Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen ituradan varianttien altistavien perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syöpä (HNPCC) on ratkaisevaa kliinisessä hoidossa kantajia, mutta useat probands pysyvän negatiivisena tällaisten varianttien tai karhun variantit epävarma merkitys (VUS). Ohessa kuvataan tuloksia integroiva molekyylitason analyysit 132 HNPCC potilailla tarjoaa todisteita parantaen geenitestausta HNPCC perinteisiä tai seuraavan sukupolven menetelmiä. Potilaat seulottiin: ituradan alleelin ekspressio (ASE), nukleotidin variantteja, uudelleenjärjestelyjä ja promoottori metylaation mismatch korjaus (MMR) geenien; ituradan

EPCAM

uudelleenjärjestelyjä; kasvain mikrosatelliitti epävakaus (MSI) ja immunohistokemiallinen (IHC) MMR-proteiinin ilmentyminen. Probands negatiivisia patogeenisten varianttien MMR geenien seulottiin ituradan

APC

ja

MUTYH

sekvenssivariantit. Useimmat ituradan vikoja tunnistettu olivat sekvenssivariantit ja uudelleenjärjestelyt MMR geenien. Merkillistä, muuttunut ituradan ASE MMR geenien havaittiin 8/22 (36,5%) probands analysoitu, kuten 3 tapauksissa negatiivinen muissa näytöksissä. Lisäksi ASE esittänyt todisteita varten synnyssä ja ohjannut luonnehdinta VUS jaetaan 2 ylimääräistä probands. Ei ituradan MMR-geenin promoottori metylaatio havaittiin vain yksi

EPCAM

uudelleenjärjestely havaittiin. Useissa tapauksissa kasvain IHC ja MSI poikkesivat ituradan seulonnan tuloksista. Erityisesti

APC

tai kaksialleelisten

MUTYH

ituradan puutteita havaittiin 2/19 probands negatiivisia patogeenisten varianttien MMR geenien. Tuloksemme osoittavat, että ASE täydentää gDNA perustuvia analyyseja tunnistamisessa MMR vikoja ja karakterisointi VUS vaikuttavien geenien ilmentyminen, lukumäärä kasvaa ituradan muutoksia havaittu. Tuntuva osa probands negatiivisia MMR-geenin varianttien satamissa

APC

tai

MUTYH

variantteja. Nämä tulokset osoittavat, että ituradan ASE analyysi ja seulomalla

APC

ja

MUTYH

virheet olisi sisällytettävä HNPCC diagnostisia algoritmeja.

Citation: De Lellis L, Aceto GM, Curia MC, Catalano T, Mammarella S, Veschi S, et ai. (2013) Integrative analysointi Perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syövän: panos alleelispesifisen Expression ja muut Analyysit Diagnostic algoritmit. PLoS ONE 8 (11): e81194. doi: 10,1371 /journal.pone.0081194

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2013 Hyväksytty: 09 lokakuu 2013; Julkaistu: 20 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 De Lellis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat varoja Italian opetusministeriön, korkeakoulujen ja tutkimuksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Periytyvä polypoottinen peräsuolen syöpä (HNPCC), joka tunnetaan myös nimellä Lynch oireyhtymä, on yleisin muoto autosomaalinen hallitseva alttiutta peräsuolen syöpä (CRC) [1]. Geneettinen diagnoosi ituradan vika harjoittajien asianomaisia ​​perheitä on olennainen tehokkaan kliininen valvonta ja mahdollistaa kohdennetun kemopreventiossa joka on hiljattain osoitettu merkittävästi vähentää syövän esiintymistä näillä potilailla [2]. Kuitenkin tunnistaminen patogeenisten ituradan vikoja tämä oireyhtymä ei ole vähäpätöinen, jota kuvastaa laaja vaihtelu määrä geneettisiä muutoksia havaittu eri tutkimusten ja asianomaisten määrä variantteja epävarman merkityksen (VUS) havaittu [3-6] . Vaihteleva määrä muutoksia havaittiin heijastaa osittain eroja herkkyyden molekyylimenetelmät hyödynnetty ja osittain siitä, että kliininen diagnoosi ei täysin huomioon taustalla geneettinen heterogeenisyys, vaikka valinta probands perustuu tiukkoihin Amsterdam kriteerien I (AC -I) tai Amsterdam perusteet II (AC-II) [7]. Valtaosa HNPCC potilaista liittyvät ituradan mismatch korjaus (MMR) viat ja kehittää kasvaimia, joilla on korkea mikrosatelliitti epävakaus (MSI-H), tunnusmerkki MMR puutos. Ituradan

MLH1

tai

MSH2

variantit tunnistetaan useimmilla näistä potilaista, kun taas variantit muissa MMR geenien havaitaan pienempi osa tapauksista [1-6]. Erityisesti myös ituradan deleetiot vaikuttavat 3 ’päähän epiteelisolujen adheesiomolekyyli-geenin (

EPCAM

) voi aiheuttaa HNPCC kautta hypermetylaation ja hiljentäminen alavirran

MSH2

promoottorin EPCAM ilmentävien kudosten [ ,,,0],8].

EPCAM

deleetioita on raportoitu suhteellisen korkealla taajuudella (16-21%) erilaisissa tutkimuksissa tapauksissa negatiivisia ituradan MMR vikoja [9,10]. Korkein taajuus (jopa 33%)

EPCAM

uudelleenjärjestelyjä havaittiin osajoukko MSI-H potilailla negatiivinen ituradan MMR muutoksiin ja puuttuvat MSH2 kasvaimen ilmaisun [11,12], mutta yleinen taajuus näiden uudelleenjärjestelyt sarjassa HNPCC probands, valitsemattomat mutaatioanalyysiä asemasta tai MSH2 kasvain immunovärjäystä, ei ole arvioitu.

lisäksi MMR geenien ja

EPCAM

, muiden geenien rooli tässä geneettisesti heterogeeninen syndrooma. Suhteellisen suuri osuus perheiden kokous AC on ”familiaalinen peräsuolen syövän tyyppi X” (FCCTX), peräsuolen syöpä yhdistäminen ilman näyttöä ituradan tai kasvaimeen liittyviä MMR vikoja [4]. Suurimmalle osalle näistä perheet, geneettinen muutos vastaa paksusuolensyöpä alttiutta ei ole tiedossa, vaikka puutteita kuin MMR geenien kuten

MUTYH

,

OGG1

tai

BMPR1A

, ovat joskus havaitaan [13-15]. Tältä osin myös

APC

liittyvät muunnelmat hyvin heikennetyn fenotyypit voivat mennä päällekkäin HNPCC [16], edelleen joukon laajentaminen CRC altistavia geenejä voidaan seuloa.

Edellä mainittujen seikkojen, perinteinen geenitestauksesta HNPCC keskittyi analysointiin MMR geenien ja useita diagnostisia algoritmeja ehdotettiin optimoida seulontaan [17-21]. Nämä algoritmit voivat rajoittaa herkkyys geenitestien, aliarvioimatta kantajia patogeenisten variantit MMR geeneissä. Äskettäin erittäin tuottavia gDNA määritys (ColoSeq, University of Washington, Seattle, WA), joka perustuu kohdennettujen talteenotto ja seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) suunniteltiin samanaikaisesti analysoida MMR liittyviä ja -unrelated geenien HNPCC [22]. NGS-testaus voidaan ratkaista eräitä rajoituksia matalan suoritustehon menetelmillä, mutta tämäkin lähestymistapa on joitakin haittoja. Esimerkiksi, NGS ei tarjoa oivalluksia patogeeninen rooli VUS, jotka ovat todennäköisesti havaitse näitä erittäin tuottavia menetelmiä. Lisäksi genomista lähestymistavat eivät ole suunniteltu määrittelemään patogeenisten potentiaalia

cis

– ja trans-toimivia variantteja, jotka vaikuttavat geenin ilmentymistä. Nämä rajoitukset voivat olla osittain ratkaista cDNA perustuvissa määrityksissä, kuten analyysi alleelin ekspressio (ASE), jolla on potentiaalia paljastaa ituradan vikoja altistava peräsuolen syöpä, vaikka patogeenisen muunnos ei ole varmistettu tai rooli variantit havaittu on epäselvä [23-27].

Tässä tutkimuksessa olemme kuvaavat tuloksia integroiva analyysejä useisiin 132 Italian HNPCC käyttävillä potilailla aikaisemmin kehitetty ja uusia määrityksiä varten seulonnan ituradan ja kasvain vikoja. Osoitamme, että ituradan ASE analyysi täydentää gDNA perustuvissa määrityksissä tunnistamisessa ja luonnehdinta vikoja altistavia CRC. Meidän integroiva lähestymistapa osoittaa myös, että sisällyttäminen

MUTYH

ja

APC

Seulonnassa lisää määrä patogeenisten varianttien havaittu. Kun otetaan huomioon potilaiden määrä analysoidaan, paneeli geenien seulotaan ja välillä menetelmät Tämä tutkimus näyttämät kliiniseen kääntämisestä HNPCC geneettinen testaus voidaan soveltaa perinteistä tai NGS lähestyy. Erityisesti tuloksemme tukevat sisällyttämistä ASE analyysin ja seulonnasta polypoosin geenien algoritmit geneettiseen diagnosointiin HNPCC.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja integroiva seulontastrategia

Tutkimme 132 etuyhteydettömille AC-I tai AC-II potilaiden aikaisemmin palvelukseen Italian eri toimielimissä. DNA: n ja RNA uutettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kaikki tutkimuksessa osallistujat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen jälkeen sanallinen neuvonnan ja tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean yliopiston Chieti. Kasvain MSI ja IHC analyysit tehtiin probands kanssa käytettävissä kasvainnäytteestä. Kaikkia potilaita, riippumatta tulokset kasvaimen MSI ja IHC analyysit, kävi seulonta ituradan nukleotidikorvautumisten MMR geenien jäljempänä esitetyllä tavalla. Probands negatiivisia patogeenisten nukleotidikorvautumisten testattiin vielä laajennettu ituradan uudelleenjärjestelyihin

MSH2

,

MLH1

ja

EPCAM

, jonka jälkeen seulonta ituradan

MSH2

ja

MLH1

promoottori metylaatio. ASE analyysit MMR geenien tehtiin potilailla, joilla oli saatavilla RNA ja heterotsygoottinen vähintään yhden alleeliset merkki, riippumatta tuloksista edellä näytöstä. Potilailla negatiivinen edellä analyysit testattiin

APC

ja

MUTYH

sekvenssivariantit kuten alla on kuvattu. Vaihtelu data tunnistettu tässä tutkimuksessa on toimitettu International Society for Ruoansulatuskanavan Perinnöllinen Kasvaimet (Insight, https://www.insight-group.org/variants/database/) tietokantaan.

Seulonta ituradan nukleotidin substituutioita MMR geenien

Potilaat perin seulottiin sekvenssivariantit in

MSH2

ja

MLH1

käyttäen yksijuosteisen konformaation (SSCP) analyysiä tai denaturoivalla kaltevuus (DGGE) . Kaikki tapaukset negatiivinen SSCP tai DGGE seulottiin edelleen variantteja

MSH2

,

MLH1

ja

MSH6

denaturoivalla korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (dHPLC) ja automatisoitu sekvensointi, joka havaittu muutamia muita mutaatioita karannut alku- seulonnan (tuloksia ei ole esitetty). Ennustaa mahdollisia haitallisia vaikutuksia uudenlaisten VUS käytimme seuraavia

in silico

työkalut: PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SEULOA (http: //seuloa. jcvi.org/), HSF (https://www.umd.be/HSF/), hedelmäkärpänen (https://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html), Mutation Taster (http: //www. mutationtaster.org/), Alamut (https://www.interactive-biosoftware.com). Käytimme myös MAPP-MMR (https://mappmmr.blueankh.com/) ja PON-MMR (https://bioinf.uta.fi/PON-MMR/) ennustaminen algoritmeja, jotka olivat nimenomaan validoitu missense muunnelmia MMR geenien .

analyysi laajennettiin ituradan uudelleenjärjestelyihin

MSH2, MLH1

ja

EPCAM

Perimän

MSH2

ja

MLH1

uudelleenjärjestelyjä seulottiin multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus (MLPA) 78 potilaalla negatiivinen lähtötilanteen tarkastelu patogeenisten sekvenssivariantit tai VUS. Vahvistus uudelleenjärjestelyjä saatiin ei-fluoresoiva multiplex PCR kytketty HPLC (NFMP-HPLC) tai lab-on-a-chip teknologia analysointiin kopioluvun vaihtelut (LOC-CNV), kuten aiemmin on kuvattu [28,29] . Koska alkuperäisen version

MSH2 /MLH1

MLPA Kit (SALSA P003, MRC-Holland, Amsterdam, Alankomaat) palveluksessa ei sisältynyt antureista vastaa

EPCAM

kehitimme 3 novel NFMP -HPLC määritykset seulontaan ja vahvistuksen genomisen uudelleenjärjestelyjä vaikuttavat 3 ’päähän

EPCAM

ja geenien välinen

MSH2

–

EPCAM

alueella (taulukko S1). Nämä määritykset suoritettiin osajoukko 33 tapauksissa VUS tai negatiivinen edellisen seulonnat ja joille DNA ei ollut käytetty aikaisemmissa analyyseissä. Breakpoint analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28,29].

Ituradan

MSH2

ja

MLH1

promoottori metylaatio

bisulfiittimutaqeneesi DNA muuntaminen tehtiin vuonna 44 tapausta negatiivinen alkuperäisen seulonta patogeenisten kvenssivariantit ja genomin uudelleenjärjestelyt käyttämällä Imprinting DNA muutos kit (SIGMA, Saint Louis, MO), mukaan valmistajan ohjeiden. Seulomalla ituradan

MLH1

promoottorin metylaation tehtiin metylaatiospesifinen PCR (MSP) käyttäen degeneroituneita ja metylaatiospesifistä aluke suunnitteli Suter et ai [30]. Lisäksi olemme suunnitelleet kontrolli-PCR, jossa degeneroitunut aluke, jota käytetään MSP on paritettu spesifinen aluke metyloitumattoman DNA: ta (taulukko S2). DNA SW48 solulinjaa käytettiin positiivisena

MLH1

promoottorin metylaation ohjaus. Seulomalla ituradan

MSH2

promoottorin metylaation suoritettiin MSP käyttämällä spesifisiä alukkeita metyloituneiden ja metyloitumattomien alleelien, kuten on kuvattu julkaisussa Chan et ai [31]. Positiivinen ohjauslaitteet

MSH2

promoottori metylaatio saatiin käyttämällä ohjaus DNA: ita, jotka oli yleisesti metyloitu käyttäen S-adenosylmethionine (SAM) ja M.SssI CpG methyltrasferase (New England BioLabs, Ipswich, MA).

ASE analyysi

ASE analyysit

MSH2

,

MLH1

tai

MSH6

suoritettiin alukepidennyksellä potilaalla, joiden RNA ja heterotsygoottinen vähintään yksi alleelinen merkki, riippumatta niiden mutaatiostatuksesta riippumatta. ASE-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu käyttämällä joko

32P-leimattuja tai leimaamattomia alukkeita kytketty analyysin Molecular Imager (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) tai DHPLC (Transgenomic, Omaha, NE), vastaavasti [23,25 ]. Kolme ASE määritykset suoritettiin sekä

32P-leimattuja alukkeita ja jossa DHPLC perustuva menetelmä, joka tuotti vastaavia tuloksia (taulukko S3). Jokaista ASE määritystä, keskimääräinen suhde saatiin gDNA malleja käytettiin normalisoimaan tuotetut tiedot alukkeenpidennysmenetelmiä kokeet suoritettiin käyttämällä cDNA malleja. Nämä normalisoitu cDNA /gDNA suhteet nimettiin ASE arvoja. Perustuen aiempiin tutkimuksiin, vain merkitty epätasapaino suhteellisessa alleelin ilmentyminen vastaava kaksinkertaisiksi epätasapainon alleelinen suhteissa ( 1: 2 tai 2: 1 suhde, mikä vastaa ASE arvoihin 0,5 tai 2, vastaavasti) on konservatiivisesti harkita todisteita patogeenisen muutos [23,25,26]. Nämä ASE arvot poikkeavat yli 3 SDS keskiarvoista havaittu heterotsygoottisessa ohjauslaitteet kaksi CRC altistavia geenejä, jotka olemme aikaisemmin analysoitiin perustuen saatavuuteen ASE merkkiaineiden yleisiä Italian väestöstä (ASE on

MLH1

kontrolleissa keskiarvo 1,04, SD 0,11 käyttäen rs1799977, ASE on

APC

kontrolleissa keskiarvo 1,25, SD 0,21, käyttäen rs2229992) [24,25].

Kaiken ASE vuonna

MLH1

,

MSH2

ja

MSH6

mitattiin 8 aiemmin kuvattu [23,25] ja 3 uusia määrityksiä. Alukkeet uusia määrityksiä on kuvattu taulukossa S4.

Kasvain MSI ja IHC analyysit

Kasvaimen määritykset suoritettiin klo yhteistyötahojen että palvelukseen potilaat. MSI analysoitiin useimmissa probands (93/102) kanssa käytettävissä olevat kasvaimia näytteitä, kansainvälisten ohjeiden mukaisesti [32]. Immunohistokemiallinen ilmentymä MSH2, MLH1 ja MSH6 proteiinit analysoitiin 73/102 tapauksissa saatavilla kasvainnäytteestä kuten aikaisemmin on kuvattu [13].

seulonta

APC

ja

MUTYH

nukleotidisubstituutiot

koodaussekvenssi ja introni-eksoni rajojen

APC

ja

MUTYH

analysoitiin suoralla sekvensoinnilla 19 probands negatiivinen MMR-geenin seulonta. Nämä potilaat valittiin saatavuuden DNA ja läsnäolo vähintään yhden polyyppi diagnoosin vuonna probands ja /tai heidän omaisilleen.

Tulokset

Useita lähestymistapoja käytettiin analysoimaan 132 jotka eivät liity HNPCC potilaita patogeenisten puutteita MMR ja ei-MMR geenien.

MSH2, MLH1 ja MSH6 nukleotidin variantit

Olemme havainneet 41 aiemmin kuvattu ja 15 novel MMR-geenin varianttien (taulukko 1 ja taulukko S5). Näihin sisältyy 27 menettämisestä toiminnon nukleotidin muutokset (roskaa ja kehyksenvaihdon) käyttöön ennenaikaisen lopetuskodonit (PTC), 14 vaihtoehtoja sijaitsevat liitoskohdat, 3-frame deleetioita ja 12 missense vaihdot. Kahdeksan silmu- oli kokeellisesti todistettu yhdistää muuttunut liittämiseen, mukaan lukien 7 analysoitu aiemmissa tutkimuksissa [33-38] ja 1 tässä tutkimuksessa (katso alla), kun taas 5 katsottiin patogeenista sijaitessa lähes muuttumaton dinukleotidit intronin päissä (taulukko 1 ja taulukko S5). Kaksi lukukehyksessä poistot ja 9 missense variantit ilmoitettiin patogeenisen tai mahdollisesti patogeenisten perustuu

in silico

analyyseissä, toiminnalliset analyysit laadullisia luokittelija tai monitekijäinen ennustemalli aiemmissa raporteissa [39-44], kuten taulukossa S5.

Potilaat

AC

MSI

viallinen MMR IHC

Ituradan vikoja

nukleotidin variantteja ja uudelleenjärjestelyt

muuttunut ASE

b

LCH-1IMSI-hMLH1

MLH1

c.301GA (p.Gly101Ser) GDLM- 2 # III-1IMSI-hMSH2

MSH2

c.942 + 3ATGDLM-7 # III-3IMSI-hMLH1 /MSH2

MSH2

Del eksoni 7LCH-8IMSI-HMSH2GDLV-11 # II-9IMSI- HMLH196 # 1636IIMSI-HMLH1GDLM-9 # II-2IMSI-hMSH2

MSH2

c.1549_1550delGCinsT (p.Ala517Tyrfs * 9)

MSH2

GDLG-18 # III-19IMSI-Hn.i.

MSH2

Del eksoni 3LCH-19IMSI-hMSH2

MSH2

c.2245GT (p.Glu749*)GDLG-20#II-1IMSI-HMLH1

MLH1

LCH-27IMSI-HMSH2

MLH1

GDLG-49#IV-2IMSI-HMSH2

MSH2

c.1024GA (p.Val342Ile) GDLV-52 # II-2IMSI-hMLH1

MLH1

LCH-57IMSI-hMLH1

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) LCH-58IMSI-hMSH2

MSH2

c.2005 + 3_2005 + 14del12LCH-59IMSI-hMSH2

MLH1

c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31) LCH-88IMSI-Hn.a.

MLH1

c .1731GA (p.Ser577Ser) LCH-93IIMSI-Hn.a.

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 19 # 719IIMSI-hMSH2

MSH2

c.1444dupA (p.Arg482Lysfs * 6) 297 # 875IMSI-hMLH1

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 307 # 2619IMSI-hMLH1

MLH1

c.199GA (p.Gly67Arg) 309 # 3478IMSI-hMSH2

MSH2

Del eksonit 9-10311 # 2042IMSI-Hn.i.

MLH1

c.731GA (p.Gly244Asp) 338 # 1489IMSI-hMLH1 /MSH6

MLH1

c.382GC (p .Ala128Pro) 349 # 1581IMSI-hMSH2

MSH2

c.942 + 3AT363 # 2541IMSI-hMSH2

MSH2

Del eksonit 9-10412 # 3342IIMSI-hMSH2

EPCAM

Del eksoni 3

– MSH2

eksonissa 7 459 # 2809IMSI-hMSH2

MSH2

Del 5’upstream alue – eksoni 8476 # R26IMSI-hMSH2

MSH2

Del eksonit 1-6667 # 2412IMSI-hMSH2

MSH2

c.942 + 3AT668 # 2371IMSI-hMLH1

MLH1

c.545 + 3AG670 # 2413IMSI-hMLH1

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) 727 # AAIMSI -HMSH2

MSH2

c.942 + 2TA814 # DGRIMSI-Hn.a.

MSH2

c. [376GγA (;) 2251G C] (s. [Gly126Ser (;) Gly751Arg]) 986 # 3487IMSI-hMLH1

MLH1

c.1731 + 4AG 1068 # 3015IMSI-hMLH1

MLH1

c.1050delA (p.Gly351Aspfs * 16) 1070 # 2957IMSI-hMSH2

MSH2

c.2287G C (p.Ala763Pro) 1080 # 2974IIMSI-Hn.a.

MSH2

c.2089CT (p.Cys697Arg) 1251 # 3260IIMSI-hMSH2

MSH2

c.374C T (p.Gln125 *) 1256 # 3479IIMSI-hMSH2

MSH2

c.1786_1788delAAT (p.Asn596del) 1293 # 3286IMSI-hMLH1

MLH1

Del eksoni 61301 # 3323IIMSI-hMSH2

MSH2

c.2519_2530del12 (p.Val840_Cys843del) 1459 # 3324IIMSI-hMLH1

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) LES1 # LPIIMSI-Hn.a.

MLH1

c.731GA ( p.Gly244Asp) 298 # 668 /1584IMSI-hMSH2

MSH2

c.1077-2A C319 # 1004IMSI-hMSH2

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 350 # 1933IMSI-hMLH1

MLH1

c.676CT (p.Arg226 *) 360 # 2916IMSI-hMLH1 /MSH6

MLH1

c.1731 + 4AG

MLH1

903 # 2630IIMSI-hMSH2

MSH2

Del eksoni 31218 # 3238IMSI-hMLH1

MLH1

Dup eksonit 2-31515 # 3442IIMSI-hMSH2

MSH2

c.1255CT (p.Gln419 *) 334 # 1170IMSI-hMSH2

MSH2

c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)

MSH2

711 # 2495IIMSI-hMLH1

MLH1

c.1459CT (p.Arg487 *) 1205 # BAIIMSI-hMLH1

MSH2

c.1215CA (p.Tyr405 *) 1206 # GEIMSI-hMSH2

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 357 # 2038IMSI-Hn.a.

MSH2

c. 2294delC (p.Ala765Valfs * 47) 600 # 2237IMSI-Hn.a.

MSH2

Del eksonit 4-61138 # 3149IMSI-Hn.a.

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 737 # 2838IMSI-Hn.a.

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) TO9726IMSI-Hn.a.

MLH1

c.2040CA (p.Cys680 *) GE9804IMSI-Hn.a .

MSH2

c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2) GE9726IMSI-Hn.a.

MSH2

c.2536CT (p.Gln846 *) SI9744IMSI-Hn.a.

MSH2

c.942 + 3ATGE9914IMSI-Hn.a.

MLH1

c.677 + 1GAF102IMSI-Hn.a.

MLH1

c.546-2A GSI9606IMSI-Hn.a.

MLH1

c.911AT (p.Asp304Val)LCH-4IMSI-Hn.i.LCH-12IMSI-Hn.i.LCH-85IMSI-Hn.a.LCH-47IMSI-Hn.a.871#R08IMSI-Hn.a.GE0101IMSI-Hn.a.GE9801IMSI-Hn.a.GE9903IIMSI-Hn.a.LCH-6IMSSn.a.LCH-13IMSSn.i.LCH-79IMSSn.a.296#776IMSSn.i.303#2547IMSSn.i.308#1260IMSSn.i.

MUTYH

c. [1145G A]; [1395_1397delGGA] (p.[(Gly382Asp)];[(Glu466del)]313#1381IMSSn.a.342#2803IMSSn.i.365#2192IIMSSn.a.368#2506IMSSn.i.369#2169IMSSn.a.370#3105IMSSn.i.

APC

c.1100_1101delCT (p.Ser367Cysfs*10)633#3114IMSSn.i.728#2509IMSSn.i.818#2543IMSSn.i.933#R14IMSSn.a.1165#3159IMSSn.i.1193#3187IMSSn.i.SV0001IMSI-Ln.a.TO9913In.a.MLH1705#3035In.a.MLH1

MLH1

c.1367C A (p.Ser456 *) 1008 # 2829In.a.MSH2

MSH2

c.1757C G (p.Ser586 *) 1077 # 2979In.a.MLH1

MLH1

c.453 + 1GA1420 # 3343IIn.a.MSH2

MSH2

c.868GT (p.Glu290 *) LCH-15In.ani

MLH1

c.1918CT (p.Pro640Ser) LCH-23IIn .ana

MSH2

Del eksoni 1GDLG-29 # III-8IIn.ana

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) GDLG-31 # III-11In.ana

MLH1

c.954delC (p.His318Glnfs * 49)

MLH1

LCH-86In.ana

MSH2

c.212-1G A83 # 3103In.ana

MLH1

Del exon1

MLH1

601 # 2307In.ana

MSH6

c.3013CT (p.Arg1005 *) 1157 # 834In.ana

MSH2

c.119delG (p.Gly40Alafs * 24) 324 # R10In.ana

MLH1

c.1896GA (p.Glu632Glu) 337 # 2224In.ana

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) 359 # 2578In.ana

MLH1

c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44) 463 # 3031In.ana

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 602 # 2416In.ana

MLH1

c.1011delC (s. Asp338Ilefs * 29) 985 # 2683In.ana

MLH1

Del eksoni 61074 # 3001In.ana

MSH2

c.1059delG (p.Asn354Thrfs * 3) 1200 # 3221In.ana

MSH6

c.738_741delAAAA (p.Lys246Asnfs * 32) GE0201In.ana

MSH2

Del exon16GE9911In.ana

MLH1

c.1011delC (p.Asp338Ilefs * 29) TO0012In.ana

MLH1

c.1888_1892delATTGA (p.Ile630 *) TO0225In.ana

MLH1

c.2040CA (p.Cys680 *) GE0410In.ana

MSH2

c.942 + 3ATGE0330In.ana

MSH2

c.1216CT (p.Arg406 *) 162 # 2696In.ana

MLH1

c.1559-2A GLCH-10In.a.n.i.LCH-16In.a.n.a.LCH-51In.a.n.a.LCH-53In.a.n.a.54#982In.a.n.i.314#1200In.a.n.i.353#1114In.a.n.a.455#2186In.a.n.a.1082#2982In.a.n.a.F435In.a.n.a.GE0002In.a.n.a.Table 1. Yleistä MSI, IHC ja mutaatiostatuksesta tilaansa 132 HNPCC jotka eivät liity potilaiden kokous AC.

Na, tietoja ei ole saatavilla; ni, IHC ei informative.aNovel variantteja on lihavoitu. Ituradan MMR geenivirheitä joillekin potilaille on aiemmin raportoitu (katso taulukko 2 ja taulukot S3, S5, S6 ja S7). Olemme myös havainneet useita muunnelmia aikaisemmin raportoitu ei-patogeeninen (katso taulukko S5) .bASE arvo 0,5 tai 2. CSV Lataa CSV

Suoritimme

in silico

analysoi päätellä toiminnallinen vaikutus 4 vaihtoehtoja (3 missense ja 1 introni), joilla ei sitä ollut saatavilla tietoja aiemmista raporteista. Sillä 3 romaani missense variantteja on haitallinen vaikutus proteiinien toiminnan ennustettiin

in silico

työkaluja, kuten PON-MMR ja MAPP-MMR (taulukko S5).

In silico

työkaluja osoitti mahdollinen vaikutus liitos romaani introni variantti (

MLH1

c.1731 + 4AG) (katso jäljempänä) (taulukko S5). Lisäksi variantti, romaani

MSH2

in-frame poisto (c.2519_2530del12, p.Val840_Cys843del), katsottiin mahdollisesti patogeenisten koska se poistaa 4 aminohappotähteiden erittäin konservoituneita muiden lajien ja sijaitsee ATPaasi domain on MSH2 proteiinin, jossa vaihtelut aiemmin raportoitu aiheuttavan vikoja epäsuhta sitovia tai vapauta [45,46].

Yksi potilas (814 # /DGR) havaittiin merkittävä kahdella missense substituutioita

MSH2

(c.376GA ja c.2251GC) ennustetaan olevan patogeenisia (katso taulukko S5). Valitettavasti ei sukulaisia ​​tämän potilaan oli käytettävissä geenin havaitseminen ja vaihetta kahden vaihtoehdon ei voitu varmistaa.

Kaiken seulonta sekvenssivariantit HNPCC liittyvien geenien sallittu havaitsemisen 56 eri substituutiot selvä tai mahdollisten patogeenisten merkitys 72 potilaalla, joista 26

MLH1

(46,5%), 28 in

MSH2

(50%) ja 2

MSH6

(3,5%) (taulukko 1 ja taulukko S5).

Perimän uudelleenjärjestelyt MSH2, MLH1 ja EPCAM

seulonta

MLH1

ja

MSH2

by MLPA, jonka jälkeen vahvistava testeissä käytetään LOC-CNV ja /tai NFMP-HPLC, osoitti, että läsnä genomisen uudelleenjärjestelyjä (mukaan lukien 14 poistot ja 1 päällekkäisyyttä) in 15 78 potilaista analysoitiin (19%) (taulukko 1 ja taulukko S6). Geeni vaikuttaa uudelleenjärjestely oli

MSH2

10 probands (13%) ja

MLH1

5 probands (6,5%).

EPCAM

uudelleenjärjestelyjä seulottiin NFMP-HPLC potilailla, joilla ei havaittavissa patogeenisten varianttien tai VUS. Lisäksi

EPCAM

uudelleenjärjestelyjä arvioitiin 3 potilaalla (476 # R26, 459 # 2809 ja 412 # 3342), joka perustuu MLPA ja NFMP-HPLC-oli näyttöä

MSH2

poistot, joihin liittyy ensimmäisen eksonin geeni (taulukko S6). Yksi näistä potilaista (476 # R26) oli poistamisesta

MSH2

eksonit 1-6 ja NFMP-HPLC-pohjainen EPCAM tutkimukset osoittivat, että uudelleenjärjestely ei ulotu

EPCAM-MSH2

intergeeniset alue (taulukko S6). Eräässä toisessa potilaan (459 # 2809), aiemmin raportoitu olevan deleetio ulottuu eksonien 1-8

MSH2

[28], EPCAM määritykset osoittivat, että poistetaan sisälsi

MSH2

5 ’ylävirtaan alue, mutta säästi 3’

EPCAM

(kuva S1). Kolmannessa potilas (412 # 3342) poisto vaikutti kaikkiin

EPCAM

eksonit sisältyvät EPCAM määrityksissä (eksonit 3, 8 ja 9) (Kuva S1). Tämä poisto pidentää eksonia 7

MSH2

, osoitettuna MLPA ja NFMP-HPLC (taulukko S6). Ei

EPCAM

uudelleenjärjestelyjä havaittiin muilla potilailla analysoitu. Kaikki

MLH1, MSH2

ja

EPCAM

uudelleenjärjestelyjä varmistettiin vähintään 2 riippumatonta analyysit perustuvat MLPA, NFMP-HPLC tai LOC-CNV. 9 tapauksessa vahvistus uudelleenjärjestelyjen voitaisiin saada myös murtuessa analyysiä tai RT-PCR: llä (taulukko S6), kuten aiemmin raportoitu [28,29].

Ituradan promoottori metylaatio

Ituradan MMR-geenin promoottori metylaatio analysoitiin tapauksissa negatiivinen alkuperäisen seulonta patogeenisten nukleotidin varianttien ja genomista uudelleenjärjestelyt. CpG promoottori metylaatio havaittiin vain positiivisella kontrolli-DNA: iden (SW48 solulinja

MLH1

ja yleisesti metyloitua ohjaus DNA

MSH2

, vastaavasti – tuloksia ei ole esitetty).

Ituradan ASE analyysi

Niistä 22 potilaasta, jotka voidaan analysoida, havaitsimme muuttunut ituradan ASE on

MLH1

6 potilasta ja

MSH2

vuonna 2 potilaalla (taulukko 2 ja taulukko S7). Näistä potilaista 2 osoitti monoallelic ilmaus

MLH1

(GDLV-52 # II-2 ja 83 # 3103) ja 6 oli selvästi epätasapainoinen ilmaus

MLH1

(360 # 2916, GDLG- 20 # II-1, GDLG-31 # III-11 ja LCH-27, keskiarvo ASE arvot 4,7, 2,01, 2,24 ja 2,64, vastaavasti) tai

MSH2

(GDLM-9 # II-2 ja 334 # 1170, keskiarvo ASE arvot 3,58 ja 9,20, tässä järjestyksessä). Loput potilaat olivat vaatimattomasti epätasapainossa tai tasapainotettu ASE (taulukot 2 ja S7). ASE arvoja havaittiin 22 probands kuvataan kuviossa 1. viite luku kuvaa myös arvot, joita olemme aiemmin mitattu verrokeilla heterotsygoottinen usein c.655AG variantti (rs1799977) on

MLH1

[ ,,,0],25].

Potilaat

Patogeenisia ituradan variantteja

ASE analyysi

Gene

ASE merkki

Seuraus

normalisoitu ASE-arvo (SE)

b

GDLM-2 # III-1

MSH2

c.942 + 3AT

MLH1

c. 655AGp.Ile219Val1.00 (0,07) LCH-8

MSH2

c.984CTp. (=) 1,09 (0,07)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.97 (0,16) GDLG -18 # III-19

MSH2

Del eksoni 3

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.91 (0,10) LCH-27

MLH1

c.655AGp.Ile219Val2. 64 (0,38) GDLG-31 # III-11

MLH1

c.954delC (p.His318Glnfs * 49)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val2.24 (0,07) LCH-51

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.84 (0,10) LCH-59

MLH1

c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31)

MLH1

c. 655AGp.Ile219Val0.97 (0,11) GE9804

MSH2

c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.09 (0,05) 96 # 1636

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.17 (0,06) 334 # 1170

MSH2

c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)

MSH2

c.278_279delTTp.Leu93Profs * 69,20 (3,97) 359 # 2578

MLH1

c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.33 (0,04) 314 # 1200

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.01 (0,03) 1082 # 2982

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.07 (0,02)

MSH6

c.540TCp. (=) 1,10 ( 0,12) 83 # 3103

c

MLH1

Del eksoni 1

MLH1

c.655AGp.Ile219ValLoss G alleleTable 2. tulokset alukkeenpidennysmenetelmiä ASE analyysit suoritettiin tässä tutkimuksessa.

ain Taulukko S7 kiteytämme tulokset ASE analyysien ylimääräisiä 8 potilaista tässä tutkimuksessa, jonka ASE tulokset oli aikaisemmin raportoitu [23,25] .bMarkedly epätasapainossa ASE arvot on lihavoitu .cFor tämä potilas PE analyysin tässä tutkimuksessa vahvistettiin menetys lauseke G-alleelin aiemmin esitetty cDNA sekvensoinnin [28]. CSV Lataa CSV

ASE-arvojen 2 katkoviivat vastaavat alle kaksinkertaiseksi epätasapainon alleelinen suhteet (katso menetelmät).

Kolme potilasta, joilla on muuttunut ituradan ASE (GDLG-31 # III-11, 83 # 3103 ja 334 # 1170) tunnettiin harjoittajien

MLH1

tai

MSH2

poistot. Sitä vastoin 2 potilailla, joilla on epätasapainoinen ASE alustava seulonta patogeenisten varianttien SSCP tai DGGE oli negatiivinen, mutta myöhemmin uudelleen analyysi DHPLC ja sekvensoinnilla tunnistettiin kehyksenvaihdon on

MSH2

(asia GDLM-9 # II-2) ja introni-

MLH1

variantti voi olla vaikutusta liitos (tapaus 360 # 2916, katso jäljempänä) (taulukko 1 ja taulukko S7). Kaiken variantteja, joilla on selkeä tai mahdollinen patogeeninen rooli havaittiin 5 8 potilaalla on epätasapainoinen ASE (taulukko 1 ja taulukko S7), kun taas 3 potilaalla (GDLG-20 # II-1, LCH-27 ja GDLV-52 # II-2) poikkeava ASE oli ainoa ituradan vika havaittu [23,25].

analyysi uudenlainen otaksutun silmukoivat

In silico

analyysin eri liitos ennustuksen ohjelmistot (katso menetelmät) osoitti, että vaikutus romaanin

MLH1

c.1731 + 4AG variantti jaetaan 2 probands (360 # 2916 ja 986 # 3487) oli epävarma. Ne kuitenkin ehdotettu, että tämä muutos saattaa vaikuttaa silmukoinnin vähentämällä vahvuus donorikohta (keskimääräinen lasku 13%, välillä 7,4-22%). Saatavuus cDNA potilaassa 360 # 2916 pystyimme testaamaan onko c.1731 + 4AG variantti liittyy silmukointioperaation vika. Tämä muutos oli vaikeasti alkuperäisen testaus RT-PCR-monistettu cDNA, koska vain villityypin transkriptit paljasti suoralla sekvensoinnilla tai elektroforeettinen analyysi (tietoja ei esitetty). Kuitenkin tulosten perusteella ASE analyysi, joka osoittaa selvästi epätasapainon alleelinen lauseke (keskimääräiseksi alleeliset suhde 4,7, johdettu radioaktiivinen ja DHPLC perustuvissa määrityksissä, taulukko S3), me arveltu, että muuntunut liitos saattaa paljastaa DHPLC. Ennustetusti, sitä herkempi DHPLC analyysi mahdollisti havaitseminen suuren piikin, jonka retentioaika vastaa villityypin transkriptio ja pieni piikki, joka vastaa vähemmän ilmaistu lyhyempi transkriptio. Sekvensointi vahvisti, että vähemmän ilmaisi

MLH1

transkriptio tapahtuu out-of-frame eksonin 15 ohitusta (kuva S2).