Krooninen sairaus

tiivistelmä

Andrographis lineata

on kasviperäisten lääkekasvi käytetty perinteisen lääketieteen korvikkeena

Andrographis paniculata

. Täällä käyttäen kypsä lehtiä eksplanttien on

.

lineata

osoitamme ensimmäistä kertaa haavasolukko induktion perustettu MS-alustalla, joka sisälsi 1,0 mg l

-1 IAA. Kuivattu callus alistettiin liuotinuuttoon asetonilla. Edelleen asetoni jäännös erotettiin silikageelipylväskromatografialla, kiteytettiin ja tunnettu sen perusteella, ydinmagneettisen resonanssin (protoni ja c13) ja nestekromatografisella massaspektroskopia. Tämä analyysi paljasti esiintyminen kahden tunnetun flavonoideista nimittäin, 7-

O

-methylwogonin (MW) ja Echioidinin (ED). Lisäksi näitä yhdisteitä testattiin niiden sytotoksisuus leukemiasolulinjan, CEM. Tunnistamme, että ED ja MW aiheuttama sytotoksisuuden on ajasta ja pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Edelleen lisäys LDH: n vapautuminen käsittelemällä ED ja MW vahvistivat lisäksi meidän sytotoksisuuden tulokset vastaan ​​leukemiasolulinjan. Silmiinpistävän, MW oli tehokkaampi kuin ED verrattuna trypaanisinisen ja MTT-määrityksiä. Tuloksemme kerrata hyödyllisyyttä kallusviljelmät tuotantoon kasvin tietyn bioaktiivisten sekundäärimetaboliitteja sijaan käyttää luonnonvaraisia ​​kasveja. Yhdessä meidän

in vitro

tutkimukset antavat uusia oivalluksia

.

lineata

kallusviljelmät toimii lähteenä kemoterapeuttisia syöpälääkkeitä.

Citation: Mohammed A, Chiruvella KK, Rao YK, Geethangili M, Raghavan SC, ghanta RG (2015)

In vitro

Tuotanto Echioidinin, 7-

O

-Methywogonin alkaen kallusviljelyt

Andrographis lineata

ja niiden sytotoksisuus syöpäsoluihin. PLoS ONE 10 (10): e0141154. doi: 10,1371 /journal.pone.0141154

Editor: Brett Neilan, University of New South Wales, Australia

vastaanotettu: toukokuu 26, 2015; Hyväksytty: 03 lokakuu 2015; Julkaistu: 21 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Mohammed et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

lyhenteet: MS, Murashige ja Skoog; BA, bentsyyliadeniinijohdannainen; IAA, indoli 3 etikkahappo; NAA, naftaleeni etikkahappo; 2,4-D, 2,4-dikloorifenoksietikkahappo; TLC, ohutkerroskromatografia; NMR, magneettikuvaus; LC /MS nestekromatografia /massaspektrometria; UV, ultravioletti näkyvä spektroskopia; IR, infrapunaspektroskopia; MTT, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia; MW, 7-

O

-methylwogonin; ED, echoidinin; DMF, dimetyyliformamidi; DMSO, dimetyylisulfoksidi; nm, nanometriä; MHz, mega hertsiä

Johdanto

Kaikista syöpien, leukemian pidetään yksi aggressiivinen hengenvaarallisia hematologisia syöpäsairauksia miljoonien potilaiden diagnosoitu vuosittain. Leukemia on todettu olevan erittäin herkkiä kemoterapeuttisten aineiden [1]. Seulonta peräisin olevia luonnontuotteita lääkekasveja ovat lupaavia arvokkaina lähteinä kasvainten hoitoon lääkkeitä. Luonnontuotteet aiheuttavat syöpää ehkäisevistä potentiaaleja estämällä solujen lisääntymisen ja apoptoosin aiheuttamiseksi [2,3]. Kasviuutteita, joilla on syövän vastainen aktiivisuus on seos, kaikkien yhdisteiden läsnä uutteessa sijaan tietyn yhdisteen [4,5]. Tämä vaatii hakusanalla eristettyjen yhdisteiden kanssa hyvin määritelty farmakologisia ominaisuuksia.

In vitro

kulttuureissa työllistää kasvikudosjätteet kulttuuri tekniikka on edullinen ehjä kasvi tuottaa sekundaarimetaboliitteja tuhoamatta luonnollisessa elinympäristössä [6,7,8]. Tämä johtuu siitä, että määrä solujen kasvua ja biosynteesiä viljelmässä aloitetaan pieni määrä kasvien materiaali on melko korkea, on huomattavasti tuotetaan lyhyessä ajassa. Manipuloimalla viljelyolosuhteita, kasvihormonit on arvokas väline kohottamista bioaktiivisten metaboliittien [9]. Tämä on toisin kuin suuri määrä

in vivo

laitoksissa käytetään saada pienen määrän lääkettä.

Tuotanto kasviperäisiä lääkeaineilla on kysymys huomattava sosioekonominen merkitys. Tämä on saanut teollisuuden sekä tutkijat pohtimaan käyttö

in vitro

kulttuureissa vaihtoehtona tarjonta. Tuotanto kasvi sivutuotteiden kasvattamalla erilaistumaton kudosten

in vitro

suuria määriä ovat jo pitkään tunnustettu keinona, jossa sekä kausiluonteisuuden ja aika spesifisyys tuotannon voitaisiin kiertää. Kallusviljelmät lupaavat saada laitteistokohtaisia ​​arvokasta aineenvaihduntatuotteiden hyväksi saannon parantamiseksi bioaktiivisten yhdisteiden, nopeuttaa vauhti säilyttäminen ja lisääminen on tärkeä etninen lääkekasveja [10]. Aiemmat tutkimukset ovat onnistuneet tuotannon sekundäärimetaboliitteja kautta

in vitro

kulttuuri [11,12,13,14,15,16]. Esimerkiksi prenyloituja flavanoneista kuten sophoraflavanone G ja lehmanin saatiin

Sophora flavescens

kallusviljelyssä [17]. Kallus on

Hypericum perforatum

kiertojaksot tuottivat 6-C-prenyyli luteoliini, yhdessä luteoliini-5,3′-dimetyylieetteri, luteoliini-5-glukosidi ja luteoliini-3′-glukosidi [18]. Tärkeää on syövänvastainen yhdiste, kuten taksolin saatiin myös kallusviljelyt Taxus-lajin [19,20,21]. Silmiinpistävän, isoflavonipitoisuudesta alkaen kallusviljelyt Genista lajit olivat enemmän kuin

in vivo

kasveille [22,23].

Andrographis

(akanttikasvit) koostuu 250 sukujen ja 2500 lajia. Kaikista suvut, Andrographis

paniculata

on potentiaalinen merkitys perinteisen lääketieteen hoidettaessa erilaisia ​​sairauksia, koska sen laaja kirjo biologisia vaikutuksia [24,25]. Farmakologisia vaikutuksia

Andrographis

ovat läsnäolon vuoksi flavonoideja, terpenoids ja flavonoidi glykosidit, kuten andrografolidi, echiodinin ja echiodinin 5-

o

-β-D-glukopyranosidi. Andrografolidin ja niiden johdannaisilla on potentiaalista syövän vastaisia ​​ominaisuuksia [26]. 7-

O

metyyli dihydrowogonin, 5-hydroksi-3,7,8,2′-tetrametoksi flavone ja flavone 7-

O

-methylwogonin juuret

.

paniculata

on havaittu [27]. Kallusviljelyt

.

paniculata

raportoitiin olevan 7-

O

-methylwogonin, kalotti flavone I ja 5-hydroksyyli-7,8,2′-trimetoksi flavone [28]. Esiintyminen 7-

O

-methylwogonin on ensimmäinen raportti 2′-deoxyflavone.

Andrographis lineata

käytetään esillä olevassa tutkimuksessa on heimojen lääkekasvi palvelevat niin hyvä korvike

.

paniculata

. Samoin tämä kasvi käytetään lääkärien hoitoon käärme puree, diabetes, ihosairaudet, kuume, ummetus, keuhkoputkentulehdus, syöpä, tulehdus ja stomachic. Se on myös hallussaan antihelmiit- tisiä tulehduksenvastainen, kuumetta alentava ja antiperiodic ominaisuudet [29,30]. Leaf tahnaa käytetään kuivatuksen hengitystieinfektiot kun root keittäminen antidoottina. Flavonoidit yhdessä andrografolidin on raportoitu lehtiuutteista [31]. Farmakologiset tutkimukset lehtiuutteita näkyvissä antibakteerinen, diureetti hepatoprotective ja diabeteslääkkeet toiminta [32,33,34].

Aiemmat tutkimukset

.

paniculata

ovat osoittaneet käyttökelpoisuutta kallusviljelmät tuotantoon sekundäärimetaboliitteja sijasta käyttää villi kasveja. Tämä sai meidät kehittämään callus induktion

in vitro

tuotannon sekundäärimetaboliitteja suhteellisen lyhyessä ajassa ajamalla kausiluonteinen paine ympäri vuoden. Kirjoittajat raportoivat ensimmäistä kertaa perustamisen kallusviljelmät peräisin lehtiä eksplanttien on

.

lineata

. Me osoitamme eristäminen ja rakenteellinen karakterisointi echioidinin (ED) ja 7-

O

-methywogonin (MW) silikageelipylväs- kromatografialla, jota seuraa ydinmagneettisen resonanssin (protoni ja c13) ja nestekromatografisella massaspektroskopia. Lisäksi osoitamme ED ja MW aiheuttamaa sytotoksisuutta vastaan ​​leukemiasoluja aika- ja pitoisuudesta riippuvasti.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja kemikaalit

Kemikaalit kuten NAA, 2,4-D, IAA saatiin Sigma. HgO

2 oli peräisin E. Merck, sakkaroosi Sisco, silikageeli Acme synteettisiä kemikaaleja ja agar alkaen CDH, Mumbai, Intia. DMSO, DMF, asetoni, heksaani, etyyliasetaatti ja metanoli hankittiin Sigma.

Plant Materiaali ja Tissue Culture ehdot Callus induktio

Kypsät lehdet kerätään pellolta kasvatetut kasvit on

.

lineata

käytettiin eksplanttien. Lehdet steriloitiin pinnalta 70% etanoliin 30 sekuntia, jota seuraa huuhtelu steriiliä tislattua vettä, käsiteltiin sitten 0,1%: HgO

2 (w /v) (Merck) 2 min ja sen jälkeen pesemällä steriiliä tislattua vettä. Leikkaus päät eksplantaatit reunustettu terävä steriili kirurginen terät. Lisäksi eksplantaatit valutettiin steriilin suodatinpaperin levyjä ennen inokulointia. Ravinteiden media käyttää esillä olevassa tutkimuksessa oli Murashige ja Skoog elatusainetta, 1962. media oli hyytynyttä agar (0,8%), ja sakkaroosi 3% käytettiin lähteenä hiilihydraattia. PH väliaineen säädettiin sitten 5,6-5,8 ja väliaine lopulta tehty tunnettuun tilavuuteen. Agar lisättiin median ennen annostelua säiliöihin (15 ml 25 x 150 mm koeputkissa), joka autoklavoitiin 15 minuutin ajan 15 lbs /in

2. Sisältäviä koeputkia steriilien pantiin kaltevaan asentoon, jotta pinta-alan kasvattamiseksi median. Kaikkia viljelmiä inkuboitiin kulttuuri huoneessa 25 ± 2 ° C ja suhteellinen kosteus 50-60% ja 16 h valojaksoa klo fotonivuon tiheys 15-20 μ E m

2 s

-1 alkaen valkoinen viileä loisteputket.

MS-alustalla eri pitoisuuksilla auksiinit (2,4-D, IAA ja NAA) vaihtelevat 0,1-1,0 mGL

– l käytettiin tutkimaan niiden vaikutukset callus induktio vaihtelevia pitoisuuksia (taulukko 1). Tämän jälkeen vakiintunut haavasolukko saadaan MS-alustalla, johon on lisätty 1,0 mg l

-1 IAA viljeltiin 4-5 kertaa optimaalisen callus tuotteilleen säännöllisesti 20 päivää inokulaation jälkeen. Tämä tekniikka kallusta induktion tuotantoon sekundäärimetaboliitteja on aiemmin kuvannut eri ryhmien [10,14,23,35].

Extraction, eristäminen ja tunnistaminen Puhdistettu yhdisteiden

.

lineata

Calli

hankitaan calli kuivattiin ensin huoneen lämpötilassa muutaman päivän ja materiaali sitten murskataan hienoksi jauheeksi (750 g). Saatu jauhe alistettiin liuotinuuttoa käyttäen kuumaa asetonia soxhlett ilman- [10]. Kapeana parantaa liuenneen aineen liukoisuutta luonnontuotteita ja, poimii useimmat sekundäärimetaboliitteja. Jotta saadaan maksimaalinen määrä yhdisteiden

Andrographis lineata

kallukset, käytimme asetonia soxhlation kuuman kunnossa. Lisäksi käyttö asetonia talteen liuotin ei ole purkaa lipidejä yhtä tehokkaasti kuin se olisi mikä sekundäärimetaboliitteja. Haihduttamalla uute

vakuumissa

saatiin tummanruskea jäännös, asetoniuute (30 g) (kuvio 1B). Asetoniuuteliuosta suspendoitiin H

2O, jaettiin heksaanilla, jolloin saatiin heksaani liukoisten ja liukenemattomien fraktioiden. Edelleen, me suorittaa heksaania fraktiointia, koska se poistaa ulos klorofylli ja ei-polaaristen.

(A) Callus aiheutettiin alkaen lehtiä eksplanttien MS-alustalla, johon oli lisätty 1,0 mg l

-1 IAA (Bar = 2,5 mm) 4 viikon kuluttua. (B) Kaaviokuva phytochemical analyysi kallusta on

Andrographis lineata

eristämiseksi bioaktiivisten yhdisteiden.

heksaani Liukenematon jäännös (20 g) kromatografoitiin silikageelillä käyttäen heksaani- etyyliasetaatti gradienttieluenttina, ja vastaavat fraktiot yhdistettiin tuottamaan neljä osa-fraktiot (fraktiot I Fr. IV). Fraktiot II edelleen erotettiin käyttämällä silikageelipylvästä eluoiden gradientilla heksaani-etyyliasetaatista, jolloin saatiin keltaista kiinteää ainetta (24 mg), joka oli nimetty ALC-1. Tämä antoi vihreä väri Fe

3+ oranssi punainen väri sekä Mg-HCl ja Zn-HCl. Toisaalta, toistuva silikageelillä CC (5 x 90 cm) ja heksaani liukoisen fraktion kanssa polaarisuus oli kasvava käyttäen etyyliasetaatin /heksaanilla saatiin kolme osa-fraktiot (F1-F3). Fraktio F2 kromatografoitiin uudelleen yli silikageelikolonnissa käyttäen heksaani /EtOAc: tä (60:40), jolloin saatiin valkoista kiinteää ainetta (20 mg). Edelleen tämä kiteytys metanolista tuotti värittömiä neulasia (19 mg). Tämä nimettiin ALC-2. Se antoi vihreä väri alkoholi- rautakloridin ja vaaleanpunainen väri Mg-HCl acid.

lisäpuhdistus subfraktioita heksaanista liukeneva (Fr. I, Fr. III-IV), ja heksaania liukeneva (F1 ja F3) jakeet ei tuottanut mitään kiteistä periaate. Kaikki eluaatit, jotka sisälsivät ”jäämän” tai ”ei ole jäämiä” tutkittiin TLC: llä, kuten on kuvattu alla ruiskuttamalla 8% metanolisella rikkihappoa. Tämän jälkeen kuumentamalla kuumalla levyllä 100 ° C: ssa 4 minuutin ajan, optimaalinen värin kehittymistä. Maljat visualisoitiin ja Rf-arvot laskettiin. Seuraavaksi puhdistettua yhdisteet eluoitiin vastaavaan liuottimeen järjestelmiä ja eluaatit säilynyt spektrianalyysi.

ultravioletti (UV) -spektrit tallennettiin Beckman 25 ja Shimadzu UV-240 spektrofotometrit ja arvot annettiin nm. Infrapuna- (IR) -spektrit tallennettiin Perkin-Elmer malli 283B ja 297 kaksinkertainen palkki spektrofotometrit ja

ν

arvot annettiin cm

-1. Protoni magneettinen resonanssi (

1H-NMR) -spektrit tallennettiin Varian, 200, JEOL FX-90Q ja Bruker-AM-300 spektrofotometrit TMS sisäisenä standardina. Hiili-13-ydinmagneettinen resonanssi (

13C-NMR) -spektrit tallennettiin JEOL FX-90Q spektrofotometrillä. Kemialliset siirtymät annettiin δ ppm. Massaspektrit (MS) tallennettiin LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) National Center for massaspektroskopia Indian Institute of Chemical Technology, Hyderabad.

ohutkerroskromatografialla (TLC) B

lasilevyjen (20 x 20 cm) pestiin perusteellisesti juoksevan veden jälkeen tislatulla vedellä ja levyjä pidettiin valmiina silikageeliä sovelluksen. Silikageeliä 25 g (huippu) liuotettiin 50 ml: aan kahdesti tislattua vettä, sekoitettiin hyvin ja liete johdetaan sitten levitin. Levitin varovasti vedetty pitkin levyt, (2-3 mm paksuus) saada edes käyttöä. Levyt aktivoitiin 100 ° C: ssa noin 45 minuuttia, annettiin jäähtyä, poistetaan uunista ja saatettiin käyttää.

Eluaatit sovellettu muodossa paikalle mikropipetin, 2 cm pohjan yläpuolelle levyn ja annettiin kuivua hiustenkuivaajalla. Sitten levyt kehitettiin heksaani: etyyliasetaatti 9: 1 (v /v) ja heksaani: etyyliasetaatti 8: 2 (v /v). Liuottimen annettiin liikkua 15 cm, poistettiin, annettiin kuivua. Levyt suihkutettiin 8% metanolia rikkihappo, on sen jälkeen, kun suoritettiin kuumentamalla kuumailmauunissa 100 ° C: ssa 5 min. Sitten yhdisteet tehtiin näkyviksi ja Rf-arvot laskettiin. Samoin ennen silikageeli päällystetyt levyt kehitettiin eri liuotinsysteemejä heksaanilla, etyyliasetaatin ja metanolin uutteet. Levyt vastustivat chromatoplates sai sumutereagenssilla. Ääriviivat yhdisteiden merkitty neulan suihkuttamattomat silikageelilevyillä.

Cell Culture

Ihmisen -leukemiasolulinjan CEM hankittiin National Center for Cell Science, Pune, Intia. Soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä (SERA LAB, USA), joka sisälsi 10% FBS: ää (GIBCO BRL, USA), 100 U G-penisilliiniä /ml ja 100 ug streptomysiiniä /ml 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Solut jaettiin klo 1:10 joka 3-5 päivä.

Echioidinin (ED) ja 7-

O

-methywogonin (MW), jota käytetään esillä olevassa tutkimuksessa on luonnollinen flavonoideja puhdistetaan alkaen lehtiä callus on

.

lineata

. Yhdisteiden ED ja MW liuotettiin DMF: ään (Sigma, USA). Suurin pitoisuus DMF: n (dimetyyliformamidi) käytettiin kokeissa oli yhtä suuri kuin 0,05% ja sama määrä käytettiin vehikkelikontrollina. Kaikissa kuvatuissa kokeissa echioidinin ja 7-O-methywogonin lisättiin 24 tunnin kuluttua viljelmästä.

elinkykyyn trypaanisiniekskluusiolla

trypaanisiniekskluusiolla määritys suoritettiin vaikutuksen arvioimiseksi ED ja MW elinkelpoisuus CEM-soluja. Noin 0,75 x 10

5 solua /ml, käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla ED ja MW. Seuraavat 24 h solujen kasvun, eri pitoisuuksia ED ja MW (10, 50, 100 tai 250 uM) tai vehikkeliä (DMF), lisättiin soluille. Solut vetäytynyt kulttuuri välein 24h ja värjättiin trypaanisinisellä kuvatulla [2,36]. Solujen lukumäärä (elinkelpoisten-unstained ja elinkelvottomat-blue) laskettiin käyttäen hemosytometria. Kukin koe suoritettiin kolme itsenäistä kertaa hyvän sopimuksen.

Cell Proliferation MTT: llä

Solujen eloonjäämistä edelleen arvioitiin 3- (4,5-dimetyyli- tiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) väriaineen vähentäminen määritys, joka perustuu kykyyn elinkelpoisten solujen aineenvaihdunta keltaisen tetratsoliumsuolan violettiin formatsaani, joka voidaan havaita spektrofotometrisesti. CEM-solut kasvavat log-vaiheessa käsiteltiin eri pitoisuuksilla ED ja MW (10, 50, 100, 250 uM) ja inkuboitiin 5% CO

2 ilmapiiri korkea kosteus. Solut kerättiin sen jälkeen, kun 48 ja 72 h ja sitä käsiteltiin MTT: tä (0,5 mg /ml), kuten aiemmin on kuvattu [36,37]. Absorbanssi mitattiin 570 nm: kuopan ELISA-levylukijalla. Keskimääräinen absorbanssi väliaineen valvonnan oli tyhjä ja vähennettiin. Yhdisteen pitoisuus aiheuttaa 50% solujen kasvun esto (IC

50) arvioitiin 72 h kuluttua altistumisen. Absorbanssi kontrollisoluihin otettiin 100% elinkelpoisuuden ja arvot käsiteltyjä soluja laskettiin prosentteina kontrollista. Esitetyt tulokset on saatu kolmesta itsenäisestä erissä kokeita.

LDH Release määritys

Release laktaattidehydrogenaasin (LDH) on osoitus kalvon eheyden ja siten, soluvaurioita. LDH määritys suoritettiin arvioimaan LDH: n vapautuminen kulttuurin seuraavat ED ja MW hoito (10, 50, 100 ja 250 uM) on CEM-soluja 48 ja 72 kohti vakioprotokollia [37]. Solunsisäinen LDH määritettiin jälkeen solujen liuottamisen Jäätymisen ja nopea sulatus. LDH: n vapautuminen mitattiin absorbanssi 490 nm: ssä. Prosenttiosuus LDH: n vapautuminen laskettiin: (LDH aktiivisuus media) /(LDH toimintaa mediassa + solunsisäinen LDH-aktiivisuus) x 100. Kukin koe suoritettiin kolme itsenäistä kertaa hyvän sopimuksen.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe. Kaikki analyysit suoritettiin GraphPad ohjelmistoa käyttäen yksisuuntaista ANOVA seurasi Tukey-Kramer monivertailutestillä. Tilastollinen merkittävyys harkita p 0,05.

Tulokset

In vitro

Callus induktio kypsistä Leaf Eksplan-

perustettu kallusviljelmät kypsistä lehtiä eksplanttien MS-alustalla, johon on lisätty auksiinit kuten NAA, 2,4-D ja IAA. Luonne kalluksen vaihteli pitoisuus eri auksiinit (taulukko 1). White, pehmeä ja hauras känsä saatiin MS-alustalla, jota oli täydennetty 2,4-D (0,1-0,5 mg l

-1). Taajuus valon kellertävän vihreä, kova, organogeenisiin kallusta kannalta biomassan kasvun todettiin olevan enintään (75%) läsnäollessa 1,0 mg l

-1 IAA (kuvio 1A) 4 viikon kuluttua (taulukko 1).

kuitenkin 1,0 mg l

-1 NAA ja 2,4-D huomattavasti korostunut taajuus kallusmuodostukseen. Ikä lehtiä explant oli kriittinen callus jatkuvaa lisääntymistä. Käyttö iäkkäiden lehtien alensi kallusmuodostukseen. Optimaalinen haavasolukko induktio havaittiin, että läsnä oli 1,0 mg l

-1 IAA ja sen eristämiseen käytetty bioaktiivisten yhdisteiden (kuvio 1A). Organogeenisiin callus nostettiin sen volyymin jatkoviljelemällä callus segmenttien MS-alustalla, johon on lisätty 1,0 mg l

-1 IAA noin kahtakymmentä päivää. Callus oli terve kaikissa alakulttuurien ja jatkoviljely kallusta säädetty irtotavarana määrä, sekundaarimetaboliittien uuttamalla. Kuten odotettua, siirtyessään jotka sisälsivät cytokinin, BA osoitti ampua morphogenic vastetta (tietoja ei esitetty).

rakenne tunnistaminen Echioidinin ja 7-

O

-methylwogonin

Characterization ja rakenteellinen määrittäminen echioidinin (ED) ja 7-

O

-methywogonin (MW) perustettiin pääasiassa pohjalta 1D NMR ja massa- spektrin tutkimukset. Yhdiste ALC-1 kiteytettiin metanolista keltaisina kiteinä (20 mg), jonka sulamispiste oli, 264-265 ° C. Se analysoitiin sen molekyylikaava C

16H

12o

5 molekyylipainolla 285 [M + H]

+. Se oli violetti UV ja UV /NH

3. Spektrin yksityiskohdat yhdistettä on annettu alla.

UV (S1A kuvio):

λ

max (MeOH) (log ε) 265 (4,40), 335 (4,19) nm . IR (S1B Kuva):

v

max (KBr) 3416 (OH), 2980, 1662 ( C = O), 1614, 1504, 1452, 1350, 1245, 1159, 865 , 831 cm

-1.

1H-NMR (kuvio 2A): (300 MHz, DMSO

d

6) δ 12,88 (1 H, s, 5-OH, vaihdettavissa D

2O), 10,90 ( 1 H, s, 2′-OH, vaihtokelpoinen D

2O), 7,90 (1 H, dd,

J

= 2,0, 8,0 Hz, H-6 ’), 7,40 (dt, 1 H,

J

= 2,0, 8,0 Hz, H-4 ’), 7,10 (s, 1H, H-3), 6,99-7,05 (m, 2H, H-3’, 5 ’), 6,75 (d, 1H,

J

= 2,5 Hz, H-8), 6,35 (d, 1 H,

J

= 2,5 Hz, H-6), 3,90 (s, 3H, OMe-7) .

13C-NMR (kuvio 2B): (300 MHz, DMSO

d

6) δ 182,0 (C-4), 165,1 (C-7), 161,4 (C-2), 161,0 (C-5), 157,3 (C-8a), 156,7 (C-2 ’), 132,8 (C-4’), 128,4 (C-6 ’), 119,3 (C-5’), 117,0 (C-1 ’), 116,9 (C-3’), 109,1 (C-3), 104,6 (C-3a), 97,8 (C-6), 92,4 (C-8), 55,9 (OMe-7). LC-MSD (Kuva 2C):

m Twitter /

z

= 284 [M]

+, 285 [M + H]

+.

(A)

1H NMR -spektrit (B)

13C-NMR-spektri (C) Nestekromatografia massaspektrit (D) rakenne echioidinin.

Näin ollen edellä edellä spektrin tutkimukset ALC -1 luonnehdittiin 5, 2′-dihydroksi-7-methoxyflavone (Echioidinin, DE) (kuvio 2D) kuin sen fyysinen ja spektritiedot olivat hyvässä sopusoinnussa kirjallisuuden arvoihin [38].

Seuraavaksi, yhdiste ALC-2 kiteytettiin heksaanista vaaleankeltaisina neuloina (20 mg), jonka sulamispiste, 181-182 ° C. Se analysoitiin sen molekyylikaava C

17H

14o

5 molekyylipainolla, 298. Se oli violetti UV ja UV /NH

3. Spektrin yksityiskohdat yhdistettä on annettu alla.

UV (S2A Kuva):

λ

max (MeOH) nm (log

ε

) 272 (4,52 ), 345 (3,78) nm. IR (S2B Kuva):

ν

max (KBr) 3416 (OH), 2938 (-OMe), 1661 ( C = 0), 1605, 1510, 1447, 1376, 1274 , 1225, 1125, 1030, 970, 833, 767, 686 cm

-1.

1H-NMR (kuvio 3A): (300 MHz, DMSO

d

6) δ 12,65 (1 H, s, OH-5), 8,10 (2H, m, H-2 ’ , 6 ’), 7,61 (3H, m, H-3’, 4 ’, 5’), 7,01 (1 H, s, H-3), 6,60 (1 H, s, H-6), 3,98 (3H, s , OMe-7), 3,87 (3H, s, OMe-8).

13C-NMR (kuvio 3B): (300 MHz, DMSO

d

6) δ 183,5 (C-4), 164,7 (C-2), 160,0 (C-7), 159,4 (C-5), 150,3 (C-8a), 132,8 (C-4 ’), 132,3 (C-8), 130,0 (C-1’), 130,1 (C-3 ’, 5’), 127,2 ( C-2 ’, 6’), 105,8 (C-3), 105,4 (C-4a), 96,7 (C-6), 61,6 (OMe-8), 56,8 (OMe-7). LC-MSD (Kuva 3C):

m Twitter /

z

= 299,1 [M + H]

+.

(A)

1H-NMR-spektri (B)

13C-NMR-spektri (C) Nestekromatografia massaspektrit (D) rakenne 7-

O

metyyli wogonin.

Näin edellämainituista spektrin tutkimukset, rakenne ALC-2 valaistaan ​​5-hydroksi-7, 8-dimethoxyflavone (7-

O

-methylwogonin) (kuvio 3D) ja sen vahvistettiin myös verrattuna kirjallisuuden arvojen [39].

Echioidinin (ED) ja 7-

O

-Methylwogonin (MW) aiheuttama Sytotoksisuus in leukemiasoluja annoksesta ja ajasta riippuvaa Manner

Seuraavaksi tutkimme sytotoksinen vaikutus ED ja MW (kuviot 4A ja 5A) proliferaatioon ja selviytymistä leukemiasolulinjan, CEM (T-solu leukemia). Trypaanisinistä määritys oli ensimmäinen rivi meidän tutkimuksen, jossa CEM käsiteltiin 10, 50, 100 tai 250 uM ED ja MW. Solut lisäämättä yhdistettä toimi kontrollina. Koska yhdiste liuotettiin DMF: ään (dimetyyliformamidi), solut DMF: llä käytettiin vehikkelikontrollina. Suurin pitoisuus DMF: ää käytettiin kokeissa oli yhtä suuri kuin 0,05% ja sama määrä käytettiin vehikkelikontrollina. Lisäämisen jälkeen yhdisteen, solut laskettiin välein 24 h saakka kontrollisolujen saavutetaan stationäärifaasin. Tulokset osoittivat, että solujen kasvuun vaikuttivat kasvaessa ajan (kuviot 4B ja 5B). Vaikutus rajoittui kun 10pM ED ja MW käytettiin. Kuitenkin pitoisuudet 100 ja 250 uM lisännyt solukuoleman (kuviot 4B ja 5B). IC

50 ED ja MW oli noin 100 uM, 72 h hoidon.

(A) rakenne ED. (B) arviointi solujen elinkelpoisuus käyttäen trypaanisinistä määritystä seuraavien 10, 50, 100 ja 250 uM ED tai DMF (kontrolli) hoitoon. Solut kerättiin, trypaanisininen värjätään ja lasketaan joka 24. tunti, kunnes se saavutti stationäärifaasin. (C) määritys% solujen elinkelpoisuuden MTT: llä CEM-soluissa. Soluja viljeltiin 10, 50, 100 ja 250 uM ED tai ajoneuvon ohjaus 24, 48 ja 72 tuntia. Että% solujen elävyyden laskettiin harkitsee DMF käsiteltyjä soluja kuin 100% ja piirtää edustus virhepalkkien. (D) mittaaminen LDH: n vapautuminen hoidon jälkeen ED. Altistuksen jälkeen CEM-solujen ED eri pitoisuuksina (10, 50, 100 ja 250 uM) 24, 48 ja 72 tuntia, vapauttamaan LDH mitattiin 490 nm: ssä. Tulokset esitetään prosentteina LDH: n vapautuminen. Kukin koe suoritettiin kolme itsenäistä kertaa hyvän sopimuksen.

(A) rakenne MW. (B) arviointi solujen elinkelpoisuus käyttäen trypaanisinistä määritystä seuraavien 10, 50, 100 ja 250 uM MW tai DMF (ajoneuvon hallinnan) hoitoon. Solut kerättiin, trypaanisininen värjätään ja lasketaan joka 24. tunti, kunnes se saavutti stationäärifaasin. (C) määritys% solujen elinkelpoisuuden MTT: llä CEM-soluissa. Soluja viljeltiin 10, 50, 100 ja 250 uM MWor ajoneuvon hallinnan 24, 48 ja 72 tuntia. Että% solujen elävyyden laskettiin harkitsee DMF käsiteltyjä soluja kuin 100% ja piirtää edustus virhepalkkien. (D) mittaaminen LDH: n vapautuminen hoidon jälkeen MW. Altistuksen jälkeen CEM-solujen MW eri pitoisuuksina (10, 50, 100 ja 250 uM) 24, 48 ja 72 tuntia, vapauttamaan LDH mitattiin 490 nm: ssä. Tulokset esitetään prosentteina LDH: n vapautuminen. Kukin koe suoritettiin kolme itsenäistä kertaa hyvän sopimuksen.

Sytotoksisuus aiheuttama ED ja MW leviämisen leukemiasolujen Lisäksi todennettiin käyttämällä MTT-määritystä. CEM-soluja käsiteltiin 10, 50, 100 ja 250 uM ED ja MW otettiin talteen 24, 48 tai 72 tuntia ja tehtiin MTT-määrityksellä (kuviot 4C ja 5C). Tulokset osoittivat, että solujen elinkelpoisuus vaikutti käsittelemällä ED ja MW 100 ja 250 uM, erityisesti 72 tunnin jälkeen. Nämä tulokset viittaavat lisäksi siihen, että ED ja MW aiheuttaa sytotoksisuutta.

Lisäksi, LDH määritys suoritettiin määrittämään solun eheys seuraavat ED ja MW hoito (10, 50, 100 ja 250 uM). Tulokset osoittivat pitoisuudesta ja ajasta riippuvaa nousu LDH: n vapautuminen käsittelemällä ED ja MW, edelleen vahvistaa edellä esitetyt tulokset (kuviot 4D ja 5D). Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että ED ja MW kykenivät aiheuttaen sytotoksisuutta tasyöpäsolulinja.

Keskustelu

on ollut kasvavaa kiinnostusta tunnistaa kasvituotteiden terapeuttisina aineina, jotka voivat tehokkaasti häiritä syöpäsolun lisääntymistä. Yksi silmiinpistävä lääkekasvi tässä rekisterissä on

.

lineata

monenlaisia ​​farmakologisia vaikutuksia. Tässä tutkimuksessa ensinnäkin kuvaamme perustaminen kallusviljelmät kypsistä lehtiä eksplanttien. Toiseksi osoitamme eristäminen ja rakenteellinen karakterisointi echioidinin, 7-

O

-methywogonin päässä kallusviljelmät. Kolmanneksi hyödyntäen solupohjaiset määritykset me näyttää hoitoon echiodinin, 7-

O

-methywogonin on leukemiasolujen poisti sen solujen lisääntymistä. Yllä johtopäätökset perustuvat useiden eri analyysejä kuten kuvattu paperilla. Nämä tulokset ovat tärkeitä johtuen realisaatioita ihmiselle kuin etsittäessä uusia farmakologisesti aktiivisia yhdisteitä kasveista on johtanut löydettiin monia kliinisesti käyttökelpoisia lääkkeitä.

Useat riviä näyttöä aikaisemmin viittaa roolia kasvunsääteet stimuloiva biosynteesiä lääkkeellisesti tärkeitä sekundäärimetaboliitteja kasvien

in vitro

solukkoviljelmät [10,22,35,40]. Tällainen toissijainen aineenvaihduntatuote tuotanto

in vitro

perustuu olettamukseen, että arvokas tuote tuotettu luonnossa tahansa elimen tai muun kudoksen kasvista voidaan stimuloida kerääntyä eriytymättömiä soluissa. Tällaiset kallusviljelmät kykenevät tuottamaan metaboliitteja sellaisia ​​määriä selvästi yli määritysrajan riippuen ravintoalustalla, sakkaroosikonsentraatio, ikä callus ja solulinjaa. Wewetzer [40] kertoi, että morfologinen erittely ei ole edellytys atsadiraktiini tuotantoon; mutta korkeimmat pitoisuudet havaittiin täysin eriytymättömiä soluissa. Me raportoimme ensimmäistä kertaa IAA kertyvät flavonoidit kallusviljelyssä on

.

lineata

. Viime aikoina on raportoitu vaikutus IAA lisäämisessä isoflavonipitoisuudesta vuonna kallusviljelyt

pensasväriherne

yhdessä cytokinin [22]. Edelleen havaintomme vihreä läiskät callus osoittavat korkea callus kasvu sekä callus kyky tuottaa versoja. Tutkijat ovat onnistuneet tuottamaan useita arvokkaita toissijainen phytochemicals järjestäytymätön kallusviljelmät [14,35,41,42,43,44,45].

Tässä tutkimuksessa, järjestelmällinen phytochemical tutkimus

.

lineata

kallusviljelmät johtaa eristämistä ja karakterisointia kahden yhdisteen: 5, 2′-dihydroksi-7-methoxyflavone (echioidinin) ja 7-

O

-methylwogonin. Eristäminen 2′-happipitoista flavonoideja, joita esiintyy harvoin luonnossa, mistä

.