Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSC) ovat herättäneet suurta jännitystä viime vuosikymmenen aikana ja ovat lupaavia kohteita tehokasta kasvainten hoitoon ilman pahenemisvaiheita ja etäpesäkkeitä. Eri menetelmiä, jotka mahdollistavat rikastuttaa syöpäsolulinjoja CSC, tumorspheres kulttuuri on pääasiassa käytetty. Tässä raportissa, yritimme tuottaa tumorspheres useista hiiren ja ihmisen syövän solulinjoissa: B16-F10, HT-29, MCF-7 ja MDA-MB-231-soluja. Tumorspheres saatiin vaihteleva energiankäyttötapojen kaikissa solulinjoissa lukuun ottamatta MDA-MB-231-soluja. Sitten tutkittiin useita CSC piirteitä sekä tumorspheres ja tarttuu kulttuurien B16-F10, HT-29 ja MCF-7-soluissa. Yllättäen, tumorspheres muodostavien solujen olivat vähemmän klonogeenisten ja, kun kyseessä ovat B16-F10, vähemmän proliferatiivinen kuin kiinnittyneitä soluja. Lisäksi emme noudata mitään rikastumista väestöstä ilmentävät CSC pinnan merkkiaineiden tumorspheres alkaen B16-F10 (CD133, CD44 ja CD24 markkereita) tai MCF-7 (CD44 ja CD24 markkereita) soluja. Päinvastoin, tumorspheres kulttuuri HT-29-solut näyttivät rikastuttaa soluissa, jotka ilmentävät paksusuolen CSC markkereita,

so.

CD133 ja CD44-proteiineja. Jotta B16-F10-solulinja, kun 1 000 solua injektoitiin syngeeninen C57BL /6-hiiriä, tumorspheres muodostavien solujen näkyy huomattavasti vähemmän tuumorigeeninen potentiaali kuin tarttuneet solut. Lopuksi tumorspheres kulttuuri B16-F10-solujen aiheuttama alas-säätely vimentiinista joka voisi selittää ainakin osittain, alempi tuumorigeenisyyteen of tumorspheres muodostavien solujen. Kaikki nämä tulokset yhdessä kirjallisuudesta osoittavat, että tumorspheres kulttuuri syöpäsolulinjois- voi aiheuttaa rikastuminen CSC mutta solulinjassa riippuvaisella tavalla. Lopuksi, laaja luonnehdinta CSC ominaisuudet tumorspheres peräisin syöpä-solulinjasta tai syövän kudoksen täytyy suorittaa, jotta voidaan varmistaa, että syntyvän tumorspheres todella rikastettu CSC.

Citation: Calvet CY, André FM, Mir LM (2014) Kulttuuri on syöpäsolulinjoissa Tumorspheres ei systemaattisesti Aiheuttavat Cancer Stem Cell Enrichment. PLoS ONE 9 (2): e89644. doi: 10,1371 /journal.pone.0089644

Editor: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 24 tammikuu 2014; Julkaistu: 24 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Calvet et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Tutkimus oli toteutettiin soveltamisalaan EBAM European Associated Laboratory. Tämä työ oli osittain tukevat avustusta Agence Nationale de la Recherche (IPSIOAT) ja Département du Val-de-Marne kautta TELVAC projekti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä kantasolut (CSC), alapopulaatio syöpäsoluja, ovat herättäneet suurta kiinnostusta tiedeyhteisössä viimeisen kahden vuosikymmenen aikana. Ne ovat todellakin epäillään olevan vastuussa kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden, vastus kohti hoito ja näin pahenemisvaiheita [1].

CSC on monia ominaisuuksia, joilla on normaali kantasolujen kuten erilaistumista kyky, itseuudistumiseen ja suhteellinen lepotilan viittaa siihen, että he voisivat mahdollisesti peräisin normaalista kollegansa kautta kertyminen muuttamassa mutaatioita joko geneettisiä tai epigeneettiset [2] – [4]. CSC ovat kantasoluja, jotka voivat itse uudistaa tai erilaistuvat heterogeenisen suvusta, joka muodostaa kasvain irtotavarana. Toisin kuin klonaalinen evoluutiomalli syövän etenemisen, CSC malli toteaa, että kaikki syöpäsolut eivät ole yhtä tuumorigeenisia kun pistetään

in vivo

[1], [5]. Viisitoista vuotta sitten, Bonnet ja Dick osoittivat ensimmäistä kertaa, että CD34

+ CD38

– CSC eristetty akuutti myelooinen leukemia pystyivät kerrata heterogeenisuus alkuperäisestä kasvaimesta sarjasiirrostuksilla transplantations ksenograftimalleissa vastoin CD34

-CD38

+ soluja [6]. Sittemmin CSC mallia, jota käytetään selittämään paitsi etenemistä leukemia, mutta myös kiinteiden syöpien, kuten rinta-, maha-, paksusuoli-, eturauhas-, munasarja-, maksa-, haima-, keuhko-, aivo- ja kilpirauhasen karsinoomat, melanooma, osteosarkooman ja Ewing sarkooma [7].

CSC näyttö vastus kohti kemoterapiaa ja sädehoitoa. Niiden kyky paeta sytotoksisuuden tavanomaisten syöpähoitoihin ja elvyttää kasvain lopussa hoitoja johtuu useista mekanismeista: lepotilan, ilmaus Antiapoptoottisten proteiineja, huumeiden effluksipumppujen, korkea aineenvaihdunta kapasiteetti ja alhainen reaktiivisen hapen lajit [1], [8], [9].

Lisäksi, kuten normaaleille kantasoluja, CSC kapealla on osoitettu aktiivinen rooli ylläpidossa stemness ominaisuuksista sekä että erilaistamattomuuden ei-CSC kautta epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [10]. Tämä ilmiö, joka tunnetaan olevan mukana metastaattisen prosessin voi myös selittää alkuperää CSC koska nämä solut jakavat suurimman osan ominaisuuksista jälkeisestä EMT soluja, kuten korkeat hyökkäys ja muuttoliike kyky, ja lisääntynyt ilmentyminen mesenkymaalisten merkkiaineiden (

esim

vimentiinista). Lisäksi syöpäsolut joutuvat käymään EMT hallussaan lisääntynyt Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja ilmaista korkeampi CSC merkkiaineiden [8], [10] – [12].

Harvat menetelmät ovat tällä hetkellä saatavilla eristää CSC. Viljeleminen soluista kiinnittämisestä riippumattomalla tavalla, osaksi seerumia rikastunut kasvutekijöitä, käytettiin ensimmäisen levittämään ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen eriyttämätön tilassa [13]. Ponti ja työtoverit osoittivat, että tämä menetelmä oli myös tehokas ylläpitämään rintojen CSC kulttuuri [14]. Sellaisissa olosuhteissa, solut kasvoivat monisoluisina kolmiulotteinen klooneja kutsutaan ”tumorspheres”. Tämä tekniikka osoittanut toimivuutensa rikastamista ja ylläpitää CSC useista solulinjoista [15].

Tässä artikkelissa pyrimme arvioimaan kykyä tumorspheres kulttuurin tekniikka rikastuttaa useita syöpäsolulinjoja CSC. Itse asiassa se on suuri käytännön kiinnostusta lääkekehityksen ja arviointia varten tehokkuuden hoitoja toimimaan syöpäsolulinjoja rikastunut CSC koska ne katsotaan kuin se, joka olisi kohdennettava kasvainten pitkällä aikavälillä ilman toistumisen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti noudattaen eettiset ohjeet, jotka Euroopan komitea (direktiivin 86/609 /CCE). Université Paris-Sud Animal eettinen komitea # 26, on rekisteröity Ranskan Department of Research, erikseen hyväksynyt tätä protokollaa (protokolla rekisterinumero # 2012_007).

Adherent Cell Culture

hiiren B16-F10 melanooma, HT-29 ihmisen paksusuolen adenokarsinooma, MCF-7 ja MDA-MB-231 ihmisen rinta- adenokarsinooma solulinjoja viljeltiin DMEM: ssä, McCoyn 5A-MEM tai RPMI 1640-väliaine, vastaavasti. Kaikki alustat täydennettiin 1%: glutamax, 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (PS), kaikki hankittiin Life Technologies (Cergy Pontoise, Ranska). Insuliinin liuosta (Sigma, St Quentin Fallavier, Ranska) on 10 ug /ml lopullinen konsentraatio oli nimenomaan käytettiin MCF-7-soluviljelmässä. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa 95%: n kosteudessa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2 ja siirrostettiin heti konfluenssiin (1:10, 1:08, 1:06 tai 1:04 laimennus, vastaavasti) käyttäen TrypLE liuos (Life Technologies). Soluja mycoplasma-vapaa ja rutiininomaisesti tarkastettava Venor GeM-One Step Mycoplasma havaitseminen pakki ostettiin Biovalley (Marne-la-Vallée, Ranska).

Tumorspheres Culture

10 000 elinvoimaiset solut siirrettiin T75-ultra-low noudattamista pulloon (Corning, Avon, Ranska) 10 ml: CSC, joka koostui DMEM /F12 alusta plus glutamaxia (Life technologies), 4 ug /ml hepariinia (Sigma), 2% B27 täydentää (Life tekniikat), 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF, Peprotech, Neuilly-sur-Seine, Ranska), 20 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä (FGF-b, Peprotech) ja 1% PS. Tuore EGF, FGF-b ja hepariinia lisättiin väliaineeseen joka 3. päivä. Tumorspheres annettiin kasvaa aikana 4 päivää (B16-F10) tai 7 päivää (HT-29 ja MCF-7). Sillä dissosiaatio, tumorspheres ensin sentrifugoitiin 5 minuuttia 200 g, pelletti suspendoidaan sitten varovasti uudelleen 500 ui Accutasella (Life Technologies) ennen inkuboitiin 5 minuuttia 37 ° C: ssa. Kun oli lisätty 2 ml DMEM /F12, tumorspheres hajotettiin pipetoimalla varovasti ja sitä siirretään takaisin tumorspheres viljelyolosuhteet, kuten aiemmin on kuvattu.

Tumorsphere muodostava Tehokkuus määritys

ARIAIII Cell lajittelija (BD Biosciences , USA) käytettiin tarkasti siirtää 1 single elävien solujen (

eli

propidiumjodidista-negatiivinen solu) kuhunkin kuoppaan ultramatalaa sitoutuminen 96-kuoppalevylle (Corning), joka sisälsi 100 ui CSC välineellä. Tuore EGF, FGF-b ja hepariinia lisättiin joka 3 päivä. Tämä koe suoritettiin, jotta voidaan arvioida tumorsphere muodostumista solujen kykyä peräisin adherenttiviljelmiä tai aikaisemmin muodostetun ensisijaisen tai toissijaisen tumorspheres. Sen jälkeen, kun 10 päivää viljelyn jälkeen kuoppien määrä sisältää tumorsphere suurempi kuin 50 pm määritettiin käyttäen faasikontrastimikroskooppia.

klonogeeninen määritys

ARIAIII Cell lajittelija on käytetty juuri siirtää 200 elävää solua (

eli

propidiumjodidilla-negatiiviset solut), erottaa yhden viikon ikäisiä tumorspheres tai kiinnittynyt yksisolukerroksia kulttuurin kuhunkin kuoppaan normaalia sitoutumista 6-kuoppaisella levyllä, joka sisälsi DMEM 10% FBS: ää ja 1% PS. Kun 5 päivän viljelyn ja B16-F10 ja 10 päivää HT-29 ja MCF-7, väliaine heitettiin pois, solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen vesiliuosta, joka sisältää 20% etanolia, 3,7% formaldehydiä ja 0,2% kristalliviolettia. Kyky muodostaa klooneja laskettiin muodostuneiden pesäkkeiden määrästä suhteessa pesäkkeiden lukumäärä muodostettu kiinnittyneitä soluja.

proliferaatiotestillä

ARIAIII Cell lajittelija on käytetty siirtämään 1 000 B16-F10-elinkykyisten solujen (

eli

propidiumjodidilla-negatiiviset solut), erottaa yhden viikon ikäisiä tumorspheres tai kiinnittynyt yksisolukerroksia, kuhunkin kuoppaan normaalia sitoutumista 96-kuoppaisella levyllä, joka sisälsi DMEM 10% FBS: ää ja 1% PS. Levy laitettiin IncuCyte ™ FLR kuvantamisjärjestelmä (Essen Biosciences, Welwyn Garden City, Iso-Britannia) puitteissa säännöllinen soluviljelmässä inkubaattoriin (37 ° C, 95% kosteus, 5% CO

2). Neljä eri alueita kohti hyvin seurattiin (10-kertainen suurennus, vaihekontrasti) kanssa IncuCyte ™ 4 tunnin välein yhden viikon aikana. Kasvu mitattiin kanssa IncuCyte ™ -ohjelmiston ja kaksinkertaistaa aika määritettiin käyttäen lineaarista regressiomallia.

Immunovärjäys Pitoisuus

50 000 elinkelpoisen B16-F10-solut (trypaanisinieksluusiolla testi) erillään yhdestä -week-vuotias tumorspheres tai trypsinisoitiin kiinnittyneet yksisolukerroksia inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä 0,5 ug rotan anti-hiiren monoklonaalinen CD133-APC, CD44-FITC tai CD24-PE-vasta-aineilla (eBiosciences, Pariisi, Ranska) 100 ui puskuria, joka koostui PBS: ssä, joka sisälsi 3% naudan seerumialbumiinia (Sigma). Immunovärjäys suoritettiin myös HT-29, MCF-7 ja MDA-MB-231-solulinjoja käyttämällä hiiren anti-humaani monoklonaalinen CD133-APC, CD44-PE, CD44-APC tai CD24-FITC-vasta-aineita (Miltenyi Biotec, Pariisi, Ranska) mukaan valmistajan ohjeiden. Tämän jälkeen solut pestiin ja analysoitiin kanssa Accuri C6 virtaussytometrillä (BD Biosciences, USA).

Side Väestö Pitoisuus

Yksittäinen solususpensio 1,10

6 B16-F10 solua /ml in seerumittomassa DMEM /F12-väliaine valmistettiin käyttäen erottaa yhden viikon ikäisiä tumorspheres tai liittyvät yksikerroksia. Tämä solususpensiota inkuboitiin 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma) 90 minuuttia 37 ° C: ssa pimeässä. Negatiivinen kontrolli Solususpensio alttiina Hoescht 33342 ja 50 uM verapamiilia (Sigma) inkuboitiin rinnakkain. Sitten solut pestiin PBS: lla ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan DMEM /F12, joka sisälsi 5 ug /ml propidiumjodidia (Sigma) jättää kuolleita soluja. Analyysi tehtiin käyttäen LSR II virtaussytometrillä (BD Biosciences).

Kvantitatiivinen RT-PCR (RT-qPCR) B

TRIzol® reagenssia (Life Technologies) käytettiin erottamaan kokonais-RNA: B16-F10 tarttuvien solujen tai tumorspheres mukaan valmistajan ohjeiden. 1 ug RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Life Technologies). Vahvistusta ja havaitseminen SYBR Green toteutettiin käyttäen Step One Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems, Ranska) mukaan valmistajan ohjeita. 18S taloudenhoito geeniä käytettiin sisäisenä standardina. Seuraavia alukkeita käytettiin 10 uM kutakin:

E-kadheriinin:

eteenpäin 5′-GAGCCTGAGTCCTGCAGTCC-3 ’, käänteinen: 5′-TGTATTGCTGCTTGGCCTCA-3’

vimentiinista:

eteenpäin 5′-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3 ’, käänteinen: 5′-GATTCCACTTTCCGTTCAAGGT-3’

Snai1:

eteenpäin 5′-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3 ’, käänteinen : 5’-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3 ’

18S:

eteenpäin 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′, käänteinen: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3 ’

tuumorigeenisyystesti Pitoisuus

100 ui DMEM /F12, joka sisälsi 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 tai 100 000 elävää solua (trypaanisinieksluusiolla testi) dissosioituneista B16-F10 tumorspheres injektoitiin molempiin kylkiin 6-to -8 viikon ikäisiä C57BL /6-hiiriä (Harlan, Gannat, Ranska) kahdessa eri paikassa. 1 000 solua ruiskutetaan hiirten ryhmä koostui 6 hiiret ja muut ryhmät käsitti 3 hiirtä kussakin. Kontrolliryhmiin injektoitiin sama määrä soluja, jotka ovat peräisin B16-F10 adherenttiviljelmiä ja suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan DMEM: ä. Hiiret tarkastetaan kaksi tai kolme kertaa viikossa aikana 50 päivää. Hiiret lopetettiin heti, kun kasvaimet saavutti 2 000 mm

3 tai tuli nekroottisen minimoimiseksi eläinten kärsimykset.

Tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvot ja keskihajonnat.

Data analysoitiin käyttäen parametritonta Mann-Whitney-Wilcoxonin testi, Kruskall-Wallis testi Dunnin korjausta tai χ2 testi ja p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tulokset

B16-F10, HT-29 ja MCF-7-solut pystyvät muodostamaan Tumorspheres

B16-F10, HT-29, MCF-7 ja MDA-MB-231-solulinjoja viljeltiin ankkurointi riippumattomalla tavalla , mikä tarkoittaa päälle tarttumattoman substraatti seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi kasvutekijöitä, joiden tarkoituksena on ylläpitää pluripotentti- (

eli

FGF-b ja EGF). 4 päivän jälkeen viljelmässä B16-F10-soluja ja 7 päivää HT-29 ja MCF-7-soluissa, tumorspheres noin 100 um havaittiin (kuva 1) ja erotettiin ja jatkoviljely. Päinvastoin, MDA-MB-231-solut eivät onnistuneet muodostamaan tumorspheres, vaikka enemmän kuin 10 päivää.

(A) B16-F10, (B) HT-29 ja (C) MCF-7- tumorspheres. Tumorspheres muodostettiin jälkeen 4-7 päivää viljelyn seerumivapaassa elatusaineessa, joka sisältää FGF-b ja EGF ultra-low kiinnittyminen alustaan. Mittaviivat edustaa 100 um.

B16-F10 tumorspheres voitiin viljellä, kuten tumorspheres pitkiä kohtia (yli 20 kohtia). Noin 20% B16-F10-solut pystyivät muodostamaan tumorsphere ja tämä pysyi suhteellisen vakiona ainakin kolmen ensimmäisen kohdat (kuva 2). Samanlaisia ​​hinnat saatiin MCF-7 tumorspheres muodostumisen tehokkuutta. Mitä tulee HT-29-solulinjaa, 80% kiinnittyneet solut pystyivät muodostamaan ensisijainen tumorspheres kun havaitsimme lasku alas noin 50% soluista on sekundäärinen tai tertiäärinen tumorspheres muodostumista. Nämä erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä.

Tumorspheres muodostumisen tehokkuutta olivat erittäin cell line-riippuvainen. T1: ensisijainen, T2: toissijainen, T3: tertiäärinen.

kyky muodostaa Adherent Colonies on vähentynyt viikon kuluttua Culture kuin Tumorspheres

Yhden viikon ikäiset tumorspheres johdettu B16-F10, HT-29 tai MCF-7-solut hajotettiin, siirrettiin takaisin kiinnittynyt olosuhteet ja niiden pesäkkeiden muodostumisen tehokkuutta verrattiin tarttuvien solujen. Kyky muodostaa klooneja tumorspheres muodostavien solujen, jotka ovat peräisin kolmesta solulinjojen väheni merkittävästi, eli 20-to-30% lasku verrattuna kiinnittyneitä soluja (kuvio 3, paneeli A). Lisäksi 30%: sta 80% adherenttien pesäkkeistä peräisin B16-F10 tumorspheres muodostavia soluja selvästi vähemmän tiheää kuin ne, jotka johtuvat kiinnittyneitä soluja (kuvio 3, paneelit B ja C). Tämä viittaa siihen, että tumorspheres muodostavien solujen tehtiin mukauttamista tai valinnan kulttuurin suspensiossa, jolloin heikompi kyky liittää alustaan. Tällaista muutosta ei pesäkkeiden morfologiassa havaittiin tapauksessa HT-29 ja MCF-7-solulinjoissa.

(A) Tumorspheres muodostavien solujen syntyy noin 20-30% vähemmän pesäkkeitä kuin kiinnittyneet solut, riippuen solulinjaa pidetään (*** varten p 0,001 B16-F10 ja HT-29-solujen, ** p 0,01 MCF-7-solut). (B) Tarttuneesta B16-F10-solut aina muodostettu pyöreä ja pakattu pesäkkeet taas (C) B16-F10 tumorspheres muodostavia soluja muodostuu myös vaihteleva määrä huonosti tiheä pesäkkeitä, jotka vaihtelevat 30%: sta 80% kokonaismäärästä pesäkkeitä. Mittaviivat edustaa 200 um.

B16-F10 Tumorspheres muodostava solut kasvavat hitaammin Adherent olosuhteet kuin niiden Adherent Counterparts

B16-F10 pysyvä ja tumorspheres muodostavien solujen (molemmat ensisijainen ja toissijainen tumorspheres) viljeltiin alle kiinnittyvä olosuhteissa yhden viikon ja niiden leviäminen kvantitoitiin käyttäen Incucyte ™ yhtymäkohta algoritmia. Kaksinkertaistaminen aikaan B16-F10-soluja toissijainen tumorspheres oli merkittävästi korkeampi kuin niiden kiinnittyneet solu kollegansa (kuvio 4), mikä viittaa jälleen, että tumorspheres muodostavien solujen koki mukauttamista kulttuurin suspensiossa, jolloin heikompi leviämisen alle kiinnittyvä olosuhteissa.

kaksinkertaistaminen aikaan B16-F10-solujen sekundäärisen tumorspheres oli merkittävästi korkeampi kuin tarttuvien solujen. Ns: ei ole tilastollisesti merkitsevä, * P 0,05.

Tumorspheres Culture Vaikuttaa Expression CSC Markers in Cell Line riippuvaisella tavalla

Immunovärjäys on myös klassinen menetelmä tunnistaa CSC [1], [15]. Näin ollen, solut tumorspheres tai liittyvät yksisolukerrokset immunovärjättiin käyttäen tunnistavien vasta-aineiden yleisimmistä CSC pinnan markkereita,

so.

CD133, CD44 ja CD24-proteiineja (Taulukko 1). Kirjallisuuden mukaan, CD133, CD44 ja CD24 käytetään tunnistamaan CSC väestön B16-F10 solulinjassa [16], kun taas ainoastaan ​​CD133 ja CD44 tunnistetaan luotettavasti markkereita HT-29 CSC [17]. Mitä rintasyövän solulinjat kuten MCF-7 ja MDA-MB-231, joka on CD44

+ CD24

– profiili kuvattiin CSC [18], [19].

kiinnittyneissä yksikerroksia, lähes kaikki B16-F10-solut ilmensivät CD44 ottaa huomioon, että CD133 ja CD24-proteiinit havaittiin vähemmän kuin 1% soluista. Nämä hinnat pysyivät ennallaan, kun viljellään soluja tumorspheres jopa 23 kohtia. Vaikka CSC voidaan myös tunnistaa puoli väestön pystyy pumpata Hoechst 33342 ansiosta kalvo ABC kuljettajat [15], [20], ei ole puolella väestöstä ei havaittu joko B16-F10 tarttumista tumorspheres muodostavien solujen (tuloksia ei ole esitetty).

Mitä HT-29-solulinja, joka on 15% kasvua CD133

+ CD44

+ solujen havaittiin tumorspheres (49,6% soluista) verrattuna kiinnittyneitä soluja (34,3% soluista) vihjaten kohti rikastumista CSC. Tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä, koska korkeat keskihajonnat.

MCF-7-solut sisälsivät noin 50% CD44

+ CD24

– solujen kiinnittynyt väestöstä. Tämä laski alas 33,1%, kun soluja viljeltyjä tumorspheres, vaikka tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Siinä tapauksessa, että MDA-MB-231-soluja, jotka eivät olleet tehokkaita lainkaan muodostavat tumorspheres, yli 99% adherenttien solujen populaatio oli CD44

+ CD24

-.

Tumorspheres Culture of B16-F10 Vähentää ilmentäminen vimentiinista ja E-kadheriinin

Kuten aiemmin mainittiin, useat kirjoittajat kertoivat, että CSC hallussaan jälkeinen EMT solujen ominaisuuksia, kuten alas-säätely epiteelin markkereita (

esim

E-kadheriinin) ja ylös-säätely mesenkymaalisten markkereita (

esim

vimentiinista ja Snai1) [8], [11]. RT-qPCR analyysi suoritettiin, jotta voidaan verrata ilmentymisen E-kadheriinin, vimentiinistä ja Snai1 sekä B16-F10 tarttuvien solujen ja tumorspheres. Sekä E-kadheriinin ja vimentiinin geenin ilmentyminen oli huomattavasti vähentynyt, kun soluja viljeltiin, kuten tumorspheres. Havaitsimme 50% vähemmän E-kadheriinin mRNA (kuvio 5, paneeli A) ja 80% vähemmän vimentiinista mRNA tumorspheres kuin kiinnittyneitä soluja (kuvio 5, paneeli B). Snai1 mRNA ei havaittu kummassakaan soluviljelmässä olosuhteissa.

Sekä vimentiinista (A) ja E-kadheriinin (B) on säädellä vähentävästi tumorspheres. *** P 0,001.

B16-F10 Tumorspheres muodostavia soluja ovat vähemmän Kasvaimia synnyttävä kuin tarttuneet solut on syngcenisiä Mouse Model

Kultakanta tapa arvioida läsnäolo CSC koostuu pistämällä CSC rikastunut populaatio hiirillä ja havainnoimalla korkeammat kasvaimen kestää hinnat verrattuna hiiriin ruiskutettiin kuin CSC rikastettu soluissa [1], [15]. C57BL /6-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti joko 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 tai 100 000 B16-F10-solut, jotka olivat kiinnittyneet solut yhdelle ryhmälle ja tumorspheres muodostavia soluja toisessa ryhmässä. Kasvainten havaittiin, kun vähintään 1 000 solua oli injektoitu. Kun tämä määrä soluja injektoitiin, tumorspheres muodostavia soluja oli huomattavasti vähemmän tuumorigeeninen kuin kiinnittynyt vastineet (kuvio 6, paneeli B). Kuitenkin, missä tahansa suurempia määriä injektoitiin soluja, ei havaittu merkittävää eroa näiden kahden ryhmän välillä (kuvio 6, paneeli A ja B).

(A) injektio 300, 3 000 ja 30 000 solua . (B) injektio 1 000, 10 000 tai 100 000 solua. Kun 1 000 solua injektoitiin hiirillä, tumorspheres muodostavien solujen olivat huomattavasti vähemmän tuumorigeenisia kuin heidän kiinnittynyt kollegansa. Adh: kiinnittyneet solut, Sph: tumorspheres muodostavia soluja. Ns: ei merkittävää, * P 0,05.

Keskustelu

Syöpä kantasolut (CSC) parhaillaan tutkittu laajasti, koska ne on tarkoitus aloittaa ja ylläpitää kasvaimen kasvua ja lisäksi ovat ajatellaan olevan vastuussa kasvaimen uusiutumisen [1].

Tumorspheres kulttuuri on raportoitu rikastuttaa useita syöpäsolulinjoissa kuten rinta-, maksa-, paksusuoli ja munasarjasyövän solulinjoissa CSC [15]. Tässä tutkimuksessa testasimme CSC väkevöimisen tumorspheres kulttuurin hiiren B16-F10-melanoomasoluja, HT-29 ihmisen paksusuolen adenokarsinooma soluja, ja MCF-7 ja MDA-MB-231 ihmisen rinta- adenokarsinooma soluissa.

toisin mitä Zhong

et al.

havaittu [21], meidän koe osoitti, että B16-F10 solut lisääntyivät helposti suspensiossa tumorspheres 3 kk ajan ainakin. Tumorspheres muodostava määriä B16-F10 ja MCF-7-solujen pysyi vakiona kolmen ensimmäisen kohtia, joka on hyväksytty tuntomerkki CSC itseuudistumisen. HT-29-solujen samalla syntyy tumorspheres vaikka muodostumisnopeus taipumus vähentyä, kun ensimmäinen kulkua. Sitä vastoin tumorspheres kulttuuri MDA-MB-231-soluja ole tuottanut tulosta. Tämä havainto oli yhdenmukainen sen kanssa, mitä jotkut kirjoittajat raportoitu [22], [23], vaikka toiset osoitti tässä solulinjassa oli itse asiassa kykenevät muodostamaan tumorspheres [24], [25]. Oletimme, että sukupuuttoon tumorspheres muodostumisen kyky meidän MDA-MB-231-solujen saattaa johtua siitä, että nämä solut olivat siirrostettiin monta kertaa ennen kokeissa. Itse asiassa, tämä seuraus solun passage tumorspheres muodostumisnopeus on aikaisemmin osoitettu [26]. Edelleen characterizations joten ne suoritettiin siten, että päätelmiä stemness ominaisuuksiin B16-F10, HT-29 ja MCF-7 tumorspheres.

CSC käsite todetaan kasvaimen kasvun taustalla on syöpäsolut stemness ominaisuuksia, jotka hankkinut proliferaatiopotentiaali ja kyky muodostaa klooneja välittää itseuudistumisen kyky. Suostumuksella tämän hypoteesin, useita raportteja mainita, että otaksuttu CSC hallussaan parannettu kyky muodostaa klooneja [27] – [31] ja lisääntyvät nopeammin [29] – [31] kuin ei-CSC. Kuitenkin meidän tutkimus osoitti, että B16-F10 tumorspheres muodostavien solujen olivat vähemmän proliferatiivinen kuin tarttuvien solujen sisään kiinnittynyt olosuhteissa. Lisäksi B16-F10, HT-29 ja MCF-7-soluissa näkyy alemman klonogeeniset potentiaali viljeltynä kuin tumorspheres. Oletimme, että tumorspheres muodostavia soluja mukautettu kulttuurin suspensiossa, jolloin heikompi kyky liittää (ja kasvaa) säännöllisesti kiinnittynyt alustaan. Tämä jotenkin sulkee pois kuvauksen Rikastusprosessista CSC on tumorspheres.

Tutkimme lisäksi stemness ominaisuuksia käyttämällä klassisia biomarkkereita raportoitu CSC tunnistamiseen [1], [15]. Dou ja työtoverit osoittivat, että B16-F10 CD133

+ CD44

+ CD24

+ soluja rikastetaan CSC [16]. Siksi vertasimme prosenttiosuus CD133

+, CD44

+ ja CD24

+ solujen B16-F10 tumorspheres ja tarttuneet solut mutta ei havainnut mitään eroa. Näin ollen, vaikka Hoechst 33342 ulosvirtaus-kompetentteja soluja on myös osoitettu kirjallisuudessa on rikastettu oletetun CSC [15], [20], ei tällaista solupopulaatio havaittiin sekä tumorspheres ja kiinnittynyt B16-F10-soluja. Tämä viittaa siihen, että puoli väestöstä määritys ei ole merkitystä havaitsemiseksi CSC kaikissa solutyypeissä.

Mitä HT-29-solulinja, kolmasosa väestöstä oli profiilia paksusuolen CSC,

eli

. olivat CD133

+ CD44

+ solujen [17], [32], ja tämä nousi jopa 50%, kun soluja viljeltiin niin tumorspheres. Kuitenkin johtuen korkeasta standardipoikkeamat tässä määrityksessä yhdessä havaintojen vähentynyt kyky muodostaa klooneja ja vähentynyt tumorspheres muodostumisen tehokkuutta jälkeen ensimmäinen kanava, emme voineet päätellä CSC rikastamiseen.

Myös määrällisesti CD44

+ CD24

– rintojen CSC väestöstä [33] sekä MCF-7 ja MDA-MB-231-soluja. Entinen solulinja näkyy 17%: n lasku CD44

+ CD24

– solupopulaation tumorspheres, johdonmukaisesti alemman klonogeeniset potentiaali havaitsimme, kun soluja viljeltiin sellaisenaan. Yllättäen lähes kaikki MDA-MB-231 kiinnittyneet solut olivat CD44

+ CD24

-, vaikka ei saanut mitään tumorsphere tästä solulinjasta.

Kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, että muodostumista tumorspheres ei aina korreloi rikastuminen aiemmin kuvatulla CSC markkereita ja että ilmentävien solujen osuus näistä CSC markkereita ei ennusta tumorspheres muodostumista kyky, ainakin rungon syöpäsolulinjoja tutkittu tässä raportissa.

Lisää silmiinpistävän, tuumorigeenisen potentiaalin B16-F10 tumorspheres muodostavia soluja oli pienempi kuin B16-F10 kiinnittyneet solut, vahvistaa kaikki

in vitro

tietojen saimme. Aivan hiljattain, Collura ja työtoverit julkaistaan ​​samanlaisia ​​havaintoja [34]. Koska tumorspheres todettiin myös tehokkaampia aloittamista kasvaimia kuin tarttuu yksisolukerrosten tapauksessa useiden muiden syövän solulinjat [35] – [38], tämä viittaa siihen, että vaikutus tumorspheres kulttuurin kasvainten muodostumiseen riippuu vahvasti tutkittu solu line.

yhä useammat tekijät raportoivat, että CSC läsnä jälkeinen EMT solujen ominaisuuksia [8], [10] – [12]. Ilmaisu Kolmen EMT liittyvien geenien (koodaavat E-kadheriinin, Snai1 ja vimentiinistä) arvioitiin B16-F10 tumorspheres käyttäen RT-qPCR analyysi. E-kadheriinin osallistuu vuorovaikutukset epiteelin kaltaisia ​​soluja ja on alas-säädellä Snai1. Vimentiinista on välituote hehkulamppuja ilmaistu mesenkyymisolujen. Kaksi suurta tunnusmerkkejä EMT ovat alas-säätely E-kadheriinin ilmentymisen ja ylös-säätely vimentiinista ilmaisun [39] – [42]. Aiheuttavan kasvaimia määrityksissä, tämä johtaa lisääntyneeseen kasvaimen ottaa. Tutkimuksessamme on B16-F10-solut, vimentiinistä mRNA taso laski rajusti vuonna tumorspheres, tukee se, että he esittivät alempi kasvainten muodostumiseen verrattuna tarttuneet solut. Kuitenkin E-kadheriinin mRNA taso oli myös pienempi tumorspheres ja yllättäen emme havaitse Snai1 mRNA joka laukaisee alas-säätely E-kadheriinin aikana EMT [8]. Tämä osoittaa, että toinen reitti voi olla mukana tumorspheres muodostavien solujen estämiseksi ilmentymisen E-kadheriinin. Yhdistelmä, vähentyneen ilmentämisen E-kadheriinin, mikä edistää EMT, sekä vähentynyt ilmentyminen vimentiinin, edistää mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtymistä (MET), voi selittää pieni ero kasvaimien välillä tumorspheres ja tarttuneet solut. Tuloksemme osoittavat, että tumorspheres kulttuuri B16-F10-solut todellakin vaikuttaa ilmaus EMT liittyvien geenien mutta se on vielä selvittämättä, jos solut tumorspheres tyypilliset ominaisuudet EMT tai MET.

Ensimmäinen, voimme päätellä, että voimakas ilmaus CSC pintamerkkiaineita ei ennusta tumorspheres muodostumista, kuten MDA-MB-231-soluja.

Toiseksi, meidän tulokset johtavat meidät päättelemään, että tumorspheres kulttuuri ei ole tehokas tapa rikastuttaa B16-F10 hiiren melanooma ja MCF-7 ihmisen rinta- adenokarsinooma solulinjoissa CSC. Mitä HT-29-solulinja, tulokset olivat vähemmän selkeitä eikä voida tehdä johtopäätöksiä. Ottaen huomioon tutkimuksemme ja muut raportointi parannus CSC piirteitä tumorspheres kulttuureissa, voimme päätellä, että tämä menetelmä näyttää rikastuttaa CSC solulinjassa riippuvaisella tavalla, riippumatta lajeista tai syöpätyyppeihin harkita. Vaikka johtopäätöksiä vain syöpäsolulinjasta, tumorspheres kuin varsinaiseen ihmisen kasvaimista (gliooma) on myös raportoitu olevan vaikea jatkoviljelyn lisääntynyt erilaistuminen ja apoptoosin verrattuna kiinnittynyt CSC kulttuurin laminiini päällystetyt pullot [43].

Yhteenvetona muodostumista tumorspheres ei aina ennustaa rikastuminen CSC ja täten voida pitää universaalina menetelmä CSC rikastamiseen syöpäsolulinjoissa. Laaja luonnehdintaa CSC allekirjoitettavaksi tumorspheres muodostavien solujen on tärkein pakollista ennen sopimuksen saavuttamiseen CSC rikastamiseen.

Ulkopuolella runkoon CSC rikastamisen tuottaminen tumorspheres edelleen kiinnostava ja hyödyllinen tekniikka.