Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aktivoituminen autophagy on laajasti kuvattu pro-selviytymisstrategiana, joka auttaa pitämään solut elossa seuraavat menettämään ravintoaineiden /kasvutekijöiden ja muut stressaavaa solun olosuhteissa. Lisäksi cytoprotective vaikutuksia, autophagy voi seurata solukuolemaa. Autophagic vacuoles voidaan havaita ennen tai solukuoleman aikana, mutta rooli autophagy kuolemaan prosessi on vielä kiistanalainen. Monimutkainen vuorovaikutus autophagy ja apoptoosin on tullut esiin, kun otetaan huomioon, että lukuisat geenit, kuten p53 ja Bcl-2-perheen jäsentä, jaetaan näiden kahden reitin.

Menetelmät /Principal Havainnot

tässä tutkimuksessa havaittiin voimakas ja peruuttamaton sytotoksinen aktiivisuus tallin Curcumin johdannainen

bis

-DeHydroxyCurcumin (bDHC) ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, mutta ei ihmisen normaalien solujen. Autophagy nostatetaan bDHC ennen solukuolemaa osoittaa lisääntynyt autophagosome muodostumista -measured elektronimikroskoopilla, fluoresoiva LC3 puncta ja LC3 lipidation- ja autophagic vuon -measured häiritsemällä LC3-II liikevaihdon. Kertyminen Poly-ubikitinoitu proteiineja ja ER-stressi tapahtui vastavirtaan autophagy induktion ja solukuolemaan. Solusyklin ja Western blot analyysit esiin aktivoinnin mitokondrio-riippuvaista apoptoosia, joka liittyy kaspaasi 7, 8, 9 ja sytokromi C vapautumista. Käyttämällä farmakologinen estoja ja RNAi kokeita, osoitimme, että ER-stressin aiheuttama autophagy on merkittävä rooli laukaista bDHC-solukuoleman.

Päätelmä /merkitys

Meidän tulokset kuvaavat mekanismia, jonka kautta bDHC edistää kasvain selektiivinen proliferaation esto, joka tarjoaa yksiselitteinen todiste roolin autophagy vastakkaisia ​​leviämisen koolonkarsinoomasoluissa.

Citation: Basile V, Belluti S, Ferrari E, Gozzoli C, Ganassi S, Quaglino D, et al. (2013) bis-dehydroksi-Curcumin Triggers Mitokondrioiden-Associated Cell Death in Human koolonkarsinoomasoluissa läpi ER-stressiä Autophagy. PLoS ONE 8 (1): e53664. doi: 10,1371 /journal.pone.0053664

Editor: Regine Schneider-Stock, Institute of Pathology, Saksa

vastaanotettu: 12 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2012 Julkaistu: 11 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Basile et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-MFAG (lupanumeroon 6192 CI) ja Fondazione Cassa di Risparmio di Vignola CI ja EF. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Apoptosis, joka tunnetaan myös tyypin I solukuoleman, on paras kuvattu mekanismi solukuoleman ja on morfologisesti tunnusomaista solun kutistuminen, kalvon rakkuloituminen, ydin- tiivistyminen, ja muodostuminen apoptoottisten kappaleiden [1]. Energiariippuvainen ryöpyn molekyylitason tapahtumia koordinoi apoptoottisen prosessin, joka voidaan erottaa kahteen pääreittiä: ulkoista kuoleman reseptori reitti ja luontainen mitokondrioiden kautta. Kahden reitin näyttävät olevan yhteydessä toisiinsa ja vaikuttavat toisiinsa, ja molemmat laukaisemaan kaspaasien 3, 6 ja 7, proteaasit kohdistaminen sata proteiineja ja johtaa solun purku [2].

Lisäksi apoptoosin, autophagy on kuvataan vaihtoehtona itsetuhoista soluprosessia. Autophagy on pitkään tunnettua varustaa solun selviytymisen seuraavien ravintoaineiden /kasvutekijöitä puutetta tai muita rasittavissa olosuhteissa, ja vasta viime aikoina se on yhdistetty solukuolemaan. Joka tunnetaan myös nimellä tyypin II solujen kuoleman, autophagy aktivointi on ominaista läsnäolo autophagic ontelot sytoplasmassa, ja laajentuminen endoplasmakalvoston (ER) ja Golgin laitteessa [3]. Double-membraned autophagic rakkuloiden koteloida sytoplasmassa soluelimiin ja, sen jälkeen kun niiden fuusio lysosomeihin autophagolysosomes huonontavat niiden sisältö [4]. Klassinen autophagy polku toimii alavirtaan mTOR (nisäkkään rapamysiinin kohde) kinaasi. Kun tämä Ser /Thr-kinaasi on liittynyt mTORC1 proteiini-kompleksin, se pystyy tukahduttamaan autophagic koneita. 16 autophagy liittyvä (ATG) proteiinien on kuvattu osallistumaan sen autophagy polku [5], ja suurin osa niistä osansa monimutkainen prosessi kaksinkertaisen membraned rakkuloiden muodostumista ja kasvua, alavirtaan mTORC1 [6]. Vaikka esto mTORC1 reitti on paras tunnettu mekanismi, jonka avulla autophagy indusoituu, monia muita signa- ja transkription tapahtumia voi olla mukana aktivoitumisen autophagic prosessin. Erityisesti eri kinaasien hallita eri vaiheita tämän catabolic prosessin, kuten AMP-aktivoitu proteiinikinaasi, Akt, mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (ERK, p38 ja JNK) ja proteiinikinaasi C: n [7].

roolia autophagy solujen eloonjäämisen sijaan solukuolemaan riippuu solujen ja kudosten yhteydessä sekä luonteesta stressi ärsyke [8].

Apoptotic ja autophagic solukuolema eivät ole toisiaan poissulkevia reittejä: ne voivat indusoivat solukuoleman samanaikaisesti ja yhteistoiminnallisesti (katsaus katso [9]). Autophagic morfologioita soluja havaitaan juuri ennen tai sen aikana solukuolema; vaikka, onko autophagy on mekanismi, jolla solut todella kuolevat ja onko solukuolemaa on suorittaa autophagy tai autophagy vielä keskusteltu [10].

välinen ero apoptoottinen ja autophagic solukuolemaan hankaloittaa vielä kaksi näkökohdat: i) solujen eri jännitykset liipaisu signaalintransduktioreitteihin voi saada aikaan sekä apoptoosin ja autophagy ja ii) monet proteiinit välttämättömiä autophagy ovat mukana myös apoptoottisen-solukuoleman, kuten ATG5, transkriptiotekijä p53 ja Bcl-2-perheen jäseniä.

p53 on tunnettu oncosuppressor, aktivoitu tehdä erilaisia ​​stressin ärsykkeille, ja vastaavat transkription säätelyyn sekä pro- ja anti-apoptoottiset geenit. Vaikka pro-apoptoottiset geenit, kuten Bax, Puma ja Noxa ovat säädelty, antiapoptoottinen niitä, kuten Bcl-2α, ovat alas-säätelee ydinvoiman p53. Lisäksi sytoplasmisesti paikallinen p53 on osoitettu olevan tärkeä valvoa apoptoottisen vasteen, indusoimalla Bax oligomeroimalla on mitokondrioita tai vapauttamalla pro-apoptoottisten BH3-vasta-proteiinien niiden anti-apoptoottisen kumppanit Bcl-2 /Bcl-XL [11] .

rooli p53 tuumorisuppressiogeeneksi on myös katsoneet sen toiminnan säätelyssä autophagy. p53-välitteisen aktivaation autophagy johtaa solukuolemaan kautta transaktivaation autophagy indusoivan proteiinin DRAM ja inaktivoituminen mTOR-reitin [12], [13]. Oppositioon farmakologinen esto ja inaktivaation p53 todennäköisesti kielteisesti säätelyyn autophagy kautta transkriptiosta riippumattomien mekanismien [14].

Lisäksi p53, Bcl-2-perheen jäsenet ovat yhteisiä pelaajia apoptoosin ja autophagy. Ne ovat keskeisiä sääntelyn ulomman mitokondrion kalvon läpäiseväksi (MMP), mikä on vapauttamisesta vastaavan sytoplasmaan proteiinien välittäjinä solukuoleman, kuten sytokromi C Bcl-2-proteiinien on osoitettu estävän autophagy hajottamalla Bcl -2 /Bcl-XL-Beclin-1 kompleksit [15]. Ei ole selvää, miten Bcl-2-proteiinien osallistuvat apoptoottista

verrattuna of the autophagic prosessi, mutta kaksi eri toimintoa voidaan määrittää proteiinin lokalisoinneissa klo mitokondriot mieluummin kuin ER [16]. Suhteellinen taso Bcl-2 ja Beclin-1 noussut esiin useita cellular sääteleviin tekijöihin onko autophagy myötävaikuttaa syövän estoa tai eloonjääminen (tarkistetaan [17]).

Various luonnontuotteita ja lääkkeet voivat aiheuttaa syöpäsolujen kuolema aktivoitumisen kautta autophagy tai kohdistamalla polkuja autophagy [18]. Tamoksifeeni, Imatinibi, resveratrolin ja Curcumin ovat esimerkkejä molekyyleistä, kohdistamaan niiden sytotoksinen aktiivisuus syöpäsoluja

kautta

induktion autophagic solukuoleman [17], [18].

Curcumin aktiivinen komponentti löydetty in juurakosta

Curcuma longa

, on osoittanut terapeuttista aktiivisuutta eri kasvaimia. Se voi estää aloittamista, etenemistä ja kasvainten solujen eloonjäämistä [19]. Erityisesti hiiren malleja ja kliinisissä kokeissa osoittanut chemopreventive potentiaali ja peräsuolen syöpään [19]. Peräsuolen sinoomasolulinjoja, Curcumin estää soluproliferaatiota aiheuttamalla G2 /M solukierron pysähtymisen tai apoptoosin, kun käytetään suuria annoksia [20], [21]. Lisäksi modulaatio solun apoptoottisten reittien mukaan Curcumin on hiljattain havaittu syöpäsolujen potilailla, joilla peräsuolen syöpä [22].

Microarray osoittivat, että Curcumin indusoiman apoptoosin säätelevät useita signalointireittien [23], [24]. Curcumin up-säätelee proapoptoottisten proteiineja (Bax, Bim, Bak, Puma ja Noxa) ja alas-säätelee antiapoptoottinen niitä (Bcl-2 ja Bcl-XL) erilaisissa syöpäsoluissa, liipaisu vapauttamista Sytokromi C ja aktivointi kaspaasi 3 [24]. Ihmisen melanooma, HL-60 leukemia ja mahan soluja, Curcumin aktivoi apoptoosia Fas-reseptorin /kaspaasi 8-reitin [25], [26], [27]. Sen lisäksi, että apoptoottista aktiivisuutta, Curcumin aiheuttaa ER stressin eri ihmisen kasvainsoluissa, joista liposarkooma soluihin [28], ei-pienisoluinen keuhkosyöpä soluihin [29] ja leukemian solujen [30].

autophagy prosessi vie osittain antiproliferatiivisia ja apoptoottista toimintaa Curcumin sekä

in vitro

ja

in vivo

: syöpäsoluissa ja vierassiirrännänmallissa hiirimallissa, Curcumin ja sen metaboliitin Tetrahydrocurcumin kasvun estämiseksi pahanlaatuisten solujen aktivoimalla autophagic-solukuoleman

kautta

Akt /mTOR /p70S6K signalointi ja ERK1 /2 reittejä [31], [32], [33]. Vuonna gliooma aloittamisen soluissa, Curcumin anto johtaa tuumorisuppressiogeeneksi takia autophagy aiheuttaman differentiaatiotapahtumiin [34].

Huolimatta Curcumin esto keskeinen molekyyli polkuja tumorigeneesin Kliinisissä tutkimuksissa alhainen biosaatavuus, rajoitettu kudosjakautumisessa nopea aineenvaihdunta [35]. 90% Curcumin hajoaa nopeasti neutraalissa ja perusedellytyksiä kautta hapetuksen, pelkistyksen, glukuronidaatiota sulfaatio [28], [29]. Voittaa nämä rajoitukset, luonnollisia ja synteettisiä analogeja on syntetisoitu, joista

bis

-DeHydroxyCurcumin (bDHC) (Fig. 1A, vasen paneeli). Solut anto bDHC 72 tuntia IC50 pitoisuuksina aiheutti lievää laskua on antiproliferatiivinen vaikutus verrattuna Curcumin androgeeniriippuvaisissa ja riippumaton eturauhassyöpä solulinjoissa ja estrogeeniriippuvainen ja riippumattaman rintasyövän solulinjoissa [36], [37].

. Vasen paneeli: rakenne bDHC. Oikea paneeli: Annos-vaste vaikutuksen bDHC solujen elinkyky 24 tuntia hoitoa, verrattuna kontrolliin ja DMSO käsiteltyjä soluja. B. PI /FACS-analyysi solusyklin etenemisen jälkeen DMSO, Curcumin (10 uM) ja bDHC (30 uM) hoitomuotoja 16 ja 24 tuntia (vasen ja oikea paneeli, vastaavasti). Ilmoitettu tapahtumat ovat keinoja kymmenen itsenäisen kokeen (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). C. PI /BrdU kaksimuuttujainen FACS 16 ja 24 tuntia hoitoja DMSO, Curcumin ja bDHC. Analyysi aidatulla jättää SubG1 väestölle. D. Vasen paneeli: prosenttiosuus anneksiini V-positiivisten solujen päälle 24 tuntia hoidon bDHC verrataan DMSO ja Curcumin käsiteltyjä soluja. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta – /+ SD. Middle paneeli: PI /monoparametric solusyklin analyysi bDHC käsiteltyjä soluja

versus

bDHC-solujen luovutettu 24 tuntia tuoreessa väliaineessa. Tapahtumat on merkitty avulla kolmen erillisen kokeen (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). Oikea paneeli: γ-H2AX ekspressiotasot

vs.

aktiini käsitellyissä soluissa bDHC 24 tuntia.

Tässä raportissa selvitettiin kasvaimen selektiivisen estävä teho bDHC annetun leviämisen paksu- ja syöpäsoluja. Verrattuna Curcumin, bDHC on aktiivinen aiheuttaen peruuttamatonta sytotoksinen vaikutus HCT116 ja LOVO soluja, mutta ei ihmisen normaaleissa soluissa.

kertymistä Poly-ubikitinoitu proteiineja ja induktio ER stressi ovat ylävirtaan signaaleja autophagy, joka laukaisee mitokondrio-riippuvaista apoptoosia. Farmakologinen ja RNAi-välitteinen inhibitio ER-stressi ja autophagy korostaa, että autophagy voimistaa anti-proliferatiivista vaikutusta bDHC. Tutkimuksemme osoittavat, että bDHC toimii pro-autophagic sytotoksinen lääke, purkautumassa sen terapeuttista potentiaalia torjunnassa valikoivasti kasvainten kehittymiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja huumeiden

Human peräsuolen HCT116, HCT116 /E6 ja HCT116 Bax – /- oli jalomielinen lahjoitus Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Soluja viljeltiin Iscoven muunnettuun Dulbeccon alustaan ​​(IMDM), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS). Ensisijainen ihmisen fibroblasteissa (HF) kasvatettiin DMEM 10% FCS: ää, jossa on glutamiinia (2 mM) ja gentamysiiniä (55 mg /l). Maksan ihmisen sikiön epiteelisolujen WRL68 solujen ja paksusuolen adenokarsinooman LOVO-solut ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FCS: ää. Kaksinkertaistumisaika on arvioitu olevan 16 tuntia HCT116 ja LOVO kasvainsoluja, ja 24 tuntia HF ja WRL68 normaalit solut.

Curcumin [1,7-bis [3-metoksi-4-hydroksi-fenyyli] hepta-1,6-dieeni-3,5-dioni] ja bDHC [1,7-bis [3-metoksi-fenyyli] hepta-1,6-dieeni-3,5-dioni] syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on raportoitu [20 ]. Puhtaus synteettisesti yhdisteitä, määritettiin NMR tekniikoilla ja palaminen analyysi oli 98%. Curcumin ja bDHC lisättiin lämpimään väliaineessa 10 uM ja 30 uM pitoisuuksina, vastaavasti. C3-bDHC annettiin soluja, 3 uM. HCT116-soluja inkuboitiin adriamysiiniä (1,3 uM) 48 tunnin ajan. Farmakologisen estoja, soluja esikäsiteltiin 1 tunti ja sitten yhteistyössä inkuboitiin bDHC vielä 16 tai 24 tuntia 25 uM ZVAD-fmk (Enzo Life Sciences), 5 uM LEVD-fmk (Enzo Life Sciences), 3 uM wortmanniini (Enzo Life Science), 2 uM Sykloheksimidi (Sigma Aldrich), 20 uM Chloroquine (Sigma Aldrich), 50 uM Salubrinal (Santa Cruz). Thapsigargin (Sigma Aldrich) annettiin soluille 36 tunnin ajan 1 uM.

sytometrinen analyysi (FACS) B

Virtaussytometrinen solusyklin analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Epäsuora fluoresenssi värjäys suoritettiin käyttäen anti-fosfo-histoni H3 (Ser10) (Cell Signaling # 9706) ja hiiren anti-FITC (Dako # F0313) vasta-aineita. Solut kerättiin jälkeen lääkehoidot, pestiin kahdesti PBS: llä 1 ×, kiinnitettiin 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja post-kiinnitettiin 90% metanolia o.n. -20 ° C: ssa. Läpäiseväksi tekemisen jälkeen 0,25% Triton X-100 PBS 1 x 5 min, solut värjättiin primääristä vasta-ainetta (1:25) o.n. 4 ° C: ssa, ja sekundaarista vasta-ainetta (1:50) ja vielä 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sitten soluja käsiteltiin RNAasi A 40 min, inkuboitiin propidiumjodidia (30 ug /ul), vielä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä ja analysoitiin sytometrillä.

Apoptoottiset solut tunnistettiin FACS, käyttämällä anneksiini V-FITC-konjugaattia (Bender MedSystems) seuraavat protokollaa valmistajan.

Cellular oton tutkimukset

bDHC uutettiin soluista ja kasvualustaa aiemmin raportoitu [20].

Crystal Violet määrityksessä

proliferaation esto mitattiin Crystal Violet värjäys ja pitoisuus, jolla solujen kasvu inhiboituu 50% (IC50), määritettiin seuraavat 24 tuntia hoidon bDHC. Poistamisen jälkeen soluviljelyalustaa, yksisolukerros kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 0,05%: Crystal Violet liuos 20% metanolia 30 minuutin ajan. Pesujen jälkeen solujen annettiin kuivua. Sisällytetty väri liuotettiin happamaan isopropanolissa (1 N HCI: 2-propanoli, 1:10) ja määritetään spektrofotometrisesti 540 nm: n aallonpituudella. Uutettu väriaine oli verrannollinen solujen määrä. Prosenttiosuus sytotoksisuus laskettiin vertaamalla absorbanssi käsiteltyjen käsittelemättömiin soluihin.

akridiinioranssivärjäyksellä

HCT116-soluja käsiteltiin DMSO: n ja bDHC 8 ja 16 tuntia. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin akridiinioranssia (1 ug /ml) 15 min ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen visualisointi Zeiss Axioskop 40-fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa).

Solunsisäinen ATP pitoisuus

määritys solunsisäisen ATP-pitoisuus suoritettiin käyttäen ATP bioluminisenssimäärityksen kit CLSII (Roche), seuraten valmistajan protokollaa.

Mitokondrioiden kalvojännite

Mitokondrioiden kalvojännite mitattiin arvioimalla sitoutuminen 3,3-Dihexyloxacarbocyanineiodide (DiOC6), kationinen väriaine, joka sitoutuu mitokondrioita ja ehjät kalvon potentiaalia. Solut leimattiin sen jälkeen, DMSO: ssa tai bDHC inkuboitu 16 ja 24 tuntia DiOC6 (4 nM) 40 minuuttia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä 1 x ja fluoresenssi-intensiteetti analysoitiin käyttämällä Beckman Coulter sytometrillä.

immunoblottauksella

Solut hajotettiin Laemmli-näytepuskuriin 1 x täydellisen solu-uutteet. Nuclear /sytoplasminen uutteet valmistettiin kuten raportoitu Ref. [38]. Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: anti-p53: DO-1 (Santa Cruz # sc-126), anti-phospo-H3 (Ser10) (Millipore # 05-817), anti-H2A happo-patch (Active motiivi), anti- -p21 (Upstate), anti-aktiini (Santa-Cruz), anti-PARP1 (Santa Cruz # sc-8007), anti-γH2AX (Millipore, # 05-636), anti-GADD153 (F168) (Santa Cruz # sc -575), anti-tubuliini (Sigma-Aldrich), anti-pilkottiin kaspaasien 3, 7, 8, 9 (Cell Signaling), anti-kaspaasi-4 4B9 (Enzo Life Sciences), anti-Bax (N-20) (Santa Cruz # sc-493), anti-Bcl-2 (Santa Cruz # sc-509), anti-Bcl-XL (Santa Cruz # sc-8392), anti-LC3B (Sigma Aldrich # L7543), anti-Ub (Santa Cruz # sc-8017), anti-ATG7 (Sigma Aldrich # A2856), anti-Beclin 1 (Sigma Aldrich # B6061) ja anti-H3 (C16) (Santa Cruz # sc-8654). Kemiluminesenssiosoitusta reagenssia on ostettu Millipore (Luminata Classico ja Forte Länsi HRP).

eristäminen sytosolifraktion digitoniini- lyysimenetelmällä

2.000.000 HCT116 solut pestiin kahdesti PBS: ssä 1 x ja sitten uudelleen digitoniinia lyysipuskuria (75 mM NaCl, 1 mM NaH

2PO

4, 8 mM Na

2HPO

4, 250 mM sakkaroosi, 190 mg /ml digitoniinia, proteaasi-inhibiittorit). Kukin näyte inkuboitiin jäillä 5 minuutin ajan ja sitten sentrifugoitiin 15,000 x g: llä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Supernatantit kerättiin ja niitä käytettiin Western-blottauksella käyttämällä anti-sytokromi C-vasta-ainetta (Santa Cruz # sc-13560).

Immunofluoresenssi

Immunofluoresenssianalyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20], [ ,,,0],39], käyttäen anti-p53 DO-1 (Santa Cruz # sc-126) ja anti-LC3B (Sigma Aldrich # L7543) vasta laimennettuna 1:100 PBS + BSA 1%. p53 solusijaintipaikan tutkittiin Zeiss Axioskop 40 fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss, Jena, Saksa), kuvat kerätään jossa AxioCam HRc kameran ja AxioVision versio 3.1 ohjelmistopaketti. Värjäys endogeenisen LC3B analysoitiin konfokaalimikroskopialla (Leica DM IRE2).

Plasmidit ja ohimenevän transfektion

HCT116 transfektoitiin ohimenevästi Bcl-2, Bcl-XL tai kantajan plasmidit FuGENE (Promega ). Ihmisen Bcl-2 ja Bcl-XL ekspressiovektorit ystävällisesti M. Priault (CNRS IBGC UMR 5095, Bordeaux, Ranska) [40]. Solut otettiin talteen 48 tuntia transfektion jälkeen Western blot ja solusyklin analyysi.

Sirna (siRNA) B

HCT116-solut transfektoitiin (Lipofectamine 2000 Invitrogen) 200 nM pariksi ATG7, BCN1 ja ei-kohdistuksen ohjaus pieniä häiritseviä RNA: ita (Sigma Aldrich), kuten ovat kuvanneet Hoyer-Hansen et al. [41]. CHOP siRNA (HSC.RNAI.N004083.10.2 maasta IDT) oli ystävällinen lahja A. Pietrangelo (University of Modenan ja Reggio Emilian, Modena, Italia). Yhteensä tiivisteet ja FACS näytteet valmistettiin 72 tunnin kuluttua, kun siRNA transfektiota.

RT-PCR-analyysi

RNA, retrotransskription ja semikvantitatiivinen PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [42], [43]. Aktiini ja LC3B monistettiin seuraavien oligonukleotidien: aktiini

varten: 5′-GAGGCCCAGAGCAAGCGT-3 ’; Actin

Rev: 5′-GCTCGAAGTCCAGGGCGACG-3 ’; LC3B

For: 5′-CCTGGAGAAAGAGTGGCATTT-3 ’; LC3B

Rev: 5′-GAAGGCAGAAGGGAGTGTGT-3 ’.

pyyhkäisyelektronimikrosko- (SEM) B

kasvaneet solut yksikerroksisessa coverslip kiinnitettiin 1,25% glutaraldehydillä PBS: ssä 1 x 30 min RT ja pestiin PBS: ssä 1 x kolme kertaa. Sen jälkeen nestehukka arvostellaan etanoliin ratkaisuihin, yksilöt olivat kriittisen pisteen kuivataan CO

2 käyttäen Critical Point kuivuri 010 Balzer, asennettu alumiinin tyngät ja ruiskutusker–päällystetty 10 nm kulta-palladium päällystysyksikössä E 500 ( Polaron). Havainnot tehtiin Philips XL-30 pyyhkäisyelektronimikroskoopilla.

Transmissioelektronimikroskopia analyysi

Solut, kaavittiin petrimaljoja, sentrifugoitiin 12000 x g: ssa 5 ’10 ° C: ssa. Tuloksena pelletit kiinnitettiin yön yli 2,5% glutaraldehydillä (Agar Scientific, Stensted, UK) Tyroden puskurissa, post-kiinteä 2 tuntia 1% osmiumtetroksidilla (Agar Scientific), kuivattu ja upotettu TLV hartsi (TAAB, Aldermaston, UK ). Semithin osat saadaan läpi koko paksuuden pelletit värjättiin toluidiinisinisellä ja havaittu Zeiss Axiophot valomikroskoopilla (Oberkochen, Saksa). Ultrathin leikkeet värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla ja havaittu Jeol 1200 EXII (JEOL, Tokio, Japani).

Kromatiini Immunosaostaminen (chip)

sirut suoritettiin chromatin alkaen DMSO ja bDHC käsiteltyjä soluja 24 tunnin ajan kuvatulla Martens

et al.

[44]. PCR oligonukleotidit raportoitiin aiemmin [43].

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään avulla vähintään kolmen itsenäisen kokeen +/- SD. Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA, jota seurasi LSD testi selvittää välillä eroja erityisryhmille.

Tulokset

Effects of bDHC elinkyvystä ja solusyklin etenemisen HCT116-solujen

Koko annos-vaste-kokeet suoritettiin HCT116-soluissa tunnistamaan kyky bDHC tukahduttaa solujen kasvua. bDHC sytotoksisuus määritettiin kautta Crystal Violet elintärkeä värjäystä menetelmällä ja 50% estävä pitoisuus solujen kasvuun (IC50) arvioitiin yhtä kuin 30 uM, seuraavat 24 tuntia hoidon (Fig. 1A, oikea paneeli).

vaikutus bDHC solusyklin etenemistä tutkittiin fluoresoivalla-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) (Fig. 1 B). HCT116-soluja käsiteltiin 16 ja 24 tuntia bDHC ja jakautumisen solusyklivaiheista verrattiin DMSO: hon ja Curcumin käsiteltyjen solujen. Kuten aiemmin on esitetty [20], Curcumin pidätettiin solut G2 /M vaiheessa puolittaa väestön G0 /G1 ja S-vaiheessa 16 tunnin sisällä; mitään merkittävää kasvua SubG1 tapahtumista havaittiin. Eri tavalla, bDHC kertynyt solujen paitsi G2 /M (noin 23% verrokista solujen 37% käsiteltyjä soluja), mutta myös SubG1 vaiheessa (2,5%: sta 10%). Pitkäaikainen altistuminen, SubG1 tapahtumia hieman esille, kun Curcumin (4%: sta 8,6%), kun taas ilmeinen kasvu oli havaittavissa bDHC (4%: sta 33%).

solukierron profiili sitten luonut suorittamalla PI /BrdU biparametric analyysi ja valikoivaa ruiskutus ilman SubG1 väestöstä (Fig. 1 C). Kuten odotettua, Curcumin puolittunut S-vaiheessa väestö ja kaksinkertaistunut G2 /M-soluissa. Sekä Curcumin, bDHC käsiteltyjä soluja oli selvästi laskua varhaisen S väestöstä (noin 33%: sta 5,9% ja 4,8% sen jälkeen kun 16 ja 24 tuntia, vastaavasti) ja kertymistä G2 /M tapahtumia (noin 25%: sta noin 42% ja 50%, kun 16 ja 24 tuntia), kun taas mitään merkittäviä muutoksia G0 /G1 prosenttiosuus havaittiin.

syrjiä G2 ja mitoosi väestön solut dual koetettiin PI ja tietyn vasta-aine mitoosi markkeri fosfo-histoni H3Ser10 virtaussytometriaa käyttämällä (kuva. S1A). Vaikka noin 90% 4n solut olivat positiivisia fosfo-histoni H3Ser10 seuraavat Curcumin hoidon, vain noin 2% havaittiin niin mitoosi väestön upon bDHC annon.

verrattiin monoparametric ja biparametric analyysejä (Fig. 1 B ja kuviossa . 1 C) korosti, että pääasiallinen vaikutus bDHC hoito on G2 lohkon 16 tunnin ja solukuolemaa kun 24 tuntia.

Sytotoksinen aktiivisuus bDHC tutkittiin SEM-analyysillä (Kuva. S1B). Syvä morfologisten muutosten pinnan, kuten menetys tai suurennetaan mikrovillusten kalvo ”blebs” ja apoptoottiset kappaleet olivat läsnä bDHC käsitellyissä soluissa. Lisäksi voimakas lisääntyminen anneksiini V-positiivisten solujen havaittiin seuraavat 24 tuntia bDHC annon (61%) verrattuna DMSO: ta (7%) ja Curcumin (24%) käsiteltyjen solujen (kuvio. 1D, vasen paneeli), mikä viittaa siihen, aktivointi apoptoottisen solukuoleman.

tarkastella palautuvuus bDHC-kasvun pysähtymisen, HCT116-solut käsiteltiin 24 tunnin ajan bDHC pestiin sitten poistaa kuolleita soluja ja luovutetaan 24 tunnin tuoreeseen alustaan. Peruuttamattomia vaikutuksia solujen elinkykyisyys havaittiin, jolla on selkeä kertyminen SubG1 tapahtumia (38%) ja ei lisätä muita vaiheessa solusyklin (Fig. 1D, keskimmäinen paneeli).

Samalla HCT116, ihmisen paksusuolen adenokarsinooma LOVO solut osoittivat ilmeinen lisäystä SubG1 jälkeisten bDHC annon 24 tunnin ajan (2,6% DMSO 27,7% vuonna bDHC käsitellyissä soluissa) (kuvio S1C).

johdonmukaisesti ulkonäköä solujen hypodiploid SubG1 DNA-pitoisuus, bDHC laukaisi fosforylaation histoni variantin H2AX (γ-H2AX), jonka tehtävänä on liitetty DNA: n fragmentoituminen apoptoosin aikana [45], sekä HCT116 ja LOVO-solut (Fig. 1 D, oikeanpuoleinen paneeli ja Fig. S1C , oikea paneeli).

bDHC indusoi solukuoleman HCT116-soluissa, mutta ei ihmisen normaaleissa soluissa

pohtivat seuraavaksi bDHC ollut kasvain-selektiivisen aktiivisuuden. Transformoimattomissa ihmisen fibroblasteissa (HF) ja maksan ihmisen sikiön epiteelisolujen normaalit solut (WRL68), joiden kahdentumisaika on 24 tuntia, käsiteltiin 24 ja 48 tuntia bDHC 30 uM ja kasvua suppressoivaa aktiivisuutta jälkeen tutkittiin FACS: lla (Fig. 2A ja B , vasen ja keskimmäinen paneeli). HF-soluissa, bDHC indusoi progressiivista S (19,8%: sta 21,9%: iin ja 11,4%: sta 17% 24 ja 48 tuntia, vastaavasti) ja G2 /M-tapahtumia (16,8%: sta 24,7% 24 tuntia, 8,5% 34,5% 48 tunnin kuluessa). bDHC annettavaksi WRL68 suurensi sekä S ja G2 /M tapahtumia sekä, mutta eri tavalla kuin HF soluista, maksimaalinen vaikutus havaittiin 24 tunnin kuluttua (14%: sta 20,6% S-vaiheessa, ja 19,1%: sta 33,7% G2 /M vaiheessa). Mielenkiintoista, ei HF eikä WRL68 solut sitoutuneet apoptoottisen solukuoleman ja johdonmukaisesti, ei kasvua γ-H2AX ilmentymistä havaittiin upon bDHC hoitoon (Kuva. S1D).

. PI /FACS-analyysi HF solusyklin etenemisen jälkeen DMSO: n ja bDHC hoitoja 24 ja 48 tuntia (vasen ja keskipaneeli, vastaavasti). PI /monoparametric solusyklin analyysi bDHC käsiteltyjä soluja

vs.

bDHC-irronneet solut (oikea paneeli) (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). B. Vasen ja keskimmäinen paneelit: analyysi solusyklin etenemisen WRL68 solujen seuraavien 24 ja 48 tunnin hoidon DMSO tai bDHC. Oikea paneeli: PI /FACS monoparametric analyysi WRL68 käsiteltyjen solujen bDHC 48 tunnin ajan ja sitten vapautettiin tuoreeseen alustaan ​​vielä 24 tunnin ajan (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). C. kvantitatiivinen arviointi bDHC pitoisuus UV-vis-spektroskopialla. Ylempi vasen paneeli: bDHC talteen solulysaateista of HCT116 (•) ja HF (▴) soluja 24 tunnin jälkeen hoidon eri pitoisuuksina (10, 20 ja 30 uM). bDHC talteen solupelleteistä (ng) toimitettiin yhteensä solun proteiinien (mg), määritetään käyttämällä Bradfordin menetelmällä. Oikea yläpaneeli: vertailu soluunottoa (20 ja 30 uM pitoisuuksina) in HCT116 (mustat histogrammit) ja HF-solujen (harmaa histogrammit). Alempi paneeli: bDHC talteen elatusaineet inkuboinnin jälkeen ja HCT116 (•) ja HF (▴) soluja bDHC 10, 20 ja 30 uM. Kaikki tiedot normalisoitiin valvonnasta (DMSO). Drug määrä määritettiin lukemalla absorbanssi λ

max = 393 nm. Raportoidut arvot ovat keskimäärin kolmen erillisen kokeen – /+ SD.

pysyvyyden tutkimiseen solusyklin lohkon indusoitui normaaleissa soluissa, HF-soluja käsiteltiin bDHC 48 tunnin ajan, sitten pestiin ja julkaistiin huumeeton väliaineessa 24 tunnin ajan. Toisin HCT116, HF soluja siirtyy G2 /M G1 vaiheeseen (48%: sta 56,3% julkaisun jälkeen), eikä kasvua SubG1 havaittiin (Fig. 2A, oikeanpuoleinen paneeli). Reversiibeliä vaikutukset bDHC normaaleihin soluihin olivat vielä selvemmin WRL68 soluissa, joiden solusykliä jakelu 48 tunnin kuluttua ja julkaisun jälkeen tuoreeseen alustaan ​​täydellisesti päällekkäin että valvonta soluja (Fig. 2B, keskimmäinen ja oikea paneeli).

Nämä tiedot vihjaavat, että bDHC palautuvasti estää solusyklin etenemistä ei-pahanlaatuisia soluja ilman aiheuttamaan apoptoosin.

tarkoitus purkamiseen luonteesta bDHC selektiivisyyttä koolonkarsinoomasoluissa pikemmin kuin normaalit solut, suoritimme lisätutkimuksia arvioida vaihtelua soluunottoa funktiona hoidon pitoisuus HCT116 ja HF-solulinjat. Data normalisoitiin ja esitettiin ng /mg yhteensä proteiineja (Fig. 2C, ylemmät paneelit) ja viljelyväliaineessa jäämämäärät (ug) (Fig. 2C, alempi paneeli). Drug kertymä kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla molemmissa solulinjoissa, mutta HCT116 paljasti huomattavan korkeampi otto verrattuna HF solulinjaan 30 uM: 4575 ± 40

versus

2979 ± 21 ng /mg kokonaisproteiinia ( Fig. 2C, ylempi oikea paneeli).

bDHC aiheuttama solukuolema on kaspaasiriippuvaisen prosessi

tutkia panos caspases päätösten täytäntöönpanosta apoptoosin, me esi-inkuboida HCT116-solujen kanssa laaja-kaspaasiestäjä ZVAD ennen hoitoon soluja bDHC 24 tunnin ajan (Fig. 3A, vasen paneeli). Dramaattinen pudotus SubG1 tapahtumista havaittiin samanaikaisesti etenevään kerääntyminen solujen S ja G2 /M vaiheet (11,7%: sta 24,5% S-vaiheessa ja 16%: sta 40%: in G2 /M, kun ZVAD esikäsittely) . Inhibitiota apoptoosin ZVAD määritetään ilmeinen vähennys fosforyloidun H2AX (Fig. 3A, oikeanpuoleinen paneeli ja Fig. S2A).