Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämä tutkimus tehtiin tulkita toisistaan ​​riippuvaisia ​​roolit (i) metylaation E2 sitoutumiskohta I ja II (E2BS-I /II) ja replikaation (nt 7862) pitkällä kontrollialueella (LCR), (ii) ilmentymisen viruksen onkogeenin

E7

, (iii) ilmaus transkriptin (

E7-E1∧E4) B, joka koodaa E2-repressoriproteiinin ja (iv) viruskuorma , ihmisen papilloomavirus 16 (HPV16) liittyvät kohdunkaulan syöpään (CaCx) synnyssä. Tulokset paljastivat yliedustus (p 0,001) metylaation nukleotidiin 58 E2BS-I keskuudessa

E2

-intact CaCx tapauksissa verrattuna

E2

-disrupted tapauksissa. Bisulfiitti sekvensointi LCR paljasti yliedustus metylaation nukleotidin 58 tai muu CpG: t in E2BS-I /II, joukossa

E2

-intact tapauksissa kuin

E2

-disrupted tapauksissa ja puute metylaation replikaation tapauksessa molemmat. Viruksen transkripti (

E7-E1∧E4

), joka tuottaa repressori E2 analysoitiin APOT (monistuminen papilloomaviruksen onkogeenisten transkriptio) kanssa kytkettyä-kvantitatiivinen-RT-PCR (on

E7

ja

E4

geenejä) erottamaan episomaalinen (puhdas tai samanaikainen integroidulla) puhtaasti integroitu virusgenomien suhteen perusteella,

E7

C

T /

E4

C

T. Suhteellinen kvantifiointi perustuu vertailevaan C

T (kynnysarvotaso sykli) menetelmä paljasti 75,087 taittuu korkeampi

E7

mRNA ilmaisun episomaalisessa tapauksissa yli puhtaasti integroitu tapauksissa. Viruskuormaa ja

E2

geenin kopio lukumäärät korreloivat negatiivisesti

E7

C

T (p = 0,007) ja

E2

C

T (p 0,0001), vastaavasti, kukin normalisoitu

ACTB

C

T, joukossa episomaalisia tapauksissa vain.

k

yhdistetty elin clustering analyysin harkitsee

E7

C

T peräisin APOT kytketty-kvantitatiivinen-RT-PCR-määritys, yhdessä viruskuorma, paljasti valtavan heterogeenisuus HPV16 positiivinen CaCx tapauksissa kuvaajana integroitu virusgenomeista. Havainnot tarjota uusia oivalluksia HPV16 liittyviä CaCx synnyssä ja korosta että CaCx tapaukset että satama episomaalista HPV16 genomeja ehjät

E2

ovat todennäköisesti erillisiä biologisesti, puhtaasti integroidun virusgenomeja kannalta isäntägeenejä ja /tai reittejä mukana kohdunkaulan syövän syntymistä.

Citation: Das Ghosh D, Bhattacharjee B, Sen S, Premi L, Mukhopadhyay I Chowdhury RR, et al. (2012) Jotkut Novel Insights HPV16 Liittyvät kohdunkaulan syövän synnyssä Perustuu analyysit LCR metylaatio, Viral Load, E7 ja E2 /E4 Expressions. PLoS ONE 7 (9): e44678. doi: 10,1371 /journal.pone.0044678

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 22 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 07 elokuu 2012; Julkaistu: 06 syyskuu 2012

Copyright: © Das Ghosh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Department of Biotechnology (Grant No. BT /PR8014 /Med /14/1220/2006), Intian hallitus. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

HPV16 näyttää olevan yleisin korkean riskin HPV-tyypille tunnistettu CaCx tapauksissa syöpää edeltävät kohdunkaulan muutokset ja sytologisesti normaalissa kohdunkaulan näytteissä [1], [2]. Intiassa joukossa HPV positiivinen CaCx tapauksissa enemmistö on HPV16-DNA positiivinen [3], [4].

On selvää, että vaikka HPV-genomin olemassa episomaaliseen muodossa heikompilaatuisen vaurioita, virusgenomin saa integroitu, yhä laatuja vaurion [5]. Siitä huolimatta tämä havainto analyysi yhdistyksen HPV infektioiden CaCx kehityksen tuloksista käy ilmi Integroitujen sekä episomaalisia HPV: n muotoja, erityisesti HPV16, vuonna CaCx tapauksissa [6]. Meidän havainnot ovat osoittaneet, että

E2

geeninhajotustekniikoiden merkittävästi yliedustettuina CaCx tapauksissa verrattuna kontrolleihin [7]. Kuitenkin, yli 60%: n CaCx tapauksissa satama ehjä

E2

, huolimatta siitä, että HPV16 E2-proteiini säätelee negatiivisesti transkription

E6

ja

E7

geenit [7] , [8]. Tämä sai meidät etsimään uusia paradigmoja kohdunkaulan syövän synnyn, joka antaisi oivalluksia mekanismeja jatkuva

E6 Twitter /

E7

mRNA ilmaisu vaikka

E2

geeni ehjä, eli läsnäolo samanaikaisen virusgenomien (sekä episomaaliset ja integroitu) tai puhtaasti episomaalisina virusgenomien [7], [9] – [11].

Perustuen vertailun viidentoista HPV16 positiivisen sytologisesti normaali taaviisikymmentäseitsemän HPV16 positiivinen CaCx tapauksissa ehjä

E2

geeni, ehdotimme, että menetys E2 repressorin aktiivisuutta tällaisissa tapauksissa, pääasiassa E-linjaa, voisi johtua CpG metylaatio nukleotidin 58 sisällä E2 sitoutumiskohta I (E2BS- I) vieressä p97-promoottorin, mikä vaimentaa sitoutumista E2 tällä sivustolla [7], [9]. Olemme myöhemmin havaittu, että viruskuorma

E2

-intact tapauksissa oli huomattavasti korkeampi verrattuna niihin, joilla häiritsi

E2

geeni. Tämä edelleen sai meidät tulkitsemaan että viruskuorman yhteydessä

E2

-status, saattaa olla syy merkitystä CaCx synnyssä [12]. Biologinen uskottavuus tällaisia ​​huomautuksia todennäköisesti tukee se, että E2-proteiini parantaa viruksen DNA: n replikaatiota olemalla vuorovaikutuksessa viruksen replikaatiota tekijä E1 ja rekrytointi sen replikaation [13] – [15], ja myös sillä on suorempi rooli replikointi helpottaa viruksen genomin erottelun kytkettynä virusgenomien isännöidä mitoottisiin kromosomeja [16] – [17].

sitoutui Tässä tutkimuksessa keskitytään HPV16 positiivisia E2 ehjä ja E2 häiritsi CaCx tapauksissa aluksi, jonka jälkeen niiden luokittelu episomaalisia ja integroituneempien, määrittää toisistaan ​​riippuvaisia ​​roolit (i) metylaation E2 sitoutumiskohtiin I ja II (E2BS-I /II) ja replikaation LCR, (ii) ilmentymistä viruksen onkogeenin

E7

, (iii) ilmaus transkriptin (

E7-E1∧E4) B, joka koodaa E2-repressoriproteiinin ja (iv) virus- kuorma, HPV16 liittyvät CaCx synnyssä. Tutkimuksemme aikaan uusia oivalluksia vaihtoehtoisin menetyksen E2 repressorin aktiivisuutta, joka voisi liittyä E2BS-I /II metylaatio, läsnäolo transkriptin (

E7-E1∧E4

), joka koodaa E2 repressoriproteiinin, korkea virusmäärä ja

E7

ilmaus keskuudessa HPV16 positiivinen CaCx tapauksissa episomaalinen (puhtaat tai samanaikainen integroidulla) virusgenomien eikä niihin tapauksiin, joissa puhtaasti integroidulla virusgenomien. Tässä tutkimuksessa olemme edelleen tunnistaa käyttämällä uutta tekniikkaa, APOT kytkettyä-kvantitatiivinen-RT-PCR, joka oli valtava monimuotoisuus joukossa HPV16 positiivinen CaCx tapauksissa olipa kyse virus kopioida numeroita ja

E7

ilme tasoilla.

Materiaalit ja menetelmät

näytteet ja kohteet

käytetyt näytteet tätä tutkimusta varten sisäkkäisiä meneillään olevan luonnollisen kohorttitutkimuksessa [7], [11], [12 ]. HPV16 positiivinen pahanlaatuinen näytettä (N = 184; histopatologisesti vahvisti invasiivisia okasolusyöpää ja kliinisesti diagnosoitu kasvain vaiheen III ja yli kohti FIGO luokitus) olivat peräisin naimisissa aiheista, osallistuu syövän lähete sairaalaan (Saroj Gupta Cancer Centre ja tutkimuslaitos, South 24 Parganas, Länsi-Bengal, Intia). Näytteet (tuoreet biopsia kudokset) kerättiin osallistujille kirjallinen lupa hyväksymä institutionaalisten eettinen komitea ihmiskokeita Intian tilastoinstituutin. Tiedot koskevat aiheita, näytteet, DNA eristys, PCR-pohjainen HPV16 havaitseminen, määritys

E2

häiriöitä tila päällekkäisten DNA-pohjainen PCR ja arvio virusmäärän on kuvattu muualla [12]. Niistä 184 tapauksessa näytteiden määrä kätkeminen ehjä

E2

oli 140, ja koska kyseinen häiritsi

E2

oli 44.

määrittäminen metylaatiostatuksen HPV16 DNA rajoitus entsyymi ruoansulatusta ja PCR

E2

-intact tapauksissa metylaatio tila E2BS-I [50-ACCGAAA

CCGG

T-61] ja myös alue LCR että

E6

(LCR-

E6

) määritettiin rajoitus-pilkkomalla

HpaII /MspI

ja

McrBC

entsyymit (New England Biolabs), vastaavasti, ja analysoitiin PCR: llä sen jälkeen, julkaistujen menetelmien [9]. Noin 20% metyloitu (perustuen

McrBC

restriktiodigestio) tapauksessa valittiin satunnaisesti kustakin

E2

-intact (30/140) ja

E2

-disrupted (9/44) luokat bisulfiitti sekvensointia käyttämällä alukeparia 5′-TAA GGT TTA AAT TTT TAA GGT TAA TTA AAT-3 ’ja 5′-ATC CTA AAA CAT TAC AAT TCT CTT TTA ATA-3’, joka kattaa kannat 7748 -115 [18].

RNA: n eristys ja käänteinen transkriptio

Yhteensä-RNA: t, 41 syöpänäytteissä, eristettiin, puhdistettiin ja käsiteltiin DNaasi I: llä käyttäen Qiagen RNeasy kit seuraten valmistajan protokollaa. Yksi mikrogramma kokonais- RNA: ta käänteistranskriptoidaan käyttäen 200U M-MuLV-käänteistranskriptaasia (Fermentas) 20 ul: ssa reaktioseosta, joka sisälsi 5X RT-puskuria [Fermentas; 250 mM Tris-HCl (pH 8,3 25 ° C: ssa), 250 mM KCI, 20 mM MgCl

2, 50 mM DTT: tä], 10 mM dNTP: tä, 0,1 M DTT: tä, 20 U RNaasi-inhibiittori ja 400 ng (dT) 17 -P3 aluketta. Seos, joka sisälsi RNA: ta ja alukkeita, kuumennettiin 70 ° C: ssa (10 minuuttia) ja jäähdytettiin (10 minuuttia), ennen kuin lisättiin 5 x puskuria, 0,1 M DTT: tä ja RNaasi-inhibiittoria, ja sen jälkeen, inkuboitiin 25 ° C (2 minuuttia), minkä jälkeen lisäksi käänteistranskriptaasin ja myöhempi inkuboinnit 25 ° C: ssa (10 minuuttia) ja 42 ° C (60 minuuttia). Reaktio inaktivoitiin 70 ° C: ssa (15 minuuttia).

Vahvistus fyysisen tilan HPV16 genomien ja läsnäolo viruksen transkriptio, E7-E1∧E4, on CaCx tapauksissa, jonka APOT kytketty-quantitative- RT-PCR-määritys – uutta tekniikkaa

käsite APOT kytkettyä-kvantitatiivinen-RT-PCR-määrityksen.

APOT määritystä käytettiin ensisijaisesti päästä monistettujen tuotteiden koko alue

E7

osoitteeseen

E2

käyttäen yhteensä cDNA muodostetaan oligo-dT-aluketta (dT) 17-P3, jossa P3 oli Adapterisekvenssi (periaatetta noudattaen 3 ’RACE) [19]. Sen sijaan, että myöhemmän keino varmistaa eheys virusgenomien Southern hybridisaatiolla, sisäkkäisiä PCR: ää, jossa on erillinen RT-PCR (TaqMan) aluke-koetin sarjat

E7

ja

E4

suunniteltiin tässä tutkimuksessa tarkistaa eheyttä virusgenomien perustuva kvantitatiivinen ero

E7

ja

E4

transkription tasoa.

E7

on aina (sekä episomaalisessa ja integroitu olosuhteissa) todettiin olevan ehjä, koska sen rooli onkogeenisuustutkimuksessa, ja se ei anna suojapaikkaa jatkos-liitoskohdan. Joten, kvantifiointi

E7

transkriptio viruksen cDNA altaan voisi merkitä viruksen läsnäolo riippumatta sen genomista tila (episomaalinen tai integroitu). Toisaalta,

E2

koodaus ehjän repressori säilyy

E4,

joka puolestaan ​​omistaa sarana-koodaavan alueen E2-proteiinin. Sarana-koodaava alue kuulemma satamat suurin osa häiriöistä sivustoja viruksen integraation isännän genomiin [20]. Siten kvantifiointi sarana-koodaavan alueen sisällä

E4 myynnissä maassa viruksen cDNA-allas, voi merkitä läsnäolo ehjä

E2

. Joten koetin-alukesarjoista suunniteltiin

E7

ja

E4

varten TaqMan-pohjainen qRT-PCR: APOT-PCR-tuotteet. Differential monistaminen

E7

ja

E4

vuonna episomit ja integroi voitiin osoittaa erot C

T-arvot

E7

– ja

E4

erityisiä qRT-PCR.

APOT-PCR.

ensimmäinen PCR P1 (5′-CGG ACA GAG CCC ATT ACA AT-3 ’) ja P3 (5’ GAC TCG AGT CGA CAT CG-3 ’) ja sisäkkäistä toinen PCR P2 (5′- CCT TTT GTT GCA AGT GTG ACT CTA CG-3′) ja (dT) 17-P3 (5’-GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTTTTTTTTTTTTTTT-3 ’) suoritettiin 41 CaCx tapauksissa seuraavat julkaistujen menetelmien [19]. PCR-tuotteet tarkistettiin agaroosigeelillä (1,5%) elektroforeesin P2 – (dT) 17-P3 tuotteita.

TaqMan-pohjainen kvantitatiivinen RT-PCR-E7 ja E4 on APOT-PCR-tuotteet.

Reaktioseoksen (10 ui)

E7

ja

E4

duplex qRT-PCR sisälsi 2X TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 3 ng alukkeita ja 2 uM koetin . Aluke-koetin HPV16

E7

(eteenpäin: 5’AAG TGT GAC TCT ACG CTT CGG TT -3 ”käänteinen: -5 ’GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA A- 3′, koetin: 5’- FAM-TGC GTA CAA AGC ACA CAC GTA GAC ATT CGT A-BHQ -3) ja HPV16

E4

(eteenpäin: 5’CTT GGG CAC CGA AGA AAC AC -3 ’; käänteinen: 5’-GAT TGG AGC ACT GTC CAC TGA GT -3 ’, koetin: 5′-Vic-ACG ACT ATC CAG CGA CC-BHQ -3’) tuotti 78 bp ja 118 bp amplikonien, vastaavasti. Reaaliaikainen PCR-ohjelma sisältyy UNG-aktivointi 50 ° C: ssa 2 minuutin ajan, alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja pariutuminen 60 ° C: ssa 1 minuutin ajan. PCR-kontrollit olivat NTC (ei-templaatti-ohjattu) sekä erilliset alikvootit käänteistranskriptio reaktioita (i) kaikki reagenssit paitsi mRNA: n, (ii) mRNA: ta ja kaikki reagenssit, mutta ei käänteistranskriptaasia, ja (iii) HPV-negatiivinen solu mRNA: ta. Duplex-määritys suoritettiin vähintään kaksi kertaa, kolme rinnakkaista näytettä kohden jokaisessa määrityksessä.

PCR GAPDH ja TP53 vahvistaa mRNA: n läsnäolon ja puuttumisen DNA

läsnäolo mRNA varmistettiin PCR alukkeilla kattavat eksonin eksonin risteyksessä

GAPDH

. Reaktio 10 ui sisälsi 1,25 mM MgCl

2, 100 uM dNTP: tä, 1 yksikkö Amplitaq Gold® DNA-polymeraasia (Applied Biosystems) ja 50 ng alukkeita (eteenpäin: 5′-CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA-3 ”reverse: 5′-TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA-3 ’) ja 1 ui cDNA: n 10 x AmpliTaq Gold® puskuria (Applied Biosystems). PCR-ohjelmassa oli 40 sykliä, joissa denaturaatio 94 ° C: ssa, pariuttaminen 55 ° C: ssa ja pidennys 72 ° C: ssa, kukin 1 minuutin ajan, sekä alkudenaturaation 8 minuuttia 95 ° C: ssa ja lopullinen venymä 5 minuuttia 72 ° C. Läsnä 106 bp: n amplikonin tarkistettiin 2,5% agaroosigeelissä.

puuttuminen DNA-kontaminaation varmistettiin PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka kattavat intronit

TP53

. Reaktio 20 ui sisälsi 2 mM MgCI

2, 50 uM dNTP: tä, 1 yksikkö Amplitaq Gold® DNA-polymeraasia (Applied Biosystems), 40 ng alukkeita (eteenpäin: 5′-CCT GAA AAC AAC GTT CTG GTA A- 3 ’; reverse: 5′-GCA TTG AAG TCT CAT GGA AG-3’) ja 2 ui cDNA 10X AmpliTaq Gold® puskuria (Applied Biosystems). PCR-ohjelmassa oli 35 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa, jäähdytys 56 ° C: ssa ja pidennys 72 ° C: ssa, kukin 1 minuutin ajan, sekä alkudenaturaation 8 minuuttia 95 ° C: ssa ja lopullinen venymä 5 minuuttia 72 ° C. Läsnäolo 448 emäsparin amplikonia tarkistettiin 1,5% agaroosigeelissä.

suhteellinen kvantitointi

E7

ja

E2

mRNA ilmentyminen qRT- PCR (TaqMan) B

E7

ja

E2

geeniekspressioiden kvantifioitiin keskuudessa osajoukko 30 näytettä, joista 17 oli episomaalinen (puhdas tai samanaikainen) ja 13 puhtaasti integroitiin qRT-PCR (suhteellinen kvantifiointi vertailevien C

T-menetelmä). E7 ilmentyminen kvantifioitiin käyttämällä samaa aluketta-koetinsarjaa kuten APOT kytketty-kvantitatiivinen-RT-PCR-määritys [

21

].

E2

ilmentyminen arvioitiin 82 emäsparin amplikonin E2-spesifinen aluke-koetin [eteenpäin: 5 ’AAC GAA GTA TCC TCT CCT GAA ATT ATT AG 3’; käänteinen: 5 ’CCA AGG CGA CGG CTT TG 3’; anturi: 5 ’(BODIPYR6G) -CAC CCC GCC GCG ACC CAT A- (DQ) 3’]. Reaktioseoksen (10 ui) sisälsi 2 ui cDNA: ta, 50 ng alukkeita, 0,1 uM koettimet ja 2X TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Ihmisen ACTB Endogeeninen ohjaus (VIC /KTK Probe, Primer Limited) (Applied Biosystems) (amplikonin size = 171 emäsparia) käytettiin normalisoija. PCR-ohjelma ja ohjaimet käytettiin samoja kuin APOT kytketty-kvantitatiivinen-RT-PCR. Analyysit, jossa on kolme rinnakkaista näytettä kohden, toistettiin kahdesti.

TILASTOANALYYSI

Kolmogorov-Smirnov testi suoritettiin sen selvittämiseksi, testi-muuttujia kuin virus kopioida numeroita ilmauksia taloudenhoito geenin ja virusgeenit seurasi normaalijakaumaa. Itsenäinen 2 otoksen t-testi ja U-testi käytettiin tunnistamaan yhdessä sairausfenotyyppi vastaavasti muuttujia seurannut normaalijakaumaa ja ne, jotka eivät. Chi-squared analyysi suoritettiin testaamiseksi yhdistys metylaation E2BS-I

E2

häiriöitä-asema joukossa CaCx näytteitä.

k

yhdistetty elin klusterointialgoritmi (

k

= klusterien lukumäärä) käytettiin luokitella eri puhtaasti integroitujen virusgenomien. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen ohjelmistopaketti, SPSS for Windows v16.0.

Tulokset

metylointi tilan LCR ja E2BS-I (nukleotidi 58) HPV16 positiivisia CaCx tapauksissa kätkeminen ennallaan tai häiritsi

E2

jälkeen aikaisemmassa tutkimuksessa [9] me tutki tarkemmin roolia CpG metylaation nukleotidin (nt) 58 sisällä E2 sitoutumiskohta I (E2BS-I), vuonna CaCx synnyssä suoralla vertailun HPV16 positiivisen CaCx tapauksissa kätkeminen virusgenomien ehjät tai häiritsi E2-geeni käyttämällä laajennettu joukko satakahdeksankymmentäneljä CaCx näytettä. Restriktiohajotuksella (

HpaII /MspI

) ja myöhemmin PCR-analyysi paljasti metylaation E2BS-I (nukleotidi 58), proksimaalinen p97-promoottorin sisällä LCR, olevan huomattavasti korkeampi (p 0,001) joukossa

E2

-intact tapauksissa (69/140; 49,28%) verrattuna

E2

-disrupted tapauksissa (5/44; 11,36%).

bisulfiittimutaqeneesi-sekvenssianalyysi, LCR-DNA: 39 CaCx tapauksissa vahvisti, että yksi

E2

-intact tapauksissa (n = 30), metylaatio oli näkyvämpi (kuvio 1) nukleotidiasemissa 31 (SPI sitoutumiskohta, 63,33%), 37 ja 43 (E2BS-II, 86,66% ja 60%, vastaavasti), 52 ja 58 (E2BS-I, 70% ja 83,33%, vastaavasti), verrattuna viruksen replikaation aloituskohdan (kanta 7862, 3,3%). Lisäksi verrattuna

E2

-intact tapauksissa

E2

-disrupted tapauksissa (n = 9) kuvataan ei metylaatio asemissa 7862 ja 31 ja vähemmän metylaation muista asennoista. Edustavia elektroferogrammit on esitetty kuvassa S1.

(A) Bar kaavio vertaamalla prosenttiosuus näytteistä metyloitu eri CpG: t sisällä LCR HPV16-genomin välillä

E2

-intact ja

E2

-disrupted näytteitä. (B) kaaviomainen esitys mainittujen CpG tehtävissä LCR: 7862 – Virusreplikaatio alkuperä; 31 – SPI sitoutumiskohta; 37 ja 43 – E2BS II; 52 ja 58 – E2BS I.

Vahvistus läsnäolosta viruksen transkriptin

E7-E1∧E4

joka koodaa repressori E2 CaCx tapauksissa perustuen APOT kytketty-quantitative- RT-PCR-määritys ja luokittelu näytteet episomaalisen (puhdas tai samanaikainen) ja puhtaasti integroitu virusgenomin muotoja

Vakiinnutettuaan esiintyminen metylaation CpG: t sisällä E2 sitoutumiskohtia vieressä p97 promoottori tapauksissa kätkeminen ehjä

E2

ja puuttuminen tapauksissa kätkeminen häirinnyt

E2

, seuraava tavoite oli vahvistaa läsnäoloa E7-E1∧E4 transkriptien entisessä vahvistamaan ilmentymistä repressorin

E2

selostukset tällaisissa tapauksissa toisin niissä tapauksissa, jotka ovat häiriintyneet

E2

. Käytimme APOT määritys, jossa tapauksessa läsnäolo bändi koko 1050 emäsparin kun elektroforeesi PCR-tuotteiden saadaan P2 ja (dT) 17-P3 alukkeita 1,5% agaroosigeelissä, (kuvio 2A), pidettiin spesifisiä repressori

E2

-splice variantti,

E7-E1∧E4

,

koodattu koskemattomista

E2

geeni. Absence of 1050 emäsparin kaistan ja läsnäolo bändejä muita pituuksia 1050 emäsparin osoittaa läsnäolon integroida johdetun transkriptien [19]. Kuitenkin läsnäolo 1050 emäsparin kaistan yhdessä off-kokoinen bändejä ilmaisemaan sekoitettuja tai lomakkeet eli rinnakkaiselo episomaalista ja integroituja muotoja virusgenomien. Tällainen analyysi tunnistettu 22 CaCx tapauksissa kuvaajana esiintyminen

E7-E1∧

E4 transkriptio ja siten E2-repressorin selostukset ja 19 CaCx tapauksissa puuttuu esiintyminen transkriptin. CaCx tapauksissa voisi näin ollen spekuloitu kätkeminen episomaalisena (n = 4), samanaikaisesti (n = 18) ja integroidut (n = 19) muodot virusgenomien, jota vahvistettiin myöhemmin suorittamalla reaaliaikaisia ​​PCR (Taqman-määritys) käyttämällä PCR-tuotteet saadaan P2 ja (dT) 17-P3 alukkeita, jotka vastaavat

E7

ja

E4

ilmaisun sijasta Southern hybridisaatio.

reaaliaikainen PCR ( RT-PCR) vastaavat tiedot

E7

ja

E4

(kuvio 2B) on edustettuina C

T arvoista, jossa C

T määritellään kynnys sykli PCR, jossa, monistettu tuote havaittiin ensimmäisen kerran.

E7

– ja

E4

erityisiä PCR tehokkuus ei eronnut perustuu absoluuttiseen kvantifiointiin standardikäyrän menetelmällä käyttämällä eri kopion numeroita (1,75 x 10

8, 1,75 x 10

6 ja 1,75 x 10

4 kopiota) pUC19 plasmidivektorin HPV16 referenssisekvenssiin insertin (kuvio S2). MRNA: n läsnäolo varmistettiin PCR: llä alukkeilla ulottuu eksonin eksonin risteyksessä

GAPDH

(kuvio 2C) ja ilman DNA-kontaminaation varmistettiin PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka kattavat intronit

TP53

(kuvio 2D ).

(A) edustaja geelielektroforeesi osoittaa P2 – (dT) 17-P3 tuotteita. Kaista 1: näyte osoittaa läsnäolo 1050 emäsparin kaistan-size osoittaa episomaalista virus- genomin. On muita band-kokoja osoittaa samanaikaisen asema; Kaistat 2, 3, 4, 6: ei band-koko 1050 emäsparin osoittaa integroitu tilan näistä näytteistä. Kaista 5: 100 bp ladder (Roche). (B) TaqMan-pohjainen kvantitatiivinen RT-PCR-monistus kuvaajia

E7

ja

E4

cDNA.

E7

transkriptoidaan molemmissa episomaalisessa (puhdas tai samanaikainen) ja integroitu tapauksissa, mutta

E4

transkriboidaan vain episomaalisessa tapauksissa. (C) agaroosigeelielektroforeesi PCR-tuotteiden

GAPDH

cDNA (alukkeet ulottuvat eksoni-eksoni risteyksessä). Kaista 1: negatiivinen kontrolli; Kaista 2: CaSki- solulinjan DNA (negatiivinen kontrolli); Kaistat 3-7: näyte cDNA näytetään tietyllä taajuusalueella koko 106 emäsparia; Kaistat 3 ja 7 esittävät episomaalinen (puhtaat tai samanaikainen) näytteet T323 ja T329, vastaavasti, kun taas, kaistat 4-6 esittävät puhtaasti integroitu näytteitä T327, T326 ja T328, vastaavasti; Kaista 8:

Hae

III pilkottu? X174 DNA-markkeri (Promega). (D) agaroosigeelielektroforeesi PCR-tuotteiden

TP53

cDNA (alukkeet ulottuvat intronit). Lane 1-6, 8, 9: näyte cDNA ei näy tietyllä taajuusalueella koko 448 emäsparia; Kaistat 1, 2, 4, 6 ja 9 esittävät puhtaasti integroitu näytteitä T326, T327, T345, T344 ja T328, vastaavasti, kun taas kaistat 3, 5 ja 8 esittävät episomaalinen (puhtaat tai samanaikainen) näytteet T329, T323 ja T339, vastaavasti; Kaista 10: CaSki- solulinjan DNA (positiivinen kontrolli); Kaista 11: näyte DNA (positiivinen kontrolli); Kaista 12: vesi (negatiivinen kontrolli); Kaista 7:

Hae

III pilkottu? X174 DNA-markkeri (Promega).

mukaan APOT kytketty-kvantitatiivinen-RT-PCR-määritys, genomi-asema HPV 16 voisi myös tulkittava suhteen perusteella,

E7

C

T /

E4

C

T. CaCx näytteistä (19/41) näytetään

E7

ja

ACTB

ilmaisun mutta ei

E4

lauseke (

E7

C

T /

E4

C

T = määrittelemätön), nimettiin tapauksissa integroidulla virusgenomien. CaCx näytteistä (18/41) esittämällä ilmaus

E7

kuin

E4

(

E7

C

T /

E4

C

T≤1) yhdessä

ACTB

ilme, pidettiin tapauksissa kuvaajana läsnäolo sekä episomaalisen ja integroitu virusten genomit (samanaikainen). Oli neljä CaCx tapausta osoittavat samanlaisia ​​ekspressiotasoja sekä

E7

ja

E4

(

E7

C

T /

E4

C

T = 1) yhdessä

ACTB

ilmaisun, ja nämä pidettiin näytteitä kätkeminen episomaalisena virusgenomien. Ei ollut merkitsevä (p = 0,186, t-testi) ero

ACTB

mRNA ilmaisun välillä CaCx tapauksissa kätkeminen episomaaliset virusgenomien (puhdas ja samanaikainen) keskiarvolla ± sd = 32,98 ± 3,99 ja puhtaasti integroitu virusgenomit kanssa keskiarvo ± sd = 34,99 ± 3,26. Näin ollen 53,66% (22/41) ja CaCx tapauksissa kanna ehjän virus-genomien joista 18,18% (4/22) oli puhdasta episomaaliset genomien ja 81,82% (18/22) oli samanaikainen genomit (taulukko 1).

uudelleenanalysoinnissa meidän tietojen E2BSI metylaation nt 58 LCR tästä osajoukko näytteitä, paljasti myös, että tällainen metylaatio oli merkitsevästi (p

trendi = 0,001) yleisempää tapaukset kuvaajana episomaaliseen (puhdas ja samanaikainen) virusgenomien (17/22; 77,27%) verrattuna niihin, joilla puhtaasti integroitu viruksen genomeja (5/19; 26,32%).

Analyysi ilmaus

E7

ja

E2

geenit CaCx tapauksissa kätkeminen episomaaliset (puhdas ja samanaikainen) tai puhtaasti integroitu HPV16 genomeja ja korrelaatio virusmäärä

seuraava tavoite oli tutkia, ovatko nämä kaksi syöpätyypit, (i) ne, jotka saavat episomaalisena ( puhdas ja samanaikaisesti) ja (ii) integroitu virus muotoja, erosivat viruksen kasvaimia synnyttävän ilmaisun, analysoimalla

E7

mRNA: t. Olemme kvantitatiivisesti

E7

ilmentymistä (normalisoitu

ACTB

), jonka TaqMan-pohjainen qRT-PCR cDNA: n tuotteiden syntyy suoraan mRNA: ista, joka osajoukko 17 episomaalisen (puhtaasti episomaaliset ja samanaikaisesti) ja 13 puhtaasti integroitu tapauksissa.

E7

mRNA: n ilmentymisen (

E7

C

T /

ACTB

C

T) havaittiin normaalisti jakautunut molemmissa episomaalisessa (Kolmogorov-Smirnov Z-arvo = 0,418, p = 0,995) ja integroidut (Kolmogorov-Smirnov Z-arvo = 1,06, p = 0,211) tapauksissa. Suhde,

E7

C

T /

ACTB

C

T, oli merkitsevästi pienempi (p 0,001; t-testi) keskuudessa episomaaliset (keskiarvo ± sd = 0,84 ± 0,15) kuin integroidut (keskiarvo ± sd = 1,12 ± 0,18) tapaukset osoittavat korkeampia

E7

ilmentymistä entisessä.

suhteellinen kvantitointi perustuu vertailevaan C

T-menetelmä paljasti myös huomattavia eroa (p 0,001; U-testi) välillä ACk

T (

E7

C

T –

ACTB

C

T) arvot tapauksissa, joissa on integroitu virus genomit (mediaani ACk

T = 1,26) sekä episomaaliseen genomit (mediaani ACk

T = -4,97). Kertamuutoksen analyysi (käyttäen 2

-ΔΔCT, jossa ΔΔC

T = mediaani ACk

T episomaalisen – mediaani ACk

T integroituja), kuvataan, että

E7

ilme tapauksissa, joissa episomaalisessa (puhdas ja samanaikainen) virusgenomien oli 75,087 taittuu korkeampi kuin tapauksissa, joissa puhtaasti integroitu virusgenomeja.

Viral kopioida numeroita (luonnollinen log muuttaneet) 100 ng genomista DNA: ta, olivat myös huomattavasti korkeampi (p 0,001 ; U-testi) kesken 17 episomaalisesta tapaukset (mediaani ln (viruskuorma) = 18.02 per 100 ng DNA: ta) verrattuna 13 puhtaasti integroitu tapauksissa (mediaani ln (viruskuorma) = 9,28 per 100 ng DNA: ta). Suhde,

E7

C

T /

ACTB

C

T, todettiin olevan korreloi merkitsevästi viruskuorma (p = 0,007; R

2 = 0,398) sisällä episomaalisesta näytteet (puhdas ja samanaikainen) (kuvio 3A), mutta ei sisällä pelkästään integroitu näytteistä (p = 0,51; R

2 = 0,038) (kuvio 3B).

(A) korrelaatio

E7

C

T /

ACTB

C

T kanssa viruskuorman (luonnollinen log-arvot) on CaCx tapauksissa episomaaliset (puhtaasti episomaaliset ja samanaikainen) virusgenomit; (B) korrelaatio

E7

C

T /

ACTB

C

T kanssa viruskuorman (luonnollinen log-arvot) on CaCx tapauksissa integroidulla virusgenomit; (C) korrelaatio

E2

C

T /

ACTB

C

T kanssa viruskuorman (luonnollinen log-arvot) osalta

E2

geenin CaCx tapauksissa episomaaliset (puhtaasti episomaaliset ja samanaikainen) virusgenomeja.

episomaaliset (puhdas ja samanaikainen) tapaukset osoittivat samanaikaista ilmentymistä

E2

mRNA (keskiarvo (

E2

C

T /

ACTB

C

T) ± sd = 0,92 ± 0,18), kun taas puhtaasti integroitu tapauksissa tehnyt niin. Suhde,

E2

C

T /

ACTB

C

T, havaittiin merkittävästi korreloi (p 0,001; R

2 = 0,621) (Kuva 3C), jossa

E2

geenikopiomäärä numerot (mediaani ln (

E2

kuormitus) = 15,41 100 ng DNA) keskuudessa tällaisissa tapauksissa kätkeminen episomaaliset (puhdas ja samanaikainen) virusgenomeja.

yhteinen analyysi

E7

C

T arvot APOT kytketty-kvantitatiivinen-RT-PCR-määritys ja virusmäärä keskuudessa CaCx näytteitä kuvaajana puhtaasti integroitu HPV16 genomien työllistää

k

yhdistetty elin klustereiden

puuttuminen korrelaatio

E7

ilmaisutapoja virusmäärä muun CaCx tapauksissa integroidulla virusgenomit ennakoi mahdollisuutta olemassaolosta heterogeenisuus tällaisten CaCx tapauksia osalta

E7

ilme. Meillä on siis vielä analysoitu tietomme suorittamalla klusterianalyysillä (

k

yhdistetty elin ryhmittely), joka perustuu viruskuormaa ja

E7

C

T (APOT kytketty-kvantitatiivinen-RT-PCR ). Tällainen analyysi voisi optimaalisesti luokitella tapauksissa häiritsi virusgenomien (46.34%; 19/41) neljään klustereita (kuva 4), kuten on kuvattu taulukossa 2. Vastaavat klusteri-keskukset ovat olleet edustettuina taulukossa 3.

ACTB

mRNA ilmentymä näistä tapauksista ei korreloinut joko niiden viruskuorman (p = 0,588, lineaarinen regressio) tai

E7

C

T-arvot (APOT kytketty-kvantitatiivinen-RT-PCR) (p = 0,753, lineaarinen regressio).

Cluster 1: alhainen virusmäärä ja pieni

E7

ilmaisu; Ryhmä 2: korkea virusmäärä ja pieni

E7

ilmaisu; Ryhmä 3: kohtalainen viruskuormaa ja maltillinen

E7

ilmaisu; Cluster 4: lievä tai kohtalainen viruskuormaa ja korkea

E7

ilme.

Näistä neljästä klustereita, Cluster 1 (keskiarvo viruskuorma ± sd = 6,87 ± 1.074; keskiarvo

E7

C

T ± sd = 37,91 ± 1,416) sisältyy 6 näytettä (31.60% puhtaasti integroitujen näytettä). Kaiken kaikkiaan nämä oli alhainen virusmäärä ja pieni

E7

ilme. Cluster 2 (keskiarvo viruskuorma ± sd = 17,01 ± 1,447; keskiarvo

E7

C

T ± sd = 36,38 ± 1,948) myös 6 näytettä (31.60% puhtaasti integroitujen näytettä), joka oli korkea virus- ja alhainen

E7

ilme. Näistä näytteistä,

ACTB

transkription (samalla määrällä cDNA, jota käytettiin APOT-kytketty-kvantitatiivinen-RT-PCR-analyysi

E7

ja

E4

) ei korreloinut viruskuorma (p = 0,942, lineaarinen regressio). Cluster 3 (keskiarvo viruskuorma ± sd = 14,72 ± 3,359; keskiarvo

E7

C

T ± sd = 12,47 ± 2,128) sisältyy 5 näytettä (26,32% puhtaasti integroitujen näytettä) ja nämä kuvata kohtalainen virusmäärä ja kohtalainen

E7

ilme. Cluster 4 (keskiarvo viruskuorma ± sd = 9,36 ± 2,694; keskiarvo

E7

C

T ± sd = 2,41 ± 0,467) sisältyvät 2 näytettä (10,56% puhtaasti integroitujen näytettä), joka paljasti alhainen maltillinen viruskuorman ja erittäin korkea

E7

ilme. Etäisyydet näytteiden keskuksista niiden vastaavien klustereiden esitetään taulukossa 2. Näin ollen neljän ryhmän, kaksi todettiin ominaista kohtalainen tai suuri

E7

ilmaisun ja loput kaksi kuvatun alhainen