PLoS One: vaikutus pienten molekyylien Moduloiva androgeenireseptorin (SARM) in Human Eturauhassyöpä Mallit
tiivistelmä
hallinnointi hormonirefraktorisiksi eturauhassyöpä on suuri haaste terapiassa tämän kasvain, ja tunnistaminen uusia androgeenireseptorin antagonisteina tarvitaan tehdä hoidon tehostamiseksi. Analysoimme aktiivisuus kahta uutta androgeenireseptorin antagonistit, (
S
) -11 ja (
R
) -9, in
in vitro
ja
in vivo
kokeellisissa malleissa hormoniherkän tai kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC).
In vitro
kokeet suoritettiin LNCaP, LNCaP-AR, LNCaP-Rbic ja Vcap ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Sytotoksinen aktiivisuus määritettiin SRB ja BrdU ottoa, AR transaktivaatiota lusiferaasireportterista määritys ja PSA-arvot Real Time RT-PCR ja ELISA-määritykset. Solusyklin etenemisen liittyviä markkereita arvioitiin western blot.
In vivo
kokeet suoritettiin SCID ksenosiirrettyjä soluilla eri herkkyyttä hormonihoito. In hormoniherkän LNCaP ja LNCaP-AR soluja, jälkimmäinen ilmentävät korkeita androgeenireseptorin tasolla (
R
) -9 ja (
S
) -11 osoitti korkeamman sytotoksisen vaikutuksen verrattuna viitteen yhdisteen ((
R
) -bicalutamide), myös läsnä synteettisen androgeenin R1881. Lisäksi sytotoksinen vaikutus tuotetaan (
R
) -9 oli suurempi kuin (
S
) -11 kahden hormonin kestävä LNCaP-AR ja Vcap soluja. Merkittävä väheneminen PSA tasoilla havaittiin altistumisen jälkeen molemmat molekyylit. Lisäksi, (
S
) -11 ja (
R
) -9 inhiboi DNA-synteesiä estämällä androgeenin indusoimaa sykliini D1-proteiinin tasoja.
In vivo
tutkimuksissa toksikologiset (
R
) -9 ei paljastunut läsnäolo haittatapahtumia. Lisäksi (
R
) -9 esti kasvaimen kasvua eri
in vivo
malleissa, erityisesti LNCaP-Rbic ksenografteissa edustaja uusiutuva sairaus. Meidän
in vitro
tulokset korostavat antituumorivaikutuksen molempien uusien molekyylien (
R
) -9 ja (
S
) -11, joten ne voi olla houkutteleva vaihtoehto hoitoon CRPC.
Citation: Tesei A, Leonetti C, Di Donato M, Gabucci E, Porru M, Varchi G, et ai. (2013) vaikutus pienten molekyylien Moduloiva androgeenireseptorin (SARM) in Human Eturauhassyöpä mallit. PLoS ONE 8 (5): e62657. doi: 10,1371 /journal.pone.0062657
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
vastaanotettu: 12 joulukuu 2012; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 08 toukokuu 2013
Copyright: © 2013 Tesei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Gabriella Castoria ja Marzia Di Donato saanut rahoitusta Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC-IG11520) ja Ministero Italiano per la Ricerca SCIENTIFICA (PRIN 2010NFEB9L_002). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat konfliktin julistaa Annalle Tesei , Greta Varchi ja Andrea Guerrini. Drs. Anna Tesei, Greta Varchi ja Andrea Guerrini ovat keksijöiden patenttihakemus (# WO /2010/092546), joka perustuu havaintojen kuvattu tässä tutkimuksessa. Nykyä ei ole olemassa tuotteita kehitteillä tai markkinoidaan julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.
Johdanto
Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä ja kuudenneksi yleisin syy syövän kuolema miehillä kaikkialla maailmassa [1]. Kehittyneissä maissa, kuten Italiassa, se on yleisin pahanlaatuinen kasvain miehillä ja toinen vain keuhkosyövän kannalta syövän kuolleisuus [2], [3]. Kirurgian, sädehoidon ja /tai androgeenideprivaatio ovat tehokkaimpia kliinisen hoitojen alkuvaiheessa sairauden. Erityisesti, hormonihoito johtaa remission, joka tyypillisesti kestää 2-3 vuotta. Kuitenkin, eturauhassyöpä usein metastasizes luun ja lähes poikkeuksetta etenee androgeenista itsenäinen valtio, jolla on huono ennuste ja eloonjäämismediaani vaihtelee 10-20 kuukautta [4]. Tähän mennessä paljon tutkimusta eturauhassyöpä on suunnattu androgeenieritystä keskittyen pääasiassa tapoja alenevassa kiertävän androgeenien ja estämään androgeenireseptorin (AR) toiminnallisuutta.
Antiandrogens, luokitellaan steroidi tai ei-steroidi yhdisteiden , inhiboivat androgeenin aktiivisuus kilpailevasti estää vuorovaikutusta testosteronin ja /tai dihydrotestosteroni (DHT) ja AR. Steroidi antiandrogeenit, joista syproteroniasetaatti on edustavin, on viime aikoina käyty paljon keskustelua, koska niiden sivuvaikutuksia, kaltaisia aiheuttamien kastraatio terapia [5]. On myös huolissaan niiden näennäinen hepatotoxicity pitkäaikaisesta käytöstä ja tromboembolisia komplikaatioita aiheuttamat niiden mahdollisia progestogenic toimintaa [6].
steroidiset antiandrogeenit, kuten bikalutamidi (Casodex®), FLUTAMIDE (Eulexin®) ja nilutamidi (Nilandron®) näyttävät olevan paremmin siedetty kuin niiden steroidi analogit ja ovat tällä hetkellä ainoa keino välttää kastraatio hormonitoiminnan eturauhassyövän hoitoon [5]. Nämä yhdisteet ovat usein nimitystä ”puhdas antiandrogeenit”, koska ne sitoutuvat yksinomaan AR. Bikalutamidi on paras siedetty näiden lääkkeiden, [7] – [9], mutta, kuten kaksi muuta, se toimii agonistina kun AR mutaatioita esiintyy (W741C e H874Y) ja /tai tapauksissa AR yli-ilmentymisen, kuten tapahtuu hormoni tulenkestävä eturauhassyöpä. Nyt on yleinen yksimielisyys siitä avainroolia AR etiologiassa ja etenemisen eturauhassyöpä (PC), vaikka se kehittyy androgen-herkkä kastraatio-resistenttejä (CRPC). Tätä tukee näyttöä siitä, että AR ilmentyminen säilyy useimmissa eturauhassyövän yksilöitä, riippumatta vaiheessa ja arvosana, sekä se, että vain pieni osa CRCP potilailla esiintyy menetys AR ilmaisun, oletettavasti kautta AR promoottori metylaatio [10]. Lisäksi tutkimukset kasvain näytteet CRPC potilaat ovat paljastaneet useita mekanismit kasvainsolujen aktivoida AR signalointi,
esim
AR vahvistus tai mutaatio, muutokset ilmaus osallistuvien entsyymien steroidogeneesiä, ja intracrine androgeenituotanto [11 ] – [25]. Huolimatta kliinistä hyötyä sekä ensimmäisen ja toisen linjan hormonihoidoissa, yleisimmin käytetty antiandrogeenit, kuten bikalutamidi, on alhainen AR affiniteetti [26]. Nämä havainnot ovat johtaneet etsittäessä uusia molekyylejä, joilla on korkeampi AR-affiniteetin lisäämiseksi kliinistä tehokkuutta.
Tämä prekliinisen Tutkimuksessa tarkasteltiin aktiivisuuden ja vaikutusmekanismeja uusien pienten orgaanisten molekyylien pystyvät toimimaan androgeenireseptorin antagonisteina LNCaP-soluissa, jotka sisältävät mutaation kodonissa 877 AR-ligandia sitova domeeni [27], ja eri solulinjoissa tyypillinen CRPC olosuhteissa.
Materiaalit ja menetelmät
Lääkkeet ja Chemicals
Pure (
R
) -bicalutamide (aktiivinen enantiomeeri steroideihin antiandrogeeni, Casodex®) ja yhdisteet (
S
) -11 ja (
R
) -9 oli suoraviivaisesti syntetisoitiin erittäin diastereoselektiivisiä menetelmiä (patenttihakemus no. WO2010 /116342A2 ja ei. WO2010 /092546A1 [28]), lähtien (D) -omenahappoa, (D) -phenylglicine ja (D) -fenyylialaniinia, vastaavasti. (
S
) -11 ja (
R
) -9 liuotettiin asetonin ja etanolin (10 mM), vastaavasti, kun taas synteettinen androgeenireseptorin metyylitrienolonia R1881 (CHEMOS-GmbH, Regenstauf, Saksa ) liuotettiin DMSO: hon (35,2 mM) ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Casodex® ostettiin Sigma-Aldrich (Milano, Italia).
Constructs
cDNA, joka koodaa villityypin Har oli pSG5 [29]. 3416 rakenne, joka sisältää neljä kopiota villityypin SLP-HRE2 (59-TGGTCAgccAGTTCT-39), kloonattiin Nhel in pTKTATA-Luc [30].
Solulinjat ja Culture
ihmisen eturauhassyöpä solulinjat LNCaP ja Vcap saatiin American Tissue Culture Collection (Rockville, MD, USA). LNCaP-AR solulinja, joka on johdettu LNCaP ja valmistettu vakaasti ilmentämään korkeita AR, luovutti ystävällisesti Dr. Charles L. Sawyersilta (Howard Hughes Medical Institute tutkija Memorial Sloan Kettering Cancer Centerissä New Yorkissa, USA). The (
R) B -bicalutamide kestävä jatkokloonin LNCaP-soluja (LNCaP-Rbic) eristettiin laboratoriossamme viljelemällä LNCaP emosolulinjassa 50 viikon ajan 20 uM (
R
) – bikalutamidia.
Vcap-soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (Mascia Brunelli SpA, Milano, Italia). LNCaP ja LNCaP-AR-soluja ylläpidettiin RPMI 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 1% glutamiinia (Mascia Brunelli S.p.A., Milano, Italia). LNCaP-Rbic soluja ylläpidettiin samalla tavalla täydennetty (
R
) -bicalutamide. Ellei toisin mainita, soluja käytettiin eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa, kaikissa kokeissa. Cos 7-soluja kasvatettiin DME täydennetty fenolipunaista, 5% vasikan sikiön seerumia (FCS), insuliinia (6 ng /ml), L-glutamiinia (2 mM), penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 U /ml) ja hydrokortisonia (3,75 ng /ml). Solut tehtiin lepotilassa käyttämällä fenolipunaista DMEM ja dekstraani puuhiilikäsitelty vasikan seerumia. Kaikki nämä menettelyt on kuvattu aiemmin [31] – [33].
Transfektio, tumaansiirtymiseen ja transaktivointimääritys
AR translokaatioanalyysin (Fig. S5), Cos-7-soluissa 70 % konfluenssiin transfektoitiin 1 ug: lla puhdistettua plasmidi-käyttäen Superfect reagenssia (Qiagen, Hilden, Saksa). Sitten solut tehdään lepotilassa ja vasemmalle stimuloimattomia tai stimuloitu 10 nM R1881: n 60 min puuttuessa tai läsnä tutkimuksen yhdisteitä. Sillä transaktivointimäärityksen (Fig. S4), Cos-7-solut maljattiin 70% konfluenssiin fenolipunaista DME, joka sisältää 5% hiilellä erotettua seerumia. 48 tunnin kuluttua solut transfektoitiin Superfect 0,8 ug 3416-PTK-TATA-Luc, yksin tai 0,2 ug pSG5-Har-ilmentävien plasmidin. 18 tunnin jälkeen, transfektoituja soluja stimuloitiin 10 nM R1881: n (liuotettu 0,001% etanolia, lopullinen konsentraatio) 24 tuntia poissa tai läsnä on ilmoitettua yhdisteitä. Ohjaus soluja käsiteltiin pelkästään vehikkelillä. Solulysaatit valmistettiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen Luciferase Assay (Promega). Tulokset korjattiin käyttämällä CH110-ilmaistuna-galaktosidaasin aktiivisuus.
AR-ligandin sitoutuminen tilavuus Studies in LNCaP Solut
LNCaP-soluja ylläpidettiin, kuten aiemmin on raportoitu [32], ja tehdään lepotilassa käyttämällä fenolipunaista keskipitkän ja dekstraani hiilellä erotettua seerumia [32]. Solujen 70% konfluenssiin inkuboitiin lisäämällä 10 nM [3H] R1881: n (98 Ci /mmol; Perkin Elmer) ja väliaineen puuttuessa tai läsnä osoitetun ylimäärä radio-reagoimattomat yhdisteet. Sen jälkeen 4 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä ja otettiin talteen kaapimalla varovasti kylmähuoneessa käyttäen 600 ui jääkylmää PBS: ää, joka sisälsi 0,05% EDTA: a (w /v). Määrä solujen alikvootti 100 ui laskettiin. Alikvootti (200 ui) solususpensiota toimitettiin kahtena kappaleena louhinta solunsisäisten radioaktiivisuus käyttäen 500 ui jääkylmää etanolia (100%) 1 tunti [33]. 24 tunnin jälkeen 37 ° C: ssa, laskettiin radioaktiivisuus nestetuikelaskurilla. Epäspesifinen sitoutuminen [3H] R1881: n määritettiin erillisissä kuopissa lisäämällä ilmoitettu ylimäärä leimaamatonta R1881 inkubointielatusaineeseen.
In vitro Kemosensitiivisyys määritys
sulforodamiini B (SRB) määritystä käytettiin mukaisesti menetelmän mukaan Skehan et ai. [34]. Lyhyesti, solut kerättiin trypsinoimalla, lasketaan ja maljataan tiheydellä 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaisille, tasapohjaisille mikrotiitterilevyille (100 ui solususpensiota /kuoppa). Kokeita ajettiin octuplicate ja jokainen koe toistettiin kolme kertaa. Optinen tiheys soluja määritettiin aallonpituudella 490 nm kolorimetrisellä levylukijalla. Annosvastekäyrät luotu Exceltaulukkolaskentaohjelmaan ja 50% estävä pitoisuus (IC
50) arvot määritettiin graafisesti tontteja.
Quantitative Reaaliaikainen PCR
Solun kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Minikit (Qiagen). Yksi mikrogramma RNA: ta käänteiskopioitiin cDNA käyttäen iScript (BioRad, Hercules, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen MyiQ Single Color Real-Time PCR Detection System (BioRad) ja SYBR Green I värjätä kemiaa. Stabiilisti ilmaistu endogeenisen β2-mikroglobuliinin monistettiin kontrollina laadun ja määrän tulo RNA. Alukkeet mRNA vahvistusta GAPDH, eteenpäin 5′-CGCTACTCTCTCTTTCTGGC-3 ’, käänteinen 5′-AGACACATAGCAATTCAGAAT-3’; HPRT eteenpäin 5’AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG -3 ’, käänteinen 5’GTCTGGCTTATATCCAACATTCG -3’; PSA eteenpäin 5’GCAGCATTGAACCAGAGGAG -3 ’, käänteinen 5’CCATGACGTGATACCTTGA -3’) suunniteltiin käyttäen Beacon Designer Software (Version 7.2, BioRad). Reaaliaikainen PCR suoritettiin kolmena kappaleena reaktioita lopulliseen tilavuuteen 25 ml, joka sisältää 50 ng cDNA-templaattia, SYBR Green Mix, ja 200 nM eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita. Näytteitä pidettiin 95 ° C: ssa 10 minuuttia ja 30 sekuntia, jota seurasi 40 monistussykliä 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan, ja sitten 60 ° C: ssa 30 sekuntia, GAPDH, HPRT ja PSA. Tuote spesifisyys kontrolloitiin sulamispisteanalyysillä. Monistuksen tehokkuus, joka ei koskaan vaihdella 5% eri kokeissa, käytettiin määrittämään suhteellinen ilmentyminen mRNA saadaan käyttämällä Gene Expression Macro Software (Version 1.1) (BioRad). MRNA: n määrä normalisoitiin endogeenisen viittaus geenien GAPDH ja HPRT ja ilmaistaan n-kertaisesti tasolle suhteessa hoitamattomiin näytteitä.
Reaaliaikainen RT-PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja vaihtelukerroin ( CV), laskettuna kolmen Ct-arvoja, oli aina 1,5%. Toistettavuus suhteellinen mRNA: n ilmentymisen laskettiin tulokset kahdesta kokeesta, joissa menettely suoritettiin eri retrotransskription tuotteita peräisin samasta mRNA: sta näytteestä. CV oli aina 10%.
määritys PSA tasot
PSA ELISA kit toimittama Abnova (Taiwan Corporation, Taiwan) käytettiin mukaan valmistajan ohjeiden. Pitoisuus PSA mitattiin spektrofotometrisesti 450 nm: viljelyalustassa.
BrdU
Kun
in vivo
leimaamisen 100gM BrdU (Sigma), lepotilassa olevat solut peitinlaseil- vahvistettu ja läpäiseviksi. BrdU analysoitiin immunofluoresenssilla käyttäen laimennettua (1:50 PBS: ssä) hiiren monoklonaalinen anti-BrdU-vasta-ainetta (klooni BU-1, GE Healthcare), kuten aikaisemmin on raportoitu [35]. Hiiren vasta-aineen havaittiin käyttäen laimennettiin (1:200 PBS: ssä) Texas red-konjugoitua vuohen anti-hiiri -vasta-aine (Jackson Laboratories).
Immunofluoresenssianalyysi
Solut coverslip kiinnitettiin ja permeabilisoitiin [36 ]. Villityypin Har ektooppisesti ilmaistaan Cos-7-soluissa visualisoitiin [37] käyttäen kaniinin polyklonaalista anti-C19-vasta-ainetta (Santa Cruz). Primaarisen vasta-aineen havaittiin käyttäen laimennettiin (1:100 PBS: ssä) Texas red-konjugoitua vuohen anti-kani-vasta-aine (Jackson Laboratories). Peitelaseja lopuksi Hoechstilla 33258, ylösalaisin ja asennettu Mowiol (Calbiochem). Fields analysoitiin DMBL Leica (Leica Microsystems S.r.l, Milano, Italia) fluoresenssimikroskoopilla käyttäen HCXPL Apo 63 × öljy tavoite. Kuvat otettiin käyttäen DC480 kameraa (Leica) ja hankitut FW4000 (Leica) -ohjelmalla [36], [37].
lysaatit ja Western Blot analyysi
Solulysaatit (2 mg /ml proteiinikonsentraatio) valmistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [32]. Sykliini D1, P27 ja CDK4 havaittiin käyttäen sopivia vasta-aineita [38]. AR havaittiin, käyttäen kanin polyklonaalista anti-AR-vasta-aineita (C-19, Santa Cruz), kuten on raportoitu [36] Immuunijärjestelmän kanssa reagoivat proteiinit paljastettiin käyttäen ECL-detektointijärjestelmällä (GE Healthcare).
In vivo
Kokeet
Five kuuden viikon ikäisiä, koiraspuolisia SCID CB-17 /IcrHanHsd-Prkdcscid hiiret hankittiin Harlan Laboratories (Correzzana, Italia). Kuusi-8-viikon ikäisiä CD-1 nude (nu /nu) hiiret hankittiin Charles River Laboratories (Calco, Italia). Kaikki eläinkokeet suoritettiin Animal Facility (Safu) Regina Elena National Cancer Institute Roomassa. Tuolloin, jossa kokeet suoritettiin, ei ollut aktiivinen eettinen komitea eläinten Tutkimus Regina Elena National Cancer Institute. Kuitenkin Animal Facility instituutissa oli saanut täyden valtuutuksen suorittaa in vivo kokeita Italian terveysministeriön, joka hyväksyi myös tässä tutkimuksessa. Kaikki toimenpiteet, joissa eläimiä ja niiden hoito tehtiin mukaisesti vakiintuneiden ohjeiden, jotka noudattavat kansallista (DL nro 116, GU, Suppl. 40, helmikuu 213 18, 1992; kiertokirjeessäkään nro 8, GU, heinäkuu 1994) ja kansainvälisten lakien (ETY neuvoston direktiivi 86/609, OJ L 358 1, 12 joulukuu 1987, opas hoito ja käyttö Laboratory Animals, Yhdysvaltojen National Research Council, 1996). Eläimet lopetettiin eettisistä syistä niskavenytyksellä kun kasvaimet saavuttivat keskimäärin 3,0 g paino tai kun niistä tuli kuolemaisillaan havaintojakson aikana.
(
R
) -9 toksikologisiin kokeisiin , terveitä hiiriä käsiteltiin oraalisesti päivittäin letkulla 10, 25, 50 ja 100 mg /kg (
R
) -bicalutamide tai (
R
) -9 28 peräkkäisen päivän ajan. Syövänvastaisen aktiivisuuden kannalta kokeissa, hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti kyljen kanssa Vcap, LNCaP ja LNCaP-RBic eturauhasen syöpäsolujen 10
6 solua /hiiri 100 ul: ssa liuosta, joka koostuu 50% Matrigel ja 50% seerumia. Noin 1 kuukausi (kun kasvain massa 5-150 mg näkyi) hiiriä satunnaistettiin, jaettu ryhmiin ja käsittely aloitettiin. Hiiriä käsiteltiin suun kautta päivittäin letkulla varten.
4 peräkkäisen viikon ajan (
R
) -bicalutamide, (
R
) -9 tai Casodex® 10 mg /kg . Yhdisteet liuotettiin 80% PEG-400: n ja 20% Tween-80. Verrokkihiiret vehikkeliä saman hoitojakson aikana. Viisi hiirtä kutakin ryhmää arvioitiin. Tuumorin koko mitattiin kolme kertaa viikossa kaksi ulottuvuutta, jonka paksuus ja tuumorin paino laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: a × b
2/2, jossa a ja b ovat pitkiä ja lyhyitä halkaisija kasvaimen, vastaavasti.
Antitumor tehoa hoitojen arvioitiin seuraavia loppupisteet:% TWI, prosenttia kasvaimen paino esto; (B) kasvaimen kasvun viivästyminen, arvioitiin T-C, jossa T ja C ovat mediaani kertaa käsiteltyjen ja kontrolli kasvaimia, vastaavasti, voivat saavuttaa saman koon (
ts.
1000 mg); c) vakauttaminen, regressio tai täydellinen vaste evinced mukaan palpability.
Ethics lausunto
Kaikki toimenpiteet, joissa käytetään eläimiä ja niiden hoito tehtiin mukaisesti vakiintuneiden ohjeiden, jotka noudattavat kansallista (DL nro . 116, GU, Suppl. 40, helmikuu 213 18, 1992; kiertokirjeessäkään nro 8, GU, heinäkuu 1994) ja kansainvälisten lakien (ETY neuvoston direktiivi 86/609, OJ L 358 1, 12 joulukuu 1987; opas Care ja käyttö Laboratory Animals, Yhdysvaltojen National Research Council, 1996).
tilastollinen analyysi
analysoimiseksi PSA proteiinimääritysmenetelmällä, eroja todetut arvot erilaisten käsittelyjen jälkeen analysoitiin Opiskelijan t-testi parittomia havaintoja.
P
arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Analysointiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR kokeissa yksisuuntainen ANOVA Dunnettin post testi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism versio 4.00 Windowsille (GraphPad Software, San Diego Kalifornia USA). Saadut tiedot BrdU, ARE-luc reportterigeenin ja tumaansiirtymiseen määritykset analysoitiin pariksi
t-testi
.
P
arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Sillä
in vivo
kokeissa Studentin t-testiä (parittomia, kaksihäntäinen) käytettiin vertaamaan keskiarvoista (Software Primer Biostatistiikka, McGraw-Hill, New York, NY, USA). Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun
P
0,05.
Tulokset
Yhdiste Structure
Työmme keskittyy potentiaalisten lyijy yhdisteistä Uudentyyppiset selektiiviset androgeenireseptorin modulaattorit (SARM), syntetisoitiin innovatiivinen ja erittäin diastereoselektiivisiä menetelmiä, edelleen prekliinisen ja kliinisen kehityksen. Antagonistinen ja agonistinen toiminta noin 30 erilaista ei-steroidi, synteettinen AR ligandien kautta rakenteen ja tehokkuuden suhteen tutkimus on jo kuvattu [28]. Erityisesti olemme arvioineet
in vitro
antituumorivaikutuksen kaksi uutta bikalutamidin kaltaisia propanamidi molekyylit, (
S
) -11 ja (
R
) -9, ( kuva 1A). Niiden kemialliset rakenteet poikkeavat että bikalutamidi läsnä ollessa typpiatomin sijasta hydroksyyliryhmä keskeinen hiiliatomi, ja substituentti kiraalisessa stereokeskuk-,
esim
. bentsyyliryhmä ja fenyyliryhmä, vastaavasti. Lisäksi, (
S
) -11 on tunnusomaista, että läsnä on hydantoiini osan, mikä edelleen vaikuttaa sen steerisen esteen.
(A) kemiallinen rakenne ja molekyylipaino (Mw) (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 ja (
R
) -9. (B) AR ligandin sitoutumisen syrjäyttämisen analyysi LNCaP. Lepotilassa LNCaP-soluja inkuboitiin 10 nM [3H] R1881: n puuttuessa tai läsnä ollessa ilmoitettu ylimäärä (0,5 uM 4 uM) radio reagoimattomat yhdisteet. Solunsisäinen radioaktiivisuus määritettiin. Inset paneelissa B esitetään AR sitoutumiskohdat määritettiin 10
3 soluja inkuboitiin 10 nM [3H] R1881 (R1881 *) ilman tai läsnä on ilmoitettua ylimäärä leimaamatonta (
R
) -9, (
S
) -11 tai (
R
) -bicalutamide (
R
) -bic. Tiedot kolmesta eri kokeissa kerättiin ja jäljellä sitova laskettiin ja ilmaistiin% kaikista AR sitoutumiskohdista.
n
= kokeiden lukumäärästä. Tilastollinen merkitys tulosten arvioitiin myös pariksi
t
testi ja P-arvot 0,005 pidettiin merkittävinä. Ei ole merkitystä johtui ero jäljellä välinen sitoutuminen soluja inkuboidaan 10 nM [3H] R1881: n läsnä ollessa (
S
) -11 tai (
R
) -9 ja ne inkuboitiin 10 nM [3H] R1881: n läsnä ollessa (
R
) -bicalutamide ((
R
) -bic). LNCaP-soluja inkuboitiin myös 10 nM [3H] R1881: n puuttuessa tai läsnä oli 100-kertainen ylimäärä (1 uM) leimaamatonta R1881 tai Casodex®. Jäljellä sitovia oli 13% ja 14% leimaamatonta R1881 tai Casodex®, vastaavasti.
Sidonta tilavuus Studies
Ensin arvioitiin kyky (
S
) -11 ja (
R
) -9 nimenomaan syrjäyttää ligandin sitovaa aktiivisuutta AR kokonaan LNCaP. Tätä varten lepotilassa olevat solut inkuboitiin 10 nM [3H] R1881: n puuttuessa tai läsnä osoitetun ylimäärä radio-reagoimattomat yhdisteet. Solut tehtiin lepotilassa käsittelemällä seerumin kanssa dekstraani-hiilellä poistaa vapaa steroideja ja sitten kerättiin kaapimalla varovasti säilyttää sitovan kalvon AR voidakseen harkita sitä osana sitovia tuloksia. Tulokset eri itsenäisestä kokeesta analysoitiin, paljastaen että molemmat (
S
) -11 ja (
R
) -9 yhdisteitä syrjäyttänyt [3H] R1881 sitoutuminen noin 45% ja 80%, kun käytetään 0,5pM ja 1 uM (kuvio. 1B ja upotus). Lähes koko [3H] R1881 siirtymä havaittu, kun kutakin yhdistettä käytettiin 2 uM tai 4 uM (Fig. 1 B ja upotus). Samanlaiset tulokset havaittiin käyttämällä leimaamatonta R1881 tai Casodex® (Fig. 1B selite) tai sitoutumisen syrjäyttämisen analyysi suoritettiin Cos-soluissa ektooppisesti ilmentäviä Har (tuloksia ei ole esitetty). Antiandrogeeninen (
R
) -bicalutamide olennaisesti käyttäytyi kuin (
S
) -11 ja (
R
) -9, vaikka se oli hieman tehokkaampi kuin (
S
) -11 ja (
R
) -9 in syrjäyttäminen AR ligandia sitova käytettynä pieninä pitoisuuksina (0,5 tai 1 uM). Tilastollisesti näkökulmasta (Fig. 1 B legenda), nämä erot näkyvät merkityksetön. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että (
S
) -11 ja (
R
) -9 yhdisteet sitoutuvat AR.
Sytotoksisuus in vitro
sitten arvioitiin
in vitro
sytotoksinen aktiivisuus (
R
) -9 ja (
S
) -11 paneelissa eturauhassyövän solulinjoissa eri vaiheissa hormonin reagointikykyä ja edustaja eri patologisia piirteitä ihmisen eturauhassyövän (Fig. 2).
Sytotoksinen aktiivisuus (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11and (
R
) -9 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa LNCaP, LNCaP-Rbic, LNCaP-AR ja VCAP jälkeen 144 tunnin altistus mitattuna SRB-määrityksellä (keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta). Pitoisuudet (uM) (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 ja (
R
) -9 aiheuttaa 50%: n lasku solujen eloonjäämistä (IC
50) on esitetty oikealla käyrien.
Solut altistettiin skalaari lääkeaineen pitoisuuksina 0,02 20 um 144 tuntia. (
R
) -bicalutamide ei näkynyt annosvaikutuskuvaajia että resistenttien LNCaP-Rbic solulinja tai VCAP soluissa kätkeminen korkeita villityypin AR. Vaikka heikko annos-vaikutus suuntaus havaittiin solulinjoissa luonnollisesti ilmentävät AR (LNCaP) tai solujen muokattu yli-ilmentävät reseptorin (LNCaP-AR), IC
50 (2 uM) havaittiin vain LNCaP-solulinjassa (kuvio . 2).
(
S
) -11 osoittivat vaatimaton aktiivisuutta ollenkaan, mutta korkein pitoisuus (20 uM), jossa havaitsimme vaatimattoman sytotoksinen vaikutus VCAP soluissa (Fig. 2 ). Muissa solulinjoissa voimakas sytosidinen vaikutus havaittiin IC
50-arvot vaihtelevat 11,2 uM 13 uM. (
R
) -9 tuotettu vaikutus samanlainen kuin (
S
) -11 vain LNCaP-Rbic mutta aiheutti annokseen liittyvää ja voimakas sytotoksinen vaikutus muita solulinjoja, luonnollisesti tai keinotekoisesti ilmentävät AR, aina päästä IC
50-arvot, vaikka VCAP soluissa (6 pM).
vaikutus Hormonaaliset Stimulus
Tutkimme myös sekaantumista antiandrogeeneinä on vaikutus R1881 aiemmin hoitamattomilla LNCaP ja johdannainen LNCaP-AR linjat, jälkimmäinen muokata ilmentämään korkeampia villityypin AR ((Fig. 3A). Pitkäaikainen R1881 10 nM kasvanutta solujen eturauhasen syövän linjojen noin 1,5- 2.5-kertainen. samanaikainen altistuminen solujen R1881 ja (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 tai (
R
) -9 72 tuntia tukahdutti kasvu ärsyke antama synteettinen androgen. erityisesti (
R
) -9 osoittautunut tehokkaimmaksi inhiboimaan hormonaalista proliferatiivisen stimulaatiota alkaen 5 uM. Lisäksi odotetusti, merkittävä lisäys (
P
0,01) PSA-pitoisuudet ovat havaittiin kasvatusalustaa LNCaP (43%) ja LNCaP-AR (62%) solujen jälkeen 48 tunnin altistus 10 nM synteettiset androgeenien R1881 (Fig. S1). Sen sijaan kaikki antiandrogeeni yhdisteitä käytetään pitoisuuksina, jotka ovat 20 uM inhiboi PSA eritystä viljelyalustaan molempien solulinjojen. Erityisesti sekä (
R
) -9 ja (
S
) -11 alensi PSA-pitoisuudet ovat merkittävästi korkeampia (
P
0,01) kuin joka tuotti by (
R
) -bicalutamide (
P
0,01).
(A) arviointi SRB-määritys antitumor acitivity skalaari pitoisuuksia (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 tai (
R
) -9 hormoni-reagoiva LNCaP ja AR yli-ilmentyvä LNCaP-AR-solut, kun läsnä on tai ei ole synteettisen androgeenin, R1881: n (10 nM). Pylväät edustavat keskiarvoa kahdesta toisistaan riippumattomasta kokeesta. (B), (C) arviointi mRNA PSA-geenin jälkeen 24 tunnin altistuminen eri pitoisuus (
S
) -11 (C) tai (
R
) –
9
(D) läsnä ollessa tai ilman R1881 (pisteet ovat keskiarvo kahdesta riippumattomasta kokeesta *
P
0,05).
Tutkimme myös varhainen modulaatio AR transkriptionaalisen aktiivisuuden aiheuttaman kaksi uutta molekyylien valotusaika ja pitoisuudet eivät kykene indusoimaan massiivinen solun tappaminen.
merkittävä lisäys PSA-mRNA-tasojen havaittiin (
P
0,005). Saadut näyttävät osoittavan, että (
R
) -9 pieninä pitoisuuksina on tehokkaampaa kuin (
S
) -11 estossa transkriptionaalista aktiivisuutta AR.
vaikutus BrdU
arvioitiin vaikutuksen molempien yhdisteiden androgeenin indusoiman DNA synteesiä LNCaP kolmessa eri kokeessa. (
R
) -9 (Fig. 4A) ja (
S
) -11 (Fig. 4B) esti merkittävästi BrdU stimuloidaan 10 nM R1881 hoitoon LNCaP tehty lepotilassa käyttäen fenoli red-elatusaineella ja dekstraani hiili-käsiteltyä seerumia. Inhibitorinen vaikutus oli samanlainen tai jopa voimakkaampi kuin saadaan käyttämällä samaa pitoisuusalueella (10-20 uM) Casodex (Fig. 4 A ja B) tai (
R
) -bicalutamide (taulukko 1). (
R
) -9 (
S
) -11 jälleen inhiboi merkittävästi BrdU stimuloitiin 10 nM R1881: n hoitoon LNCaP-AR, jotka oli tehty lepotilassa, kuten on kuvattu edellä LNCaP (Fig. S2).
A ja B, lepotilassa LNCaP-solut peitinlaseil- jätettiin käsittelemättä (kontrolli) tai käsiteltiin 18 tunnin ajan synteettisen androgeenin R1881 (10 nM) puuttuessa tai läsnä on ilmoitettua antagonistien (käytetty 10 tai 20 uM). Sen jälkeen
in vivo
sykkii 100 uM BrdU, BrdU analysoitiin immunofluoresenssilla ja ilmaistiin% kaikista ytimeksi. A ja B, numerot yläosassa kunkin bar edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen (
n = 3
), jossa keskihajonta (SD) 1. Tilastollinen merkitys tulosten A ja B avulla on arvioitu pariksi
t
testiä.
P
arvot olivat 0,005 stimuloitu 10 nM R1881. Kuva.