Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme aiemmin osoittaneet, että stroomasolulinja eristetyn hyytymistekijä-1 (SDF-1, CXCL12) /CXCR4-systeemi liittyy perustamiseen etäpesäkkeiden suun syöpä. Äskettäin pienet ei koodaavat RNA: t, MikroRNA (miRNA) on osoitettu olevan mukana metastaattisen prosessin useita erilaisia ​​syöpiä. Kuitenkin miRNA jotka edistävät etäpesäkkeitä aiheuttama SDF-1 /CXCR4 järjestelmä suusyövän ovat suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa selvitimme etäpesäke liittyviä miRNA aiheuttama SDF-1 /CXCR4 järjestelmän avulla B88-SDF-1 suun syöpäsoluja, joilla on toiminnallinen CXCR4 ja etäinen metastaattinen potentiaali

in vivo

. Kautta miRNA mikrosiruanalyysi tunnistimme ylössäätelyyn miR-518c-5p in B88-SDF-1-soluissa, ja vahvisti induktio reaaliaikaisella PCR-analyysillä. Vaikka LNA-pohjainen miR-518c-5p-inhibiittori ei vaikuttanut solujen kasvuun B88-SDF-1-soluissa, se ei merkitsevästi estä kulkeutumista soluihin. Seuraavaksi me transfektoimme miR-518c ekspressiovektori vanhempien B88 soluihin ja CAL27 suun syöpäsolujen ja eristetty vakaa transfektantit, B88-518c ja CAL27-518c soluja, tässä järjestyksessä. Ankkurointi riippuvia ja riippumattaman kasvua miR-518c transfektantit oli merkittävästi parannettu verrattuna kasvua mock soluja. Lisäksi olemme havainneet parannetun näiden solujen vaeltamiseen. LNA-pohjainen miR-518c-5p estäjä merkittävästi heikentynyt tehostetun solujen kasvua ja migraatio miR-518c transfektantit, mikä osoittaa, että nämä ilmiöt olivat lähinnä riippuvaisia ​​ilmaus miR-518c-5p. Seuraavaksi tutkimme funktio miR-518c-5p

in vivo

. miR-518c transfektanttien tai mock transfektantit ympättiin nokka lihakseen tai verisuonten nude-hiirten. Kasvaimen tilavuus, imusolmukkeiden etäpesäke, ja keuhkometastaasitestissä lisääntyivät merkitsevästi hiirillä ympätty miR-518c transfektantit. Nämä tulokset osoittivat, että miR-518c-5p säätelee kasvua ja etäpesäkkeiden suusyövästä alavirran kohde SDF-1 /CXCR4 järjestelmä.

Citation: Kinouchi M, Uchida D, Kuribayashi N Tamatani T, Nagai H, Miyamoto Y (2014) osallistuminen miR-518c-5p kasvun ja metastaasin in Oral Cancer. PLoS ONE 9 (12): e115936. doi: 10,1371 /journal.pone.0115936

Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 elokuu 2014; Hyväksytty: 02 joulukuu 2014; Julkaistu: 23 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Kinouchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B, 25293411 ja C, 26463046, http: //www. jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aiemmin osoittaneet, että B88-solut, jotka ovat suun kautta syöpäsoluja, jotka ilmentävät kemokiinireseptoria CXCR4, erityisesti etäpesäkkeitä kaulan imusolmukkeet kautta stroomasolujen johdettu tekijä (SDF) -1 gradientti tuotetaan imusuonten strooman [ ,,,0],1] – [3]. Pakko ilmentyminen SDF-1 B88-soluissa (nimeltään B88-SDF-1-solut) Siirretään parannettu soluliikkuvuus ja keuhkojen etäpesäkkeiden laskimonsisäisen rokotus [4]. Viime aikoina olemme myös osoittaneet, että CXCR4 lauseke myötävaikuttaa metastaattisen potentiaalin sylkirauhasten syövät [5]. Lisäksi olemme myös osoittaneet, että esto CXCR4 1,1 ’- [1,4-fenyleenibis (metyleeni)] bis-1,4,8,11-tetra octahydrochloride (AMD3100), joka on CXCR4-antagonisti, voi olla voimakas anti -metastatic hoito CXCR4 liittyvän pään ja kaulan alueen syöpä [5], [6].

Vaikka SDF-1 /CXCR4 järjestelmä lähinnä toimii kemotaktinen tekijä syöpäsolujen siemeniin metastaasien, viimeaikaiset tutkimukset osoittivat että tämä järjestelmä säätelee myös kasvaimen kasvua, syöpä solujen kasvaimen mikroympäris- vuorovaikutuksen ja angiogeneesin [7] – [10]. Itse asiassa luoda etäpesäkkeitä, useita tärkeitä prosesseja, kuten invaasio, intravasation, ekstravasaatio ja kohdunulkoinen kasvupotentiaalia, ovat välttämättömiä. Näin ollen, on tärkeää tutkia funktio on alavirrassa oleva kohde (t), joka vastaa prosessia etäpesäke SDF-1 /CXCR4-järjestelmä. MikroRNA (miRNA) ovat pieniä sääntely ei-koodaavat RNA: t, jotka sitoutuvat tiettyyn kohde-mRNA: iden, jotka johtavat translaation tukahduttamisen [11]. miRNA osallistuvat säätelyyn biologisia prosesseja, kuten solun kasvussa, erilaistumista ja apoptoosia, sekä fysiologiset olosuhteet ja taudin aikana, kuten syövän [11]. Viimeaikaiset todisteet ovat osoittaneet, että miRNA keskeisessä asemassa ovat etäpesäkkeisessä prosessissa useita erilaisia ​​syöpiä [11]. Kuitenkin miRNA jotka edistävät etäpesäkkeitä aiheuttama SDF-1 /CXCR4 järjestelmä suusyövän ovat suurelta osin tuntemattomia. Näin ollen tässä tutkimuksessa tutkimme tavoite miRNA säätelee SDF-1 /CXCR4 järjestelmä B88-SDF-1 soluissa käyttäen miRNA mikrosiruja ja tutkitaan niiden toiminnallinen rooli etäpesäkkeitä suun syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

hiiret käsitellään suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Animal tutkimuskomitea, Tokushima Yliopisto (Luvan numero: 11111). Lyhyesti, kaikki hiiret sijoitettiin häkkeihin patogeenivapaissa kunnossa, sai ruokaa ja vettä mielin määrin, ja ylläpidetään 12 tunnin valo /pimeä sykli asianmukaisella lämpötilaohjattu huoneen. Kaikki kirurgia ja eutanasia tehtiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. B88-solut [1], [12] alun perin perustettiin potilaalta, jolla kielen syövän 1988. eettinen komitea Tokushiman yliopistollisen sairaalan luopua tarvetta suostumuksen käytöstä tässä solulinjassa (Luvan numero: 453).

miRNA mikrosiruanalyysi

Pieni RNA miRNA mikrosiruanalyysi uutettiin seerumia B88-mock-solut ja B88-SDF-1-soluissa. MiRNA mikrosiru suoritettiin ja analysoitiin Toray (Tokio, Japani) käyttämällä ihmisen 3D-Gene Array (V16.1.0.0). Microarray raakadataa talletettiin Gene Expression Omnibus (GEO, http: //www.ncbi.nlm.nih.-gov/geo) mukaan vähintään tietoa microarray kokeilu (MIAME) ohjeet. Hakunumerolla on GSE59323.

Solut ja soluviljelmä

Suun syöpäsolut olivat vapaat mykoplasman ja bakteerikontaminantteja. CAL27 solut ovat suun syöpäsolut, jotka oli saatu American Type Culture Collection (Rockville, MD). B88-solujen erittäin etäpesäkkeitä kaulan imusolmukkeet, kun solut ympätään nokka lihaksen nude-hiirten, mutta harvoin etäpesäkkeitä keuhkoihin laskimoon inokulaation [1], [4]. Sen sijaan, CAL27 solut harvoin etäpesäkkeitä kaulan imusolmukkeet tai keuhkoihin, kun solut ympätään nokka lihakseen tai häntäsuoneen nude-hiirten, vastaavasti (julkaisematon havainto). Soluja pidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) täydennettynä 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä kosteutetussa ilmakehässä 95% ilmaa ja 5% CO2, 37 ° C: ssa.

hiiret ja

in vivo

tutkimuksessa

BALB /c-nude-hiiriä ostettiin CLEA Japan (Osaka, Japani). Hiiriä pidettiin alle patogeenivapaissa olosuhteissa. Kokeet aloitettiin, kun hiiret olivat 8 viikkoa ikäisiä ja suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [1], [4]. Lyhyesti, solut ortotooppisesti siirrostettiin puremalihakset nude-hiirten (2 x 10

6) tai ympättiin verisuoniin nude-hiirten (1 x 10

6); nämä hiiret tapettiin päivänä 35. Kasvaimen tilavuus arvioitiin mittaamalla kasvaimen koko ja seuraavaa kaavaa käyttäen: kasvaimen tilavuus = 1/2 x L x W

2, jossa L ja W edustavat suurin halkaisija ja pienin halkaisija, vastaavasti. Läsnäolon tai puuttumisen imusolmukkeiden ja etäispesäkkeitä vahvistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla.

Transfektio

Solut (5 x 10

5 solua /malja) siirrostettiin 100 mm: n viljelymaljoille astiat (Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) DMEM täydennetty 10% FCS. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut transfektoitiin 5 ug: lla HSA-miR-518c ekspressiovektorin tai kontrollivektorilla (Origene, Rockville, MD), käyttäen Lipofectamine LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA) lopullisessa konsentraatiossa 50 pM. Soluja inkuboitiin 24 tuntia DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FCS: ää (V /V) ja myöhemmin trypsinoitiin ja ympättiin (1:05 ​​suhde) 100 mm: n viljelymaljoilla DMEM, joka sisälsi 10% FCS: ää (V /V). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut pantiin selektiivisessä alustassa, joka sisälsi genetisiiniä (700 ug /ml G418: aa, Life Technologies). Kun valinta on G418 2 viikkoa, kaikki pesäkkeet kerättiin ja seuraavat stabiilit transfektantit eristettiin: B88-518c, B88-mock2, CAL27-518c, ja CAL27-mock-solut.

Kvantitatiivinen RT-PCR

24 tunnin kuluttua, RNA eristettiin logaritmisesti kasvavista solujen TRIzol reagenssilla (Life Technologies) mukaan valmistajan ohjeiden. Käänteiskopiointi suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA RT Kit (Life Technologies) tai miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Kvantitatiivinen PCR, miR-518c-5p ja RNU6B miRNA havaittiin käyttäen TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies) tai miScript Primer Assay (Qiagen). Gene yleiskäyttöön mitattiin jatkuvasti ABI StepOnePlus Real-Time PCR System aikana 40 PCR-sykliä. Joissakin kokeissa solut transfektoitiin kanssa tai ilman 50 nM miRCURY LNA microRNA estäjä (Exiqon, Vedbaek, Tanska) käyttäen Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies).

MTT-määritystä

Solut ympättiin 96-kuoppalevylle (Falcon, Becton Dickinson Labware) 5 x 10

3 solua kuoppaa kohti DMEM, joka sisälsi 10% FCS. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, solut transfektoitiin kanssa tai ilman 50 nM miRCURY LNA microRNA-inhibiittoriin, käyttäen Lipofectamine RNAiMax. Kun oli kulunut 24 tai 48 h, solujen lukumäärä kvantifioitiin määrityksellä käyttäen MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia; Sigma].

In vitro

solussa migraatiokokeessa

in vitro

kulkeutumista soluihin arvioitiin käyttämällä siirtoaltaat (Corning, NY), kuten aiemmin on kuvattu [1]. Solut kytketty huokosten tai solut on kiinnitetty alapintaan kalvon laskettiin 10 kenttää suurella teholla näkymä (x 400), jonka kolmasosa henkilö sokkona hoito-olosuhteissa. Joissakin kokeissa 50 nM miRCURY LNA microRNA estäjä transfektoitiin ennen kuin solut ympättiin ylempään kammioon.

Haavan määrityksessä

24 h kuluttua solujen ymppäämisen, lineaarinen haava synnytettiin konfluenttien yksisolukerrosten raaputtamalla pipetin kärjen. Irrallinen solut pestiin pois sekoittaen. Solut valokuvattiin samalla pisteessä verkkoon 48 tuntia myöhemmin. Kukin solulinja päällystetty ja haavoittui kolme kertaa.

Sferoidiviljelmiä muodostumisen määritys

Solut ympättiin 96-kuoppalevylle (NanoCulture kilpi; SCIVAX Life Sciences, Woburn, MA) 1 x 10

3 solua per kuoppa DMEM: ssä, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua FCS: ää. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, fenotyyppi solujen havaittiin faasikontrastimikroskoopissa (x 300).

Tilastollinen

Merkittävät erot välineet eri ryhmien arvioitiin StatView 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA) käyttäen yksisuuntaista ANOVA merkitys asetettu p 0,05.

tulokset

eristäminen miR-518c-5p, joka indusoi SDF- 1 /CXCR4 järjestelmä

Tutkimme miRNA alavirtaan SDF-1 /CXCR4 järjestelmän avulla suusyövän solulinja, B88-SDF-1, joka on autokriini SDF-1 /CXCR4 järjestelmän ja näytteille etäinen metastaattinen potentiaali

in vivo

[4]. Microarray-analyysi paljasti, että useita miRNA ilmentyivät tai vaimentua in B88-SDF-1-soluissa verrattuna vale-soluja (tietoja ei esitetty). Vahvista spesifisyyden mikrosiruanalyysi, Mirna ilmentyminen vahvistettiin kvantitatiivisen RT-PCR. Samanlainen microarray tuloksiin, miR-518c-5p (aiemmalta nimeltään miR-518c *) ilmentyminen yläreguloituja B88-SDF-1-soluissa verrattuna mock soluihin (Fig. 1A). Lisäksi tämä säätelyä oli täysin kumottu transfektion miR-518c-5p LNA estäjä (Fig. 1A). Olemme myös saaneet samanlaisia ​​tuloksia vanhempien B88 solut stimuloidaan SDF-1 (Fig. 1 B).

(A) ilmentyminen miR-518c-5p vahvistettiin B88-mock ja B88-SDF-1 solut reaaliaikaisella PCR: llä. Vaimennussäätely miR-518c-5p in B88-SDF-1-solujen käsittelyn jälkeen miR-518c-5p LNA inhibiittori vahvistettiin myös. Määr .: ole havaittavissa. (B) ekspressio miR-518c-5p vahvistettiin vanhempien B88 soluissa hoidon jälkeen tai ilman SDF-1 reaaliaikaisella PCR: llä.

vaikutus miR-518c-5p estoa solussa kasvua ja SDF-1 /CXCR4-riippuvaisen solumigraation

Aiemmin olemme huomanneet, että kumpikaan paracrine eikä autokriininen SDF-1 /CXCR4-järjestelmä vaikuttaa kiinnittymisestä riippuvaisen kasvun B88-solujen [1], [4] . Olemme tutkineet vaikutusta miR-518c-5p solun kasvuun käyttämällä tiettyä miR-518c-5p LNA estäjä. Inhibiittori ei vaikuttanut kasvua joko B88-mock tai B88-SDF-1-solut (Fig. 2A). Me tutkimme seuraavaksi vaikutuksen miR-518c-5p on SDF-1 /CXCR4-riippuvainen kulkeutumista soluihin. Migration kammion määritykset paljastivat, että parannettu motiliteettia B88-SDF-1-soluissa oli merkittävästi heikentynyt käsittelyn jälkeen miR-518c-5p LNA estäjä (Fig. 2B).

(A) kasvu B88-mock solut (vasen puoli) ja B88-SDF-1-soluissa (oikea puoli), kun läsnä on joko ohjaus- LNA estäjää tai miR-518c-5p LNA estäjä tutkittiin käyttäen MTT-määritystä. Ei ollut merkittäviä eroja kolmen ryhmän yksisuuntaisella ANOVA. (B) motiliteettia B88-SDF-1-soluissa, kun läsnä on joko ohjaus- LNA estäjää tai miR-518c-5p LNA estäjä tutkittiin käyttämällä Transwell migraatiokokeessa. Yhteensä 2 x 10

4 solut trans- ennen Alkukiteiden kammiossa. **;

p

0,01 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin tai ohjaus LNA estäjä käsiteltyjä soluja yksisuuntaisella ANOVA.

vaikutus miR-518c-5p ilmentymisen vaikutus solujen kasvuun

Seuraavaksi suoritetaan vahvistuksen toiminnon määrityksen yli-ilmentävät miR-518c-5p vanhempien B88-soluissa ja myös vanhempien CAL27 soluja, joissa ilmentyminen CXCR4 ja miR-518c-5p ei ollut havaittavissa. Transfektion jälkeen tyhjän vektorin tai miR-518c ekspressiovektoriin, keräsimme kaikki G418 resistenttien kloonien välttää klonaalisen heterogeenisuus solujen ja vahvistetaan seuraavat transfektantit, B88-mock2, B88-518c, CAL27-mock ja CAL27-518c. Havaitsimme ylössäätelyyn miR-518c-5p MIR-518c transfektanttien verrattuna mock-solut, jotka inhiboivat täysin käsittelemällä miR-518c-5p LNA estäjä (Fig. 3A, B). Ankkuroinnista riippuvaisten kasvupotentiaalia sekä B88-518c ja CAL27-518c soluissa merkittävästi parannettu verrattuna ja mock-solut (Fig. 3C, D), jotka estivät merkittävästi käsittelemällä miR-518c-5p LNA estäjä (Fig. 3E, F). Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus miR-518c yli-ilmentyminen on kiinnittymisestä riippumatonta solujen kasvua. B88-mock2 solut muodostivat pyöreä ja tiukka solu- soluadheesiota pallosia (Fig. 3G), kun taas B88-518c solut muodostivat puskaradio kaltainen pallosia (Fig. 3 H). Sitä vastoin sekä CAL27 transfektantit muodostettu pyöreä pallosia (Fig. 3I, J), mutta suuremmat sferoidit havaittiin CAL27-518c soluissa (kuvio. 3J).

B88-solujen ja CAL27 solut transfektoitiin stabiilisti ohjaus vektori tai miR-518c ekspressiovektoriin, ja B88-mock2 tai B88-518c soluja ja CAL27-mock tai CAL27-518c solut eristettiin, vastaavasti. (A, B) ekspressio miR-518c-5p että B88-transfektanteilla (A) ja CAL27-transfektantit (B) arvioitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Vaimennussäätely miR-518c-5p in B88-518c soluissa tai CAL27-518c solujen käsittelyn jälkeen miR-518c-5p LNA inhibiittori vahvistettiin myös. (C, D) ankkurointi-riippuvainen kasvu B88-transfektanttien (C) ja CAL27-transfektanttien (D) arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. *;

p

0,05, **;

p

0,01 verrattuna mock soluihin yksisuuntaisella ANOVA. (E, F) kasvu B88-transfektanttien (E) ja CAL27-transfektanttien (F), kun läsnä on joko ohjaus- LNA estäjää tai miR-518c-5p LNA estäjä tutkittiin käyttäen MTT-määritystä. *;

p

0,05, **;

p

0,01 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin tai ohjaus LNA estäjä käsiteltyjä soluja yksisuuntaisella ANOVA. (GJ) Anchorage riippumaton kasvu B88-mock2 (G), B88-518c (H), CAL27-mock (I) tai CAL27-518c (J) arvioitiin käyttäen nano-kulttuuri levy.

vaikutus miR-518c-5p ilmentymisen vaikutus solujen vaeltamiseen

B88-518c solujen hankki merkittävän kemokineettiset vastaus (Fig. 4A) ja tehostetun solun liikkuvuus (Fig. 4B). Olemme myös havainneet parannetun maahanmuuton CAL27-518c soluissa (Kuva. 4C). Tehostetun solun motiliteettia B88-518c solujen oli merkittävästi heikentynyt käsittelyn jälkeen miR-518c-5p LNA estäjä (Fig. 4D).

(A) B88-mock2 tai B88-518c soluja viljeltiin yhtymäkohta. Haava paranemista määritys suoritettiin. *;

p

0,05 verrattuna mock soluihin yksisuuntaisella ANOVA. (B, C) motiliteettia B88-518c soluja (B) tai CAL27-518c solut (C) arvioitiin käyttämällä Transwell migraatiokokeessa. Kukin transfektanttia ympättiin tiheydellä 1 x 10

4. **;

p

0,01 verrattuna mock soluihin yksisuuntaisella ANOVA. (D) motiliteettia B88-transfektanttien läsnä ollessa joko ohjaus- LNA estäjää tai miR-518c-5p LNA inhibiittori tutkittiin myös käyttämällä Transwell migraatiokokeessa. **;

p

0,01 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin tai ohjaus LNA estäjä käsiteltyjä soluja yksisuuntaisella ANOVA.

rooli miR-518c-5p kasvuun ja etäpesäkkeiden

in vivo

vieressä arvioitiin vaikutusta miR-518c-5p kasvuun ja etäpesäkkeiden in vivo. B88 ja CAL27 transfektantit ortotooppisesti siirrostettiin puremalihakset nude-hiirten [1]. Koko ensisijaisen kasvaimen B88-518c solut (Fig. 5A) ja CAL27-518c solut (Fig. 5B) oli merkittävästi lisääntynyt verrattuna tuumoreihin mock-solut. Vaikka sekä mock ja miR-518c transfektantit histopatologisesti metastasized kohdunkaulan imusolmukkeiden paino imusolmukkeiden sisältävät miR-518c transfektantit oli huomattavasti painavampi kuin imusolmukkeiden sisältävät mock-solut (Fig. 5C-E). Me seuraavaksi suoritetaan laskimoon rokotus käyttäen näitä transfektanteissa. Lukuisat ja suuri etäpesäkenystyröiden havaittiin keuhkoissa kaikissa hiirillä, jotka inokuloitiin B88-518c solut (Fig. 6A). Määrä noduulien välillä hiirillä, jotka inokuloitiin B88-518c solujen lisääntyi merkitsevästi verrattuna numero mock-solut (Fig. 6B).

(A, B) B88-transfektanttien (A) ja CAL27-transfektanttien ( B) ortotooppisesti siirrostettiin puremalihakset nude-hiirten, jotka tapettiin päivänä 35. koko primaaristen kasvainten mitattiin kerran viikossa. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± SD. *; p 0,05 verrattuna mock soluihin yksisuuntaisella ANOVA. (C) edustaja H p 0,05 verrattuna vale-solujen yksisuuntainen ANOVA.

Solut inokuloitiin verisuonten nude-hiirten, jotka tapettiin päivänä 35. (A) edustaja H 0,01 verrattuna mock soluihin yksisuuntaisella ANOVA.

Keskustelu

miRNA ovat pieniä, endogeeninen, evoluutiossa konservoitunutta ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät noin 60% nisäkkäiden geenien moduloimalla opintosuoritusotteensa tasoilla. miRNA ovat mukana monissa molekyyli polkuja ja keskeinen biologisissa prosesseissa kuten solun kasvua, kehitystä, erilaistumista, lisääntymistä ja solukuoleman [11]. Viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet, rooli miRNA moduloivan metastaattisen prosessin yhteydessä kiinteitä kasvaimia, ja nämä miRNA on nimetty metastamir [13]. Lukuisia metastamirs on tunnistettu ja on pro- ja anti-metastaattisen vaikutuksia [11]. On kuitenkin todennäköistä, että on olemassa monia miRNA jotka ovat metastamir tuntematonta, koska 3% ihmisen genomin arvioidaan koodaavan miRNA-sekvenssit [14]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että miR-518c-5p voi olla uusi etäpesäke edistävää metastamir. miR-518c-5p alunperin tunnistettu 250 pientä RNA kirjastot 26 eri elinjärjestelmien ja solutyyppejä ihmisen ja jyrsijöiden, rikastunut hermosolujen sekä normaali ja pahanlaatuisten hematopoieettisten solujen ja kudosten [15]. Vaikka toiminta miR-518c-5p ei ole selkeästi määritelty syöpiä, Dyrskjøt ja kollegat osoittivat, että miR-518c-5p oli merkitsevästi yhteydessä taudin etenemiseen korjattaessa taudin vaiheessa ja arvosana käyttäen Coxin monimuuttuja regressioanalyysi [16]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että miR-518c-5p osoitti merkittävän säätelyyn ylöspäin retinoblastooma on miRNA mikrosiruanalyysi [17]. Yhdessä meidän läsnä tuloksiin, miR-518c-5p voi toimia kuin oncomiR tuumorisoluissa.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-518c-5p on voimistuvan SDF-1 /CXCR4-järjestelmä parakriinisellä tai autocine tavalla. Rhodes ja työtovereiden tutkittu miRNA ilmaisun aiheuttama SDF-1 /CXCR4 järjestelmä estrogeenireseptori-alfa-positiivisten rintasyövän soluja [18]. Kumpikaan ei kuitenkaan miR-518c-5p eikä toinen miRNA havaittu omassa miRNA analyysissä olivat läsnä niiden tuloksia. Lisäksi, vaikka myös analysoineet miRNA microarray analyysi CXCR4-positiivinen sylkirauhasen syöpäsoluja, ACC-M [19] sen jälkeen, kun on stimuloitu SDF-1, ei ollut mitään yhteistä miRNA välillä kolmen miRNA mikrosirulla analysoi käytöstä huolimatta SDF-1 /CXCR4 järjestelmän näissä syöpäsoluissa (tuloksia ei ole esitetty). Tämä havainto saattaa johtua siitä, että erilaisissa koeolosuhteissa solujen; kuitenkin, se voi johtua eri paikkasidonnainen metastasoitunut kuvio näitä syöpäsoluja. Esimerkiksi rintasyöpä suosii metastasizing luun, sylkirauhasen syöpä on keuhko-, ja suun syöpä on imusolmuke. Siten miRNA jotka ovat tarpeen hakeutuvat erityisiä kohde-elimeen voidaan aktivoida CXCR4 sitoutumisen sen ligandin, SDF-1 näissä syöpäsoluissa.

mekanismi miR-518c-5p kiihdytyssäätely, että SDF -1 /CXCR4 järjestelmä suullinen syöpäsoluissa ei selvitetty esillä olevassa tutkimuksessa. miR-518c-5p kuuluu miR-515 perheen kromosomissa 19 miRNA klusterin, niin kutsuttu C19MC [20]. C19MC on suurin klusteri, säilynyt vain kädellisillä, koodaus 59 kypsä miRNA ja näyttää erittäin alhainen ilmentyminen useimmissa ihmisen kudoksissa johtuu epigeneettiset ohjaus [20]. Koska SDF-1 /CXCR4 järjestelmä voi ylössäätää DNMT1 /DNMT3ß ilmaisun [21], tai ANP32A /Lanp, osa estäjä histoni asetyyli transferaasin [22], miR-518c-5p säätelyä voi riippua tulosta demetylaatiota C19MC. Vaihtoehtoisesti, äskettäiset tutkimukset osoittivat, että jotkin miRNA jäsenten C19MC ilmentyivät maksasyövän, tunnettu siitä poikkeava IGF, fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) -Akt-mTOR tai p53-reittiin aktivointi [23], [24]. SDF-1 /CXCR4 järjestelmä voisi myös aktivoida PI3K-Akt reittejä B88 soluissa [1], ja nämä reitit saattavat olla mukana ylösajon miR-518c-5p. Olemme edelleen tutki miR-518c-5p ilmentymisen käyttäen suullisen tasyöpäsolulinja, HNT, jossa ilmaus CXCR4 oli 7,5 kertaa pienempi kuin että B88-soluissa [1], [3]. HNT-SDF-1-solujen teki näytteille vähäistä, mutta ei merkittävää, fenotyyppisiä muutoksia

in vitro

ja

in vivo

, jossa aktivointi PI3K-Akt by SDF-1 ei ollut havaittavissa [ ,,,0],4]. Lisäksi miR-518c-5p induktio hNT-SDF-1-soluissa oli havaittavissa vain marginaalinen tasolla, todennäköisesti johtuu alennettu ilmaus CXCR4, verrattiin B88 soluja (tuloksia ei ole esitetty). Siten CXCR4 ekspressiotaso ja vahva alavirran signalointia, kuten PI3K-Akt, voi olla kriittinen aktivointi miR-518c-5p ilmaisun siksi lisätutkimuksia tarvittaisiin selventää tätä mekanismia.

esillä olevassa tutkimuksessa, miR-518c-5p indusoi SDF-1 /CXCR4 järjestelmä ei stimuloi solujen kasvua, mutta ei lisätä solujen vaeltamiseen käyttäen LNA estäjä. Sen sijaan voimme havaita sekä kasvun kiihtyminen ja parannettu muuttoliike jälkeen transfektion miR-518c ekspressiovektorin,

in vitro

ja

in vivo

. Vaikka syy on epäselvä, havainto saattaa johtua vaikutuksesta miR-518c-3p tuottama miR-518c ekspressiovektoriin. Emme kuitenkaan löytäneet edellinen raportteja miR-518c-3p syöpäsoluissa ja solujen kasvua, ja LNA estäjä vastaan ​​miR-518c-5p hillitsevän tehostettu kasvu sekä B88-518c ja CAL27-518c soluja (Kuva. 3E , F). Näin uskomme, että vaikutus miR-518c-3p kasvuun solujen voi osittain huomiotta. Toinen mahdollisuus voi olla, koska vaimennussäätely fysiologisissa tai väärän kohde-mRNA: iden, jotka jakavat vastaavan siemenen sekvenssin yli-ilmentyminen miR-518c-5p. Kuitenkin, yli-ilmentyminen miR-518c-5p oligonukleotidin päinvastoin esti kasvua ja migraation B88-solujen ja CAL27 soluja, todennäköisesti johtuen downregulation vääriä kohde-mRNA: ta (määritystuloksia ei ole esitetty). Tämä tulos osoittaa, että ilmentyminen miR-518c käyttämällä vektoria menetelmää indusoi fysiologisia ja ei-toksisen tilan näiden suun syöpäsoluja. Näin uskomme, että maltillinen induktio miR-518c-5p voi olla riittävä solujen vaeltamiseen, mutta vahva induktio miR-518c-5p voidaan tarvita induktioon solujen kasvua. Koska

in silico

mRNA tavoitteita miR-518c-5p sisältävät useita geenejä, jotka säätelevät kasvua ja etäpesäkkeiden (S1 taulukko), opinnäytteet kohdegeenien voi ohjata eri vaikutus miR-518c-5p.

C19MC, kuten miR-518c-5p, karttoja kromosomi band 19q13.4 [20]. Kasamatsu ja kollegat osoittivat, että 19q13.4 lokus monistuu sylkirauhasten rauhasmainen kystinen syöpä, erittäin metastaattinen tyyppinen pään ja kaulan alueen syöpä [25]. Lisäksi vahvistus tämän lokuksen usein havaitaan ependymoblastoma ja alkion kasvaimet runsaalla neuropiilissä ja totta ruusukkeet, erittäin aggressiivinen alkion kasvaimet, nopeudella 93% [26]. SDF-1 /CXCR4 järjestelmällä on merkittävä rooli ylläpitämisessä arkkitehtuurissa markkinaraon hematopoieettisten ja muiden kudosten kantasolujen kuten itusolujen ja follikulaarinen suoliston, ja hermoston kantasolujen [27], [28]. Erityisesti useimmat syöpä kantasolut (CSCS) ilmaista CXCR4 ja vastata kemotaktinen kaltevuus SDF-1, mikä viittaa siihen, että CSCS edustavat todennäköisimmin alapopulaatio joka kykenee aloittamaan etäpesäkkeiden [29]. Lisäksi useat ryhmät ovat viime aikoina liitetty ilmaus jäsenten C19MC kanssa miRNA allekirjoitus tunnusomainen ihmisalkioiden kantasolujen [20]. Yhdessä C19MC, mukaan lukien miR-518c-5p, voidaan ilmaistaan ​​CSCS, jotka ovat mukana kasvun ja etäpesäkkeiden.

Johtopäätökset ja suositukset

Nämä tulokset osoittivat, että miR-518c-5p säätelee kasvua ja etäpesäkkeiden suusyövästä alavirran kohde SDF-1 /CXCR4 järjestelmä. Jatkossa olisi tärkeää tutkia yhdistyksen välillä CXCR4 ja miR-518c-5p ilmentymisen kliinisestä materiaalista. Jos molekyyli mekanismi miR-518c-5p syövän etäpesäkkeiden voitaisiin selventää, tukahduttaminen solujen kasvua ja muuttoliike jonka miR-518c-5p estäjä voi toimia perustana kehittämiselle hoitoja vastaan ​​etäpesäke.

tukeminen Information

S1 Taulukko.

miRNA kohteena miR-518c-5p analysoidaan käyttämällä microRNA.org ohjelman (https://www.microrna.org/microrna/getMirnaForm.do), ja raja-arvo on sovitettu alle -1,5 of miRSVR pisteet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0115936.s001

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Koh-ichi Nakashiro (Department of Oral ja leukakirurgia, Ehime University Graduate School of Medicine) antamaan teknistä apua.