Krooninen sairaus

tiivistelmä

GIPC1 on sytoplasminen rakennusteline proteiinia, joka on vuorovaikutuksessa lukuisten reseptorin signalointi komplekseja, ja kehittyvien näyttöä siitä, että sillä on merkitystä kasvainten synnyssä. GIPC1 ilmentyy erittäin monissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien rinta-, munasarja-, maha- ja haimasyöpä. Tukahduttamista GIPC1 ihmisen haimasyövän soluja inhiboi

in vivo

kasvaimen kasvua immuunivajaisiin hiirillä. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää GIPC1 toiminto, me tukahdutti ilmaisunsa ihmisen rinta- ja peräsuolen syövän solulinjoissa ja ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen (HMECs) ja analysoitiin sekä geenien ilmentyminen ja solun fenotyyppi. Suppressio GIPC1 edistää apoptoosin MCF-7, MDA-MD231, SKBR-3, SW480 ja SW620-solut ja heikentää kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumista HMECs. Nämä havainnot osoittavat GIPC1 on keskeinen rooli syövän syntyyn, ja sen ilme on välttämätöntä selviytymisen ihmisen rinta- ja peräsuolen syövän soluja. Lisäksi suoritetaan GIPC1 knock-down-geenin allekirjoitusta käytettiin kuulustella julkisesti saatavilla rinta- ja munasarjasyövän mikrosirujen aineistoja. Tämä GIPC1 allekirjoitus tilastollisesti korreloi useita rinta- ja munasarjasyövän fenotyyppien ja kliinisiin tuloksiin, mukaan lukien potilaan selviytymistä. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että GIPC1 esto voi olla uusi kohde terapeuttiselle kehityksen ihmisen syöpien hoidossa.

Citation: Chittenden TW, Pak J, Rubio R, Cheng H, Holton K, Prendergast N, et ai. (2010) terapeuttinen vaikutukset GIPC1 hiljentäminen in Cancer. PLoS ONE 5 (12): e15581. doi: 10,1371 /journal.pone.0015581

Editor: Pawel Michalak, Virginia Tech, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 lokakuu 2010; Hyväksytty: 12 marraskuu 2010; Julkaistu: 30 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Chittenden et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: TWC, AC, JQ, JP, RR, KH, NP, VG, YC, SB, MS, JCM, EAH, MA, ja RS tukivat varoja Dana-Farber Strategic Fund aloite ja Claudia Adams Barr Foundation. J.Q. ja J.C.M tuettiin osittain avustusta National Library of Medicine (R01LM010129) Yhdysvaltain National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

GIPC1, GIPC2 ja GIPC3 käsittävät ihmisen GIPC geenin perhe, joka on tunnettu siitä, että yhden, konservoitunut PDZ domeenin ja GIPC homologia (GH1 ja GH2) domeenit [1]. GIPC1 on rakennusteline proteiini osallistuu solun pinnan reseptorin ilmentymisen, solun sisäiseen liikenteeseen ja signaalitransduktion. Osoitimme aikaisemmin GIPC1 on keskeinen rooli fysiologisessa kasvutekijän signalointi, endoteelisolujen sääntely, ja valtimoiden haarautuva morfogeneesiä niin hiirillä ja seeprakala [2], [3]. Lisäksi GIPC1 vuorovaikutuksessa ja stabiloi tärkeitä reseptorin signalointi komplekseja, kuten reseptorityrosiinikinaasien TrkA ja TrkB [4], [5], VEGF co-reseptori neuropiliini-1 [6], FGF co-reseptorin syndekaani-4 [7], [ ,,,0],8], Frizzled-3-reseptori [9], IGF-1-reseptorin [10], TGF-beeta tyypin III reseptorin [11], ja endogliini [12]. Nämä reseptori monimutkaista vuorovaikutusta kuvastaa roolia GIPC1 pelaa sovittimen proteiinia, joka yhdistää useita kasvutekijä tuettu tunnustusta prosesseja solunsisäisten signalointireittien, joka huipentui solusyklin säätelyssä muiden toimintojen.

syöpä, GIPC1 tunnistettiin immunogeenisen antigeenin yli-ilmentynyt sekä rinta- ja munasarjasyövän kasvaimia [13], [14]. GIPC1 ja GIPC2 mRNA: t ilmentyvät OKAJIMA, TMK1, MKN45 ja KATO III ihmisen mahalaukun syövän soluja, ja eri ensisijainen mahalaukun kasvaimet [15], [16]. GIPC1 ilmentyy erittäin ihmisen haiman adenokarsinooma ja sillä on keskeinen rooli vakauden IGF-1 R haiman adenokarsinooma solulinjoissa [17], [18]. Viimeksi GIPC1 suppressio ihmisen haimasyövän soluja osoitettiin estävän

in vivo

haiman kasvaimen kasvua immuunipuutteisilla hiirillä [19]. Kuitenkin mekanismi, jolla GIPC1 edistää syövän kasvua ei ole vakiintunut.

Tutkiakseen sitä roolia, GIPC1 pelaa syöpä, käytimme RNAi tukahduttaa GIPC1 ilmaisua sekä rinta- ja peräsuolen syövän solut ja ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen (HMECs). Aloitimme tutkimus tarkastelemalla muutokset globaalissa geeniekspressiomalleja jälkeen GIPC1 tukahduttaminen. Analyysimme osoittaa, että GIPC1 tarvitaan rinta- ja peräsuolen syövän solujen selviytymisen ja sillä on keskeinen rooli syövän syntyyn.

Tulokset

GIPC1 hiljentämisen ja geeniekspression kuviointi MDA-MB231 ihmisen rintasyövän soluja

GIPC1 geeniekspressio pudotettiin MDA-MB231-solujen transduktiolla lyhyt hiusneula-RNA: iden (GIPC1 KD) sekä tyhjiä vektori ja transdusoimattomien valvontaa. Sen jälkeen puromysiiniselektion, seitsemän riippumattoman biologisen rinnakkaisnäytettä kustakin transduktion kasvatettiin viljelmässä, RNA eristettiin, ja GIPC1 knock-down analysoinnissa käytettiin qPCR. qPCR löytyi 85% knock-down in GIPC1 KD soluissa suhteessa transdusoimattomien ja tyhjä-vektorin valvontaa. RNA: t riippumattoman altaat hybridisoitiin Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChips ™, data normalisoitiin käyttämällä Tukeva Multi-Array analyysi [20] toteutetaan Bioconductor

affy

paketti, ja Tutkimusanalyysi suoritettiin hierarkkinen klusterointi käyttämällä Bioconductor paketti,

made4

[21]. Vahva biologinen vaikutus GIPC1 hiljentäminen havaittiin (kuva S1). Merkitys Analyysi mikrosirujen (SAM q-arvo = 0%) [22] saatiin selville 3081 probesets (~2271 geenejä), joilla on muuttunut ilmentyminen GIPC1 KD solujen verrattuna vektorisäädön soluja.

Tämä GIPC1 KD geeni lista verrattiin esittämiä Bild et al. [23], joka analysoi yli-ilmentyminen viisi onkogeenien (aktivoitu H-Ras, ihmisen E2F3, aktivoitu β-kateniinin, ihmisen c-Myc, ja ihmisen c-Src) primaarisessa HMECs käyttäen

OrderedList

[ ,,,0],24]. Löysimme tilastollisesti merkittävää päällekkäisyyttä epätavallisen ilmaistu geenien GIPC1 KD ja aktivoitua H-Ras over-ilmentyminen geenin listoja (P«0.05, kuva S2).

3081 GIPC1 KD probesets edustaa 2271-geenejä käytettiin toiminnalliseen rikastukseen analyysin avulla Expression Analysis Systematic Explorer (EASE) [25] ja sisäkkäisiä EASE, joka soveltaa EASE esittäviä analyysi toistuvasti tunnistaa GO tytär termejä, jotka ajavat merkitys korkeamman tason suhteen (Chittenden

et al

. toimitti). EASE käyttää Fisherin testiä tunnistaa toiminnallisista luokista geenin sarjaa, jotka ovat yliedustettuina suhteessa taustaan ​​jakeluun geenien analysoitiin. Kahdeksan 67 yliedustettuna geeni ontologian (GO) ehdot saapuvat EASE on esitetty taulukossa 1, joita ovat termejä, jotka liittyvät soluproliferaatioon, solusyklin, solusyklin pysähtymisen, apoptoosin, solujen vaeltamiseen ja ubikitiinistä välittämän proteiinien hajoaminen.

sisäkkäisiä EASE (Nease) on jatkoa EASE, joka käyttää toista, alatason, iteratiivista Fisherin testiä löytää GO alaluokkien että ajaa EASE termi valinta. Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 2, sisältää 17 tilastollisesti rikastettua toiminnallinen alaluokkien soluprosesseja saapuvat EASE. Nease totesi, että EASE-merkitsevä GO biologisen prosessin luokkaa,

solujen lisääntymistä

,

proteiinia muutos

,

mitoosia

,

solujen kasvuun ja /tai ylläpito

solun tukirangan organisaation ja biogeneesiä

, ja

fysiologinen prosessi

kollektiivisesti ohjaavat biologisia prosesseja

soluadheesiota ja integriini välittämä signalointi

. Samoin EASE-merkitsevä termi

sytoplasmaan organisaatio ja biogeneesin

löysi Nease ajettavaksi osittain

sytokineesiin jälkeen mitoosia

. Nease löytyi

apoptoosin

merkittävä määrä mennä liittyvät termit

sääntelyn aktiinifilamentin

ja

JAK-STAT signalointiryöpyn

. Muuttunut ekspressio havaittiin geenien mukana sekä

solujen vaeltamiseen

ja

aineenvaihduntaa

; muutokset

ubikitiinistä proteiini ligaasin aktiivisuuden

johtuvat muutoksista proteiineihin. Nease osoittaa myös, että GIPC1 KD muuttaa geenien ilmentymistä EGF, TGF, ja WNT reseptorin signalointireittejä.

Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että GIPC1 on mukana solujen lisääntymisen, apoptoosi, solun liikkuvuuden ja tarttuvuus ja ubikitiinistä välittämän proteiinien hajoaminen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että GIPC1 lla on laaja merkitys kuin sen alussa yhdessä verisuonten sääntelyä ja että se voi syöpää, olla mukana liittyviä prosesseja solu- kierron kontrolloinnin.

GIPC1 hiljentäminen estää MDA-MB231 leviämisen ja indusoi apoptoosia

Koska GIPC1 KD vaikuttaa prosesseihin liittyvät solun kasvuun, arvioimme vaikutuksia GIPC1 heikentymisen MDA-MB231-solujen lisääntymisen. Määritimme solujen elinkyky GIPC1 ehtyminen sekä resatsuriinia ja MTS tetratsoliinikokeella määritykset kokeellisessa ja valvontaa soluja. Molemmissa tapauksissa GIPC1 hiljentäminen aiheuttaa merkittävä väheneminen solujen elinkelpoisuuden 48 tuntia ymppäyksen jälkeen (kuvio 1A ja 1 D). Koska GIPC1 vuorovaikutuksessa neuropiliini-1 [6], soluja käsiteltiin VEGFA (10 ng /ml) sen määrittämiseksi, onko solun elinkyvyn menetykseen aiheuttama GIPC1 vaimennusta voitaisiin ratkaista asiaa mitogeeni. VEGFA hoito ei ole riittävä estämään noin 40% ja 60%: n vähennys solujen elinkelpoisuuden GIPC1 KD-soluissa 48 ja 72 tuntia, vastaavasti (kuvio 1 D).

. Solujen elinkelpoisuuden arviointi (sininen) ja kaspaasi 3/7 aktiivisuus (vaaleanpunainen) 0, 24, 48, ja 72 tuntia. Yhtenäiset viivat sinisellä laatikot (ei Transdusoimattomia) ja sininen ruutu (ei-kohde) ja katkoviiva sininen kolmioita (GIPC1 KD) osoittavat solujen elinkykyä. Pink tarkoittaa kaspaasi 3/7 aktiivisuutta. B. Normalisoitu kaspaasi 3/7 aktiivisuutta. Yhteensä kaspaasi 3/7 aktiivisuus normalisoitiin solujen elinkelpoisuuden ja arvioitiin 0, 24, 48, ja 72 tuntia. Normalisointi tarkoittaa 2,1 kertainen nousu kaspaasi 3/7 aktiivisuuden GIPC1 KD soluissa verrattuna ei-kohdesoluihin 72 tuntia. C. Tunnel määritys. DNA pirstoutuminen arvioitiin% positiivisena kontrollina. GIPC1 KD korreloi 11.24 kertaiseen kasvuun apoptoosin (GIPC1 /Non-kohde; P 0,05). D. arviointi solujen lisääntymistä, kun VEGF: n (10 ng /ml) induktio. Proliferaatiota arvioitiin 0, 24, 48, ja 72 tuntia. Päivinä 1, 2, ja 3 normalisoitiin päivään 0 Yhtenäiset viivat sinisellä laatikot (transdusoimattomien) ja sininen ruutu (ei-kohde) ja katkoviiva sininen kolmioita (GIPC1 KD) osoittavat solujen lisääntymisen nälkiinnyttämisalustassa. Pink tarkoittaa VEGF induktio. D. arviointi katkaistun PARP1. PARP1, halkaistut PARP1, GIPC1, ja GAPDH ilmentyminen arvioitiin western blot MDA-MB231 ihmisen rintasyövän soluja. Data esitetään keskiarvoina ± SEM. Tähdet osoittavat tilastollinen merkitsevyys (P≤0.05) välillä muiden kuin kohde-ja GIPC1 KD olosuhteissa.

GIPC1 KD vaikuttaa myös apoptoosin. Vaikutusten määrittämiseksi GIPC1 hiljentäminen on kaspaasi 3/7 toimintaa, fluorimetrisessä resatsuriinia väheneminen määrityksessä esitetään kuviossa 1A multipleksoidaan Apo-ONE homogeeninen kaspaasi-3/7 määrityksessä. Kun kaspaasi 3/7 toiminta on normalisoitu solujen elinkelpoisuuden arvoja, havaitsimme merkittävää kasvua kaspaasi 3/7 aktiivisuuden GIPC1 KD-soluissa verrattuna valvoa solulinjoja 72 tuntia (kuvio 1 B). Löysimme samanlaisia ​​häviöitä solujen elinkelpoisuuden ja lisääntynyt kaspaasi 3/7 toiminnan jälkeen GIPC1 hiljentäminen MCF-7 ja SKBR-3 ihmisen rintasyöpä ja SW480 ja SW620 ihmisen paksusuolen syövän solulinjat (tietoja ei esitetty).

sen ratkaisemiseksi, onko kasvu kaspaasi 3/7 aktiivisuuden löytyy MDA-MB231-soluissa liittyy DNA pirstoutuminen, teimme DeadEnd kolorimetristä TUNEL määrityksessä (kuvio 1 C). GIPC1 kohdistaminen aiheuttaa DNA pirstoutuminen; arvioitiin suhteessa kontrolliin verrattuna soluihin, suhteellinen suhde apoptoottisten solujen (GIPC1 KD /ei-kohde) on 11,24 (P 0,05). Lisäksi lisäystä sekä kaspaasi 3/7 toimintaa ja DNA pirstoutuminen GIPC1-vaiennetaan solut liittyy lisääntynyt ilmentymä pilkkoa PARP1 (kuvio 1 D). Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​mikrosiru havainnot (taulukot 1 ja 2), jotka osoittavat GIPC1 hiljentäminen estää soluproliferaatiota ja edistää apoptoosia.

GIPC1 hiljentäminen indusoi MDA-MB231 G2 solusyklin pidätyksen

Microarray tulokset sekaantunut solusyklin vaikutuksia GIPC1 KD. Suoritimme yksikanavainen FACS-analyysi GIPC1 KD solujen ja niihin liittyvien ohjainten tutkia solusykliä valvonta- ja GIPC1 KD soluja. GIPC1 tukahduttaminen edistää hienovarainen G1 ja syvällinen G2 pidätys 14. päivänä jälkeisen puromysiiniselektion on GIPC1 shRNA transfektanteilla (kuvio 2A). Nämä tulokset osoittavat solujen kerääntymiseen sekä G1 (43,70% ± 1,86% soluja vs. 38,58% ± 0,21%) ja G2 (46,33% ± 1,29% vs. 27,70% ± 0,67%) vaiheiden solusyklin GIPC1 KD verrattuna muille kuin kohde-ohjaus soluissa. GIPC1 KD solut edelleen kulkemaan S-vaiheeseen vasten näkyvä G2 pidätys (9,98% ± 0,57% vs. 33,73% ± 0,53%). GIPC1 Knockdown johtaa myös merkittävä kerääntyminen soluista 8N DNA huippu (9,74% ± 0,67% vs. 0%) ja solu- jäännökset (sub-G1; 5,52% ± 0,54% vs. 1,57% ± 0,17%). Yhdessä microarray havaintoja esitetään taulukoissa 1 ja 2, ja verrattiin asianmukaista valvontaa, nämä tiedot viittaavat siihen, GIPC1 tukahduttaminen edistää solujen jakautumista pysähtymiseen ja apoptoosiin.

. Yhden kanavan FACS-analyysi transdusoimattomien, muiden kuin kohde-, ja GIPC1 KD soluja 14 päivää transduktion jälkeen. Grey on% soluja G1. Keltainen tarkoittaa% soluista S-vaiheessa. Orange yhteensä% solut G2. Sininen on% soluja 8N. D ilmoittaa% roskia. B. Western blot-analyysi CDC25B, GIPC1, ja GADD 45 α /γ ilmentymisen transdusoimattomien, muiden kuin kohde-, ja GIPC1 KD soluja. Data esitetään keskiarvoina ± SEM. Tähdet osoittavat tilastollinen merkitsevyys (P≤0.05) välillä muiden kuin kohde-ja GIPC1 KD olosuhteissa.

Voit selvittää syyt epätavalliseen solusyklin löytyi GIPC1 tukahduttaminen, käytimme Western blotting arvioimaan proteiinin ilmentymistä tunnettujen solusyklin check-pisteen sääntelyviranomaisten löydetty differentiaalisesti ilmaistut mikrosiruanalyysillä. GIPC1 hiljentäminen aiheuttaa menetyksen CDC25B ja kasvu GADD45α /γ-proteiinin ilmentymistä (kuvio 2B). CDC25B tarvitaan CDK1 aktivointia ja käyttöönottoa mitoosiin; toteaa, ilmaus GADD45 proteiinin perheenjäsenet ovat seurausta esimerkiksi kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurioita. Nämä havainnot tukevat sekä mikrosirulla (taulukot 1 ja 2) ja FACS (kuvio 2A) tulokset osoittavat, että GIPC1 tukahduttaminen ensisijaisesti painoteta G2 pidätykseen.

GIPC1 tukahduttaminen muuttaa soluadheesiota ja liikkuvuus

Microarray havainnot viittaavat GIPC1 on mukana adheesio ja liikkuvuus (taulukot 1 ja 2). Olemme arvioineet vaikutuksia GIPC1 hiljentäminen solun liikkuvuuteen ja tarttuvuus MDA-MB231 kokeellisia ja ohjaus soluja. GIPC1 Äänenvaimennusjärjestelmä merkittävästi parannettu MDA-MB231 soluadheesiota sekä 30 ja 60 minuutin jälkeen pinnoituksen (kuvio S3A). Käytimme tyhjästä (haava) määritys arvioimaan vaikutuksia GIPC1 KD solun liikkuvuus. GIPC1 tukahduttaminen laski merkitsevästi MDA-MB231 solumigraatio, tai ilman kahdeksan tuntia kasvutekijän induktion (kuvio S3B). Microarray havainnot osoittavat GIPC1 tukahduttaminen liittyy rikastuminen poikkeuksellisen ilmaisi geenien sisällä integriini välittämää RHO proteiini, JAK-STAT, EGF, Ras, TGFp ja WNT väyliä (taulukko 2 ja kuva S2). Nämä reitit, ensimmäinen löytyy meidän bioinformatiikan analyysi, säätelevät sekä soluadheesiota ja maahanmuuttoa ja ovat ehdokkaita lisätutkimuksia. Kokeellisesti GIPC1 ehtyminen tulokset tiiviimpään soluadheesion ja vähentää solun liikkuvuus. GIPC1 ehtyminen johtaa menetykseen EGF, FGF2, PDGF-BB, TGFp 1, ja VEGFA indusoi solun liikkuvuus (kuva S3B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että GIPC1 on merkitystä monien tärkeiden signaalitransduktioreaktioteiden että osuvat sekä soluadheesiota ja liikkuvuuteen.

GIPC1 tarvitaan kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumista tHMEC-LT-st solulinja

sen arvioimiseksi, onko GIPC1 tarvitaan syövän syntyyn, me tukahdutti ilmaisunsa hTERT-ikuisti HMECs transformoitiin SV40 Large T (LT) ja Pieni T (st) antigeenejä (tHMEC-LT-st) [26]. tHMEC-LT-st solut pystyvät kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun; kuitenkin, GIPC1 ehtyminen vähensi tehokkuutta kiinnittymisestä riippumattoman pesäkkeiden muodostumista tHMEC-LT-st solulinja verrattuna kontrollisoluihin. Ylimääräisenä ohjaus, toinen GIPC1 shRNA konstruktia käytettiin tässä koesarjassa (kuvio 3A). Nämä tiedot osoittavat, että GIPC1 tarvitaan kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumisen, mitta onkogeenisen transformaation HMEC-soluissa.

. Pehmeä agar pesäkkeenmuodostusta nontransduced, muiden kuin kohde-, ja GIPC1 KD tHMEC-LT-st soluja soluihin. B. Western blotting osoittaa effectivness on GIPC1 hiljentäminen kaksi erillistä GIPC1 shRNA contructs: NM_005716.2-1083s1c1 ja NM_005716.2-499s1c1. Data esitetään keskiarvoina ± SEM. Tähdet osoittavat tilastollinen merkitsevyys (P≤0.05) välillä muiden kuin kohde-ja GIPC1 KD olosuhteissa.

kliinistä merkitystä geenien säätelee GIPC1 knock-down

Arvioidaan tarkemmin olettaen, että GIPC1 on merkittävä rooli kehityksessä ja etenemisessä ihmisen syövissä, 411 probesets taitettavalla muutos ≥2 SAM analyysiin GIPC1 köyhdytettyä MDA-MB231-solujen kontrolliin verrattuna soluihin (GIPC1 allekirjoitus; taulukko S1) käytettiin kuulustella kahta yleisesti saatavilla ja kliinisesti selityksin rinta- ja munasarjasyöpä aineistojen kanssa Bioconductor paketti,

globaltest

[27]. Suuri sulautunut rintasyöpä DNA-siru aineisto, jossa 689 esikäsittelyyn näytteitä [28], [29], [30] ja munasarjasyöpä aineisto kanssa 274 hoidetuista potilaista [31] käytettiin analyysiin. Global Test monimuuttuja analyysiin 689 rintasyövän potilaiden GIPC1 KD allekirjoitus liittyy kasvaimen (P 0,01), imusolmukkeesta tila (P 0,0001), ja ER tila (P 0,05). GIPC1 allekirjoitus on myös vahvasti liittyy elossaololuku sisällä erbB2 + /ER + (n = 42, P 0,001), luminal B (n = 146, P 0,05) ja pohjapinta (n = 92, P 0,01) molekyyli- rintasyöpä alatyyppejä (Taulukko 3). Analyysi munasarjasyövän aineisto osoittaa, että GIPC1 allekirjoitus liittyy merkittävästi kaikkien kliinisten muuttujien arvioitu; mukaan lukien potilaan selviytymisen ja kasvaimen vaiheesta, laatu ja tyyppi (taulukko 3). Nämä tulokset tukevat viimeaikaiset raportit viittaa siihen, että GIPC1 on rooli ihmisen rinta- ja munasarjasyövän etiologia ja etenemiseen [13], [14].

Keskustelu

tiedetään vain vähän roolista of GIPC1 kasvaimen kasvua ja etenemistä. Todisteet osoittavat, se on erittäin ilmaistaan ​​useissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien rinta-, munasarja-, maha- ja haima- syövissä [13], [14]. Lisäksi tuoreessa raportissa osoittaa GIPC1 vaaditaan

in vivo

haiman kasvaimen kasvua immuunivajaissa hiirissä [19]. Tässä tutkimuksessa käytimme sekä laskennallisia ja kokeellisia lähestymistapoja tutkia GIPC1 ihmisen rinta- ja paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, ja potilailla, joilla on rinta- ja munasarjasyöpä. Huomasimme, että GIPC1 tarvitaan rinta- ja peräsuolen syövän solujen eloonjäämistä, ja sillä on keskeinen rooli syövän syntyyn ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen.

Tuloksemme osoittavat myös GIPC1 tärkeä rooli solukierron säätelyssä. EASE analyysi GIPC1 Knockdown MDA-MB231-soluissa näkyy rikastamista erilaisesti ilmaisi geenien kanssa selityksin toimintojen G1 /S ja G2 /M siirtymiä, solusyklin pysähtymisen, solujen lisääntymistä, ja apoptoosin. Nease pyrkii biologiset selitykset nämä tärkeimmät vaikutukset ja syytöksiä mahdollisten poikkeavuuksien soluadheesiota, integriini-välitteistä signalointia, ja sääntely aktiinisytoskeletonin. Lisäksi Nease löysi rikastuminen liittyvien geenien sytokineesiin. Tämä havainto on yhtäpitävä tuoreessa raportissa osoittaa, että aktivointi syndekaani-4 (SDC4), transmembraaninen heparaanisulfaattiproteoglykaani proteoglykaanien jotka vuorovaikutuksessa GIPC1 ja FGFR1 reseptorin säännellä FGF2 signalointia vaaditaan sytokineesiin MCF-7 ihmisen rintasyöpäsolujen [32]. Keller-Pinter

et al

. osoittivat, että serine179-fosforylaatiota ja ektodomeenin vuodattamisesta SDC4 on suurimmillaan G2 /M. Expression of mutantit matkien seriini 179-fosforylaatiota (Ser179Glu) tai fosforylaatio kestävä SDC4 aiheutti epätäydellinen abscission ja jättiläinen, monitumaiset solut [32]. Lisäksi SDC4 säätelee aktiini polymerointi, fokaalisen adheesion muodostumista, ja soluliikkuvuus kautta PI3K signalointi.

Nease analyysi viittaa myös siihen, että GIPC1 on mukana kuusi suurta signaalitransduktion verkot rintasyövän: integriini välittämää RHO proteiinia, JAK-STAT, EGF, TGF ja WNT. Nämä havainnot tukevat aikaisempia raportteja, joiden mukaan GIPC1 vuorovaikutuksessa Frizzled-3-reseptori [9], TGF-beeta tyypin III reseptorin [11], ja endogliini [12]. Huolimatta siitä, että analyysimme eivät viitanneet rikastuminen geenien sisällä PI3K signaalitransduktion verkko, huomaamme, että GIPC1 suppressio vähenee ilmaus useiden keskeisten liittyvien geenien koulutusjakson, kuten

SDC2, PIK3CB, PIK3D, PDK1, AKT3, CDC42BPA, CDC42EP3, RACGAP1,

ja

Rac1

. Toisaalta GIPC1 hiljentäminen edistää merkittävästi kohonneet geenien ilmentyminen varten

PTEN, p27

Kip1, RHOBTB1, RHOB,

ja

PAK2

. Vaikka poikkeava aktivaatio PI3K signalointi on osallisena induktioon syövän syntyyn, nämä geenit toimivat yhdessä integroida mekanismeja, jotka ohjaavat useat solun prosesseja, kuten solun tukirangan sääntely, solun liikkuvuus ja tarttuvuus, solujen lisääntymistä, ja apoptoosin [26], [ ,,,0],33].

kokeellinen validointi geenin ilmentymisen profilointi tulokset osoittavat, että GIPC1 hiljentäminen edistää G2 solukierron pidätys, apoptoosin, ja vaihtelussa soluadheesion ja liikkuvuus MDA-MB231 ihmisen rintasyövän soluissa. GIPC1 ehtyminen korreloi lisääntynyt kaspaasi 3/7 toimintaa, DNA pirstoutuminen, säätelyä GADD45 perheenjäsenten, ja menetys CDC25B ilmaisua. Lisäksi GIPC1 hiljentäminen korreloi selvästi vähentää solujen elinkelpoisuutta ja arviointeja kaspaasi 3/7 toimintaa MCF-7 ja SKBR-3 ihmisen rintasyöpä ja SW480 ja SW620 paksu- ja syöpäsoluja.

Käyttämällä RNAi heikentävistä GIPC1 mRNA: MDA-MB-231-soluja pystyimme tunnistamaan erilaisia ​​geenejä, joiden ilmentyminen on muuttunut. Vertasimme tätä GIPC1 allekirjoituksen julkisesti saatavilla rinta- ja munasarjasyövän geeniekspression aineistoja, joille hyvin selityksin fenotyyppi ja tulos oli saatavilla. Löysimme vahva korrelaatio GIPC1 allekirjoitus ja useita tärkeitä potilaan kliinisten muuttujien.

Rintasyövässä käytimme Global Testausmenetelmä ja todettu uusiutumista elinaika oli merkitsevästi liittyy GIPC1 allekirjoitus ainoastaan ​​tietyn molekyyli alatyyppejä taudin: potilailla, joilla luminal B ER + kasvaimet (high-grade ER +; P = 0,015), erbB2 + /ER + sairaus (P = 4,3 x 10

-4), ja ehkä pohjapinta-like tai kolminkertainen negatiivinen syöpiä (P = 0,0074). Within luminaali Er + (low-grade ER +) tapauksessa ja potilailla, joilla on ErbB2 + /ER- syöpiä, The GIPC1 allekirjoitus ei ollut ennustava toistumisen vapaa elinaika. Siksi GIPC1 allekirjoitus voi kyetä erottamaan potilaiden hoitotuloksiin ryhmissä korkealaatuisesta rintasyöpiä, erityisesti ne, jotka ovat ER +, eikä pelkästään erottamaan kasvain (suuri vs. pieni) tai ER tila (positiivinen vs. negatiivinen). Vuonna munasarjasyöpä aineisto, The GIPC1 allekirjoitus tilastollisesti korreloi kaikkien kliinisten muuttujien arvioitiin: kokonaiselossaoloaika ja kasvaimen, tyyppi, ja vaihe. Yksi yhteinen piirre korrelaatioita löysimme välillä GIPC1 allekirjoitus ja kliinisten parametrien rinta- ja munasarjasyövän oli yhdessä korkealaatuisesta kasvaimia, jotka ovat ominaisia ​​liiallinen DNA-vaurioita ja huono potilaan ennustetta.

saatavilla ekspressiotietojen osoittavat, että GIPC1 ilmenee vahvasti jokaisen ihmisen syövän ja tulokset viittaavat siihen GIPC1 on välttämätön osa ihmisen syövän kasvua edistetään ylävirtaan kasvutekijät ja niiden reseptorien. Koska GIPC1 signaalitransduktion aktivoidaan erilaisia ​​solun pinnan reseptoreihin, ja koska se on myös tiedetään olevan olennaisia ​​haaroitetaan morfogeneesiin valtimoiden, kohdistaminen GIPC1 välittämä polkuja on looginen terapeuttisen strategian ihmisen syöpien hoidossa. Erityisesti meidän tiedot viittaavat kohdistaminen GIPC1 voi olla erityisen tärkeää estrogeenireseptorin-positiivisia korkealaatuisesta rintasyöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

MCF-7 MDA-MB231, ja SKBR-3 ihmisen rintasyövän solulinjoissa ja SW480 ja SW620 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjat hankittiin ATCC: ltä. Ihmisen rintarauhasen epiteelisolut (HMECs) ostettiin Invitrogen (# A-10565). Ensisijainen HMEC kokeet suoritettiin ≤ kanavan 10.

hTERT

-immortalized HMECs ilmentävät SV40 LT ja st viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [26]. Kaikkia solulinjoja viljeltiin 100 x 20 mm: n kudosviljelymaljoille (Becton Dickinson # 353803). MCF-7-soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 EMEM (GIBCO # 11095-080), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (ATCC # 30-2020) ja 1% antibiootti-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). MDA-MB231-soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ja 0% CO

2 Leibovitzin L-15 Media (GIBCO # 11415-064), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% antibiootti-Antimyotic. SKBR-3-soluja viljeltiin lämpötilassa 37 ° C ja 5% CO

2 McCoyn 5A media (GIBCO # 12330-031), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% antibiootti-Antimyotic. SW480 ja SW620-soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ja 0% CO

2 Leibovitzin L-15-alusta täydennettynä 10% FBS: ää ja 1% antibiootti-Antimyotic. Ensisijainen HMECs viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 Medium 171PRF (fenolipunaista) (GIBCO # M-171PRF-500), johon on rintaepiteelisolulinja kasvun täydennysosa (megs) (GIBCO # S-015- 5) ja 1% antibiootti-Antimyotic. Kaikkia solulinjoja pidettiin 60-70%: n konfluenssiin.

shRNA lentivirusvektorilla tuotanto ja transduktio

GIPC1 (NM_005716.2-1083s1c1 ja NM_005716.2-499s1c1) ja tyhjän vektorin shRNA plasmidit sekä Delta 8,9 ja VsVg plasmidit saatiin RNAi Facility Dana-Farber Cancer Institute. Salatun, muiden kuin kohde shRNA plasmidi oli ostettavissa Sigma (# SHC002). cDNA-versioiden SV40 LT + st (LTG) kloonattiin pWZL-blast kuten aiemmin on kuvattu [26]. Kaikki plasmidit, kasvatettiin LB-liemessä +100 ug /ul ampisilliinia (Teknova # L8105). Plasmidit puhdistettiin käyttäen Qiagen HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Qiagen # 12663), ja saannot arvioitiin käyttäen NanoDrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific # SID-10135606). HEK 293T /17-soluja (ATCC # CRL-11268) laajennettiin tiheyteen 5 x 10

6/100 mm Soluviljelymaljassa (BD Primaria # 353803) Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (ATCC # 30-2002) + 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (ATCC # 30-2020) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia. Kukin levy transfektoitiin sitten FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche # 11814443001), VsVG puhdistettua plasmidi-, Delta 8,9 puhdistettu plasmidi ja joko 6 ug shRNA puhdistettua plasmidi-tai 4 ug puhdistettua LTG

WB plasmidin OptiMemiä media (Invitrogen # 11058-021). Kasvualusta vaihdettiin yhden päivän kuluttua transfektiosta DMEM + 10% FBS-alustaan, joka sisälsi 1% antibiootti-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). Media sisältävä pakattu virus kerättiin päivänä 2 transfektion jälkeen lisättiin tuoretta väliainetta lisättiin, ja viruksen sato kerättiin jälleen päivänä 3 transfektion jälkeen. Pakattu lentivirus suodatettiin 0,45 um suodattimien (Corning # 431220) ja konsentroitiin 90 minuutin ajan 16600 g: käyttäen ultrasentrifugissa (Beckman # L8-70M). Sekoittamisen jälkeen suspension lentivirus titrattiin käyttäen QuickTiter lentivirustartunnat kvantitointi Kit (Cell Biolabs # VPK-108-HIV) kohti valmistajan ohjeiden. Lentivirus shRNA vektori transduktion, kasvualustaa, joka sisältää polybreeniä ja tilavuus lentivirus, joka rinnastaa MOI 50 lisättiin soluihin ja inkuboitiin yön yli solulinjassa erityisiä viljelyolosuhteissa. Seuraavana päivänä, virus media korvattiin solulinjan erityisten kasvualustojen. 72 tuntia, kasvualustaa täydennettiin joko 10 ug /ml puromysiiniä ja /tai 2,5 ug /ml blastisidiinia. Kokeet suoritettiin 14 päivää sen jälkeen, kun valinnan.

RNA: n eristämistä, mikrosirujen hybridisaatio ja käsittely, ja kvantitatiivinen PCR

Kokonais-RNA eristettiin solulinjoista käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen # 74106) mukaan valmistajan spesifikaatioiden kanssa QIAshredder sarakkeet (Qiagen # 79656) ja solupelletti homogenointi. Kokonais-RNA kvantitoitiin käyttäen NanoDrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific # SID-10135606). Kaksikymmentä yksi Affymetrix GeneChip- Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays käytettiin tässä tutkimuksessa. Seitsemän paneelit ryhmää kohti käytettiin seuraavia MDA-MB231 solulinjoissa: transdusoimattomien, tyhjän vektorin, ja GIPC1 KD. Microarray hybridisaatio ja käsittely suoritettiin käyttäen standardeja protokollia Microarray Core Facility Dana-Farber Cancer Institute. Näytteen käsittely suoritettiin kanssa Affymetrix GeneChip- Fluidics Station FS450 ja paneelit skannattiin kanssa GCS300 array skannerin mukaan valmistajan suosituksia. Kaksivaiheinen Quantitative Real-Time PCR suoritettiin Applied Biosystems 7900HT (Applied Biosystems # 4329001) järjestelmään. TaqMan GIPC1 (Applied Biosystems # Hs00991802_m1) ja 18S Endogeeninen ohjaus (Applied Biosystems # 4304437) määritykset ajettiin 8 jäljittelee näytettä kohti käyttämällä suhteellinen kvantitointi (Delta Ct), FAM ei sammutus- asetuksia. Delta Cts laskettiin vähentämällä keskimääräinen Ct endogeenisen valvonnan keskimääräisestä Ct monistuksen kohde. Delta-delta-Ct laskettiin vähentämällä keskimääräinen delta Ct tyhjän vektorin näytteiden keskimääräinen delta Ct kohde vektorin näytteitä. Kertainen muutos laskettiin 2 potenssiin delta-delta Ct.

Microarray data normalisointi ja analyysi

Mittaustulosten (.cel tiedostot) tuotiin R ja tiedot olivat normalisoitu RMA [ ,,,0],20] avulla Bioconductor paketti,

affy

. Alustava tutkiva data-analyysi suoritettiin hierarkkinen klusterointi analyysi (keskiarvo-sidos ja metrinen 1 – Pearsonin korrelaatiokerrointa etäisyys) käyttäen Bioconductor paketti,

made4

[21]. Kaksi luokan parittomia merkitys analyysi mikrosirujen (SAM; [22], jossa on 0% vääriä löytö määrä (q-arvo) käytettiin määrittämään ero geenin ilmentymisen välillä tyhjän vektorin ohjaus ja GIPC1 KD MDA-MB231-soluissa.