Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sinkki sormi proteiini 217 (ZNF217) on välttämätön solujen lisääntymisen ja on tuumorigeneesiin. Kuitenkin sen ilme ja tarkka rooleja peräsuolen syöpä (CRC) jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että ZNF217 ilmentyminen poikkeuksellisesti yläreguloituja CRC kudoksissa ja liittyy huono eloonjäämisaste CRC potilaista. Lisäksi olemme havainneet, että ZNF217 oli otaksuttu tavoite mikroRNA (MIR) -203 käyttämällä bioinformatiikan analyysi ja vahvisti, että käyttämällä lusiferaasireportterilla määritystä. Lisäksi in vitro knockdovvn ZNF217 tai panna täytäntöön ilmentymisen miR-203 heikennetty CRC solujen lisääntymistä, invaasiota ja muuttoliike. Lisäksi yhdistetty hoito ZNF217 siRNA ja miR-203 osoitti synergistisiä inhiboivia vaikutuksia. Yhdessä meidän tulokset tarjoavat uusia todisteita, jotka ZNF217 on onkogeenisessä rooli CRC ja säätelee miR-203, ja avata mahdollisuuden ZNF217- ja miR-203-täsmähoitoihin CRC.

Citation: Li Z, Du L, Dong Z, Yang Y, Zhang X, Wang L, et al. (2015) MiR-203 vaimentaa ZNF217 säätelyyn ylöspäin peräsuolen syövän ja sen onkogeenisyydelle. PLoS ONE 10 (1): e0116170. doi: 10,1371 /journal.pone.0116170

Academic Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 25 syyskuu 2014; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2014; Julkaistu 26. tammikuuta 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: hanke tukee China National Natural Science Foundation projektit (Grant nro 81072406, 81271916, 31270971 ja 81301506), Research Fund Tohtorikoulutuskeskus of Higher Education of China ( Grant No. 20120131110055), ja Shandongin maakunnassa Natural Science Foundation (Grant nro ZR2010HZ004). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi ja kolmanneksi yleisin pahanlaatuinen kasvain naisilla ja miehillä vastaavasti maailmanlaajuisesti yli 1,2 miljoonaa uutta tapausta ja arviolta 608700 kuolemista pelkästään vuonna 2008 [1]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet diagnosointiin ja hoitoon CRC, yleinen ennuste CRC potilaille on edelleen heikko [2]. Siksi on kiireesti tarpeen kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja CRC. Tämän saavuttamiseksi syvempää ymmärrystä molekyyli- ja geneettiset verkot, jotka ohjaavat taudin alkamisen ja etenemisen CRC on välttämätöntä.

ZNF217 geeni on onkogeeni vastikään kloonattu 20

th. Se etsii kromosomissa 20q13.2 ja koodaa Kruppel kaltainen transkriptiotekijä sinkkisormi proteiinin perhe [3]. ZNF217 proteiini sisältää 8 ennustettu Kruppel-like C2H2 sinkkisormen motiiveja ja runsaasti proliinia sisältävän alueen [4]. Yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että jäsenet Zinc finger-proteiinin perheen tärkeä rooli kehitettäessä erilaisia ​​syöpiä [5]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että kopioiden lukumäärä kasvoi kromosomin 20q13.2 liittyy etäpesäkkeitä CRC [6] ja ZNF217 ylössäädellään paksusuolen syövän mitattuna laser- talteenotto microdis osassa ja multiplex kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: [7].

MikroRNA (miRNA) ovat ei-koodaus, 18-24 nukleotidiä pitkiä, yksijuosteisia RNA: ita, joilla on kyky säädellä negatiivisesti liittyvien geenien ekspressiota useissa solun prosesseja, mukaan lukien solujen proliferaatio, apoptoosin, muuttoliike, invaasio, ja stressin vastaus [8, 9, 10, 11, 12]. On osoitettu, että epänormaali kuviot miRNA ilmaisun esiintyy monissa ihmisen karsinoomia [13] ja jotka liittyvät synnyssä, eteneminen, ja luonnollinen historia useiden syöpien [11, 14]. Kehittyvät tiedot viittaavat siihen, että miRNA voivat toimia onkogeenien tai kasvainten synnyssä ja kriittisiä rooleja syövän kehityksen [15]. Eräs tutkimus esittää todisteita, jotka ZNFs säädellään transkription jälkeisellä tasolla rintasyövän miR-181a, joka suoraan kohdistuu koodausalueissa ZNFs [4].

Tässä tutkimuksessa käyttämällä bioinformatiikan algoritmeja ja lusiferaasireportterilla määritys olemme havainneet, että ZNF217 on tavoite miR-203, tuumorisuppressori miRNA. Tutkia mahdollisuuksia roolit ZNF217 uutena ennustetekijöitä biomarkkeri CRC ja sen sääntelyä miR-203 miRNA CRC kudoksissa ja pariksi normaali peräsuolen kudoksiin, suoritimme in vitro kokeissa ja vahvistivat, että 1) ZNF217 voivat edistää lisääntymistä, invaasiota ja migraatio CRC solulinjoja ja 2) ZNF217 sekä sen vaikutuksia CRC solulinjat vaimentua by miR-203, toivoen edelleen selvittämiseksi mekanismi CRC kehitystä ja tarjoavat uusia havaintoja kohdennettua hoitoa CRC.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

yhteensä 82 CRC potilaista, joille tehtiin kirurginen resektio kasvainten CRC heinäkuun 2004 ja maaliskuun 2009 Department of General Surgery, Qilu sairaalan Shandong University, Jinan, Kiina, rekrytoitiin tätä tutkimusta varten. Kaikkien potilaiden tiedot saatiin kliinisistä ja patologisten kirjaa, kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, erilaistuminen, sijainti, invaasion syvyyteen ja etäpesäke, sekä kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) vaihe. Leikkauksen patologisen lavastus kutakin aihetta määräytyy 7. painos Unionin International Cancer valvonta (UICC) kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) lavastus järjestelmä CRC. Resektoitua kasvain kudosten ja pariksi viereisen ei-syöpä kudoksiin (vähintään 5 cm: n päässä kasvain marginaali) otettiin heti talteen, pakastettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Ei potilaat saivat kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Tutkimus hyväksyttiin eettisen komitean Qilu sairaalan, Shandongin yliopistossa ja kirjoittanut tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta osallistuneista potilaista.

immunohistokemia värjäystä ja arviointia varten ZNF217

immunohistokemia (IHC) käytettiin havaita ZNF217 ilmentyminen parafinoidut CRC kudoksiin. Parafinoidut HCC kudokset leikattiin kuin 5 um: n leikkeitä paistettiin 65 ° C: ssa 2 h, ja parafiini poistettiin käyttäen standardimenetelmiä. Sen jälkeen, kun antigeeni haku ja pesun Tris-puskurilla, ZNF217 primaarista vasta-ainetta (Biosynthesis Biotechnology CO, LTD, Beijing China) levitettiin objektilaseille ja ilmentyminen ZNF217 tarkasteli inkuboimalla peroksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani-vasta-ainetta (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing , Kiina) seuraten valmistajan ohjeita.

ZNF217 värjäytyminen arvioitiin valomikroskoopilla kaksi riippumatonta tutkijat, jotka olivat tietoisia kliinisiin tuloksiin. Värjäys pidetään positiivisena ZNF217 kun voimakas korrelaatio näkyi sytoplasmassa. Kudokset pisteytettiin semi-kvantitatiivisesti laskemalla positiivinen solulima 10 erillistä kenttien 400 X suurennoksella alueilla tihein positiivisten sytoplasmaan. Sopiva cutoff pisteet saatiin käyttäen analyysiä vastaanotin toimii (ROC) käyrät piirrettiin ottamalla prosenttiosuus tulokset kasvaimen tai viereisten ei-kasvainkudoksessa kuin riippumattomia muuttujia. Lukemat lähimpänä sekä maksimi herkkyys ja spesifisyys, [eli piste (0.0,1.0) käyrällä] valittiin cut-off pisteet. Näytteet, joiden värjäys pisteet yli tai alle cutoff pisteet luokiteltiin positiivinen tai negatiivinen, vastaavasti.

Soluviljely ja transfektio

CRC solulinjoja (HT-29, SW480 ja SW620) ja ihmisen alkiomunuais (HEK) 293T solulinjaa ostettiin Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina), ja HCT116 solulinja hankittiin Shanghai Institute Biokemian ja Cell Biology (Kiina). Kaikki solulinjat viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Hyaline, UT), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa inkubaattorissa, jota oli täydennetty 5% CO

2.

transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa. Lopullinen pitoisuus 50 nM miRNA, 100 nM (siRNA) ja niiden negatiivisia kontrolleja käytettiin kutakin transfektiota.

ennustaminen ehdokas miRNA ja lusiferaasireportterista määritys

Kaksi yleisintä ja web -pohjainen bioinformatiikan algoritmeja (TargetScan ja micrornaorg) käytettiin ennustamaan ehdokas miRNA kohdistaminen nukleotidisekvenssin 3′-transloimaton alue (UTR) ja ZNF217 mRNA. Voit tarkistaa niiden tehokkuus, lusiferaasireport- määritys suoritettiin käyttäen pmiR-REPORTTM vektorit (RiboBio, Guangzhou, Kiina), joka sisälsi villityypin (WT) -ZNF217 3′-sekvenssin, tai mutantti (MUT) – ZNF217 3′-sekvenssin, . HEK293T solut lyhytaikaisesti kotransfektoitiin miR-203 jäljittelee /miR-negatiivinen kontrolli ja WT-ZNF217 3′-UTR vektori /MUT ZNF217 3′-UTR. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasianalyysissä Kit (Promega, Madison, WI) 48 h transfektion jälkeen mukaan valmistajan ohjeiden.

Reaaliaikainen RT-PCR ja Western blot

Yhteensä RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Kaikki käsittelyt RNA tehtiin alle RNaasittomalla olosuhteissa. RNA-pitoisuus mitattiin käyttämällä BioPhotometer plus (Eppendorf, Hampuri, Saksa), 260 nm: ssä, ja eristettyjä RNA säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Analysointiin ZNF217 mRNA: n ekspression. Yhteensä 1 ug RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen SuperScript-kittiä (Toyobo, Osaka, Japani) ja qRT-PCR-analyysit suoritettiin käyttämällä SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japani) ja ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems , Foster City, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. ZNF217 mRNA taso normalisoitiin P-aktiini ja taitekohdan muutokset ZNF217 mRNA ilmaisu kvantitoitiin käyttäen 2

-ΔΔCT suhteellinen kvantitointimenetelmä. Alukkeet, joita käytetään RT-qPCR on ZNF217 olivat eteenpäin, 5′-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3 ’ja Reverse, 5′-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3’. Kaikki edellä alukkeet olivat BioSune, Shanghai, Kiina.

miR-203 ilmaisua, cDNA syntetisoitiin käyttäen geeniä alukkeita (Ribobio, Guangzhou, Kiina) ja M-MLV RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 20 ul reaktioseosta. RT-reaktio reagenssien sisälsi 1 ug RNA: ta templaattina, 1 ui 10 mM dNTP-seosta, 2 ui 0,1 M DTT, 4 ui 5 x ensimmäisen juosteen puskuria, ja 1 ui 40 U /ul RNaasi-inhibiittoria. Tilavuus säädettiin RNA-vapaa H2O. Käänteisen transkription Reaktio suoritettiin kolmena kappaleena poistaa mahdolliset poikkeavat. MiR-203 ilmentyminen arvioitiin käyttäen qRT-PCR ja ABI PRISM 7500 Sequence Detection System kertaiseksi muutoksia miRNA ilmentyminen määritettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmä; ekspressio normalisoida pieni nukleaarinen U6-RNA ilmentymisen tasolla. Alukkeet, joita käytetään RT-qPCR MIR-203 olivat miR-203 eteenpäin 5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA-3 ’, U6 eteenpäin 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′ ja yleinen käänteinen aluke 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 ’.

Yhteensä proteiinit uutetaan viljellyistä soluista käyttäen RIPA puskuria, joka sisälsi PMSF ja kvantifioidaan BCA proteiinia iinianalyysikitissä (Beyotime, Haimen, Kiina). Yhteensä 30 ug proteiineja, altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Blokkauksen jälkeen kalvo inkuboitiin hiiren anti-ZNF217 monoklonaalinen vasta-aine (Abcam, Southampton, UK) tai hiiren anti-β-aktiini monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), jonka jälkeen inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Signaalit määritettiin kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Soluproliferaatiomääritys

Solujen lisääntyminen mitattiin metyyli-thiazolyltetrazolium (MTT). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

3 /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen viljeltiin 24, 48, 72, 96 ja 120 h, soluja inkuboitiin 20 ui MTT: tä (5 mg /ml) 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Muodostuneet kiteet solut haihtuvat inkuboimalla 150 ui dimetyylisulfoksidia 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja kvantifioidaan mittaamalla optinen tiheys 490 nm: ssä käyttäen entsyymi-immunologinen määritys (TECAN, Sveitsi).

Solun invaasio ja migraatiokokeessa

invasiivisia ja vaeltavia potentiaalit soluista arvioitiin käyttäen siirtokuoppaan inserttejä huokoset 8 pm (Corning). Sillä invaasiomääritys, 24 h transfektion jälkeen, 3,0 x 10

5-solut seerumivapaassa väliaineessa lisättiin ylempään insertin esipäällystetty matrigeeliä matriisi. 500 ui 10% FBS: ia, lisättiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu 48 h, ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä pinnalta transwell kalvon vanupuikolla, ja tunkeutuu soluihin alemman kalvon pinta kiinnitettiin metanolissa, värjättiin 0,1% kristallivioletilla, valokuvataan, ja laskettiin . Solujen migraation määritys suoritettiin käyttäen samankaltaisia ​​menetelmiä, paitsi että 2 x 10

5-soluja lisättiin ei-päällystetty insertit. Solut kuudella satunnaisessa kentät 200 X suurennos kunkin insertin laskettiin. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

Tilastolliset analyysit

t-testiä käytettiin analysoimaan eroja ZNF217 ilmaisun välillä kasvain ja normaaleissa kudoksissa. Korrelaatioita ZNF217 ilmaisun ja kliinis-analysoitiin parametrisen testi: U-testi kahden ryhmän välillä ja Kruskal-Wallisin testi kolme tai useampia ryhmiä. Χ2 ja Fisherin suoritettiin määrittämään assosiaatioita ZNF217 ilmaisun ja kliinis parametrit. Kokonaiselossaoloaika käyrä laskettiin Kaplan-Meier menetelmä ja selviytymisen erot potilasalaryhmissä vertailtiin log-rank-testi. Coxin monimuuttuja-analyysi suoritettiin arvioida itsenäisen ennustetekijöiden hengissä ennustamiseen. Korrelaatio ZNF217 ja miR-203 määritettiin Pearsonin korrelaatio analyysi. Tilastolliset analyysit ja kuvaajien tehtiin SPSS versio 17.0, Microsoft Excel ja GraphPad Prism-ohjelmiston. P 0,05 pidettiin merkittävä ero.

Tulokset

ZNF217 ilmentyminen korreloi kliinis-CRC

IHC analyysi 82 ​​tapauksia CRC ja niiden vastaavat noncancerous kudosten osoitti, että positiivinen värjäys ZNF217 nähtiin sytoplasmaan CRC-solujen ja vastaavat ei-syöpä limakalvon solut (Fig. 1A). Keskimääräinen prosenttiosuudet värjättyjen solujen positiivisia ZNF217 syöpäsoluissa ja vastaavat ei-syöpä limakalvon olivat 76,3% ja 38,9%, vastaavasti. Vertaamalla positiivisten solujen prosenttiosuuden, se määritettiin, että ZNF217 ilmentyminen kolorektaalikarsinoomasta oli tilastollisesti korkeampi kuin viereisen ei-syöpä limakalvon (P 0,001; Fig. 1 B).

(A-vasen ) sytoplasmaan värjäys ZNF217 CRC soluissa. (A-oikea) puute ZNF217 ilmentymisen normaaleissa paksusuolen epiteelisoluissa. (B) osuus on positiivisesti värjäytyneiden solujen syöpä ja viereisten normaaleissa kudoksissa (* P 0,05, ** 0,01). (C) Kaplan-Meier analyysi kokonaiselinaika CRC potilaiden mukaan ZNF217 ekspressiotason. ZNF217 positiivinen ryhmä (n = 55) osoitti huomattavasti lyhyempi selviytymisen verrattuna negatiiviseen ryhmään (n = 27; P = 0,0405 log-rank-testi).

Korrelaatio analyysi paljasti, että ZNF217 ilmaisua positiivisesti korreloivat kasvaimen koko, syvyys hyökkäystä, ja imusolmuke, (P 0,05), mutta ei potilaan iän, sukupuolen, histologian luokalla ja etäispesäkkeitä (P 0,05, taulukko 1). Lisäksi Kaplan-Meier testi osoitti, että potilailla, joilla on positiivinen ZNF217 värjäytyminen oli lyhyempi selviytymisen kuin ne, joilla on negatiivinen ZNF217 värjäytymistä (P = 0,028; Kuva. 1 C).

vähentäminen ZNF217 ilmaisun tukahduttaa CRC solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invaasio

mittaamiseksi biologisista ominaisuuksista ZNF217 CRC soluissa, testasimme leviämisen ja liikkuvuusluokka CRC solujen edellyttäen siRNA-välitteisen knockdovvn ZNF217 geenin. Ensin tutkimme ekspressiotason ZNF217 paneelissa CRC solulinjojen, kuten HCT-116, HT-29, SW620 ja SW480. Tulokset osoittivat, että ZNF217 ilmentymistaso oli korkein SW480-soluissa ja vähiten HT29 kaikkien testattujen solulinjojen (Fig. 2A). Tämän perusteella ekspressiokuviota, siksi chosed SW480 lisätutkimuksiin. Me ohimenevästi moduloitu ZNF217 ilmaisun transfektoimalla siRNA SW480-soluissa ja havainneet, että siRNA-välitteinen ZNF217 hiljentäminen laski soluproliferaatiota (Fig. 2B) ja heikentynyt solumigraation ja invaasiota kykyjä (Kuva. 2C). Yhdessä meidän havainnot osoittivat, että ZNF217 voisi edistää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion CRC soluja.

(B) vähentäminen ZNF217 ilmaisun transfektoimalla siRNA-ZNF217 esti merkittävästi proliferaatiota (* P 0,05) ja (C ) muuttoliike ja invaasion SW480-soluja (200-kertainen suurennus, * P 0,05) verrattuna vanhempien ja negatiivisia kontrolleja.

ZNF217 olivat suoraan kohteena miR-203

käyttäminen online-miRNA tavoite ennustuksen tietokantoja (microrna.org ja Targetscan), olemme havainneet, että ZNF217 oli mahdollinen kohde miR-203 (Fig. 3A). Voit tarkistaa tämän havainnon, rakensimme lusiferaasi toimittajat WT ja Mut 3′-UTR ZNF217 ja suorittaa lusiferaasin aktiivisuuden määritys in HEK293T soluissa. Tulokset osoittivat, että transfektio miR-203 jäljittelee inhiboi merkittävästi ekspressiota WT, mutta ei MUT 3′-UTR ZNF217 in HEK293T-soluissa (kuvio. 3B). Yhdenmukaisesti näiden tulosten, transfektio miR-203 jäljittelee vähentynyt endogeenisen ilmentymisen ZNF217 sekä mRNA: ta ja proteiinia tasot SW480-soluissa (kuvio. 3C ja 3D). Lisäksi analysoidun paneelissa 30 CRC potilaita, havaitsimme käänteinen korrelaatio ZNF217 ja miR-203 ilmentymisen CRC kudoksissa ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa (kuvio. 4E, r = 0,792, P 0,01; Fig. 3E). Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että miR-203 säätelee negatiivisesti ZNF217 ilmentymisen kautta suoraan kohdistettu sen 3′-UTR-sekvenssin.

(A): n oletettu miR-203 sitovia sekvenssejä ZNF217 3′-UTR. (B) Lusiferaasiaktiivisuutta määritys suoritettiin varten HEK293T solut kotransfektoitiin pmiR-REPORTTM vektoreita sisältäviä WT-ZNF217 3′-UTR tai MUT-ZNF217 3′-UTR-sekvenssit ja miR-203 jäljittelee. Tulokset on esitetty normalisoitu kertainen muutos lusiferaasiaktiivisuus. (C, D) ZNF217 mRNA: ta ja proteiinia, määritettiin SW480-soluissa, jotka on transfektoitu miR-203 jäljittelee tai miR-negatiivinen kontrolli, jonka qRT-PCR: llä ja Western blot, vastaavasti. (E) käänteinen korrelaatio ZNF217 mRNA ilmaisun ja miR-203 pitoisuuksia CRC kudoksissa analysoitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatio analyysi.

(A) ektooppinen ilmentyminen miR-203 transfektoimalla miR-203 matkii vähensi leviämisen SW480-solujen, verrattuna vanhempien ja negatiiviset kontrollit (* P 0,05). (C) ektooppinen ilmentyminen miR-203 varsinkin esti Solujen migraation ja invaasion SW480-soluja (200-kertainen suurennus, * P 0,05). Kääntäen, esto miR-203 ilmentymistä transfektoimalla miR-203 estäjät samanaikaisesti (B) edistää lisääntymistä (* P 0,05) ja (D) maahanmuutto ja invaasion SW480-solujen, verrattuna vanhempien ja negatiiviset kontrollit (200-kertainen suurennus, * P 0,05). Kuvio on edustava 3 kokeen samanlaisin tuloksin.

vaikutus miR-203 CRC solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion

Validoida onko miR-203 voi säädellä CRC soluproliferaatiota teimme proliferaatiomäärityksessä in SW480-soluissa, jotka on transfektoitu miR-203 jäljittelee tai sen negatiivinen kontrolli, ja havaitsivat, että lisääntynyt ilmentyminen miR-203 esti merkittävästi proliferaatiota, (Fig. 4A), liikkuvuuteen (Fig. 4B), sekä invaasio of SW480-solujen. Kääntäen, downregulation miR-203-inhibiittorit-transfektoiduissa SW480-solujen nähtävästi edistänyt leviämisen, liikkuvuuteen ja invaasion SW480-soluissa (kuvio. 4C).

yli-ilmentyminen miR-203 osittain vahvistaa ZNF217 aiheuttaman lisääntymisen, migraation ja invaasion CRC solujen

lähemmin ZNF217 välittämien geenisesta vaikutuksia säätelevät miR-203, me kotransfektoidaan SW480-solujen ZNF217 siRNA yhdistettynä miR-203 jäljittelee. Havaitsimme synergistisiä inhiboivia vaikutuksia ZNF217 ilmentymisen (Fig. 5A), sekä lisääntymistä, (kuvio. 5B), muuttoliikkeen ja invaasiota (Fig. 5c) SW480-solujen kotransfektoitiin ZNF217 siRNA ja miR-203 jäljittelee verrattuna SW480-solut transfektoitiin joko ZNF217 siRNA tai miR-203 jäljittelee yksin. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että toiminnot ZNF217 kuin voimakas onkogeeni säädellään miR-203.

(A) tehokas poistaminen ZNF217 proteiinin ekspression ZNF217 siRNA ja miR-203 jäljittelee vastaavasti ja toisiinsa yhdistettyinä. Huomaa, että ZNF217 ilmentymistä tehokkaammin tukahdutti yhdistelmähoito. Suppressio ZNF217 samanaikaisesti johti (B) merkittävät solun kasvun estämistä ja (C) maahanmuutto ja invaasiota (200-kertainen suurennus) ja SW480-solujen verrattuna negatiivisiin kontrolleihin. Huomaa synergistinen estävää vaikutusta yhdistelmän ZNF217 siRNA ja miR-203 jäljittelee verrattuna toinen niistä yksin (* P 0,05).

Keskustelu

ZNF217 on äskettäin tunnistettu jäsen sinkkisormi- proteiinin perheen. Se lähinnä toimii transkription säätelytekijänä joihin sääntelyssä kasvaimen esiintyminen ja kehittämiseen [16]. ZNF217 hallussaan useita erilaisia ​​rakennedomeeneja joista kahdeksan C2H2 sinkkisormi DNA-sitovat motiivit sekä runsaasti proliinia (16-20%) domain sijaitsee tähteissä 757-1,005. Prolinerich domeenien on osoitettu toimivan transkription aktivaattoreita monissa geenejä, kuten CTF /NF-1 [3]. ZNF217 geeni on tutkittu laajasti rintasyövän [4, 17], munasarjasyöpä [18, 19, 20], ruokatorven okasolusyöpä [21], mahasyöpä [22, 23, 24], ja eturauhassyöpä [25, 26] , mutta ei CRC. Lisäksi lisääntynyt kopiomäärä kromosomi 20q13.2 on todettu liittyvän etäpesäke CRC. Näin ollen on erityisen kannattavana tutkia sen mahdollisuuksia roolit CRC kehittämiseen.

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että ZNF217 ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tasoilla oli merkitsevästi korkeampi peräsuolen kasvain kudosten kuin sen Hyväksytty ei- kasvain kudosten ja sen yliekspressio liittyi pahanlaatuinen kliinis-ja lyhyt selviytymisen CRC potilaiden, mikä osoittaa, että ZNF217 toimii onkogeenin CRC.

Useimmat syöpäpotilaat ovat kuolleet johtuvien komplikaatioiden etäpesäke. Siksi kohdistaminen metastaattisen sairaudet on keskeinen syöpälääkkeen strategiaa. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että sinkkisormen proteiineja, on kriittisiä rooleja prosessien kasvaimen invaasion ja metastaasin lukien ZNF217 voidaan säädellä erilaisia ​​geenejä [27, 28]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että knockdovvn ZNF217 siRNA vähentänyt leviämisen, invaasion ja migraatio CRC soluissa in vitro. Nämä tulokset paljastavat onkogeenisiä ominaisuuksia ZNF217 CRC. Itse asiassa se on raportoitu, että kasvainsolut HO-8910, LNCaP ja DU145 [26] sekä rintasyövän kudoksia [4] rakentavasti ilmaista korkea ZNF217. Krig ym raportoitu että mis-sääntely E-kadheriinin ja vielä tuntemattomia ZNF217 kohdegeenien [29] voisi selittää muutoksia solujen immortalisaatioon, apoptoosin, resistenssin kemoterapia-aineiden, ja Akt fosfory- soluissa korkean ilmentymistason ZNF217 . Vaikka satoja geenejä ovat mahdollisia kohteita ZNF217 ja konsensus sitoutumiskohdat on ehdotettu, erityiset säätelevien geenien ZNF217 ilmentyminen on vähän tunnettu.

koottua todisteet osoittavat, että poikkeava ekspressio miRNA liittyy kehittämiseen CRC [ ,,,0],30, 31, 32]. Kehittyneet tietokonepohjainen lähestymistapojen miRNA tunnistamista ja kohde ennustaminen sekä validointi tekniikoita vahvistaa nämä ennustukset ovat vaikuttaneet suuresti löytämään uusia miRNA ja niiden toiminnallinen luonnehdinta. Niinpä pienimolekyylisiä välittämää häiriöstä miRNA syntyy mahdollisen uuden terapeuttinen lähestymistapa ihmisen sairauksia kuten syöpää [33]. Niistä ihmisen syöpään liittyvien miRNA, miR-203 on herättänyt paljon huomiota, koska se ilmentyy poikkeavasti erilaisia ​​syöpiä. Tutkimuksessamme havaitsimme, että miR-203 oli selvästi alassäädetty ihmisen CRC ja palauttaminen miR-203 ilmaisu voi estää proliferaatiota, invaasion ja migraatio SW480-solujen. Päinvastoin, transfektointi miR-203 estäjä stimuloi lisääntymistä, invaasiota ja migraatio SW480-solujen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-203 on mukana etäpesäke prosessit CRC ja ovat yhtä mieltä edellisen tutkimukset osoittavat, että miR-203 ilmaistiin pienemmillä kuin normaalilla tasolla joidenkin syöpien [34, 35, 36, 37]. Kuitenkin miR-203 on raportoitu kohdistamaan onkogeenin toiminto munuaisten ja virtsarakon syövät [38] ja haiman adenokarsinooma [39]. Eroavuudet miR-203 toimintoja eri syöpätyyppien voi heijastaa eroja solujen yhteydessä tai vaihtoehtoisesti kohdistettuja geenejä.

Nykyinen tutkimus tarjoaa useita rivejä todisteita siitä, että ZNF217 on uusi kohde miR-203 ja niiden antagonistinen vuorovaikutus on tärkeä rooli kehitettäessä CRC. Ensinnäkin lusiferaasireportterigeenin määritys osoitti, että lusiferaasiaktiivisuus valvonnassa ja ZNF217 3’UTR voitaisiin säädellä miR-203. Toiseksi, käänteinen korrelaatio ZNF217 ja miR-203 tasot havaittiin CRC kudoksissa. Kolmanneksi yliekspressio miR-203 tukahdutetaan ZNF217 tasoja ja vähentänyt solujen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja hyökkäyksen CRC solulinjoissa.

Yhteenvetona tässä tutkimuksessa osoitimme, että ZNF217 usein yliaktiivista CRC ja mahdollinen onkogeeni CRC kehittämiseen. Samalla meidän tutkimus kuvattu ZNF217 /miR-203 linkkiä ja tarjosi potentiaalinen mekanismi ZNF217 säätelyhäiriötä ja panos CRC soluinvaasiota. Nämä havainnot avaavat mahdollisuuden soveltaa miR-203 kohti kliinisen CRC hoitoja.

Kiitokset

Kirjoittajat ovat kiitollisia Shao-Feng Yan (Neurokirurgian, Qilu sairaala, Shandong University, Jinan , Kiina) tarjoamiseksi siRNA-ZNF217 kirjoittajat myös kiittää Chao Wang hänen teknistä ohjausta Shandong Hospital.