Krooninen sairaus

tiivistelmä

lisääntymistä indusoivan ligandin (huhtikuu) ilmenee vahvasti peräsuolen syöpä (CRC) kudoksia ja solulinjoissa. Kuitenkin biologiset toiminnot ja luotettavan signaalin aikaansaama APRIL CRC ei ole täysin ymmärretty. Täällä, käytimme Sirna valikoivasti heikentävistä huhtikuu ja määrittää sen kasvaimia synnyttäviä vaikutuksia CRC solulinjassa SW480 sekä

in vitro

ja

in vivo

. Knockdovvn APRIL SW480-soluissa liittyi modulaatiota solujen lisääntymisen sekä vähentäminen solumigraation ja invaasiota

in vitro

. Lisäksi huhtikuu-Knockdown SW480 soluilla merkittävästi esti kasvaimen kasvua ja laski etäpesäke maksassa immuunivajaissa hiiriin ihon alle. Mikä tärkeintä, havaitsimme, että downregulation APRIL SW480-soluissa johti huomattavasti vähentynyt aktiivisuus fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) /Akt-reitin. Lisäksi havaitsimme, että ihmisen rekombinantti-huhtikuu aktivaatio PI3K /Akt-reitin CRC-soluissa johtaa indusoima tärkeitä solukierron proteiinit ja metalloproteinaaseja on PI3K /Akt riippuvaisella tavalla. Tämä oli samanaikainen huomattavista solukasvun elinkelpoisuutta sekä lisääntynyt solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Yhdessä nämä pakottavia tiedot viittaavat siihen, että huhtikuu aiheuttama kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden CRC-soluja voidaan saada aikaan aktivoimalla PI3K /Akt-reitin. Nämä havainnot voivat johtaa parempaan tietoa biologisista vaikutuksista huhtikuu ja voivat antaa vihjeitä tunnistaa uusia terapeuttisia ja ehkäiseviä molekyylimarkkereita CRC.

Citation: Wang G, Wang F, Ding W, Wang J, Jing R, Li H, et al. (2013) Huhtikuu indusoi kasvaimen kehittymisen ja metastaasin peräsuolen syövän solut kautta aktivointi PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 8 (1): e55298. doi: 10,1371 /journal.pone.0055298

Toimittaja: Claudio M. Costa-Neto, University of São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 19 syyskuu 2012; Hyväksytty: 20 joulukuu 2012; Julkaistu: 29 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (numerot 81201351 ja 81201350). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on merkittävä kansanterveydellinen ongelma Yhdysvalloissa ja maailmanlaajuisesti. Yhdysvalloissa, se on kolmanneksi yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin syy syövän kuolleisuus jos miehet ja naiset pidetään erillään [1]. Esiintyminen etäpesäkkeitä johtuen kasvaimen etenemistä on syy suurin syöpään liittyvien kuolemien. Vaikka paljon edistystä diagnostisia ja terapeuttisia menetelmiä, ennuste CRC potilaille on edelleen heikko. Viime aikoina kehitys molekyylibiologian ovat johtaneet lisääntynyt tietämys mekanismeista CRC kehitystä. Viimeaikaiset laajamittainen sekvensointi ja muut genomisten analyysit ihmisen Kolorektaalituumorien osoittavat, että on olemassa jopa 80 nonsilent mutaatioita jokaisessa kasvain ja että yksittäiset kasvaimet ovat erilaisia ​​mutaatioita. Vaikka mutaatiot ovat moninaiset, luokittelu yhteisiä ja harvinaisia ​​mutaatioita paljasti, että 38 reitit hajotettiin tietyllä taajuudella, ja monet näistä reiteistä leikkaavat fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) signalointi [2]. PI3K signalointireitin on keskeinen rooli syöpäsolujen lisääntymistä, eloonjääntiä, aineenvaihduntaa, liikkuvuutta ja hyökkäystä. Se on usein vapautettiin CRC soluissa, joten se on houkutteleva terapeuttinen kohde [2], [3], [4]. Voimistunut sytokiinit, kasvutekijät ja niiden reseptorien havaittiin CRC soluihin PI3K edustavat luultavasti pääasiallinen panos kasvaimien syntyyn.

huhtikuu (proliferaatiota indusoiva ligandi, joka tunnetaan myös TRDL-1, TALL-2, ja TNFSF13 ), on jäsen tuumorinekroositekijän (TNF) superperheen, jolla on homologinen rakenne ja toiminta useiden muiden sytokiinien tässä perheessä. Se keksittiin sytokiini yli-ilmentynyt transformoitujen solujen ja voi stimuloida soluproliferaatiota [5], [6]. APRIL ilmentyy pääasiassa kasvaimen kudokset, kuten paksusuolen syöpä, haimasyöpä, mahasyöpä, ja normaalin immuunijärjestelmän solut, kuten B-solujen, monosyyttien, makrofagien, dendriittisolujen, neutrofiilit, epiteelisolut, T-solujen ja joidenkin ei-immuunisolujen kuten osteoklastien. Viimeaikaiset tutkimukset ovat analysoineet kasvainta edistävät rooli APRIL potilailla, joilla on hematologisia maligniteetteja tai kiinteitä kasvaimia. Poikkeava ilmentymä huhtikuu ja myöhemmin aktivointi pro-eloonjäämisreittejä voi mahdollistaa selviytymisen useiden hematologisten maligniteettien [6], [7], [8], [9]. Kiinteissä kasvainsolut, tutkimukset ovat rajoittuneet leviämisen tai elossapysymisvaikutuksen osallinen luonnollinen kasvainten kasvua, joka on yhdenmukainen nykyisen konseptin että tulehdusreaktioita ovat tärkeä osa kasvaimen kehitys [5], [10], [11 ]. On olemassa erilaisia ​​mielipiteitä eritystä huhtikuu tuottamien kasvainsoluja tai kasvaimeen infiltroituvat solut. Mhawech-Fauceglia et ai [10] osoittaa, että kasvainta infiltroivia neutrofiilien läsnä avanne sijasta kasvainsolut olivat pääasiallinen lähde APRIL. Tämä on toisin kuin tuoreessa tutkimuksessa V Lascano et al [12], jotka osoittivat, että huhtikuu tuottama Sekä kasvain ja ei-kasvainsoluissa oli selkeä kasvain edistävää vaikutusta peräsuolen kasvaimien syntyyn. Kuitenkin loppupään signalointikaskadien aktivoidaan huhtikuu jotka voivat olla mukana kasvainten muodostumiseen ei ole vielä tunnettu. Olemme hiljattain vahvistanut, että huhtikuu yliekspressoituu ruoansulatuskanavan syöpien, erityisesti paksusuolen ja haiman [13], [14], [15]. APRIL korkeammin ilmaistaan ​​tuumoreissa kuin normaalissa paksusuolessa, ja huhtikuu-Knockdown esti migraation ja invaasion peräsuolen syövän solujen in vitro [16]. Lisäksi seerumin huhtikuu tasot mitattiin ELISA potilaiden Haimasyöpä ehdotti, että huhtikuu on positiivinen diagnoosi ja prognoosi arvo haimasyövän [15]. Nämä alustavat tutkimukset osoittavat, että huhtikuu voi olla tärkeä rooli syövän synnyssä ja syövän etenemiseen.

Tässä tutkimuksessa tutkittiin miten APRIL peräsuolen syövän synnyn ja ominaista huhtikuu-välitteiseen signaalin siirtoon. Ihmisen CRC solulinjat ja immuunivajaissa hiiriä käytettiin vaikutusten arvioimiseksi naistaintumisprosenttia huhtikuun keskeisiä piirteitä karsinogeeninen ja metastaattinen prosessi. Arvioimme roolia APRIL solujen lisääntymisen, solusyklin, muuttoliike ja hyökkäyksen CRC solulinjoissa ja tunnistaa siihen liittyvät molekyyli- ja solutason komponentteja. Käyttämällä näitä CRC solujen ja ksenograftimallia kudoksissa, ehdotamme, että huhtikuu saattaa liittyä kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden. Lisäksi havaitsimme, että huhtikuu stimulointi välittämä PI3K /Akt-reitin signaalit säätelyyn osallistuvan solusyklin ja invaasion karsinoomasoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimuksen pöytäkirjat hyväksynyt Animal Care ja tutkimus eettinen komitea, College of Medicine, Nantong yliopisto. Kaikki eläin työ tehtiin asiaa koskevien ohjeiden (sopimus 2010-0089). Kaikki potilaat antoivat kirjallinen lupa osallistua tutkimukseen.

Potilaille ja kudosnäytteiden

CRC kudokset kerättiin kirurginen resektio yksilöitä kahdeksan potilasta, jotka eivät olleet sädehoitoa tai kemoterapiaa Affiliated sairaala Nantong yliopiston huhti 2008 ja toukokuun 2009 Heidän ikä vaihteli 45-71 vuotta, joiden keski-ikä oli 56,9 vuotta. Miespuolinen: naisten suhde oli 5: 3. Diagnoosi vahvistettiin histologisesti kaikissa tapauksissa. Dosnäytteistä käsitellään välittömästi kirurgisen poiston jälkeen. Proteiini analysoitiin kahdeksassa snap-jäädytetty tumorous ja viereisen nontumorous kudosnäytteitä, jotka säilytettiin -80 ° C: ssa.

Soluviljely ja reagenssit

Kaikki ihmisen CRC solulinjat (SW480, HT-29 , Colo-205, HCT-116) saatiin Academy of Life Science, Shanghai, Kiina ja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Invitrogen, San Diego, CA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone , Logan, USA) ja antibiootteja (100 mg /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä) 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2. Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) saatiin Fmgbio, Shanghai, Kiina ja pidettiin DMEM /F12 (Gibco). GM6001, LY294002 hankittiin Chemicon (Temecula, CA, USA). Rapamysiini saatiin Sigma. Rekombinantti ihmisen huhtikuuta (rhAPRIL) hankittiin PeproTech Inc (USA).

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) havaitsemista varten eritetyn huhtikuu

CRC solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 DMEM 0,5% FBS: ssa 72 tuntia. Soluviljelmän supernatantit kerättiin ja pitoisuus APRIL mitattiin käyttämällä ihmisen huhtikuu ELISA-kittiä (R MMP-2, GATGCCGCCTTTAACTGG ja TCAGCAGCCTAGCCAGTCG; MMP-9, GCACCACCACAACATCACCTAT ja CACAACTCGTCATCGTCGAAA; TIMP-1, CAGAAGTCAACCAGACCACCT ja ATTCCTCACAGCCAACAGTG; GAPDH, ACGCATTTGGTCGTATTGGG ja TGATTTTGGAGGGATCTCGC. GAPDH seulottiin kontrollina taloudenhoito geeni. PCR-tuotteet ajettiin 1,5% agaroosigeelillä, värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin UV-valo. Kvantitoitiin densitometrillä käyttämällä ImageJ ohjelmistoa (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Soluproliferaatiomääritys

soluproliferaatiomääritykset in vitro tehtiin käyttämällä Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Donjindo, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. shAPRIL SW480-soluja, shNTC SW480-soluja ja transfektoimattomista SW480-soluja siirrostettiin 96-kuoppalevyille DMEM, jossa oli 0,5% FBS: ää, jonka tiheys on 4 x 10

3 solua /kuoppa. HUHTI-stimuloitujen HCT-116-solut ympättiin 96-kuoppalevyille DMEM: ssä, joka sisälsi 0,5% FBS: ää, kun läsnä oli 100 ng /ml rhAPRIL, 400 ng /ml rhAPRIL, 800 ng /ml rhAPRIL tai PBS: ää (kontrolliryhmä). Solut kussakin ryhmässä maljattiin kolmena kappaleena. 24, 48, 72 ja 96 h, optinen tiheys 450 nm: n aallonpituudella, joka korreloi elinkykyisten solujen lukumäärä mitattiin, ja tulokset ilmaistiin keskiarvona A450 ± SEM.

Solusyklianalyysiä

solusyklin analyysi APRIL-stimuloidut solut viljeltiin rhAPRIL 24 tuntia, ja shAPRIL solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Sitten solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 70% etanolilla tunnin ajan 4 ° C: ssa ja inkuboitiin sitten 1 mg /ml RNaasi A: lla 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sen jälkeen solut värjättiin propidiumjodidilla (PI, 50 ug /ml) (Becton Dickinson, San Jose, CA) PBS: ssä, 0,5% Tween-20, ja analysoitiin käyttäen Becton Dickinson virtaussytometrillä BD FACScan (San Jose, CA) ja Cell Quest ja analyysiä ohjelmia.

Western blot-analyysi

Protein lysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin TBS, joka sisälsi 0,1% Triton X-100 ja 5% rasvatonta maitoa inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla. Ensisijainen vasta-aineet olivat anti-ihmisen huhtikuuta (BD, NJ, USA), anti-Pakt, anti-Akt, anti-mTOR, anti-p-mTOR (Cell Signaling), anti-c-myc, anti-sykliini D1, anti -CDK4, anti-p-Rb anti-β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). HRP-konjugoitua hiiren immunoglobuliini käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Signaalin havaitseminen suoritettiin ECL-järjestelmää (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Kvantitoitiin densitometrillä käyttämällä ImageJ ohjelmistoa. Integroitu tiheysarvoja fosforyloidun proteiinien normalisoitiin kokonaisproteiinin jokaisesta näytteestä. Stimuloimattomia tai transfektoimattomiin solut annetaan arvo 1,0, ja taso fosforylaation kaikissa muissa näytteissä oli normalisoitu tähän arvoon.

Invasion ja muuttoliike määritykset

Kasvaimen soluinvaasiota mitattiin tarkastelemalla solu invaasio kautta Matrigel (BD, USA) -päällystettyihin polykarbonaatista suodattimet (8 um huokoskoko) käyttäen TranswellTM invaasio kammiot (Costar, VWR Albertslaund, Tanska). Lyhyesti, sen jälkeen, kun 48 tuntia transfektion, SW480-solut mukaan lukien shAPRIL transfektoitujen solujen ja shNTC transfektoidut solut trypsinoitiin, ja 10

5-solut suspensoitiin 100 ul: DMEM, jossa oli 0,5% FBS: maljattiin ylemmässä kammiossa. Varten APRIL-stimuloidun HCT-116 solun invaasiomääritys rinnakkaisia ​​kokeita suoritettiin, kun läsnä rhAPRIL pitoisuutena 100 ng /ml 0,5% FBS-alustaan ​​ylemmässä kammiossa. Alempi kammio sisälsi 600 ui DMEM, jossa oli 10% FBS: ää. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa 72 tuntia, solut yläpinnalla suodattimen poistettiin pyyhkimällä pumpulipuikolla. Migration määrityksiä 10

6 solua kuoppaa kohti inkuboitiin 48 tuntia tehtiin käyttämällä samaa menettelyä, mutta päällystämättömän polykarbonaattisuodattimille. Milloin on osoitettu, solut maljattiin inserttien kanssa GM6001, tai sama tilavuus DMSO (Sigma). GM6001 pitoisuutena 10 uM 0,5% FBS-alustaan ​​liuotettuna DMSO: hon lisättiin median estävät MMP: iden soluinvaasion määrityksissä. Solut pohjaan kiinnitetyn kalvon pinnan värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja laskettiin sitten mikroskoopilla. Solut tutkittiin, laskettiin ja valokuvattiin 100 x suurennus alle käännettyä mikroskooppia. Viisi eri alojen laskettiin per suodatin kussakin ryhmässä ja jokainen koe toistettiin kolmena kappaleena. Välineet viiden yksittäisten kenttien valitaan sattumanvaraisesti saatiin kuhunkin kuoppaan.

MMP-2 ja MMP-9 tuotannon

MMP-2 ja MMP-9 toimintaa määritettiin käyttämällä kvantitatiivista sandwich-entsyymi-immunomääritys tekniikkaa. CRC-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille pitoisuutena 4 x 10

3 solua per kuoppa DMEM: ssä, jossa oli 0,5% FBS: ää kolme päivää. Tasot eritetyn MMP-2 ja MMP-9 viljelmien supernatanteissa määritettiin ELISA: lla. Määritys suoritettiin käyttäen Quantikine MMP-2 ja MMP-9 sarjat (R 0,05.

Tulokset

ilmentyminen APRIL yliaktiivista CRC kudoksissa ja solulinjoissa

Tutkimme onko huhtikuu ilmentyminen säädeltiin kudoksissa tarkastelemalla näytteitä kahdeksalta CRC syöpäpotilasta käyttävät western blot analyysiä. Huhtikuu ilmennetty proteiini taso erittäin kohonnut kaikissa CRC testatuissa kudoksissa verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa (Fig. 1A). Tämä viittaa mahdolliseen rooliin APRIL syövän kehittymisessä tai etenemisessä paksusuolessa. Huhtikuu mRNA: ta havaittiin suhteellisen korkeammalla tasolla erilaisissa ihmisen CRC solulinjojen verrattuna ihmisen napalaskimon endoteelisolujen, vaikka tasot APRIL erosivat. Huhtikuu havaittiin suhteellisesti korkeammalla tasolla vuonna SW480 ja HT-29-solujen ja sen mellanlagras ilmaistu Colo-205-soluissa. Huhtikuu ilmentyminen heikosti havaittu HCT-116-solut (Fig. 1 B). Ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa HCT-116 ja SW480 valittiin mallina järjestelmä tutkimuksemme. Vähentää huhtikuu ilme, kehitimme kaksi lyhyttä hiusneula-RNA: iden (shRNA) kutsutaan sh637 ja sh1750 [17], jotka on suunnattu ihmisen huhtikuu geeni (shAPRIL) ja aiheutti merkittävää vähentämistä huhtikuu ilmaisun verrattuna nontargeting kontrollitransfektoidut (shNTC) ja transfektoimattomista soluista . Sen jälkeen shRNA transfektion huomattavia knockdovvn APRIL transkriptin havaittiin SW480-soluissa sekä mRNA (Fig. 1 C) ja proteiini (Fig. 1 D) tasoilla. Huhtikuu ilmentyminen mitattiin ELISA CRC soluviljelysupernatantit osoittaneet, että solulinjat erittyy eri liukoisen huhtikuu, joka vahvisti, että huhtikuu on erittyvä proteiini (Fig. 1 E).

(A) Western blot-analyysi APRIL kahdeksan paria Kolorektaalituumorien (T) ja viereisen normaaleissa kudoksissa (N). # 1-8 osoittaa potilaiden numerot. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (B) semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi Huhtikuu ilmentymisen ihmisen neljän CRC solulinjoissa (SW480, HT-29, Colo-205 ja HCT-116). HUVEC-solut käytettiin negatiivisena kontrollina ja GAPDH oli sisäinen kontrolli. (C) SW480-soluja transfektoitiin shRNA suunnattu nontargeting ohjaus (shNTC) tai ihmisen huhtikuu geenin (sh637, sh1750), ja sen jälkeen 48 h APRIL mRNA-tasolla määritettiin semikvantitatiivinen RT-PCR: llä. GAPDH oli sisäinen kontrolli. (D) SW480-solut transfektoitiin shNTC tai shAPRIL, ja sen jälkeen 48 h APRIL-proteiinin tasot määritettiin Western blot. β-aktiini oli sisäinen kontrolli. (E) CRC solulinjat ja shAPRIL-transfektoituja SW480-soluja viljeltiin 72 tunnin ajan, ja supernatantit kerättiin ja arvioitiin erittyy huhtikuu ELISA.

biologinen vaikutus huhtikuun peräsuolen syöpäsolujen

analysoimiseksi toimintaan huhtikuun CRC selvitimme vaikutuksia huhtikuu knockdown ja huhtikuu stimulaation solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion ihmisen CRC solulinjoja HCT-116 ja SW480. CCK-8 määrityksessä solujen kasvun elinkyky määritettiin 24, 48, 72 ja 96 h transfektion jälkeen APRIL stimulaatiota. Havaitsimme merkittävä lasku solujen kasvua elinkelpoisuuden sh637 transfektoiduissa SW480-solut (

P

0,05; Fig. 2A), ja huomattavasti lisääntynyt solujen kasvuun elinkelpoisuutta rhAPRIL (400 ng /ml, 800 ng /ml ) stimuloi HCT-116-solut (

P

0,05; Fig. 2B) verrattuna vastaaviin kontrolleihin. Tutkia roolia APRIL CRC soluinvaasiota ja etäpesäkkeiden, suoritimme solujen vaeltamiseen ja invaasio määritykset, joita pidettiin tärkeänä

in vitro Etsinnän liittyvä maligniteetti soluja. CRC-solut, jotka on transfektoitu sh637 tai stimuloitu rhAPRIL (100 ng /ml) vaikutti merkittävästi määrä vaeltavia ja tunkeutuvat solut pohjaan kiinnitetyn kalvon pinnan, verrattuna kontrollisolujen (

P

0,05; kuviot . 2D ja E). Knockdown APRIL johtanut merkittävään tukahduttaminen solujen kulkeutumista ja solujen invaasiota rekonstituoidun tyvikalvon (Matrigel), kun taas rhAPRIL (100 ng /ml) käsittely kasvanut dramaattisesti CRC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Meidän MTT määritykset osoittivat, että hoito 100 ng /ml rhAPRIL eivät havaittavasti lisätä leviämisen HCT-116-solut (Fig. 2C), mikä viittaa siihen, että huhtikuu indusoi solujen vaeltamiseen ei liittynyt lisääntynyt solujen lisääntymistä. Leviämisen ja invaasion määritykset tehtiin myös sh1750 transfektoiduissa SW480-soluja, ja tulokset olivat yhdenmukaisia ​​sh637 transfektoiduissa soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että huhtikuu on tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden CRC soluja.

(A) shAPRIL transfektion vähensi merkittävästi solujen elävyys määritettiin CCK-8: n SW480-soluihin verrattuna transfektoimattomista ja shNTC transfektoitujen valvontaa. Tiedot edustavat keskiarvo ± keskiarvon; *

P

0,05 verrattuna shNTC. (B) rhAPRIL (400 ng /ml tai 800 ng /ml) stimulointi tehostaa merkittävästi solujen elinkelpoisuutta HCT-116-soluissa verrattuna stimuloiduista soluista; *

P

0,05. (C) Hoito 100 ng /ml rhAPRIL ei lisännyt merkittävästi leviämisen HCT-116-soluissa. (D ja E) Cell motiliteetti kautta päällystämättömiä suodattimien (siirtymä) ja läpi Matrigel päällystettyjä suodattimia (hyökkäys) on shAPRIL-transfektoitujen SW480-solujen, rhAPRIL stimuloimaa HCT-116-solut ja niiden valvontaa. Solut värjättiin kristallivioletilla, visualisoitiin mikroskopialla, ja laskettiin. (D) määrä soluja, jotka olivat tunkeutuneet laskettiin viisi edustavaa pienitehoisia (x 100) kentät (LPF) per Transwell lisätä. Kaikki määritykset suoritettiin vähintään kolmena kappaleena kolmessa riippumattomassa kokeessa. Numerot ovat keskiarvoja ± SEM. *

P

0,05 versus valvontaa. (E) Havaintoesimerkki D. Mittakaava, 40 pm.

huhtikuu-Knockdown kasvaimen kasvu estyy ja etäpesäkkeiden SW480-solujen in vivo

huhtikuu vaikuttaa kasvaimen solujen kasvua ja invaasiota

in vitro

, me seuraavaksi tutki huhtikuu vaikuttanut käyttäytymiseen kasvainten

in vivo

nude-hiirissä BALB /c, jotka ovat immuunivajavuustila ja alttiita kasvainten muodostumista ja etäpesäkkeiden. Hiiret injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen ulkopuolisten transfektoitujen SW480, shAPRIL (sh637) transfektoidut SW480 tai shNTC transfektoitujen SW480-solujen. Kasvaimen kasvu väheni merkittävästi hiiriä, joihin injektoitiin HUHTI- pudotus (shAPRIL) SW480-soluja (

P

0,05) verrattuna hiiriä, joihin injektoitiin siRNA-ohjattu (shNTC) ja ei-transfektoiduista (kontrolli) soluissa (kuvio. 3A, B ja C). Kokonaismäärät metastaattisen maksakyhmyjen ( 0,5 mm) yksittäisissä hiiret laskettiin kirurginen kaukoputken. Kokonaismäärät etäpesäkenystyröiden on esitetty taulukossa 1. Metastaattinen maksakyhmyjen vahvistettiin histologisesti ja edustava hematoksyliinillä ja eosiini värjätään kuvat on esitetty kuvassa. 3D. Ei keuhkometastaaseja havaittu missään kolmesta ryhmästä. Verrattuna transfektoimattomista ja shNTC transfektoitujen SW480-solujen APRIL-pudotus SW480-soluja oli vähentynyt etäpesäke maksassa nude-hiirissä (taulukko 1, Fig. 3d). Maksa etäpesäkenystyröiden havaittiin transfektoimattomista SW480 (n = 89) ja shNTC SW480 ryhmä (n = 78), kun taas kolme kyhmyt löytyivät huhtikuu-taintumisen SW480 ryhmä (

P

0,05) ( Pöytä 1). Vaikka shNTC ryhmä muodostuu vähemmän etäpesäkenystyröiden kuin transfektoimattomista ryhmä, tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05). Nämä tulokset viittaavat siihen, että huhtikuu on keskeinen rooli karsinogeenisia ja metastaattisen prosessin SW480-solujen

in vivo

.

(A) Nude-hiiriin injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen ohjaus soluja, shNTC transfektoiduissa soluissa ja shAPRIL (sh637) transfektoiduista soluista. (B) Näyte kasvaimen kustakin ryhmästä on esitetty. (C) Taipumus kasvaimen kasvua injektion jälkeen nude-hiirissä eri ryhmissä. Kasvaimen tilavuus mitattiin työntömitalla cm

3. (D) kokonaismäärät metastaattisen maksakyhmyjen ( 0,5 mm) yksittäisissä hiiret laskettiin kirurginen kaukoputken. Edustavia hematoksyliinillä ja eosiinivärjäykset 4-um: n osat maksojen peräisin shAPRIL ja shNTC ryhmät nähdään. Nuoli osoittaa kasvain kyhmyt. Mittakaava, 100 pm. (E) Western blot ja immunohistokemia APRIL kasvaimissa nude-hiirten kustakin ryhmästä. (F) immunohistokemiallinen analyysi p-Akt, p-mTOR, Ki-67, sykliini D1, CDK4: n, p-Rb, MMP-2 ja MMP-9: n kasvaimia nude-hiirissä injektoitiin shNTC tai shAPRIL SW480-soluissa. Mittakaava, 40 pm.

huhtikuu stimuloi PI3K /Akt-reitin CRC soluissa

PI3K /Akt-reitin on raportoitu olevan keskeinen rooli solujen lisääntymisen , muuttoliike ja hyökkäys eri syöpätyyppien. Lisäksi TNF-superperheen jäsenten huhtikuu ja B-solujen aktivoivaa tekijää (BAFF), koskettaessa niiden reseptorien, on viime aikoina osoitettu aktivoida PI3K /Akt-reitin pahanlaatuisten B-solujen [18], [19]. Niinpä selvitettävä, PI3K /Akt-reitin oli mukana APRIL-välitteisen soluvasteen kiinteässä kasvainsoluissa. Akt on substraatti PI3K, ja nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) on merkittävä alavirtavaikuttajainhibiittorit Akt. Arvioimme vaikutus huhtikuu-Knockdown on PI3K /Akt-reitin SW480-soluissa mittaamalla fosforylaation profiilia Akt ja mTOR. Huhtikuu-Knockdown vähensi fosforylaatiota Akt ja mTOR in SW480-soluissa Western blot (kuvio. 4A). Myös tutki huhtikuu vaikuttanut Akt ja mTOR fosforylaation

in vivo

. Hiiren kasvain kudosten huhtikuu kaataa, vähentynyt p-Akt ja p-mTOR proteiinipitoisuus havaittiin immunohistokemialla (Fig. 3F, yläpaneeli). Me tutkimme seuraavaksi vaikutukset huhtikuu stimulaation PI3K /Akt-reitin HCT-116-soluissa. Kasvavia pitoisuuksia rhAPRIL HCT-116-solut stimuloitiin fosforylaation Akt ja mTOR, havaittiin 3 h huhtikuun jälkeen stimulaation annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4B). Tämän jälkeen esikäsittely kanssa LY294002, synteettinen estäjä P110 katalyyttisen alayksikön PI3K, käytettiin tutkittaessa mahdollista osallistumista PI3K huhti-välitteisen Akt ja mTOR fosforylaation CRC soluissa. Esikäsittely HCT-116-solujen LY294002 estivät merkittävästi huhtikuu aiheuttama Akt ja mTOR aktiivisuus, mikä viittaa siihen, että Akt ja mTOR fosforylaation vastauksena huhtikuu oli PI3K riippuvainen (Fig. 4C).

(A) SW480-solut transfektoitiin kanssa shAPRIL (sh637) ja shNTC 48 tuntia ja analysoitiin Akt ja m-TOR fosforylaatiota western blot. (B) HCT-116-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla rhAPRIL kolme tuntia ja analysoitiin ilmentymisen fosforylaation Akt ja mTOR. (C) HCT-116-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella LY294002: ssa 24 tuntia, ja sitten stimuloitiin rhAPRIL (400 ng /ml) kolmen tunnin ajan, ja analysoitiin Akt ja mTOR fosforylaation. Fosforylaatio Akt ja mTOR määritettiin SDS-PAGE ja western-blottauksella. Densitometrinen arvot on lueteltu alla kunkin blot.

huhtikuu-välitteisen soluproliferaation ja CRC-solujen aiheuttamalla Akt ja mTOR aktivointi kautta PI3K /Akt-reitin

Koska syöpäsolujen lisääntymistä säädellään solusyklin, me seuraavaksi ratkaista, mikä vaihe solusykli muuttunut huhtikuu-pudotus solujen virtaussytometrialla PI värjäystä. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, huhtikuu-knockdown SW480-soluja pidätettiin G1 vaiheessa 48 tuntia transfektion jälkeen ja prosenttia G0 /Gl vaiheessa olevien solujen lisääntynyt merkittävästi, mikä viittaa siihen, että huhtikuu-knockdown esti solunjakautumisen G1: stä S-vaiheeseen solusyklin. Edelleen ymmärtää, miten huhtikuu-Knockdown esti S-vaihe solunjakautumisen, tutkimme vaikutus shAPRIL transfektion ilmenemistä c-myc, sykliini D1, CDK4 (kriittinen sääntelevät G1 /S siirtyminen) ja p-Rb. Havaitsimme vähentäminen c-myc, sykliini D1, CDK4 ja p-Rb taintumisen APRIL (Fig. 5C), joka ehdotti, että nämä tekijät voisivat olla mukana huhtikuu solujen jakautumisen. Hiirillä kasvainten kaataa APRIL, havaitsimme vähentynyt huhtikuu proteiinipitoisuus immunohistokemiallisesti ja western blot (kuvio. 3E), ja laski soluproliferaatiota (sykliini D1, CDK4, p-Rb ja Ki-67) (Fig. 3F, alempi paneeli), mikä viittaa siihen, että alentunut kasvaimen kasvua havaittiin APRIL knockdown voisi johtua huhtikuu solujen jakautumisen. Koska PI3K /Akt aktivaation G1 vaiheessa vaaditaan c-myc vakautus- ja S-vaiheen solunjakautumisen [20], päätimme onko huhtikuu-säätelyyn solu- syklin säätelyproteiineihin oli PI3K ja Akt riippuvainen. Olemme vahvisti rhAPRIL voi aiheuttaa solusyklin etenemistä lisäämällä merkittävästi solujen osuus S, G2M vaiheen ja ilmentymistä c-myc, sykliini D1, CDK4: n, p-Rb-proteiinit verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 5B ja D) . Samalla olemme tutkineet vaikutusta PI3K /Akt inhibitio huhtikuuta indusoiman solusyklin etenemistä SW480-soluja, jotka oli esikäsitelty PI3K-inhibiittori, LY294002, ennen huhtikuuta stimulaatiota. Olemme havainneet, että aktivointi p-Akt ja p-mTOR APRIL estyi täysin PI3K-inhibiittori LY294002, johon liittyy merkittävää inhibitiota c-myc, sykliini D1, CDK4: n ja p-Rb ilmentymistä (Fig. 5E). Tämä viittaa siihen, että huhtikuu aiheuttama Akt ja mTOR on suoraan säädellään PI3K /Akt-reitin. Kuva. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.