Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvä kuolema maailmanlaajuinen. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus useimmissa keuhkosyöpää ja ennusteen tämän taudin yhä huono huolimatta vuosikymmenien intensiivisen tutkimuksen. Niinpä uusia näkemyksiä taustalla mekanismeja, joiden NSCLC kehittyy ovat innokkaasti tarvitaan pohjana uusien linjojen hoitostrategioita. Viimeisen vuosikymmenen aikana on nähty kasvavaa kiinnostusta sääntelystä roolit mikro-RNA: iden eri luokkia syöpäsairauksia. Vastaavat tiedot on hyvin dokumentoitu syövän synnyn ja patofysiologiassa erilaisia ​​syöpäsairauksia. Silti on suhteellinen tietojen puuttuminen roolien mir-144 kasvaindiagnostiikassa ja ei ole raportti, joka osoittaa osallistumista mir-144 NSCLC kehittämiseen.

Methods /Principal Finding

Vuodesta ihmisen NSCLC kasvain kudosnäytteitä ja soluviljelynäytteissä huomasimme, että ilmentyminen mir-144 liittyy pahanlaatuiseen fenotyyppiin NSCLC. Lisätutkimukset osoittivat, että kohdunulkoinen mir-144 ilmaisu dramaattisesti estää NSCLC kasvainsolujen kasvua ja indusoi apoptoosin kuten ilmenee kohonneina apoptoottisen proteiinimarkkereita ja virtaussytometrialla muutos. Lisäksi olemme myös havainneet, että ZFX proteiinin ilmentymistä liittyy myös pahanlaatuiseen fenotyyppiin NSCLC ja knockdovvn ZFX proteiinin johtaa samankaltainen vaikutus kuin kohdunulkoisen mir-144 ilme. Lopulta huomasimme, että ZFX ilme on erittäin säädettävissä kun läsnä mir-144 ja ektooppinen ilmentyminen ZFX dramaattisesti vaimentaa mir-144 toiminta kasvaimen esto.

Johtopäätökset

tulokset ensimmäistä kertaa osoittivat mir-144-ZFX reitin on mukana kehittämässä NSCLC, joka irtoaa valoa edelleen tutkimuksia taustalla olevien mekanismien kohti parempaa ymmärrystä ja hallintaa NSCLC.

Citation: Zha W, Cao L, Shen Y, Huang M (2013) roolit Mir-144-ZFX Pathway in Growth asetukseen Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (9): e74175. doi: 10,1371 /journal.pone.0074175

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2013; Julkaistu: 16 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Zha et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Major tieteellistä ja teknologista Special projekti ”Merkittävä New Drugs Development” (2011ZX09302-003-02). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa noin 80% kaikista keuhkosyöpää. Myös tämä tauti on tunnetusti tuhoisa edennyt pitkälle [2]. Siksi ymmärtää paremmin molekulaarisia mekanismeja mukana NSCLC kehitystä innokkaasti tarvitaan perusteella tunnistaa uusia terapeuttisia kohteita ja kehittää uusia strategioita näiden sairauksien hoidossa.

MikroRNA ovat ekspressoituvat pieniä RNA: ita, jotka aiheuttavat negatiivista sääntelyn vaikutukset geeniekspression klo transkription jälkeisellä tasolla [3], [4]. Ottaen huomioon, että MikroRNA teoreettisesti kohdistaa mitään mRNA, on todennäköistä, että MikroRNA oltava erittäin laajaa toiminnallista-spektri, joka sisältää solukierron säätelyssä, solun kasvun, apoptoosin, solujen erilaistumista ja stressin vastaus [5] – [9]. Tämän mukaisesti käsite, ei ole yllätys, että MikroRNA ovat laajasti mukana ihmisen syövän kehittymisessä. Vaikka monet miRNA on raportoitu osallistuvan etiologiassa ja patogeneesissä syövän kohdistamalla onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla [10] – [12], tutkimuksissa käsitellään roolit miRNA syövän kehittymisessä ovat vielä alkuvaiheessa.

Viime aikoina on kasvava tutkimus korkoa roolista mikroRNA-144 kasvainten synnyssä ja syövän hoitoon. Useat tutkimusryhmät ovat raportoineet alas-säätely mir-144 eri syöpien kuten osteosarkooman ja mesoteliooma että hiljaista mir-144 mahdollisena tuumorisuppressoriproteiinia [13], [14]. Tarkemmin, tuore tutkimus paljasti käänteinen korrelaatio mir-144 tason ja mahasyövän kehitys [15]. Kaksi viimeaikaista paperit Courtney ryhmä osoitti, että Knockdown DCAMKL-1 voi lisätä microRNA-144, joka puolestaan ​​edistää esto paksusuolisyövän ja haimasyövän [16], [17]. On kuitenkin olemassa myös contradictive raportteja. Kuten paksusuolisyövän, toisen ryhmän raportoitu kohonnut mir-144 ihmisen ulosteiden ja syöpäkudoksessa [18]. Raportin Fu et al väitti mir-144 edistää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion nenänielun karsinooma kautta tukahduttamisesta PTEN. Toiminta mir-144 kasvainten synnyssä ja syövän kehitys näyttää monimutkaista ja erittäin kudosspesifisiä [19].

Toistaiseksi parhaan tietomme mukaan ei ole raportti paperia nimenomaan osoitettu rooli mir-144 keuhkosyöpää. On kuitenkin olemassa useita papereita vaativille tärkeän tehtävän mir-451, toinen microRNA jakavat saman lokuksen kanssa mir-144, että kasvaimen kehittymisen ja kehittäminen keuhkosyöpään [20] – [23]. Mir-451 on raportoitu vaimentua keuhkosyövän ja käänteinen suhde taudin esiintyminen ja kehitystä. Koska klusteroitu miRNA yleensä coordinately puhtaaksi oletamme, että mir-144 taso on myös pienempi keuhkosyövän [24], [25]. Mielenkiintoista, äskettäin paperi raportoitu alassäädetty mir-144 ilmentymistä kokoveressä sairastavien potilaiden keuhkojen adenokarsinooma [26]. Nämä tiedot pakko meitä oletuksen, että mir-144 ilmaisu on myös säädellä vähentävästi keuhkosyöpää, ja sillä on estävä toiminto proliferaatioon ja etäpesäkkeiden keuhkosyöpään solujen.

Sinkki sormi X-kromosomi proteiini (ZFX) kuuluu ZFY proteiinin perheen [18], ja se on yksi harvoista geenien ihmisen X-kromosomissa, joiden tiedetään paeta X inaktivaatiota. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että ZFX on tärkeä rooli itseuudistumisen ja ylläpito sekä alkion kantasolujen ja hematopoeettisten kantasolujen [27] – [30]. Muutama raportit osoittivat, että ZFX toimii kohteena mir-144 ja saa aikaan sääntelyn vaikutuksia kasvaimen kasvuun [31], [32]. Kuitenkin on edelleen puute tietojen roolista ZFX keuhkosyöpään käyttäytymiseen ja mir-144-ZFX polku ei ole koskaan raportoitu yhteydessä NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta-aineet

Micro-RNA ilmentymisen sarjoja mir451 (001105), mir144 (002676) ja RUN48 (001006) hankittiin Applied Biosystems. Sytokromi c-vasta-aine (6H2) saatiin Santa Cruz Biotechnology. Anti-ZFX-vasta-aine (ab85483), anti-kaspaasi-3-vasta (ab44976) ja anti-GAPDH-vasta-aine (ab9485) hankittiin Abcam. Trizol Reagenssit ostettiin Invitrogen. TaqMan Gene Expression Assay Kits hankittiin Applied Biosystems (Hs01017881_m1 varten ZFX ja 4308313 varten GAPDH). Muut reagenssit ovat Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen), SuperSignal Alustan Western blotting tunnistusjärjestelmä (Pierce, USA), guava neksiini Reagent (Millipore). RPMI 1640 -alustassa ja sikiön seerumia ostettiin Shanghai Haoran Biotekniikka Co lusiferaasimäärityssysteamiä Kit ja pMIR-raportti järjestelmä hankittiin Applied Biosystems. β-Gal Assay Kit ostettiin Invitrogen (luettelonro. K1455-01). Ihmisen ZFX-ELISA Kit (CSB-EL026467HU) ostettiin CUSABIO BIOTECH CO., Ltd., Kiina. Kaikki muut kemikaalit hankittiin kaupallisista lähteistä erittäin puhdasta käytettävissä.

Soluviljely

A549, CRL-5875 ja HTB-183-solulinjat hankittiin ATCC: ltä (American Type Culture Collection) kautta virasto Peking Zhongyuan Limited, Peking, Kiina. 16HBE14o

– solulinja (ihmisen normaali keuhkoputken epiteelisolujen) on antelias lahja tri Dieter Gruenert (University of California, San Francisco) [33]. Kaikki solut viljeltiin RPMI 1640, jota oli täydennetty naudan sikiön seerumilla (10%), 1% ei-välttämättömiä aminohappoja ja penisilliiniä-streptomysiiniä lisättiin. Soluja viljeltiin kostutetussa kammiossa 37 ° C: ssa 5% CO

2.

Ethics selvitys

Kaikki koetoimenpiteet hyväksyi Institutional Review Board of Jiangsun maakunnassa Medical Association. Tiedot annettiin potilaille, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikkien potilaiden näytteistä.

plasmidikonstruktion

Jotta rakennettaisiin valmiiksi mir-144, DNA-fragmentti, joka sisältää 86 bp hsa- miR-144 esiaste (plus 100 bp ylävirtaan ja 100 bp alavirtaan) monistettiin genomisesta DNA: sta 16HBE14o- solujen ja kloonattiin pcDNA (+) 3,1 (Invitrogen), joka on modifioitu puromysiiniresistenssille. Ekspressoida ektooppisesti ZFX, DNA-fragmentti koodaavan sekvenssin ZFX kerrottiin RT-PCR: llä ja kloonattiin pBabe-neo-vektoriin.

lusiferaasimääritystä, pMIR-REPORT System (Applied Biosystems) käytettiin. Plasmidit (pMIR-SELVITYS-lusiferaasi-ZFX-3′-UTR ja sen mutantti) rakennettiin seuraamalla menetelmillä. 3′-UTR ZFX monistettiin RT-PCR: llä. Alukkeet PCR ovat: gcgcaagcttcaatacttctacagaacg ja gcgcgagctccctatatgcaccagtgac. Monistettu tuote alikloonattiin pMIR-REPORT-Luciferase vektoriin Hindlll ja Sacl. QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) käytettiin tuottamaan pMIR-REPORT-Luciferase-ZFX-3′-UTR-mutantin plasmidiin käyttäen seuraavia alukkeita: 5′-cgtgtataGCAGgtttgcct-3 ’ja 5′-aggcaaacCTGCtatacacg-3’. Plasmidi koodaus β-galaktosidaasi (pMIR-REPORT β-gal-ohjattu) normalisointiin käytettiin vaihtelu johtuu eroista solujen elinkelpoisuuden ja transfektion tehokkuutta.

pudotus ZFX ilmentymisen, ZFX shRNA plasmidi. DNA-fragmentit syntetisoitiin, hybridisoitiin ja insertoitiin pLKO.1 vektoriin. Kypsä sense-sekvenssi on: 5′-atgtacctgtgtgtattgct-3 ’.

Retrovirus ja lentivirustartunnat

Retrovirus tuotanto suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [34] käyttämällä AmphoPhoenix soluja. Lentivirus pakattiin käyttäen ViraPower Kit Invitrogen seuraten valmistajan ohjeita. Virus levitettiin kohdesoluihin 24 tuntia. Infektion jälkeen solut altistettiin joko puromysiiniä (1 ug /ml) tai neomysiiniä valinta (500 ug /ml).

Mir-144 yli-ilmentyminen

Pre-mir-144 tai sen vastaava vektori plasmidi transfektoitiin A549-soluihin lipofektamiinin 2000 (Invitrogen). Transfektoidut solut aloitettiin valinnan puromysiinissä (1 ug /ml) 24 tuntia transfektion jälkeen 2 päivää.

kudosnäytteitä

26 potilasta, joilla oli diagnosoitu kuin NSCLC Department of Respiratory Medicine meidän sairaalassa olivat mukana tässä tutkimuksessa. Ennen leikkausta, yksikään näistä potilaista sai hoitoa. Kasvaimissa ja ympäröivässä ei-kasvain keuhkokudoksesta kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Ennen Näytekokoelmatodistuksen, eettinen hyväksyntä saatiin sairaalaan ja suostumus saatiin kaikilta henkilöille ennen kudoksen keruu aloitettiin.

RNA kudoksista ja soluista

Puhdista homogenisaattorissa koetin, pihdit, lastat ja muita välineitä, joita käytetään käsittelemään kudosnäytteiden pesemällä ne seuraavat puskurit peräkkäin: RNAseZAP, 75% etanolia ja DEPC Water. Salli jäädytetty kudosnäytteet sulaa tarpeeksi, ja sitten leikkaa kudoksen pieniksi paloiksi steriilillä partaterällä. Kaavi kaikki kudoskappaleesta 50 ml putkeen, joka sisälsi puskuria L3 (Invitrogen), ja homogenoidaan kudos 3 kertaa (30s joka kerta, laittaa näytteet jäihin väliajoin). Spin homogenisoitiin näytteitä 12000 g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Yhteensä miRNA uutettiin käyttäen PureLink miRNA Isolation Kit (Invitrogen) noudattamalla manufactory käsikirja.

purkaa RNA viljellyistä soluista, kaavi soluja (noin 2 x 10

6 kutakin näytettä) 15 ml: putket, ja spin ne 250 x g 5 minuuttia pelletoimaan solut. Lisää 300 ui puskuria L3 jokaiseen soluun pelletti, ja pyörre. MicroRNA uutettiin jälkeen manufactory käsikirja (PureLink miRNA Isolation Kit, Invitrogen).

Real-Time PCR analyysejä miRNA

tasot miRNA määritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Analyysit Kit (Applied Biosystems) . Alukkeet miR-451, mir144 ja RUN48 ostettiin ABI. Käänteiskopiointireaktio ja reaaliaikaisen PCR suoritettiin palveluntarjoajan protokollaa. RUN48 käytettiin sisäisenä standardina normalisoinnin. Suhteellinen ilmentyminen miRNA laskettiin käyttäen keskiarvoa kontrolliryhmän kalibroijana.

Real-Time PCR analyysejä ZFX mRNA

Kokonais-RNA eristettiin soluista eri ryhmien avulla Trizol reagensseja. MRNA-tasot on ZFX testattiin käyttäen TaqMan-geenin ilmentymisen määritystä sarjat. Reaaliaikainen PCR suoritettiin seuraavan manufactory protokollaa. Data normalisoitiin kanssa taloudenhoito GAPDH-geenin.

Guava neksiini Pitoisuus

Testi suoritettiin seuraavat manufactory protokolla (Millipore). Lyhyesti, kiinnitetty ja keskeytettiin solut kaikki kerätty. Solut suspendoitiin 100 ui alustaa ja inkuboitiin 100 ul: n Guavan neksiini Reagent jokaisessa kaivossa 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Sitten näytteet mitattiin guava System (Millipore). Aineisto analysoitiin käyttämällä ohjelmistoa yrityksen toimittamien.

Western blot

kokosolulysaateille korjattu 2% SDS täydennetty proteinaasi-inhibiittorit. Yhtä suuret määrät proteiineja (50 ug) tehtiin elektroforeesi polyakryyliamidigeelillä (10 tai 15%). Proteiinit siirrettiin puhtaasta nitroselluloosakalvoille. Jälkeen proteiini siirto, kalvot estettiin 5% rasvaa kuiva-maitoa TBS-T: ssa 1 tunti ennen kuin lisättiin primaaristen vasta-aineiden ja niitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Sitten kalvoja pestiin kolme kertaa TBS-T: n ja inkuboitiin toissijaisen vasta-aineiden 1 h huoneen lämpötilassa TBS-T: llä. Kolmen pesun jälkeen TBS-T, immunoreaktiivisia tuotteet visualisoitiin käyttäen SuperSignal Alustan Western blotting tunnistusjärjestelmä (Pierce, USA).

lusiferaasianalyysissä

lusiferaasin suoritettiin A549-soluja käyttämällä pMIR -raportti System [34] (Applied Biosystems) seuraten tarjoajan protokollaa. Lyhyesti, pMIR-REPORT-Luciferase-ZFX-3′-UTR tai sen mutantti (3 ug) oli ko-transfektoitiin pMIR-REPORT β-gal-ohjaus (1 ug) A549-soluja (10

6) kanssa tai ilman sitä mir-144 yli-ilmentyminen käyttäen 15 ui Lipofectmin 2000 (Invitrogen).

24 tuntia myöhemmin, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Luciferase Assay Kit (Applied Biosystems). Huuhtele solut PBS: llä. 250 ui Lysis Solution lisättiin soluihin. Irrota solut levy solukaapimella. Siirrä solujen lysaatti mikrofuugiputkeen ja sentrifugoidaan 4 ° C: ssa 5 min pelletoimiseksi roskia. Siirrä supernatantti uuteen putkeen. Siirrä 50 ui solu uutetta luminometrillä putkeen. Lisätään 100 ui Alustan A (ATP-liuos). Lisätään 100 ui Substrate B (lusiferiini liuos). Ohjelmoida luminometristä suorittaa 2-s mittausta edeltävän viiveen seurasi 10 s mittausjakson aikana. Asetetaan putki luminometristä ja aloittaa lukemisen. Β-galaktosidaasi-aktiivisuus testattiin käyttäen β-Gal Assay Kit (Invitrogen) valmistajan käsikirjan. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus saatiin normalisoimalla lusiferaasiekspressio kanssa β-gal ilme.

ELISA määritys ZFX

Sulata näytteet -80 ° C: ssa. Leikkaa normaali ja tuumorikudoksissa pieniksi paloiksi, ja painaa noin 100 mg näytettä kutakin määritystä. Huuhtele kudoksen PBS: llä, homogenoidaan kudoksen 1 ml: ssa PBS: ää ja tallentaa yli yön -20 ° C: ssa. Kaksi jäädytys-sulatus-sykliä murtaa solukalvot, sentrifugoidaan homogenaatteja 5 minuuttia 10000 g, 4 ° C: ssa. Mittaa proteiinin taso ZFX että supernatantista käyttämällä ZFX-Elisa Kit (CUSABIO BIOTECH CO., Ltd., Kiina) seuraten valmistajan protokollaa, ja normalisoida vasten kudoksen painoa.

Tilastot

Koetulokset on esitetty keskiarvona ± SD Tilastolliset analyysit suoritettiin parittomia Opiskelijat

t

testiä tai ANOVA olettaen että varianssi on erisuuruinen ellei toisin mainita käyttäen SigmaPlot 11,0 (San Jose, CA USA). Merkitys määriteltiin * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Tulokset

Levels of mir-144 ja mir-451 vähenevät NSCLC kasvainkudoksissa verrataan peri-kasvain normaaleissa kudoksissa

Kuten kuviossa 1A ja 1B, löysimme merkittävä alassäätöä sekä mir-144 ( 70%: n lasku, p 0,001) ja mir-451 ( 60%: n lasku, p 0,001) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kudoksia (n = 26) verrattuna ympäröivä kasvaimen normaalien kudosten (n = 26), joka on linjassa aiempien tietoja, jotka osoittavat, että mir-144 ja mir-451 samaa DNA-kohtaan, yhteistoiminnallisesti puhtaaksi ja pelaa samanlaisia ​​rooleja eri patofysiologisissa skenaarioiden [13], [24], [35], [36]. Lisäksi merkittävä väheneminen mir-144 taso (kuvio 1 C) havaitaan myös korkea-asteen syövän (IIIA-IV) vertaamalla että huonolaatuisen syöpä (IA-IIB).

ja B. suhteelliset ekspressiotasot mir-144 ja mir-451 normaalissa (n = 26) ja kasvaimen kudokset (n = 26). Ekspressiotasot mir-144 tai mir-451 kasvainkudoksissa normalisoitiin ekspressiota edellä MikroRNA vastaavassa normaaleissa kudoksissa samasta potilaasta. C. Suhteellinen ekspressiotasot mir-144 matala-asteista (IA-IIB) (n = 14) ja korkea-asteen (IIIA-IV) keuhkoadenokarsinooma (n = 12).

ekspressiotasot miR-144 ovat alhaisemmat ihmisen keuhkosyövän solulinjat verrattuna normaaliin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen

Tasaisen, huomasimme myös, että mir-144 on merkittävästi säädellä vähentävästi NSCLC solulinjoissa A549 ( 45%: n lasku, p 0,001), CRL-5875 ( 60%: n lasku, p 0,001), HTB-183 ( 50%: n lasku, p 0,001) verrattuna normaaliin keuhkoputken epiteelisolujen linjojen (16HBE14o- -solut) (kuva 2).

Ectopic miR-144 ilmentyminen inhiboi A549-solut ja edistää apoptoosia solujen

Seuraavaksi pyrittiin määrittämään, onko mir-144: lla on suoraa sääntelytehtävää kasvaimen kasvua. Tämän hypoteesin testaamiseksi, olemme menestyksekkäästi suunniteltu mir-144 hyperilmentyminen A549 keuhkosyövän soluja. Tulokset osoittivat mir-144 ilmentymisen mir-144 hyperexpressed A549 on yli 7 kertaa korkeampi kuin vektorisäätö (kuvio 3A). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että mir-144 hyperilmentämisestä aiheuttaa huomattavia tuumorin solujen kasvua (kuvio 3B) ja parantaminen apoptoosin, mikä ilmenee kohonnut apoptoottista proteiinia markkereita (sytokromi-c: n ja kaspaasi 3) ja virtaussytometria tulokset (kuvio 3C-F) .

. Yli-ilmentyminen mir-144 A549-solut, keskiarvo ± SD, n = 3. B. kasvukäyrät A549-solujen kanssa tai ilman mir-144 yli-ilmentyminen, keskiarvo ± SD, n = 3. C. Western-blot -analyysit A549-soluja tai ilman mir-144 yli-ilmentyminen. D ja E. edustaja kuvaa Guava neksiini määritys tulokset A549-soluja sekä ilman mir-144 yliekspressio, vastaavasti. F: kvantitointi Guava neksiini määrityksen tulokset, keskiarvo ± SD, n = 3.

Tulokset osoittivat Kuva 1-3 erittäin suositeltavaa, että mir-144 voi olla tärkeä inhiboiva rooli keuhkosyövän kehittämiseen . Erityisesti näyttää siltä, ​​että mir-144 on negatiivisesti yhteydessä pahanlaatuiseen fenotyyppiin keuhkosyövässä (kuvio 1, 2). Tämän mukaisesti käsite, ektooppinen ilmentyminen mir-144 johtaa dramaattiseen tuumorin solujen kasvua ja induktio kasvaimen apoptoosin.

ZFX proteiinia, alas-stream tavoite mir-144, on ilmaistu korkeampi ihmisen keuhkosyövän solulinjoja kuin keuhkoputken epiteelisolujen linja

Koska seuraava askel, se näyttää olevan mielenkiintoinen selvittää taustalla mekanismi mir-144 välittämä kasvaimen estoon. By kattavasti etsivät liittyvää tietoa, huomasimme ZFX (Zinc Finger Protein, X-linked) voi olla mahdollinen effektorimolekyylin Mir-144 toiminnan yhteydessä NSCLC kasvua ja kehitystä. Tämän hypoteesin testaamiseksi, pyysimme proteiinin ilmentymisen ja mRNA NSCLC soluissa ja tavanomaisessa kollegansa. Kuten kuvassa 4A on esitetty, olemme huomanneet, että ZFX proteiini on merkittävästi korkeampi NSCLC solulinjoissa verrattuna niiden normaaleihin vastine. Emme havainneet eroa NSCLC ja normaalien solujen mRNA tasoilla ZFX (kuvio 4B). Olemme myös todettu ZFX-proteiinin taso oli alhaisempi mir-144 yli-ilmentynyt A549-solut verrattuna vektorisäädön transdusoidut solut (kuvio 4C). Kuvassa 4D osoitimme järjestelmässä lusiferaasimääritystä käyttäen pMIR-raportti järjestelmä arvioida suoraan esto mir-144 ZFX proteiinin ilmentymiseen. Olemme löytäneet Mir-144 voi tehokkaasti estää lusiferaasin ilmentymistä sitoutumalla ZFX 3′-UTR: n, mutta ei vaikuta lusiferaasin ilmentymistä, kun sitoutumiskohdat mutatoitiin on ZFX 3′-UTR (kuvio 4E).

vaikutus Kohdunulkoisten miR-144 ilme ZFX proteiinin tasolla A549-soluja. A. Suhteellinen mRNA: n ilmentymisen tasoja ZFX A549-, CRL-5875, HTB-183 ja 16HBE14o- soluja, keskiarvo ± SD, n = 3. B. Länsi-blotit ZFX ja GAPDH yllä soluissa. C. Western-blotit ZFX ja GAPDH A549-soluja tai ilman mir-144 yli-ilmentyminen. D. kaavio lusiferaasimääritystä käyttäen pMIR-raportti järjestelmä arvioida suoraan esto mir-144 ZFX proteiinin ilmentymiseen. E. eri vaikutuksia mir-144 ZFX 3′-UTR ja sen mutantti, keskiarvo ± SD, n = 5.Mir-144 voi tehokkaasti estää lusiferaasin ilmentymistä sitoutumalla ZFX 3′-UTR: n, mutta sillä ei ole vaikutusta lusiferaasin ilmentyminen, kun sitoutumiskohdat mutatoitiin on ZFX 3′-UTR.

ZFX knockdown inhiboi A549-soluja ja edistää apoptoosia solujen

Voit testata, onko ZFX aiheuttaa myös suoraa sääntelyn toimintoa NSCLC kasvaimen kasvuun, me pudotti ZFX proteiinia A549-soluja. Kuten on esitetty kuviossa 5A, meidän pudotus rakentaa tulokset 80% proteiinin ilmentymisen säätelyä alaspäin verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 5A). Kuten odotettua, havaittiin, että ZFX pudotus indusoi voimakkaasti NSCLC apoptoosia (kuten ilmenee parannettu apoptoottisen proteiinin markkereita ja virtaussytometrialla) ja estää kasvainsolujen kasvua (kuvio 5B-F), joka on samanlainen kuin biologiset vaikutukset havaitsimme Mir-144 yli- ilmaisun esitetty edellisissä kuvissa.

. Suhteelliset mRNA ekspressiotasot ZFX A549 kanssa tai ilman ZFX Knockdown, keskiarvo ± SD, n = 3. B. Länsi-blotit ZFX, sytokromi-c, kaspaasi-3 ja GAPDH yllä soluissa. C. kasvukäyrät A549 kanssa tai ilman ZFX Knockdown, keskiarvo ± SD, n = 3 D ja E. edustaja kuvaa Guava neksiini määritys tulokset A549-soluja sekä ilman ZFX knockdown vastaavasti. F: kvantitointi Guava neksiini määrityksen tulokset, keskiarvo ± SD, n = 3.

ZFX tarvitaan tukahduttava funktio mir-144 NSCLC kasvuun

edelleen selvittää ZFX vaaditaan mir-144 toimintaa NSCLC skenaariossa samanaikaisesti yliekspressoitujen mir-144 ja ZFX proteiinin A549 solulinjassa. Me yliekspressoidaan mir-144 transfektoimalla solut ennalta mir-144 plasmidia lipofektamiinia 2000. 24 tuntia myöhemmin, me tartunnan solut retrovirus joka koodaus ZFX proteiinia. Tulokset paljastivat, että ZFX yli-ilmentyminen osittain, mutta merkittävästi vaimentaa mir-144 toimia kuten on osoitettu vähentynyt apoptoosia (kuvio 6A, 6C-6F) ja lisääntynyt kasvainsolujen kasvua (kuvio 6B) verrattuna tuumorisolujen vain mir-144 hyper- ilmaisua, joka viittaa selvästi siihen, että ZFX-masennus vaaditaan mir-144 välittämä A549 NSCLC apoptoosia ja kasvun estäminen. Yhdistetään tietoihin kuvassa 4 ja kuviossa 5, näyttää siltä, ​​että ZFX koska alavirtavaikuttajainhibiittorit geeni, voi olla mukana mir-144 välittämä NSCLC kasvainten kehittymiseen sääntelyä, joka valottaa lisätutkimuksia tämän uuden väylän NSCLC hallintaan.

. Western-blotit ZFX, sytokromi-c, kaspaasi-3 ja GAPDH A549-soluissa vain mir-144 yliekspressio, tai mir-144 yliekspressio yhdistettynä ZFX yli-ilmentyminen. Kontrolliryhmä transduktoi- kahdella tyhjällä vektorilla koodaus viruksia. B. kasvukäyrät edellä soluja. C, D ja E. edustaja kuvaa Guava neksiini määritys tulokset edellä soluja. F. kvantitointi Guavan neksiini määrityksen tulokset, keskiarvo ± SD, n = 3.

ZFX ekspressiotasot ovat merkittävästi suurempia tuumoreissa verrattuna niiden viereisten normaaleissa kudoksissa

Yhdenmukainen edellinen data, ELISA osoitti suhteellisen ekspressiotasot ZFX normaalissa (n = 26) olivat merkittävästi alemmat kuin kasvaimen kudokset (n = 26, p 0,001) (kuvio 7A). Suhteelliset tasot ZFX kasvaimissa saatiin normalisoimalla vastaan ​​ilmentymisen ZFX vastaavan normaaleissa kudoksissa samasta potilaasta. Myös suhteellinen ekspressiotasot ZFX in huonolaatuisen (IA-IIB) ja korkea-asteen (IIIA-IV) keuhkoadenokarsinooma verrattiin myös. Vaikka ZFX proteiinin tasot korkealaatuisesta keuhko agenocarcinoma olivat lievästi korkeammat kuin heikompilaatuisen data ei ollut merkittävä, possiblely koska pieni otoskoko (kuvio 7B).

. Suhteellinen ilmentymistaso ZFX normaalissa (n = 26) ja kasvaimen kudokset (n = 26). Suhteelliset tasot ZFX kasvaimissa saatiin normalisoimalla vastaan ​​ilmentymisen ZFX vastaavan normaaleissa kudoksissa samasta potilaasta. B. suhteelliset ekspressiotasot ZFX in huonolaatuisen (IA-IIB) (n = 14) ja korkea-asteen (IIIA-IV) keuhkoadenokarsinooma (n = 12).

Keskustelu

Keuhkosyöpä on yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti ja sijoittuu nro 1 kaikille syöpään kuolema. Nykyinen malli keuhkosyövän synnyssä uskotaan johtuvan yhdistelmä geneettisiä riskitekijöitä ja odottamattomia ympäristön ärsykkeet [37]. Kuten aiemmin, Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) kattaa noin 80% kaikista keuhkosyöpää alatyyppejä [2]. Siksi selvittäminen taustalla mekanismin NSCLC kehitys seisoo suuri haaste menestykselliseen hoitoon keuhkosyöpään.

Valitettavasti vaikka syövän synnyn ja patofysiologia NSCLC on tutkittu intensiivisesti viime useita vuosikymmeniä, taustalla olevan mekanismin NSCLC kehittäminen on edelleen huonosti ymmärretty ja on edelleen puute optimaalisia hoitostrategioita vielä vuosikymmenten jälkeen intensiivisen tutkimuksen.

viime vuosikymmenen aikana nähty microRNA kuumana alue syövän biologian. Vaikka MikroRNA ovat välttämättömiä myös normaalin ihmisen fysiologia, monet microRNA lajit on osoitettu olevan tärkeitä sääntelyn rooli kasvainten synnyssä ja syövän kehityksen samoin. Esimerkkejä ovat, mutta ei näihin rajoittuen, mir-574-3p ja eturauhassyövän [38], mir-23a ja mahasyövän [39], mir-21 ja paksusuolen syöpä [40]. Perustuen runsas data kertynyt kuluneiden kahden vuosikymmenen aikana, tutkijat alkoivat kiistellä käytöstä MikroRNA uusina terapeuttisina kohteina oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [41]. Tunnistetut keuhkosyöpä liittyviä MikroRNA kuuluvat mir-210 [42], mir-365 [43], mir-449C [44] jne

Nykyisessä tutkimuksessa olimme pyrkineet tarjoamaan uuden käsityksen NSCLC kehittämiseen näkökulmasta translaation tieteen. Ensin keräsimme tietoja sängyn puolella, joka osoittaa vahvasti yhdistyksen välillä pahanlaatuinen fenotyyppi NSCLC ja mir-144 ilme. Kun otetaan huomioon tietojen todellinen NSCLC näytteistä, me tutkia tarkemmin roolia mir-144 NSCLC kehittämiseen. Tulokset osoittautui erittäin positiivinen. Tiedot osoittivat, että mir-144 voimakkaasti indusoi apoptoosia ja estää kasvun NSCLC-solujen. Lisäksi tulokset ehdotti myös, että sinkki sormen X-kromosomi-proteiinia tai ZFX, näyttää olevan alavirran efektorimolekyylin Mir-144 toimintaa. Mitä NSCLC, näyttää siltä, ​​että kasvaimen vastainen aktiivisuus mir-144 on ainakin osittain läpi vääntämällä ZFX proteiinin ilmentymistä jälkeisen transkription tasolla. Tämä hypoteesi vahvistettiin edelleen toisella kaksi keskeistä havainnot 1) Mir-144 kohdistaa suoraan sääntelyn rooleja ZFX ilmaisun ja 2) ZFX proteiinin ilmentymisen (ELISA) näyttää liittyvän kasvaimen kehittymisen.

Tähän mennessä parhaisiin tietomme ei ole raportti osoittaa suoraa osallistumista mir-144-ZFX akselilla NSCLC kehittämiseen, mikä oikeuttaa lisätutkimukset tämän reitin NSCLC käyttäytymistä. Vaikka meidän ei pitäisi sulkea pois osallistumista muiden kohdegeenien Mir-144 toimia nykyisessä tilanteessa, tuloksemme, vähemmässä määrin, ainakin tarjota periaatteen todiste osoittaa, että translaation lähestymistavat voivat olla hyödyllisiä tulevaa kehitystä uusien terapeuttisten strategioita NSCLC.