on alhainen siirrosainetta alensivat taudin vakavuuden ja alemman kuolleisuuden [19]. Mielenkiintoista on, että tutkimuksissa

Eimeria

tartuntaa kanoja ja rotilla, se oli erityisen merkillepantavaa, että suurimmalla tartuttamisesta annoksen määrä ookystien tuotettujen kohden ookystien ympätty oli pienempi [20].

Toisaalta edellisessä tutkimuksessa ookystien irtoaminen istuttamisen jälkeen 10

5 ookystien oli paljon suurempi [8].