Krooninen sairaus

tiivistelmä

vapautettiin Rho GTPaasit Rac1 ja Cdc42 on löydetty eri kasvaimissa, kuten eturauhasen ja Rac-proteiinin ilmentyminen lisää merkittävästi eturauhassyövässä. RAC ja Cdc42 väyliä edistää valvomattoman leviämisen, invaasio ja metastaattisen ominaisuuksia ihmisen syöpäsoluja. Me syntetisoitiin uusi yhdiste AZA1 perustuu rakenneinformaatioon tunnetun Rac1 estäjä NSC23766. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutuksia estämällä näiden reittien mukaan AZA1 eturauhasen kasvainten muodostumiseen suorittamalla prekliinisissä tutkimuksissa käyttäen ksenografti hiirimallissa eturauhasen syöpä. Androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä solut, AZA1 esti sekä Rac1 ja Cdc42, mutta ei RhoA GTPaasi-aktiivisuus on annoksesta riippuvaisella tavalla, ja estää solumigraatiota ja proliferaatiota. Sykliini D1 ilmentyminen väheni merkittävästi seuraavien Rac1 /Cdc42 esto eturauhasen syöpäsoluja. AZA1 hoito myös alassäädetty PAK ja AKT-vaikutusta eturauhasen syöpäsolujen, jotka liittyvät induktio proapoptoottisten funktio BAD jonka poistaminen seriini-112 fosforylaatiota. Päivittäinen systeeminen anto AZA1 varten 2 viikkoa kasvun väheneminen ihmisen 22Rv1 eturauhassyövän hiirissä ja paransi eloonjäämistä kasvain eläimillä merkittävästi. Nämä tiedot viittaavat siihen rooliin AZA1 estämisessä Rac1 /Cdc42 riippuvaa solusyklin etenemistä, syöpäsolun muuttoliike ja kasvu syöpäsolujen apoptoosin liittyy alas-sääntely AKT ja PAK signalointireitille eturauhasen syöpäsoluja. Sen vuoksi ehdotamme, että pienimolekyylinen estäjähoidossa kohdistaminen Rac1 /Cdc42 Rho GTPaasina signalointipolkujen voidaan käyttää uutena hoito potilailla, joilla on edennyt eturauhassyöpä.

Citation: Zins K, Lucas T, Reichl P, Abraham D, Aharinejad S (2013) Rac1 /Cdc42 GTPaasia Specific pienmolekyylisalpaajien vaimentaa kasvu Primary Human eturauhassyöpäksenografteista ja pidensi elinaikaa hiirillä. PLoS ONE 8 (9): e74924. doi: 10,1371 /journal.pone.0074924

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 07 elokuu 2013; Julkaistu: 11 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Zins et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: PALKINTO projekti numero: Z080347; Austria Wirtschaftsservice Ges.m.b.H (AWS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on johtava syy syövän ja toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten [1]. Vaikka seulonta eturauhassyövän on parantunut, 10-20%: lla potilaista diagnosoidaan paikallisesti edennyt tai etäpesäkkeitä, kun taas toiset etenee huolimatta leikkaus, säteily ja androgeenipuutteen terapia [2], [3]. Näin ollen edennyt eturauhassyöpä on edelleen merkittävä terveydenhuollon ongelma ja tunnistamisen uusia hoitomuotoja kehitettäessä keskittyy molekyylitason signalointi polkuja on tärkeää parantaa terapeuttisen intervention.

Rho GTPaasit kuten Rac, Cdc42 ja RhoA ovat signalointi, jotka säätelevät tukirankansa organisaatio, solusyklin etenemisen, solun eloonjäämisen ja muuttoliike suoraan edistää kasvaimen kasvua ja etenemistä [4]. Cdc42 lisäksi on merkittävä rooli valvonnassa solumigraation [5]. Rho GTPaasit esiintyä joko aktiivinen, BKT-sidottu lomakkeet tai aktiivinen, GTP-sidottu muotoja, jotka määrittävät solutoiminnoille Rho GTPaasit [6]. Rho GTPaasi aktiivisuus saattaa vaikuttaa ero aktivoituminen rho GTPaasina säännellä signalointipolkujen tai vaihtelevia määriä Rho GTPaasina säätelymolekyyleja kuten rho GTPaasia aktivoiva guaniininukleotidiä vaihto tekijät (GEFs) [4]. Vapautuneilla Rho-GTPaasit on löydetty eri proliferatiivisen maligniteettien, mukaan lukien eturauhasen kasvaimia [4] ja Rac-proteiinin ekspressio on merkittävästi lisääntynyt eturauhassyövän [7].

Rho-GTPaasit säätelevät solusyklin aktivoimalla c-Jun N- terminaalisia kinaasin (JNK) ja p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK), jotka johtavat säätelyä sykliini D1 [8], [9], [10]. Rac1 signalointireitin myös merkittävä rooli solujen eloonjäämisen liittyy v-akt hiiren thymoma viruksen onkogeenin homologin 1 (AKT) kinaasi [11]. AKT vuorostaan ​​fosforyloi BCL2 liittyvä agonisti solukuoleman (BAD) [12], joka on proapoptoottiset jäsen Bcl-2-perheen, neutraloi proapoptoottiset vaikutuksia BAD [13]. p21-proteiini (Cdc42 /Rac) aktivoitujen kinaasi 1 (PAK1) on edelleen merkittävä alavirtavaikuttajainhibiittorit Cdc42 ja Rac1 [14], [15] valvonnassa ohjelmoidun solukuoleman [16].

Koska viime tutkimukset ovat sekaantuneet poikkeava Rac1 ja Cdc42 vaikutus ihmisen syövän, nämä Rho GTPaasit on ehdotettu syöpää tavoitteet [17], [18]. Rac1 oli yksi ensimmäisistä tavoitteiden järkevä lääkekehityksessä lähestymistapoja ja pienmolekyylisalpaaja- (NSC23766), joka häiritsee vuorovaikutusta Rac1 useita GEFs tunnistettiin, että vain vähäisiä muutoksia Cdc42 toimintaa [19].

Olimme kiinnostuneita kehittämään tehokkaampia, romaani, kemiallisesti modifioitu pieniä molekyylejä estävän Rho GTPaasi aktiivisuutta mahdollisesti kliiniseen käyttöön syövän hoidossa käyttäen Rac1 estäjä NSC23766 johtavana rakenteen -yhdistesuunnitteluun [19]. Nyt raportoivat tunnistamista ja biologista aktiivisuutta AZA1, uusi dual Rac1 ja Cdc42 estävä yhdiste, joka hidastaa eturauhassyövän kasvua tehokkaasti ihmisen eturauhassyövän ksenograftimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Ihmisen androgeeni-riippumaton syöpäsolujen 22Rv1 (CRL-2505), PC-3 (CRL-1435) ja DU 145 (HTB-81) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, PAA, Pasching, Itävalta), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, PAA), 0,1 M ei-välttämättömiä aminohappoja, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Solulinjat testattiin aitouden käyttämällä STR-PCR (PowerPlex 16 HS System, Promega, Madison, WI).

Yhdiste sukupolven

Käytettävissä olevien rakenteellisten ja toiminnallisten tietojen Rac1-GEF vuorovaikutus Rac1 inhibiittoriyhdisteen NSC23766 [19], ja joka hyödyntää virtuaaliseulonnan strategiaa käyttäen SINKKIPINNAT tietokannan [20], me syntyy 21 kemiallisesti erilaisia ​​mahdollisia Ras-inhiboivan yhdisteen kaavoja, jotka sitten syntetisoitiin SPEKSISSÄ (Delft, Alankomaat). Myöhemmin kaikki syntetisoidut yhdisteet testattiin

in vitro

jonka liukoisuus tutkimus, aktivaatiotesteissä ja mitokondriotoksisuuden määritykset (WST-1) määristä.

Rac1, Cdc42 ja RhoA aktivaatiotesteissä

Eturauhassyöpä-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja ravinnotta 24 tuntia. Soluja inkuboitiin pienmolekyylisalpaaja- AZA1 20 uM 60 minuutin ajan ja sitten stimuloitiin 50 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF; R MKI67) vasta-aine (kasvaimen leviämisen määrityksessä, Dako, Glostrup, Tanska ) [22], [23]. Ensisijainen vasta-aineet todettiin peräkkäisillä inkubointi sopivilla biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja peroksidaasiin konjugoidulla streptavidiinilla (Dako), joka on kehitetty 3, 3′-diaminobentsidiinillä (Vector Laboratories), vastavärjättiin haemalum, kuivattu ja kiinnitetty DPX (Merck, Darmstadt, Saksa) ja digitalisoitu kuvia syntyi.

Analyysi vaikutuksista yhdistettä AZA1 eloonjäämiseen

eloonjääminen tutkimus asetettu kolme kuukautta. Hiirillä, joilla on 22Rv1 ksenografteja käsiteltiin yhdisteellä AZA1 for 2 viikkoa (

n

= 10) tai 30% DMSO: ta (

n

= 10), kuten edellä on kuvattu. Eläimet lopetettiin kun ne olivat kuolemaisillaan.

Tilastollinen

Data testattiin normaaliuden käyttämällä Shapiro-Wilk testi. Ryhmät verrattiin nonparametric varianssianalyysillä (ANOVA, Wilcoxonin-summa testi, Kruskal-Wallisin testi). Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia. Yleinen eloonjäämiskäyrät käsittelyn jälkeen analysoitiin Kaplan-Meier selviytymisen testi. Tilastolliset testit tehtiin käyttäen SAS-ohjelmiston (versio 9.1.3) ja Enterprise Guide (versio 4.1, SAS Institute Inc., Cary, NC). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD.

P

arvojen 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

AZA1 hoito estää Rac1 ja Cdc42 aktiivisuus eturauhasen syöpäsolujen

in vitro

näytön pienmolekyylisalpaajien perustuvat muutokset NSC23766 tunnistaa kaksi estävää yhdistettä aktiivisuus tunnistettiin rakenne N * 2 * N * 4 * -bis- (2-metyyli-1 H-indol-5-yyli ) pyrimidiini-2,4-diamiini (AZA1) (kuvio 1), on vahva inhibitorinen aktiivisuus (teksti S1, Taulukko S1, kuviot S1 ja S2). Aluksi Rac1 aktivaation 22Rv1 eturauhasen solulysaateista stimulaation jälkeen EGF tutkittiin seulonta kokeissa. Aktivointi EGF-reseptorin (EGF-R) on keskeinen rooli leviämisen ja invaasion eturauhassyövän ja muodostaa siten patologisesti merkityksellinen tekijä analyysi eturauhassyövän kasvun 22Rv1 malli [24]. Aktiivisuus Rac1 oli säädelty yli kolminkertainen stimulaation jälkeen 22Rv1 eturauhassyövän solujen EGF verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Tehokkain Rac1 inhibiittori tunnistetaan oli AZA1 (taulukko S1). Hoito 22Rv1 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen kanssa 5, 10 tai 20 uM AZA1 60 min vähensi annosriippuvaisesti Rac1 aktiivisuus merkittävästi 45% (p 0,022), 70,4% (p 0,004) ja 85,7% (p 0,002), vastaavasti, verrattuna 20 uM NSC23766 (kuvio 2A vasen paneeli). AZA1 (20 uM) myös merkittävästi alassäädetty Rac1 aktiivisuus DU 145 ja PC-3 eturauhasen solulinjoissa 86,8% (p 0,006) ja 89,9% (p 0,001), vastaavasti (kuvio 2A oikea paneeli). Lisäksi, AZA1 hoito 22Rv1 2, 5, 10 tai 20 uM tukahdutetaan Cdc42-aktiivisuuden 54%, (p 0,02), 65,4% (p 0,01), 81,6% (p 0,002) ja 90,3% (p 0,001), vastaavasti (kuvio 2B vasen paneeli). AZA1 (20 uM) myös merkittävästi alassäädetty Cdc42 aktiivisuus DU 145 ja PC-3 eturauhasen solulinjoissa 71,1% (p 0,0015) ja 86% (p 0,007), vastaavasti (kuvio 2B oikea paneeli). Sen sijaan AZA1 hoito (20 uM) ei aiheuttanut suppression RhoA aktiivisuuden (kuvio 2C). Nämä tulokset osoittavat, että AZA1 nimenomaisesti ja merkittävästi alas-säätelee Rac1 ja Cdc42 toimintaa 22Rv1, DU 145 ja PC-3 ihmisen eturauhasen solulinjoissa.

(N * 2 * N * 4 * -bis- ( 2-metyyli-1 H-indol-5-yyli) pyrimidiini-2,4-diamiini).

A, Rac1 B, Cdc42 ja C, RhoA aktivoinnin 22Rv1, DU145 ja PC3 eturauhassyövän solujen inkuboinnin jälkeen (60 min), jossa eri pitoisuuksia yhdistettä AZA1 ja stimulaation 50 ng /ml EGF: ää. Keinot kolmen erillisen kokeen on esitetty. *, Poikkeavat merkittävästi EGF.

AZA1 estää leviämisen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

Sitten analysoimme vaikutukset AZA1 on solujen lisääntymisen ja apoptoosin kohdesoluissa. Hoito stimuloimattomien 22Rv1 solujen AZA1 annoksesta riippuen vähensi merkittävästi solujen lisääntymistä 72 tunnin kuluttua inkuboinnin 2, 5 tai 10 uM (p 0,001) AZA1 kontrollisoluihin verrattuna (kuvio 3A, vasen paneeli). Analysoida, AZA1 voi myös vähentää solujen lisääntymistä EGF stimuloi solujen käsittelimme EGF-stimuloidun syöpäsolujen kanssa AZA1. Hoito 50 ng /ml EGF lisäsi 22Rv1 (p 0,05, kuvio 3A, oikea paneeli), ja hieman lisääntynyt DU 145 ja PC-3 (kuvio S3) solujen lisääntymistä. AZA1 hoito annosriippuvaisesti, vähensi merkittävästi solujen lisääntymistä 72 tunnin kuluttua inkuboinnin 2, 5 tai 10 uM (p 0,001) AZA1 verrattuna EGF-stimuloidun ja käsittelemättömän 22Rv1 (kuvio 3A, oikea paneeli), DU 145 ja PC-3 solut (kuvio S3).

, Suhteellinen tiheys syöpäsolujen jopa 72 tuntia hoidon jälkeen 2, 5, ja 10 uM yhdistettä AZA1 stimuloimattomissa (vasen paneeli) tai EGF-stimuloidun (oikea paneeli) syöpä solut mitattiin käyttämällä WST-1-solujen lisääntymisen määrityksessä. AZA1 estää 22Rv1 eturauhassyövän solujen lisääntymisen sekä stimuloimattomissa ja EGF-stimuloidun syöpäsolujen annoksesta riippuvalla tavalla. Keinot kolmen erillisen kokeen on esitetty. *, Poikkeavat merkittävästi ohjaus (vasen paneeli) ja kontrollista ja EGF-stimuloitujen solujen (oikea paneeli); +, Merkittävästi erilainen ohjaus (oikea paneeli) ;. B, edustaja virtaussytometria histogrammien solupopulaatioiden osa- G

0 /G

1, G

0 /G

1, S ja G

2 /

M vaiheissa. 22Rv1 soluja inkuboitiin 10 uM AZA1 24 tuntia. Ohjaus solut eivät saaneet mitään hoitoa. Solujen DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen propidiumjodidilla. C, sykliini D1 ilme. Edustaja virtaussytometrillä analysointia ja fluoresenssin intensiteetti 22Rv1 soluissa, joita käsiteltiin 10 uM AZA1 60 min (punainen histogrammi) verrattuna käsittelemättömiin soluihin (lihavoitu viiva) ja isotyyppikontrolleja (ohut viiva). Yhdiste pienensi sykliini D1 tasoilla. *, Merkittävästi erilainen vs. kontrolli.

Seuraavaksi analysoimme solusyklin jakelu seuraavien AZA1 hoitoa. 22Rv1 solut erotettiin sub G

0 /G

1, G

0 /G

1, S ja G

2 /M vaihetta. Sub G

0 /G

1 väestö käytettiin arvioitaessa apoptoosin. Kuvio 3B esittää edustaviin tietoihin käsittelemättömistä ja AZA1 käsiteltyjen 22Rv1 soluissa. 22Rv1 soluja käsiteltiin 10 uM AZA1 24 h osoitti kasvua sub G

0 /G

1 vaihe välillä 1,47%: sta 26,9% (± 2,78; P 0,05) ja lasku G

2 /M vaiheita 32,25%: sta 20,30% (± 3,56; P 0,05) käsitellyissä soluissa 10 uM AZA1, mikä viittaa siihen, solun proliferaation inhibitio ja määrä kasvaa apoptoottisten tapahtumia. Sitten vaikutus testattiin AZA1 on solusyklin säätelyproteiini sykliini D1. Solulysaateista käsiteltiin 10 uM AZA1 60 min, sykliini D1 fluoresenssin intensiteetti laski merkittävästi 22% ± 4,2% (p 0,001) verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin edustavasti kuviossa 3C on esitetty. Nämä tulokset osoittavat, rooli AZA1 estämisessä Rac1 ja Cdc42-riippuvaisen solu- syklin tapahtumia 22Rv1 eturauhasen syöpäsolujen apoptoosin induktion.

AZA1 estää syövän solujen vaeltamiseen

Aktiivinen kasvainsolujen vaeltamista on edellytys kasvainprogression ja etäpesäkkeiden ja raportit osoittavat, että EGF-aiheuttama syöpä solumigraatio voidaan estää estämällä Cdc42 /Rac1 signalointipolkujen [25]. Siten tutkimme vaikutus AZA1 siirtyvien EGF-stimuloidun 22Rv1, DU 145 ja PC-3-solujen Transwell määrityksissä. EGF-stimulaation huomattavasti syövän soluvaelluksen 22Rv1 (kuvio 4A), DU 145 ja PC-3 (kuvio S4A) soluja (p 0,001). Solujen käsittely 2 uM AZA1 24 h merkittävästi vähentää syöpäsolujen migraatiota 59,6 ± 12% (22Rv1 solut; p 0,001; kuvio 4A), 56,8 ± 18,8% (DU 145 soluja; p 0,001; kuvio S4A) ja 57,3 ± 16,1% (PC-3-solut; p 0,001; Kuva S4A) verrattuna EGF-stimuloidun syöpäsoluja.

, kuvat ovat Siirtyneiden syöpäsolujen peräisin

in vitro

siirtolaisuuden määritys on esitetty. 22Rv1 eturauhassyövän soluja stimuloitiin 50 ng /ml EGF ja käsiteltiin 2, 5 tai 10 uM AZA1 24 h ja muuttivat syöpäsolujen määrällisesti myöhemmin

in vitro

muuttoliike määrityksiä. Tiedot kerättiin viiden yksittäisen peräkkäisen näkökentät (40x) alkaen kolmeen rinnakkaiseen Boyden kammiota. *, Poikkeavat merkittävästi valvonta; +, Merkittävästi erilainen ohjaus ja EGF-stimuloiduista soluista. B, vaikutus AZA1 hoidon lamellipodioihin ja filopodia muodostumista. 22Rv1 eturauhassyövän solut maljattiin soluviljelmässä kammioita, stimuloitiin 50 ng /ml EGF: ää ja inkuboitiin 5 ja 10 um AZA1 24 tuntia. Paraformaldehydi kiinteät solut värjättiin Atto-488 phalloidin (F-aktiini, vihreä) havaitsemiseksi polymeroidun aktiinisytoskeletonille, filopodia ja lamellipodioihin ja vastavärjättiin DAPI (sininen) ja valokuvattiin (suurennos, x1000). Nuoli osoittaa filopodia, nuoli osoittaa lamellipodioihin. Numerot filopodia ja lamellipodioihin solua kohden laskettiin 25-soluja kussakin ryhmässä. AZA1 johtaa muutoksiin solujen morfologia ja tukahduttaa filopodia ja lamellipodioihin muodostumista. *, Poikkeavat merkittävästi valvontaa; +, Poikkeaa merkittävästi valvontaa ja EGF-stimuloiduissa soluissa; ‡, poikkeaa merkittävästi EGF-stimuloiduista soluista. Co, ohjaus. C, vaikutus AZA1 on aktiini dynamiikkaan. Ilmauksia F-aktiini ja G-aktiini in 22Rv1, DU 145 ja PC-3-solut analysoitiin immunoblottauksella (F-aktiini /G-aktiini-suhde). Pylväät edustavat F /G aktiini keskiarvo ± SD. *, Poikkeavat merkittävästi valvonnasta vastaavan solulinjan; +, Poikkeaa merkittävästi valvontaa ja EGF-stimuloitujen solujen vastaavan solulinjan.

Käsittely 2 uM AZA1 myös vähentää syövän solujen vaeltamiseen kaikissa kolmessa solulinjoissa verrattuna valvoa soluja ilman EGF-stimulaatiota 40,2 ± 12,1% (22Rv1 soluista; p 0,01; kuva 4A), 20,2 ± 8,9% (DU 145 solua; p 0,04; kuva S4A), ja 24,9 ± 16,1% (PC-3-solut; p 0,05; kuva S4A), vastaavasti verrattuna EGF-stimuloidun syöpäsoluja.

solujen käsittely 5 uM ja 10 uM AZA1 edelleen vähentää siirtymää 72,1% ja 79,1% (p 0,001) 22Rv1 soluissa, 72,4% ja 91,4% (p 0,001) DU 145 soluja, ja 60,9% ja 74,7% (p 0,001) PC-3-soluissa, vastaavasti, verrattuna EGF-stimuloitujen solujen (kuviot 4A ja kuvio S4A). Nämä tulokset osoittavat, rooli AZA1 estämisessä Rac1 ja Cdc42-riippuvainen kulkeutumista 22Rv1, DU 145 ja PC-3 eturauhasen syöpäsoluja.

AZA1 vähentää lamellipodioihin ja filopodia muodostumista ja vähentää F /G-aktiini-suhde

Cdc42 ja Rac1 ovat myös ratkaisevia muodostumista filopodia ja lamellipodioihin, jotka ovat tärkeitä hyökkäys syöpäsolujen [26]. Siksi tutkittiin vaikutusta AZA1 solumorfologiaan käyttämällä phalloidin värjäys 22Rv1, DU 145 ja PC-3-solut, jotka värjää spesifisesti polymeroidun aktiinisytoskeletonin. Morfologisesti, numerot 22Rv1 lamellipodioihin ja filopodia kasvoi merkittävästi EGF-stimulaation (p 0,04; kuva 4B). Hoidon AZA1 5 ja 10 uM johti merkittävästi vähentää lamellipodioihin (p 0,01) ja filopodia (p 0,01) muodostumisen 22Rv1 eturauhassyövän soluissa, sen jälkeen 24 h verrattuna EGF-stimuloitujen solujen (kuvio 4B).

In DU 145 solua, kun taas lukuisat filopodia noudatetaan että lisäys seuraavat EGF-stimulaation, lähes lamellipodioihin ovat näkyvissä. Samanlainen vaikutus 22Rv1 soluihin, hoitoa AZA1 5 ja 10 uM, johti vähentynyt voimakkaasti filopodia muodostumista DU 145 eturauhassyövän solut 24 tunnin kuluttua verrattuna EGF-stimuloitujen solujen (kuvio S4b, ylempi kolme paneelit). PC-3-solut, sekä lamellipodioihin ja filopodia muodostuminen tapahtui ohjaus ja EGF-stimuloiduista soluista. Hoidon jälkeen AZA1 (5 ja 10 uM), lamellipodioihin olivat lähes huomaamaton ja solujen kehitetty pyöreämpi morfologia. Filopodia havaittiin vielä sen jälkeen, kun 5 uM AZA1 hoitoon, vaikkakin pienenivät 10 uM AZA1 (kuvio S4b, kolme alinta).

Siksi AZA1 esti lamellipodioihin ja filopodia muodostumista eturauhasen syöpäsolujen, näytetään eri määrin suppression riippuen syöpäsolun tyyppi. Nämä tiedot osoittavat suoran sääntelyn vaikutus Rac1 /Cdc42 toimintaa lamellipodioihin ja filopodia laajentaminen kaikilla testatuilla solulinjoilla, jotka voivat vaikuttaa AZA1 hoitoa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat erityinen tehtävä AZA1 estämään Rac1 /Cdc42 välittämiä solun morfologia.

Seuraavaksi tarkastelimme F- ja G-aktiini sisältö eturauhassyöpäsoluissa onko AZA1 voi vaikuttaa dynaamisen aktiini uudelleenjärjestelyn . AZA1 vähensi lamellipodioihin ja filopodia muodostumista ja vähentää syövän solujen vaeltamiseen. Koska Cdc42 ja Rac tiedetään pelata suuria rooleja aktiini uudelleenjärjestely, joka on edellytys näissä prosesseissa [28], arvioimme vaikutus Rac1 /Cdc42 esto suhteesta Rac1 ja Cdc42 aktiivisuus ja dynaaminen uudelleenjärjestely aktiini luuranko. Immunoblottauksella analyysit F- ja G-aktiini fraktiot osoittivat, että suhteellinen ilmentymistaso F-aktiini /G-aktiini oli merkitsevästi korkeampi EGF-stimuloidun 22Rv1, DU 145 ja PC-3-eturauhassyöpäsoluilla kontrollisoluihin verrattuna (p 0,05; kuvio 4C). Hoidon AZA1 2, 5 ja 10 uM pienensi merkitsevästi suhteellista ilmentymistä suhde F- ja G-aktiini kaikissa kolmessa solulinjoissa 24 tunnin jälkeen verrattuna EGF-stimuloidun syöpäsolujen (p 0,01; kuvio 4C) ja valvonta-soluja ( p 0,05; kuvio 4C).

Nämä havainnot osoittavat, että lamellipodioihin ja filopodia muodostumista eturauhasen syöpäsolujen liittyy uudelleenjärjestely aktiinisäikeiden ja että tämä prosessi vaikuttaa AZA1 hoitoon.

AZA1 alas-säätelee PAK signalointireitin

Ryhmä I p21-aktivoitujen kinaasien (PAK) ovat tärkeitä efektoreita pieniä GTPaaseja Rac ja Cdc42, jotka säätelevät solujen vaeltamiseen, selviytymistä ja proliferaatiota [27], [29]. PAK säätelee myös Ras-välitteisen lamellipodioihin laajennus, muuttoliike ja hyökkäys syöpäsolujen [27]. Analysoida signalointireittejä, jotka voivat välittää vaikutuksia AZA1 välitteisen Rac1 /Cdc42 inhibition, tutkimme aktiivisuus alavirtavaikuttajainhibiittorit PAK arvioimalla PAK: n fosforylaation EGF-stimuloidun syöpäsolut seuraavia AZA1 hoitoon. Tiedot osoittavat, että PAK1 /2 fosforylaatio seriinillä 144/141, joka ylläpitää katalyyttisen aktiivisuuden PAK: ien [30], on annosriippuvaisesti vähentää merkittävästi 46,9 ± 19,1% (2 uM), 55,5 ± 18,4% (5 uM) ja 85 ± 14,3% (10 uM) (p 0,04) on AZA1 hoitoon 22Rv1 soluissa verrattuna EGF-stimuloitujen solujen (kuvio 5). Samoin PAK1 /2 fosforylaatio seriinillä 144/141 myös annoksesta riippuen ja vähensi jopa 52,4 ± 15,1% (p 0,05) ja 48,1 ± 11,5% (p 0,04), tässä järjestyksessä, on AZA1 hoito EGF-stimuloidun DU 145 ja PC-3-soluja (kuvio S5), joka osoittaa, että Rac1 /Cdc42 inhibitio estää PAK1 signalointireitin näissä eturauhasen syöpäsoluja. PAK1 proteiinin tasot eivät vaikuttaneet AZA1 hoitoon (tietoja ei esitetty). Nämä havainnot viittaavat siihen, että AZA1 vaikuttaa solun liikkuvuus ja aktiini uudelleenjärjestelyn eturauhassyöpäsoluissa tukahduttamalla Rac1 ja Cdc42 aktiivisuuden kautta PAK1 /2 fosforylaation.

analyysi PAK, AKT ja BAD-fosforylaatiota EGF-stimuloidun 22Rv1 eturauhasen syöpäsolujen seuraavat AZA1 hoitoon. Edustavia Western blot kuvia ja kvantifiointiin Immunoblottien värjätty fosfo-PAK1 /2 (PPAK), fosfori-AKT (Pakt) ja fosfo-BAD (pBAD) vasta-aineet ennen ja jälkeen hoidon 2, 5 ja 10 uM AZA1 24 tuntia. Rac1 /Cdc42 saarto vähentää fosforylaation PAK1, AKT ja huono 22Rv1 syöpäsolujen verrattuna kontrolleihin (keinoja 3 itsenäistä koetta). *, Poikkeavat merkittävästi stimuloimattomasta ja käsittelemättömiä kontrolleja; +, Poikkeaa merkittävästi EGF-stimuloidun ohjaus; ‡, poikkeaa merkittävästi stimuloimattomasta, käsittelemätön kontrolli ja EGF-stimuloidun ohjaus. SP, erityinen proteiini; LC, kuormituksen valvonta.

AZA1 alas-säätelee AKT signalointireitin ja vähentää BAD fosforylaatio

Jotta voitaisiin tunnistaa myöhemmässä Rac1 /Cdc42 ehdokkaat vaikuttaa AZA1 hoito, analysoimme AKT ja MAPK aktiivisuus käyttäen fosfospesifisiä vasta-aineita. AKT ja ERK toimintaa on vähentynyt väheneminen PAK1 ilmaisun mikä alentaa solujen lisääntymistä, muuttoliike /invaasion ja eloonjäämisen paksusuolensyöpä [28]. Lisäksi AKT signalointireitin on osoitettu olevan osallisena eturauhassyövän etenemiseen ja siirtymistä androgeeni-riippumaton taudin [31].

Huomasimme, että Rac1 /Cdc42 inhibitio AZA1 24 tuntia johti merkittävään annoksesta riippuvainen inhibitio fosfo-AKT tasolle 20,8% (2 uM), 39,3% (5 uM) ja 62,5% (10 uM) (p 0,05), kun AZA1 hoito EGF-stimuloidun 22Rv1 soluissa (kuvio 5). Sen sijaan, AZA1 käsittely ei aiheuttanut muutoksia fosforylaation mahdollisia Rac1 efektoreja ERK, JNK tai p38 (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että aktivointi näiden MAPK reittejä ei vaikuta Rac1 ja Cdc42 eston 22Rv1 eturauhasen syöpäsoluja.