Krooninen sairaus

tiivistelmä

Solunulkoisilla adenosiini-5′-trifosfaattia (ATP) on signalointi molekyyli, joka indusoi lukuisia vaikutuksia vaihtelevat solujen jakautumisen modulaatioon syöpäsolujen käyttäytymistä. Kolorektaalisyövässä, ATP raportoitu stimuloivan epiteelisolujen lisääntymistä ja mahdollisesti edistää vastustuskykyä syövän hoitomuotoja. Kuitenkin tarkka rooli tämän vaaran-signalointimolekyyli on syöpä suolen epiteelisolujen (IECS) vastauksena kemoterapeuttisten aineiden on edelleen tuntematon. Käsitellä sitä, kuinka ATP voidaan vaikuttaa vaste syövän IECS ja kemoterapeuttiset aineet, käytimme Caco-2-soluihin, jotka esittelevät suoliston kaltaisia ​​piirteitä, vaikutuksen määrittämiseksi ATP ilmaisun monilääkeresistenssin liittyvä proteiini 2 (MRP2). -Geenin ja proteiinin ilmentyminen määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) ja Western-blottauksella. Kestävyys etoposidin, sisplatiinin ja doksorubisiinin määritettiin MTT määrityksiä vastauksena ATP stimulaation Caco-2-solut ja soluja, jotka MRP2 ilmentyminen alas-säädellä shRNA. ATP lisääntynyt ilmentyminen MRP2 sekä mRNA ja proteiini tasoilla. MRP2 ilmentymisen mukana ATP-riippuvainen stimulaation MEK /ERK-signalointireitin, joka liittyy kasvuun suhteellisen resistanssin Caco-2-solujen etoposidia. Poistaminen MRP2 ilmaisun käyttäen shRNA vähensi merkitsevästi suojaava vaikutus MRP2 kohti etoposidi sekä sisplatiini ja doksorubisiini. Tutkimuksessa kuvataan mekanismi, jonka ATP voi myötävaikuttaa chemoresistance syöpä IECS kolorektaalisyövässä. Koska heterogeenisuus paksusuolen adenokarsinooma vastauksia syöpälääkkeet, nämä havainnot edellyttävät jatkotutkimuksia ymmärtää roolin P2-reseptorien syövän lääkehoidon ja kehittää uusia hoitoja, joiden tarkoituksena on säännellä P2-reseptorin aktiivisuutta.

Citation: Vinette V, Placet M, Arguin G, Gendron FP (2015) monilääkeaineresistenssin-Associated Protein 2 Expression ylössäädellään by adenosiini-5′-trifosfaatti in peräsuolen syövän solut ja parantaa heidän Survival kemoterapeuttisia Drugs. PLoS ONE 10 (8): e0136080. doi: 10,1371 /journal.pone.0136080

Editor: Hendrik W. van Veen, University of Cambridge, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2015 Hyväksytty: 29 heinäkuu 2015; Julkaistu: 21 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Vinette et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Kanadan Institutes of Health Research -toimintatukea (MOP-286567) ja FPG F.P.G. on jäsenenä FRQS rahoittaman ”Centre de Recherche du Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke”.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kolorektaalisyöpä (CRC) käsittää epänormaali leviämisen suolen epiteelisolujen (IECS) johtuvat spontaani geneettisiä muutoksia tai seurauksena jatkuva loukkauksia kuten potilailla, joilla on pitkäaikainen krooninen tulehduksellinen suolistosairaus [1,2]. Progression yksinkertaisesta kasvainleesioksi on adenokarsinooma ei koske ainoastaan ​​sisäisiä piirteitä, kuten ilmaus onkogeenien kuten

c-MYC

tai tukahduttaminen /mutaatio estogeenien kuten

TP53

,

mutta myös

osallistuminen joukko liukoisen sääntelyyn tekijät kuten sytokiinit, joista TGF-β on hyvin dokumentoitu pro-tuumorigeenisia tekijä [1,3]. Äskettäin solunulkoinen adenosiini-5′-trifosfaattia (ATP) on todettu olevan vaaraksi-signalointi molekyyli erittyvän aikana tulehduksen ja kasvaimen mikroympäristössä houkutella immuunijärjestelmän soluja ja koordinoida syöpäsolujen käyttäytymistä [4,5]. Kasvaimen läheisyydessä todettiin, että ATP keskittymä voi saavuttaa 100 mm, mikä on selvästi yli pitoisuus aktivoimiseksi tarvittavat nukleotidin reseptoreihin [6,7].

Solunulkoisilla ATP on endogeeninen agonisti P2X reseptorin perheen ligandin ionikanavien ja rajoitettu määrä P2Y alaryhmään G-proteiiniin kytkeytyneiden reseptorien, nimittäin ihmisen P2Y

2 ja P2Y

11-reseptorit [8]. Vuonna kiinteitä kasvaimia, kuten CRC, ATP osoitettiin vähentävän kasvua korkealaatuisesta virtsarakon syöpäsolujen sekä

in vitro

ja

in vivo

[9]. Kliinisissä yhteyksissä, ATP infuusioiden potilaille, joilla on edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä todettiin parantaa merkittävästi elämänlaatua ja kokonaiselinaika saaneilla infuusioita

vs

. plasebo kohortti [10-12]. Kuitenkin vaikutus ATP suoliston epiteelisyöpäsolujen ei ole yhtä selvästi määritelty.

In vitro

, ATP raportoitu lisäävän Caco-2-solujen proliferaation kautta aktivointi MAPK signalointiryöpyn [13], joka johtaa kirjoittajat viittaa siihen, että ATP voi toimia mitogeeni on syöpä IECS ja mahdollisesti mukana vastarintaa hoitoon. Toinen tutkimus kertoo, että korkea ATP pitoisuudet ( 1 mM) tukahdutetaan Caco-2 solujen lisääntymistä [14]. Se on jopa ehdotettu, että anti-kasvain immuniteetin seurausta kemoterapiasta voi välittää ATP: n vapautuminen kasvainsoluja ja aktivointi NOD-kaltainen reseptori perhe, pyrin domeenin, joka sisältää 3 (NLRP3) inflammasome [15], mikä viittaa siihen, osallistuminen purinerginen reseptorin P2X7 [16,17]. Kuitenkin P2X7 yhdessä P2Y reseptorien on myös liittynyt kasvain edistäminen [18,19]. On siis selvä tarve selventää toimintaa ATP CRC.

Yli 40 vuoden ajan, valtavirran hoidon kehittyneitä CRC sillä ollut yhdistelmä DNA: ta vaurioittavien huumeiden, kuten etoposidi tai 5-fluorourasiilia (5 -FU) yhdistettynä alkylointiaineilla sisplatiini tai oksaliplatiinia sekä doksorubisiinin ja sen johdannaiset [20-24]. Vaikka useimmissa tapauksissa CRC ovat etoposidin kestävät, on olemassa tutkimuksia, jotka kannattaa käyttää tätä topoisomeraasi II: n estäjä yhdessä resveratrolin tai FTY720 (fingolimodin) välttämiseksi lääkeresistenssin [24,25]. Kuitenkin, tietyn luokan proteiineja, jotka kuuluvat ATP-Binding kasetti (ABC) superperheen voivat häiritä tehoa tällaisista hoidoista johtuen niiden kyvystä viedä kemoterapeuttiset aineet ulos soluista [26]. ABC kuljettajat käsittää seitsemän subfamilies (A-G). Perhe C (Abcc) on 13 jäsentä, joista yhdeksän on kuvattu monilääkeresistenttisyyden liittyvien proteiinien (MRPs), jotka sisältävät MRP2 (ABCC2) [26]. Syövän, positiivinen ilmaus MRP2 on liittynyt sappirakon syöpä aggressiivisuus ja huono ennuste [27] sekä chemoresistance ja huonon ennusteen potilailla, joilla on ruokatorven okasolusyöpä [28]. Vaikka kasvu MRP2 transkriptin ilmentyminen on mitattu paksusuolensyöpä kudoksissa, ei korrelaatio on tähän mennessä välillä MRP2 ekspressiotasot ja sairauden vakavuuden tai ennusteeseen [26]. Kuitenkin, ekspressio MRP2 on merkittävästi liittyy lisääntynyt resistenssi sisplatiinin, mutta ei 5-FU, viitaten rooliin paksusuolensyöpä vastustuskyky valittu kemoterapeuttisten [26,29]. Edellä esitetyn Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia, stimulaatio suolen epiteelin syöpäsolujen ATP johtaa modulaation MRP2 ilmaisun, jota olettaa aiheuttaisi lisääntynyt tuumorisolujen resistenssiin tietyille kemoterapeuttisten lääkkeiden ja näin ollen olla haitallisia kolorektaalisen syövän lisäämällä eloonjäämisen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), penisilliini-streptomysiiniä, HEPES ja sikiön naudan seerumia (FBS) hankittiin Wisentin (St. Bruno, QC, Kanada). GlutaMax oli Life Technologies (Burlington, ON, Kanada). ATP, suramiini ja pyridoxalphosphate-6-atso- fenyyli-2 ’, 4’-disulfonihapon (PPADS) olivat Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Kanada). MEK1 /2 (UO126), p38 MAPK (SB203580), PI3K (LY294002) ja NF-KB: n (BAY-11-7082) estäjiä sekä 3- (4,5-dimetyyli-2-tiatsolyyli) -2,5 difenyyli-2H-tetratsoliumbromidia (MTT) hankittiin Calbiochem (Mississauga, ON, Kanada). Dimetyylisulfoksidi (DMSO) oli Fisher Scientific (Ottawa, ON, Kanada). Kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​MRP2 ja β-tubuliinia ostettiin Cell Signaling Technology (Pickering, ON, Kanada). (HRP) konjugoitua aasin anti-kani-lgG oli Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA) ja ECL reagenssi Milliporesta (Toronto, ON, Kanada). Sytotoksinen lääkkeet etoposidin, sisplatiinin ja doksorubisiinin ostettiin kemoterapian apteekista Université de Sherbrooke Hospital Center (Sherbrooke, QC, Kanada).

Cell Culture

Ihmisen koolonkarsinoomasolulinja Caco -2 (ATCC, HTB37) ja ihmisen alkion munuais- solulinja HEK293T- (ATCC, CRL-11268) kasvatettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [30]. Erityiset estäjät lisättiin seerumittomassa elatusaineessa 30 minuuttia ennen nukleotidiin stimulaation kuin on esitetty kuvioissa. Huumeiden -sytotoksisuusmäärityksiä Caco-2-soluja kasvatettiin DMEM-alustassa ilman fenolipunaista.

Generation of MRP2 shRNA solulinjojen

21mer shRNA konstruktit on suunnattu ihmisen MRP2 (NM_000392) hankittiin Sigma-Aldrich MISSION shRNA (St. Louis, MO). Lentivirukset tuotettiin HEK293T-soluissa, ja käytettiin Caco-2-solujen infektion, kuten aikaisemmin on kuvattu [31]. Vahvistaa shRNA tehokkuutta, Caco-2-solut kerättiin, ja MRP2 ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR).

Quantitative real-time PCR

Caco- 2-soluja stimuloitiin 100 uM ATP: 3 ja 6 tuntia. Kokonais-RNA eristettiin Caco-2-solujen TRIzol reagenssia (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) syntetisoitiin 2 ug puhdistettua RNA: ta käänteistranskriptiolla käyttäen SuperScript II -järjestelmää (Invitrogen Life Technologies, Burlington, ON, Kanada). Viisi prosenttia syntetisoitu cDNA: ta käytettiin templaattina qRT-PCR käyttäen Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies, Mississauga, ON, Kanada). Sekvenssi-spesifisiä alukkeita

ABCC2

(geeni, joka koodaa ihmisen MRP2) olivat 5’AGAGCTGGC CCTTGTACTCA -3 ’ja 5′-AGGGACAGGAACCAGGAGTT – 3’. Geenien ilmentyminen oli normalisoitu glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (

GAPDH

) geenien ilmentyminen, kuten aiemmin on raportoitu [32,33].

Drug sytotoksisuusmäärityksissä

Caco-2-soluja ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 7500 solua /kuoppa. Soluja kasvatettiin 24 tuntia, minkä jälkeen etoposidi, sisplatiini tai doksorubisiini lisättiin sopiviin kuoppiin erilaisina pitoisuuksina (10-500 uM) ja soluja inkuboitiin 84 h. Kokeita varten, joissa nukleotidin ärsykkeitä, 100 uM ATP: tä lisättiin sopiviin kuoppiin 6 h ennen kuin lisättiin sytotoksista lääkettä. Tuore nukleotidit lisättiin joka 24. Resistance eri lääkkeiden määritettiin MTT solunelinkykyisyysmääritys kuten valmistaja on kuvannut. Lyhyesti, 20 ui 10 mg /ml MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Väliaine poistettiin 100 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä sekoitettiin ravistimessa 5 minuutin ajan 1500 rpm: llä, jotta liuottamiseksi formatsaanin. Optiset tiheydet mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa (Molecular Devices VERSAmax mikrolevylukijalla, Guelph, ON, Kanada) 560 nm: ssä ja 670 nm: ssä määrittämiseksi tausta signaalin.

Western blotting

Caco-2- soluja stimuloitiin 100 uM ATP: 6 ja 18 tuntia. Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja lyysattiin Triton-puskurissa (40 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,2 mM natriumortovanadaatti, 40 mM glyserofosfaatti, 0,1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia ja proteaasinestäjä seosta Sigma-Aldrich). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad Protein Assay-reagenssia. Näytteitä kuumennettiin 5 minuutin ajan 95 ° C: ssa, suoritettiin 7% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvot proteiinin immunoblottauksella, kuten aikaisemmin on kuvattu [32,33]. Immunoblottauksella ja MRP2 suoritettiin käyttäen 1/1000 laimennus kanin polyklonaalista anti-MRP2 ja spesifisen proteiinin detektoitiin käyttämällä 1: 10000 laimennos HRP-konjugoidulla aasin anti-kani-IgG: n ja visualisoidaan autoradiografiset kalvon käyttäen Millipore ECL chemiluminescence-järjestelmä . Signaali normalisoidaan, kuten on kuvattu, 1/5000 laimennosta kanin anti-β-tubuliinia vasta-aine [32,33].

mittaus ekto-nukleotidaasin aktiivisuus

ATPaasi-aktiivisuus määritettiin kiinnittynyt Caco -2-soluja kasvatettiin 24-kuoppaiseen levyyn sen jälkeen, kun kuvanneet Wink et al. [34]. Lyhyesti, joka tarttuu Caco-2-soluja inkuboitiin reaktioväliaineessa (80 mM Tris-base, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl (pH 7,4)), ja entsymaattisesti entsymaattinen reaktio aloitetaan lisäämällä 0,2 mM ATP: tä 20 minuuttia 37 ° C ° C. Vapauttamaan epäorgaanista fosfaattia (P

i) inkubaatioväliaineeseen mitattiin malakiittivihreälle menetelmällä [35], ja proteiini pitoisuus Soluhomogenaattia määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Spesifinen aktiivisuus ilmaistaan ​​nmol P

i vapautetaan /min /mg proteiinia.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen paritonta

t

testi tai varianssianalyysi (ANOVA) Dunnettin monivertailu testin jälkeen kuvatulla kuvassa legendoja. Määrä rinnakkaisnäytteiden kullekin kokeelle on myös esitetty kuvassa legendoja. IC

50 arvot ekstrapoloidaan eloonjäämiskäyrien käyttämällä ei-lineaarista regressioanalyysiä keskiarvosta kolmesta neljään kokeita. Suhteellinen vastustuskyky tekijä (RR) määritettiin jakamalla IC

50 stimuloitujen tai shMRP2-transfektoitujen solujen IC

50 valvonnan solujen, kuten aiemmin on raportoitu [36,37].

tulokset ja keskustelu

lisääntymisen merkkejä MRP2 ilmaisun ATP välittyy transkriptionaalisella ja proteiinin tasolla P2Y reseptorien

kiinteä kasvain microenvironment on runsaasti kasvutekijöitä, sytokiineja, ja kemokiinit. Nämä tekijät edistävät muodostumista tulehduksellinen mikroympäristön jotka stimuloivat tumorigeneesin [1,38]. Solunulkoinen ATP on myös löytyy runsaasti kasvaimen läheisyyteen [6,7], jossa se voi edistää leviämisen keuhko-, rinta- ja paksusuolen syöpäsoluissa [13,39,40] sekä tukee hyökkäystä eturauhasen syöpäsolujen ja kulkeutumista keuhkojen ja syöpä- IECS [41-43]. Tässä tutkimuksessa, ehdotimme, että ATP: n kasvaimen läheisyydessä voisi edistää lääkeresistenssin niin usein raportoitu potilailla alle kemoterapia peräsuolen syövän [44]. Itse asiassa analyysi MRP2 mRNA: n ekspression IECS stimuloitu 100 uM ATP: 3 ja 6 h käyttäen qRT-PCR osoitti, että nukleotidisekvenssi hoitoja johti 1,5- 2-kertainen nousu ilmentymisen MRP2 transkriptin (kuvio 1A). Ottaen huomioon, että MRP2 säädellään transkriptionaalisella tasolla, MRP2 proteiinin ilmentyminen analysoitiin sen jälkeen. Stimulaatio Caco-2-solujen 100 uM ATP: 6 tai 18 h lisääntynyt MRP2 proteiinin ekspression, määritettynä immunoblottauksella (kuvio 1B ja 1C). Ilmentyminen MRP2 myös voimistuvan 1,5- ja 2-kertainen seuraavat nukleotidin hoitoa, joka arvioidaan densitometria (kuvio 1 C). Vahvistaa, että ylössäätelyyn MRP2 ilmentymisen IECS on todellakin säädellään P2 nukleotidin reseptorit, Caco-2-soluja käsiteltiin kaksi tunnettua yleistä antagonisteja P2-reseptorien, eli PPADS ja suramiinia. Lisäyksen jälkeen jälkimmäisen Caco-2-soluihin ennen stimulaatiota 100 uM ATP: ssa 6 (kuvio 2), Western blot-analyysi paljasti, että PPADS ei ollut merkittävää vaikutusta MRP2 proteiinin ilmentymiseen taas läsnäolo suramiinia johti vähentynyt selvästi ATP-riippuva induktio MRP2 ilmentymisen (kuvio 2). Ottaen huomioon, että ATP on ensisijainen agonisti ihmisen P2X ja P2Y

2 ja 11-reseptoreihin, ja että suramiini on voimakkaampi antagonisti P2Y

2, kun PPADS on voimakkaampi antagonisti P2Y

1, 4, 6 ja P2Y

13 sekä P2X1, 2, 3 ja 5-reseptoreihin [45,46], esillä oleva tulos viittaa siihen P2Y

2 voi olla mukana säätelyssä MRP2 ilmaisua. Vaikka samanlaisia ​​tuloksia saatiin muilla syöpä suolen epiteelisolujen linjojen T84, DLD-1, HT-29 ja HCT116 (tietoja ei ole esitetty), meidän panostettiin Caco-2-soluja, koska nämä solut näyttää tyypillisiä enterosyyttien [47]. Kuten kohonneen ekspression ATP-herkän P2-reseptorien on aiemmin raportoitu sekä ihmisen peräsuolen karsinooma soluissa ja solulinjoissa [48]. Itse asiassa, ilmaus P2Y

2-reseptori, sekä P2Y

4, on raportoitu voimistuvan ihmisen paksusuolen syövän kudoksissa [49]. Aktivointi näiden reseptorien on liittynyt säätelyyn syöpäsolujen kasvua ja vastustuskyky apoptoosin [18]. Samoin P2Y

2 reseptorin ilmentymistä, syöpäkudokset eristetty CRC potilaista osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä MRP2 transkriptipitoisuuksissa verrattuna ei-syöpä marginaalit [29]. Vaikka ATP näyttää olevan tärkein liukoinen tekijä ylössäätelyyn MRP2 ilmentymisen Caco-2-solut, emme voi sulkea pois sitä adenosiini-5′-difosfaatti (ADP) voisi olla vähäinen rooli tässä prosessissa. Koska ADP voitaisiin tuottaa läpi hydrolyysin ATP ekto-nukleosiditrifosfaatin diphosphohydrolase (E-NTPDase, EC 3.6.1.5) läsnä pinnalla Caco-2-solujen [33,50], olemme todenneet, että tarttuva Caco-2-soluilla on ATPaasi-aktiivisuus 1,32 ± 0,04 nmol /min /mg proteiinia. ATP toiminnan on keskimääräinen ± SEM kolmesta kokeesta tehdään kolmena kappaleena. Meidän tulokset viittaavat lisäksi siihen, että stimulointi syöpä IECS ATP kasvattaa ilmentymisen MRP2, proteiinin tunnetaan sen roolista solun resistentiksi useiden kemoterapeuttisten aineiden, joita käytetään kolorektaalisyövän hoitoon [26].

Human suoliston adenokarsinooma Caco-2-soluja stimuloitiin 100 uM ATP: 3 tai 6 tunnin ajan, tai ohjattu ajoneuvon vain (Ctrl). (A) stimulaatiota ATP merkittävästi lisääntynyt

ABCC2

geenien ilmentyminen (koodaa MRP2) 1,5 ja 2-kertainen verrattuna ei-stimuloiduissa Ctrl määritettynä qRT-PCR-analyysillä. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM viidestä erillisiä kokeita suoritettiin kahtena kappaleena. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin yksisuuntaisella ANOVA Dunnettin useita vertailu testin jälkeen. * P 0,05, ** p 0,01 verrattuna Ctrl. (B) Tyypillinen Western blot tulos osoittaa parannettu MRP2 ilmentyminen ATP-stimuloiduista soluista. (C) Densitometri analyysi paljasti, että 100 uM ATP aiheuttama MRP2 proteiinin ilmentymistä yli 1,5-kertaiseksi, kun 6 ja 18 h stimulaation verrattuna ohjaus (Ctrl). Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM viidestä erillisestä kokeesta. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin yksisuuntaisella ANOVA Dunnettin useita vertailu testin jälkeen. * P 0,05 verrattuna Ctrl.

Caco-2-soluja käsiteltiin 100 uM PPADS tai Suramin 30 minuuttia ennen kuin lisättiin 100 uM ATP: ssa 6 tuntia. MRP2 ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella. ATP stimuloi ekspressiota MRP2 verrattuna ei-stimuloitu (N-S) soluja, kun taas lisäämällä Suramin ennen ATP stimulaatio väheni voimakkaasti MRP2 ilmentymistä verrattuna ATP-stimuloitujen solujen läsnä ollessa ajoneuvon (DMSO (-)) vain. Esitetty blot on tyypillistä kolme erillistä kokeita.

modulaatio MRP2 ilmentymistä säätelee MEK /ERK signalointiryöpyn

On hyvin dokumentoitu, että solunulkoisen ATP kautta aktivointi P2Y reseptorien, stimuloi lukuisia solunsisäisiä signalointireitteihin [13,30,41,51]. Nämä reitit ovat pääasiassa liittyy ATP-riippuvainen sääntelyn lisääntymistä [13,14], soluliikkuvuus ja mikrotubulusten uudelleenjärjestely [41], eritys tulehduksellisten tekijöiden, kuten PGE

2 käytettäessä NFKB riippuvaisella tavalla [30] ja modulaatio oksalaatti, elektrolyyttejä ja glukoosin kuljetusta [52-55]. Määrittämään signalointikaskadien osallistuvat säätelyyn MRP2 ilmaisun, Caco-2-solut esikäsiteltiin eri estäjiä, erityisesti BAY11-7082 (NFKB), U0126 (MEK 1/2), LY294002 (PI3K) ja SB203580 (p38) 30 minuuttia ja stimuloitiin sitten 100 uM ATP: ssa 6 tuntia. Solut, jotka käsitelty MEK /ERK signalointiryöpyn estäjä U0126 osoitti merkittävän vähenemisen MRP2 ilmentyminen verrattuna ATP-stimuloiduissa soluissa (kuvio 3A). Densitometria-analyysi vahvisti, että inhibitio MEK-ERK-reitin vähensi merkittävästi MRP2 ilmentymisen 2-kertaiseksi (kuvio 3B). Huomattavaa on, että inhibitio ATP-riippuvainen aktivaatio ERK1 /2-reitin on aiemmin liittynyt väheneminen koolonadenokarsinooma soluproliferaatiota [13], ja kääntäen, lisääntynyt elinkelpoisuus ihmisen kohdun limakalvon strooman soluja [56]. ERK-reitin myös liitetty vastuksen syövän hoitoon säätelemällä ilmentymisen moniresistenttien proteiinien (MDR), mukaan lukien MRP2, haiman syöpäsoluissa [57] sekä Caco-2-soluja [58]. Tuloksemme osoittivat, että ERK signalointi on osallisena ATP aiheuttaman MRP2 ilmentymisen Caco-2 ihmisen adenokarsinoomasolua.

Caco-2-soluja esikäsiteltiin NFKB (2 uM, Bay, BAY11-7082), MEK1 /2 (10 uM, U0, U0126), PI3K (20 uM, LY, LY294003) ja p38 (20 uM, SB, SB203580) estäjät 30 minuuttia ja stimuloitiin 100 uM ATP: ssa 6 tuntia. (A) Tyypillinen Western blot vastaan ​​MRP2 näytetään, josta (B) densitometria-analyysi osoitti merkittävää vähenemistä MRP2 ilmentymisen läsnä ollessa U0126, selektiivinen MEK 1/2 estäjä. Solut esikäsiteltiin U0126 johti 75%: n vähennys ilmentymisen MRP2 verrattuna ATP-stimuloitujen solujen vain (-). Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta, jotka suoritettiin kahtena kappaleena. Tilastollinen merkittävyys määritettiin parittoman

t

-testi, jossa * p 0,05 vs. ei-stimuloitu (NS) tai ATP-stimuloiduista soluista kuten on osoitettu kuvassa.

lisääntynyt ilmentyminen MRP2 syöpäsoluissa antaa resistenssin sytotoksinen lääke etoposidi

Lisääntynyt ilmentyminen MRP2 paksusuolen syöpä on yhdistetty vastus sisplatiinin, mutta ei 5-FU: [29], vaikka

ATP-sitoutumisen kasetti alaryhmä C osa 2

(

ABCC2

) haplotyyppi esitetty ennustaja vaihtelua farmakokineettisen vastauksena FOLFIRI hoito-Japanin CRC potilailla, joka sisältää 5-FU: [59]. Ottaen huomioon, että MRP2 voi viedä erilaisia ​​yhdisteitä, erityisesti sytotoksisten lääkkeiden [60-62], tutkimme vaikutus ATP solun selviytymisen Caco-2-soluja käsiteltäessä kanssa syöpälääke etoposidia. Ensimmäisessä tapauksessa vastus Caco-2-solujen eri pitoisuuksille tämän lääkkeen mitattiin kanssa tai ilman ATP stimulaatiota. Solujen eloonjääminen määritettiin MTT-kolorimetrinen koe. Lisääntynyt solujen eloonjäämistä havaittiin stimuloiduissa soluissa ATP verrattuna ei-stimuloiduissa soluissa (kuvio 4A), joka on käännetty merkittävän kasvun IC

50-arvot (kuvio 4B). Suhteellinen vastus (RR) arvoja eri olosuhteissa laskettiin myös ja havaittiin olevan suurempi stimuloitu ATP verrattuna ei-stimuloiduissa soluissa. RR-arvo 1,84 osoittaa, että ATP-stimuloidut solut olivat 1,84 kertaa enemmän vastustuskykyisiä syöpälääkkeeksi etoposidi (kuvio 4B). Tämä havainto viittaa siihen, että ATP-riippuvainen stimulaation MRP2 ilmaisun lisäsi vastus Caco-2-ihmisen paksusuolen ja peräsuolen adenokarsinooma solujen etoposidi, ja siten mahdollista osallisuutta solunulkoisen ATP: n ja P2Y-reseptorien CRC syövän lääkehoito vastus. Ottaen huomioon, että MRP2 ilmentyminen oli aiemmin liittynyt resistenssin sisplatiinin, nämä tulokset ovat näin ollen yhtäpitäviä sen hypoteesin kanssa, että MRP2 vienti kemoterapeuttiset lääkkeet pois syöpäsolujen [27,28,61] ja näin suosii niiden selviytymistä. Näin ollen nämä tulokset ovat myös mukaisesti ehdotettu rooli P2Y-reseptorien kasvaimen kehittymisen resistenssin hoitoon, kuten aiemmin on raportoitu [13].

Caco-2-soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa etoposidin 84 h läsnä ollessa tai puuttuessa on 100 uM ATP: tä lisättiin 24 tunnin välein. MTT solunelinkykyisyysmääritys käytettiin määrittämään herkkyys lääkkeen. (A) annos-vaste-käyrä sovitettiin tietojen määrittämiseksi toksisuus (IC

50-arvo) lääkkeen. Tulokset esitetään epälineaarinen selviytymisen käyrä tyypillisestä vasteen. (B) IC

50 ja RR arvot esitetään histogrammissa ja tulokset ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta neljään itsenäistä kokeita kolmena kappaleena. Tilastollinen merkittävyys määritettiin parittomia

t

-testi, jossa * p 0,05 verrattuna Ctrl.

mitätöinti MRP2 ilmaisun johtaa vähentynyt vastus solujen kemoterapeuttisten

jälkeen havainto, että ATP-stimuloi Caco-2-soluja, joilla kasvua in MRP2 ilmaisun ja olivat enemmän resistenttejä etoposidi sytotoksisuuden, tutkimme, onko esto MRP2 voisi olla päinvastainen vaikutus. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, MRP2 ilmentymistä mitätöidään Caco-2-soluihin käyttäen shRNA. Lentivirusvektorikonstruktit infektio Caco-2-solujen shRNA suunnattu MRP2 (sh305 ja sh307) lakkautetaan proteiiniekspressiota 90-100% (kuvio 5A). Kuten on esitetty kuviossa 5B, Caco-2-solut mitätöidään ja MRP2 olivat vähemmän vastustuskykyisiä etoposidin hoitoon, jossa IC

50-arvot 328,2 uM ja 108,5 uM shNT ja shMRP2, vastaavasti, RR-arvo 0,33 (Taulukko 1) . Esto MRP2 ilmaisun myös herkistyneet Caco-2-solujen sytotoksista vaikutusta sisplatiinin ja doksorubisiinin (taulukko 1). Kun läsnä on sisplatiini tai doksorubisiini, Caco-2-solut mitätöidään ja MRP2 ilmentyminen oli noin 2,5 kertaa vähemmän vastaa hoitoon, kuten on esitetty vastaavilla RR-arvot 0,36 ja 0,40 sisplatiinin ja doksorubisiini, vastaavasti (taulukko 1). Nämä tulokset ovat siis yhtäpitäviä hypoteesia, jonka MRP2 vienti kemoterapeuttiset lääkkeet pois paksusuolisyövän soluja ja näin suosii niiden selviytymistä. Lisääntynyt ilmentyminen tämän kuljettajaproteiinin ekstrasellulaaristen ATP entisestään tämän resistenssin. Toisaalta, vaimennussäätely MRP2 jonka shRNA johtaa lasku vastus syöpäsolujen huumeiden ja myöhemmin pienenee niiden solujen eloonjäämistä.

(A) Western blot-analyysiä käytettiin arvioimaan alaspäin säätely MRP2 proteiinin ilmentymisen läsnä ollessa kaksi shRNAs kohdistettu proteiinia. Down-regulation saavutettiin lentiviruksen infektio Caco-2-soluihin, kuten aiemmin on kuvattu [31]. shRNA suunnattu MRP2 (sh305 ja sh307) poistetaan proteiiniekspressiota 90-100% suurempi kuin solut, jotka ilmentävät ei-kohdistuksen shRNA (shNT). (B) Caco-2-soluja, jotka ilmentävät stabiilisti shNT tai shMRP2 (# 305) inkuboitiin sytotoksinen lääke etoposidi 84 h. Herkkyys syöpälääkkeeksi määritettiin MTT-solunelinkykyisyysmääritys. Annoksesta vastekäyrä sovitettiin tietojen määrittämiseksi myrkyllisyyden (IC

50 arvo) huumeita. Epälineaarinen eloonjäämiskäyrissä on esitetty keskiarvona ± SEM neljästä kokeesta, jotka suoritettiin kolmena kappaleena. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen useita

t

-testi vertailuja, joissa * p 0,05 verrattuna shNT. Esto ihmisen shMRP2 ilmaisun vähensi vastus Caco-2-solujen Etoposide kontrollisoluihin verrattuna. IC

50 ja RR-arvot on esitetty taulukossa 1.

Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa osoitamme korrelaatio stimulaatio ihmisen paksusuolen adenokarsinooma soluissa ATP kautta P2Y-reseptoreihin ja aktivointi MEK /ERK-reitin sekä ilmentymisen MRP2. Erityisesti, me osoitamme, että aktivointi P2Y-reseptorien ekstrasellulaaristen ATP indusoi ylössäätelyyn MRP2 ilmaisun. Tämä lisääntynyt ilmentyminen MRP2 johtaa lisääntyneen resistenssin ja selviytymistä suoliston syöpä Caco-2-soluja tiettyjen kemoterapeuttisten käytetään kolorektaalisyövän hoitoon. Vaikka rooli P2Y reseptorien kasvaimen kehittymisen hoito ei tehoa on aikaisemmin ehdottanut [13], tämä tutkimus on ensimmäinen, joka ehdottaa mekanismia, jolla tällainen vaikutus voi välittyä. Siksi nämä havainnot edellyttävät jatkotutkimuksia hahmotella roolin P2-reseptorien syövän lääkehoidon ja kehittää uusia hoitoja, joiden tarkoituksena on säännellä P2-reseptorin aktiivisuutta. Koska heterogeenisuus paksusuolen adenokarsinooma vastauksia syöpälääkkeet, seulonta potilaiden P2-reseptorien ja /tai tunnistaminen mutantin muodon P2-reseptorien sekä MRP2 ilmaisu voisi olla hyödyllistä optimointiin anti-syövän hoitomuotoja.

Kiitokset

kirjoittajat kiittää herra Pierre Pothier huolellista käsittelyä ja muuttamalla tätä käsikirjoituksen. F.P.G. on jäsenenä FRQS rahoittaman ”Centre de Recherche du Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke”.