Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme aiemmin raportoitu antisense- tekniikkaa, ”snoMEN vektoreita”, kohdennettuja knock-alas proteiinia koodaavan mRNA: t käyttäen ihmisen snoRNAs manipuloitu sisältämään lyhyitä alueita sekvenssikomplementaarisuutta kanssa mRNA tavoite. Täällä luonnehtia käyttöä snoMEN vektorien kohdistaa knock-down mikro-RNA ensisijainen selostukset. Me dokumentoida erityisiä knock-down of miR21 HeLa-soluissa käyttämällä plasmidia ilmentävät miR21 kohdistettuja snoMEN RNA: t ja näytettävä tämä indusoi apoptoosia. Knock-down on riippuvainen läsnä komplementaarisia sekvenssien snoMEN vektorin ja apoptoosin induktio voidaan estää yli-ilmentyminen miR21. Lisäksi olemme kehittäneet myös lentivirusvektoreita toimittamista snoMEN RNA: iden ja näyttää tämän tehostaa vektorin transduktion monissa ihmisen solulinjoja, joita on vaikea transfektoida plasmidivektoreihin. Transduktio lentivirusvektorien ilmentävien snoMEN suunnattu PRI-miR21 indusoi apoptoosia ihmisen keuhkon adenokarsinooma soluja, jotka ilmentävät korkeita miR21, mutta ei ihmisen primaarisissa soluissa. Osoitamme, että snoMEN välittämää tukahduttaminen miRNA ilmaisun estetään siRNA knock-alas Ago2, mutta ei knock-alas Ago1 tai Upf1. snoMEN RNA: t colocalise kanssa Ago2 solutumissa ja nucleoli ja voidaan käyttää samanaikaisesti immunosaostettiin tumauutteita mukaan spesifisiä vasta-aineita Ago2.

Citation: Ono M, Yamada K, Avolio F, Afzal V, Bensaddek D, Lamond AI (2015) Kohdennettu Knock-Down of miR21 Primary Transcripts käyttäminen snoMEN Vektorit indusoi apoptoosia ihmisen Cancer Cell Lines. PLoS ONE 10 (9): e0138668. doi: 10,1371 /journal.pone.0138668

Editor: Christophe Antoniewski, CNRS UMR7622 University Paris 6 Pierre-et-Marie-Curie, FRANCE

vastaanotettu: 24 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 02 syyskuu 2015; Julkaistu: 25 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Ono et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Rahoitusta tähän tutkimukseen on jonkin Wellcome Trust ohjelman apuraha AIL (Viite: 073980 /Z /03 /Z) (https://www.wellcome.ac.uk/) ja MRC Milstein -palkinto A.I.L. (Ref: G0801738) (https://www.mrc.ac.uk/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

snoMEN (snoRNA modulaattori geenin ilmentymisen) vektorit tarjoavat muodossa antisense-teknologiaa ilmentymisen moduloimiseksi kohdegeenien perusteella täydentäviä emäspariutumisen vuorovaikutuksia, analoginen tuttuja siRNA /shRNA vektori-järjestelmiä [1]. SnoMEN vektori tekniikka on luotu manipulointi ihmisen laatikko C /D pieni nucleolar RNA (snoRNA) HBII-180C. Tämän luokan snoRNAs sisältää sisäisen sekvenssin (M box), joka voidaan muuttaa, jotta se täydentää RNA tavoitteita. snoRNAs ovat perheen säilytetty ydin- RNA: iden keskittynyt nucleoli jossa he joko toiminto muutettaessa ribosomi-RNA: ta (rRNA), tai osallistua käsittelyyn rRNA aikana ribosomien alayksikön synteesi [2-5]. Laatikko C /D snoRNAs on nimetty yhteinen RNA motiivi tällä alaheimoon, joka toimii sitoutumiskohdan ryhmä laatikko C /D-proteiineja, mukaan lukien NOP56, NOP58, 15.5K ja erittäin konservoitunut proteiini fibrillarin, joka on erityinen 2 ’-O-metylaasiaktiivisuus. Useimmat snoRNAs koodataan sisällä intronisekvensseillä, joko sijaitsee ensisijainen selostukset proteiinia koodaavan geenien tai erityisissä sisältävien transkriptien tandem paneelit useita snoRNAs. Endogeeninen snoRNAs ovat erittäin runsas ydin- RNA: t, jotka ovat tehokkaasti jalostetaan ensisijaisesti selostukset. Siten käsittely ja toimitus snoMEN RNA: iden on samalla tehokas eikä altis kyllästymisen isäntäsolun koneet kun snoMEN ilmennetään eksogeeninen vektoreista.

Aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että snoMEN vektorit voivat vähentää proteiinin ekspressiotasot lyömällä alas ilmentymistä ydin- pre-mRNA: t, jolloin kohdentaminen komplementaaristen sekvenssien sisällä intronin ja /tai ei-koodaavan 5 ’ja 3’ viereiset sekvenssit sisällä mRNA esiasteita (pre-mRNA: t) [6]. Tämä lisää tehokkaasti eri sekvenssit kohde-RNA: ita, jotka voidaan tutkia saavuttamiseksi geenispesifisten estäviä vaikutuksia. Yhteistä endogeenisen snoRNAs, snoMEN RNA: t ovat tehokkaasti transkriboidaan RNA-polymeraasi II promoottorit, sen sijaan, että RNA-polymeraasi III promoottoreita, joita käytetään shRNA plasmidien [7]. Kuten snoMEN RNA: t on koodattu sisällä introneja, se on suhteellisen helppo suunnitella vektoreita, jotka voidaan ilmaista useita snoMEN sisällä eri intronit yhden transkriptin, joka myös koodaa proteiinia reportteri. Tämä helpottaa luomista joko ohimeneviä tai vakaa, geeni knock-ins, suoritetaan käyttämällä yhtä transkripti, ajettu yhden promoottorin. Tämä lähestymistapa käyttää snoMEN vektoreita on siten käytetään osoittamaan ihmisen ’proteiinin korvaamisesta ”stabiileja solulinjoja, joissa ilmentyminen kohdennetun proteiinin vähennetään snoMEN RNA: ita ja tehokkaasti substituoitu rekombinanttisen proteiinin, jota koodaa sama transkriptin käyttää kuljettamaan snoMEN [6].

Syöpä ja muut proliferatiiviset sairaudet (kuten autoimmuunisairaus ja tulehdus) liittyy usein epänormaaleja apoptoosia tai solujen kuolemaan. Syöpäsoluissa, esimerkiksi mekanismit ovat yleensä häiriintyy, jotka aiheuttavat ohjelmoidun solukuoleman seuraavat joko vakavan DNA-vaurioita ja /tai vikoja normaalissa solusyklin etenemistä, jolloin syöpäsolut välttää apoptoosin. Mahdollinen lähestymistapa syövän hoito on siis laukaista apoptoosin etsimällä tapa voittaa mekanismeja, jotka estävät endogeenisen signalointireittejä joka muuten johtaa kuolemaan syöpäsoluja. Nyt ajatellaan, että yksi edistää mekanismeja, joiden avulla monia muotoja syöpäsolujen tukahduttaa aktivointi solukuolemareittejä välittävät yliekspressio erityisiä MikroRNA, kuten miR21 [8].

miR21 oli yksi ensimmäisistä miRNA havaittu ihmisen perimän ja näyttää vahva evolutiivinen säilyttäminen monilla selkärankaisten lajien, mukaan lukien nisäkkäiden, lintujen ja kalojen clades [9]. RNA ilmentymisen profiilit, havaittiin käyttäen suuren suoritustehon transcriptome profilointi lähestymistapoja, jotka vertaavat miRNA kasvaimissa ja muut solulinjat, jotka liittyvät syövän kuin normaalien solujen /kudosten, silmiinpistävän viittaavat siihen, että miR21 on yli ilmaistaan ​​valtaosa syöpätyyppien analysoitiin [8 ]. Viime aikoina antisense tutkimukset kohdistuvat kypsä miR21 ehdotti, että esto miR21 funktio voi indusoida apoptoosia aktivoimalla ilmaus ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4) proteiinia tietyntyyppisten syöpäsolujen, esim. HeLa-solut ja MCF-7-soluja [10, 11]. Estyminen miR21 on raportoitu synteettisten antisense oligonukleotidianalogeja, komplementaarinen miR21 [12, 13]. Vaikka miR21 knock-down kautta antisense modifioidut oligonukleotidit ilmoitettiin pidättämään kasvainsolujen lisääntymistä, sekä

in vitro

ja

in vivo

kysymykset jäävät käyttämällä tätä lähestymistapaa kliinisessä terapiassa, jotka koskevat alhainen tehokkuus jakelujärjestelmän sekä mahdollisten sivuvaikutusten antisense-oligonukleotideja, jotka on vielä ratkaistava. Käyttö siRNA /shRNA vaihtoehtona mekanismi kohdistamista estämällä miRNA on ehdotettu terapeuttiseksi, mutta myös mahdollisia riskejä, kuten off-tavoite vaikutuksia ja häiriöitä RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC) solussa [ ,,,0],14-17]. Tästä huolimatta useat tutkimukset ovat kuvanneet estämällä ilmentymä kypsä miR21 käyttämällä siRNA /shRNA, erityisesti vaikuttavat vain 22 pohja käsitelty miRNA mutta ei aiheuta knock-down on miR21 ensisijaisen transkriptio [18].

Micro RNA: t (miRNA) käsittävät perheen lyhyt, sääntely-RNA: t, tyypillisesti 22 nukleotidin pituinen, mikä voi transkription jälkeen säädellä geeniekspressiota

in vivo

. Nisäkkäillä, miRNA on raportoitu säädellä geeniekspressiota pääasiassa mekanismeja, jotka estävät translaatiota proteiinia koodaavan transkriptien, todennäköisesti kautta emäspariutumisen erityisiä kohdesekvenssien mRNA 3 ’transloimattomia alueita (UTR: t) [19]. Joissakin tapauksissa miRNA transkriboidaan itsenäisenä transkriptioyksikössä, joka ei koodaa proteiinia. Kuitenkin monet miRNA sijaitsevat intronisekvenssit proteiinia koodaavan geenejä. Nämä intronin koodaama miRNA ovat siis koekspressoitiin vastaanottavan proteiinia koodaava geeni [20-25]. Aikuinen miRNA jalostetaan enää pre-miRNA selostukset, jotka ovat yleensä ~ 70 nukleotidin mittainen, hiusneularakenteita. Näitä pre-miRNA puolestaan ​​käsitellään alkuperäisestä päägeenis- selostukset, usein kutsutaan pri-miRNA [26].

Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että snoMEN vektoreita voidaan käyttää knock-down miR21 by Kohdistamalla tiettyihin sekvensseihin pri-miRNA tekstitystiedostojen johtaen apoptoosin ihmisen syöpäsolujen linjat. Me tutkimme tarvittavat tekijät snoMEN estoa miRNA ilmaisun ja osoittavat, että snoMEN voidaan toimittaa soluihin sekä plasmidista ja lentivirusvektoreita.

Tulokset

snoMEN kohdistaminen pri-miR21 apoptoosia transformoiduissa soluissa

Oletuksena on, että jos snoMEN voidaan kohdistaa aiheuttaa alennuksen tasojen miR21 ensisijaisen transkripti saattaa indusoida apoptoosia kasvainsoluissa, joiden selviytyminen on riippuvainen korkea miR21 ilmentymisen. Näin ollen testata, onko snoMEN voidaan muuttaa ekspression miR21, plasmidivektori ekspressoi M box-modifioitu snoRNAs suunnattu endogeenisen pri-miR21 rakennettiin (kuvio 1A), joka perustuu edellisen snoMEN suunnittelu [1]. Tämä snoMEN vektori (mCherry-pri-miR21 snoMEN) koodataan kolme snoMEN, jotka kukin suunnattu eri alueilla pri-miR21 sekvenssin. Nämä kolme snoMEN RNA: t ovat kukin koodattu erillinen intronit saman RNA pol II-transkripti, joka koodaa myös mCherry proteiinia, joka toimii fluoresoiva proteiini (FP) markkeri transfektoiduissa soluissa. Sen jälkeen transfektion mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmidivektorin HeLa- soluihin, FISH (fluoresenssi

in situ

hybridisaatio) kokeissa käyttäen snoMEN-koettimia, osoitti vakaassa tilassa lokalisaatio varten snoMEN RNA: iden, joka oli pääasiassa ydin-, jossa kerääntyminen nucleoli (kuva 1 B ja muita tietoja ei ole esitetty). Tämä kuvio on yhdenmukainen aiempien snoMEN ilme tutkimuksissa [1, 6].

(a) Rakenne kohdennettuja endogeenisten miR21 ensisijainen transkripti (mCherry-pri-miR21 snoMEN) ja kaaviokuva miR21 kypsymisen kautta. Tämä rakenne on kolme snoMEN RNA: t (sininen pentagons) aikaisemmin kuvatulla [1], paitsi että tässä M laatikko sekvenssit ovat komplementaarisia spesifisten sekvenssien sisällä endogeenisen miR21 ensisijainen transkriptio. (B) validointi snoMEN ilmentymisen Fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) analyysi. Kukin snoMEN RNA havaittiin käyttämällä M laatikko RNA koetin leimattu Cy3 (Cy3). DNA värjätään DAPI (DAPI). Mittakaava on 10 pm. (C) RNA-analyysi. Kokonais-RNA HeLa-soluista kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen ja qRT-PCR suoritettiin tunnistamiseksi miR21 prekursorimolekyylit käyttäen miR21 esiaste-spesifisiä alukkeita (pre-miR21). CDNA-synteesin jälkeen, qPCR suoritettiin käyttäen kypsynyt miR21 spesifinen aluke ja yleispohjamaaliksi tarjoamat perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, katso myös menetelmät) (Matured-miR21). U3 käytettiin latauskontrollina. Kaavio kuvaa keskiarvo ja standardipoikkeama vähintään 5 riippumattomassa kokeessa. (D) transfektoiduissa HeLa-soluissa pri-miR21-snoMEN /ohjaus 24 tuntia ennen kokonais-RNA ja Northern blot-analyysi.

24 tunnin kuluttua ohimenevän transfektion snoMEN plasmidin mCherry-yksi- miR21 HeLa- soluihin, mikä suuresti nimenomaista miR21 [27], havaitsimme ~ 65% ja ~ 45% knock-down edeltävää miR21 ja kypsynyt miR21 vastaavasti verrattuna negatiivisen kontrollin snoMEN (Control) vektori, arvioituna molemmat qRT-PCR (kuvio 1 C) ja Pohjois-blottaus-analyysi (kuvio 1 D). Lisäksi solut, jotka on transfektoitu mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmidin korkeita apoptoosin (kuvio 2A nuoli). Sitä vastoin solut, jotka on transfektoitu kontrollina snoMEN plasmidi (Control), joka ei ole kohdistettu mitään endogeenisten geenien, ei osoittanut merkkejä apoptoosin (kuvio 2A). Useita markkereita apoptoosin testattiin kussakin tapauksessa, kuten anneksiini V-määrityksellä käyttäen FACS (Fluorescence-aktivoitujen solujen lajittelu) (kuvio 2B), joka on immunofluoresenssianalyysillä katkaistun kaspaasi-3 (kuvio 2C), Western blotting-analyysi katkaistun PARP1 ja lohkaista Kaspaasi-3 (kuvio 2D). Kaikki nämä määritykset osoittivat ajan apoptoosin säätelyyn, erityisesti soluissa, jotka oli transfektoitu mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmidi. Kuitenkin kotransfektoimalla plasmidit miR21 shRNA-pLVX (joka ilmaisee ennalta miR21) ja mCherry-pri-miR21 snoMEN johti vähän tai ei lainkaan sytotoksisuutta ja apoptoosin, kun co-solujen transfektio mCherry-pri-miR21 snoMEN ja negatiivinen kontrolli EGFP-pLVX (EGFP: tä ilmentämään proteiinia yksinään) ekspressioplasmidien (kuvio 3A ja 3B). Nämä tulokset osoittavat, että apoptoosin aiheuttaman snoMEN-välitteisen miR21 ehtyminen voidaan pelastaa eksogeeniset miR21 yli ilmentymistä.

(a) mikrokuvia, joka esittää esimerkkejä apoptoosin HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu pri-miR21-snoMEN. Kuvat on otettu 72 tuntia transfektion jälkeen. Nuolet osoittavat solut esittää apoptoosin fenotyyppi. Mittakaava on 10 pm. (B) Kaavio on esitetty ajan muutosten väestöstä anneksiini-V (apoptoosin markkeri) positiivisten solujen transfektion jälkeen joko pri-miR21-snoMEN (vihreä), tai Control (punainen). Solujen lukumäärä laskettiin käyttämällä FACS: llä. Anneksiini V signaali havaittiin käyttäen Guava neksiini reagenssia (Guava tekniikat). (C) Kuvat osoittavat lokalisaatio DNA (DAPI, sininen), transfektio FP-markkeri joko pri-miR21-snoMEN /ohjaus (mCherry, punainen) ja Apoptosis markkeri (pilkkoutuu Caspase-3, vihreä). Arrowheads osoittavat Apoptosis merkki positiivisia soluja. Mittakaava on 10 pm. (D) Western blot, joka osoittaa maker proteiineja transfektoiduissa HeLa-soluissa pri-miR21-snoMEN /ohjaus 24 tuntia ennen proteiiniuutto. Kokosolulysaateille analysoitiin käyttäen mainituilla vasta-aineilla.

(a) mikrovalokuvat osoittavat pelastuskoe apoptoosin induktion kotransfektoimalla kanssa pri-miR21-snoMEN (mCherry) ja pre-miR21 ekspressioplasmidilla (GFP + miR21) /Ohjaus joka ilmentää GFP-proteiinia yksinään (GFP). Kuvat on otettu 72 tuntia ja sen jälkeen transfektion jälkeen. Mittakaava on 10 pm. (B) RNA-analyysi. Kokonais-RNA HeLa-soluista kerättiin 24 tunnin kuluttua kotransfektion pri-miR21-snoMEN (mCherry) ja pre-miR21 ekspressioplasmidin (miR21) /ohjaus-plasmidi, jotka ilmentävät GFP-proteiinia yksinään (GFP) ja qRT-PCR suoritettiin tunnistaa miR21 prekursorimolekyylit käyttäen miR21 esiaste-spesifisiä alukkeita (pre-miR21, punainen). CDNA-synteesin jälkeen, qPCR suoritettiin käyttäen kypsynyt miR21 spesifinen aluke ja yleispohjamaaliksi antamat perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, katso myös menetelmät) (Matured-miR21, Green). U3 snoRNA käytettiin kontrollina. Kaavio kuvaa keskiarvo ja standardipoikkeama vähintään 3 riippumattoman kokeen. (C) micrographs osoittavat ehkäisy ei apoptoosin induktion transfektoimalla pri-miR21-snoMEN mut, joka on 3 emäsyhteensopimattomuuksia jokaiseen M ruutuun komplementaarinen sekvenssi pri-miR21. Kuvat on otettu 72 tuntia ja sen jälkeen transfektion jälkeen. Mittakaava on 10 pm. (D) RNA-analyysi. Kokonais-RNA HeLa-soluista kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen joko pri-miR21-snoMEN mut tai Control. CDNA-synteesin jälkeen, qPCR suoritettiin käyttäen kypsynyt miR21 spesifinen aluke ja yleispohjamaaliksi antamat perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, katso myös menetelmät). U3 snoRNA käytettiin kontrollina. Kuvaaja esittää keskiarvo ja keskihajonta on vähintään 4 itsenäisen kokeen.

tutkimiseksi suhde sekvenssin M-box-alueen, että snoMEN ja pri-miR21 kohdesekvenssi, mutantti versio mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmidi (pri-miR21 snoMEN mut), johon kuului kolme kohtaanto PRI-miR21 komplementaarisen sekvenssin, tehtiin ja analysoitiin mitata sekä knock-down tasoilla ja mahdolliset apoptoosin fenotyypin (kuvio 3C ja 3D). Tulokset osoittavat, että 3 pohja epäsuhta mutaatiot M ruutuun poistaa tehokkaasti sekä apoptoosin fenotyyppi ja knock-down aktiivisuutta, verrattavissa negatiivinen kontrolli snoMEN vektori (kuvio 3C ja 3D). Olemme päätellä, että miR21 knock-alas ja tuloksena apoptoosin fenotyyppi nähty mCherry-pri-miR21 snoMEN vektori riippuu sekvenssikomplementaarisuutta välillä M ruutuun alueen ja kohdennetun alueen pri-miR21.

Meillä on myös rakennettu ja testattu toinen snoMEN vektori, mCherry-pre-miR21 snoMEN, joka kohdistuu miR21 prekursorisekvenssejä (kuvio A S1 File). Ohimenevä transfektio mCherry-pre-miR21 snoMEN plasmidin HeLa-soluja johti miR21 knock-down ja apoptoosin induktion, joka on samanlainen tulosten edellä saatua kanssa mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmidi. Tulokset mCherry-pre-miR21 snoMEN ja mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmidit olivat samanlaiset suhteen FISH analyysi, anneksiini-V määritys käyttäen FACS ja miR21 knock-down tasoilla, analysoituna qRT-PCR (kuviot BD S1 File). Nämä tulokset osoittavat, että snoMEN vektorit voidaan todellakin kohdistaa miRNA ensisijainen selostukset, joka tarjoaa enemmän joustavuutta suunnitteluun knock-down vektorit kuin kohdistaminen vain lyhyitä (~ 22 base), kypsä miRNA sekvenssit.

Seuraavaksi testasimme snoMEN vektoreita voidaan käyttää kohdentamaan muut miRNA, erillään miR21. Siten snoMEN vektorit suunniteltiin kohdistamaan neljä aiemmin hyvin tunnettu miRNA ensisijainen selostukset [27-30], eli pri-miR31, pri-let-7 g, pri-miR132 ja pri-miR210, ja niiden knock-down aktiivisuus mitattiin käyttämällä qRT -PCR seuraavat lyhytaikaista transfektiota HeLa-soluissa (kuvio 4A). Tämä osoitti erityinen ja toistettavissa knock-alas kaikki neljä kohdennettua miRNA verrattuna negatiivisen kontrollin snoMEN, arvioituna qRT-PCR. Lisäksi kunkin kohdennetun miRNA tässä tutkimuksessa selvitimme spesifisyyden miRNA knock-alas snoMEN vektorit. Voit tehdä tämän käytimme qRT-PCR mitata ja verrata tasoa vastaavien kohdennettuja ja ei-kohdistettuja mikro-RNA: t, kun ilmaus joko miRNA kohdennettua snoMEN RNA tai negatiivinen kontrolli snoMEN RNA (kuva 4B). Tämä osoitti, että esimerkiksi ilmaus mCherry-pri-miR21 snoMEN aiheutti tiettyä vähentämistä miR21 tasolle vähän tai ei lainkaan tavoitteen ulkopuolella vaikutuksia tasoilla neljän muun mikro-RNA: t testattiin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kullekin snoMEN vektorien suunnattu neljä muuta miRNA testattu edellä, eli pri-miR31, pri-let-7 g, pri-miR132 ja pri-miR210.

(a) snoMEN vektoreita suunnattu muita miRNA. Kokonais-RNA HeLa-soluista kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen ja cDNA-synteesin jälkeen, qPCR suoritettiin käyttäen kypsynyt miRNA suunnattu spesifisiä alukkeita, toisin sanoen miR31, anna-7 g, miR132, miR210, ja yleispohjamaaliksi antamat perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta biotieteiden, katso myös menetelmät) (Titaanit-miRNA, vihreä). U3 snoRNA käytettiin kontrollina. Kaavio kuvaa keskiarvo ja standardipoikkeama vähintään 3 riippumattoman kokeen. (B) analyysi spesifisyys kohdistaminen miRNA knock-down käyttäen snoMEN vektoreita. qPCR suoritettiin 5 eri miRNA (miR21, miR-31, anna-7 g, miR132, miR-210) tarkistaa mahdolliset armottoman vaikutuksista snoMEN vektorien kohdistaminen pri-miRNA eli pri-miR21 snoMEN, pri-miR31 snoMEN, pri -Anna-7g snoMEN, pri-miR132 snoMEN, pri-miR210 snoMEN. Kuvaaja osoittaa keskimääräinen signaali-suhde kolmen erillisen kokeen vertaamalla kohdennettuja snoMEN Control snoMEN transfektiolla (ohjaus, punainen). Kukin signaali normalisoitiin suhteessa U3 snoRNA tasolla.

Expression of snoMEN peräisin lentivirusvektoria

joustavuuden parantamiseksi tuottaa snoMEN soluihin, joilla pyritään erityisesti parantamaan toimitus of snoMEN solulinjoissa, jotka osoittavat alhaisen transfektiotehokkuudet varten plasmidivektorit, pyrimme rakentamaan lentivirusvektoreita jotka voivat ilmaista snoMEN (kuvio 5A). Useimmat nisäkässolut ovat alttiita lentivirus-infektion, mukaan lukien sekä raja ja ei-jakautuvat solut, kantasolut, ja ensisijainen soluihin [31]. Vertasimme lentiviruksen ilmentymistä pri-miR21 snoMEN joko ensisijainen, tai syöpäsolut, jotka ovat peräisin ihmisen kudoksista. Kaksi erillistä lentiviral snoMEN vektorit konstruoitiin, eli lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN ja lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN, jotka kohdistuvat eri alueiden miR21 ensisijaisen transkriptin (kuvio 5A ja katso myös kuvio A S1 File). Sekä pri-miR21 snoMEN pre-miR21 snoMEN myös koodata mCherry cDNA ilmauksena markkerina transfektoiduista soluista. Kuten on esitetty FISH-analyysillä, kukin lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN ja negatiivinen kontrolli lenti-mCherry-Control snoMEN (EGFP kohdennetut), näihin snoMEN RNA: ita, jotka kertyvät nucleoli, samanlainen kuin saadut tulokset, kun snoMEN-RNA: t ilmennetään transfektoiduista plasmidi-vektorit (kuvio E S1-tiedoston ja kuvio 1B) [1]. Ilmaus snoMEN RNA: iden virusvektorit vahvisti myös Northern blot-analyysi (tietoja ei esitetty).

(a) rakenne lentivirusvektorin, joka koodaa snoMEN suunnattu endogeenisen miR21 ensisijainen transkripti (Lenti-mCherry-pri -miR21 snoMEN). Tämä rakenne on kolme snoMEN-RNA: iden (sininen viisi-) ja mCherry FP-markkeri-cDNA, kuten on kuvattu kuviossa 1A, paitsi että insertti alikloonattiin vektoriin, joka tuottaa lentivirus hiukkasten (pLVX-puro, Clontech). (B) micrographs osoittavat apoptoosin induktion transdusoimalla joko Lenti-mCherry-pri-miR21-snoMEN tai Lenti-mCherry-Control-snoMEN viruspartikkeleita. Kuvat on otettu 72 tuntia transduktion jälkeen. Mittakaava on 10 pm. (C) Kokonais-RNA ihmisen keuhkojen ensisijainen (ATCC-CCL-75) ja keuhkosyöpä (ATCC-CRL-5868) solujen kerättiin 24 tuntia transduktion jälkeen. CDNA-synteesin jälkeen, qPCR suoritettiin käyttäen sekä kypsytetty miR21 spesifistä aluketta ja yleispohjamaaliksi antaman perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, katso myös menetelmät). GAPDH: ta käytettiin kontrollina. Kaavio kuvaa keskiarvo ja standardipoikkeama vähintään 4 erillisen kokeen. (D) Kaavio on esitetty ajan muutosten väestöstä anneksiini V-positiivisten solujen transdusoitu joko lenti-pri-miR21-snoMEN (vihreä), lenti-pre-miR21-snoMEN (sininen) tai Control (punainen). Solujen lukumäärä laskettiin käyttämällä FACS: llä. Anneksiini-V-signaali havaittiin käyttäen Guava neksiini reagenssia (Guava tekniikat).

Seuraavaksi lenti-mCherry-pri-miR21 virukset transdusoitiin joko osaksi Wi-38 (ATCC-CCL-75) ihmisen keuhkojen fibroblastisoluja (eristettiin sikiön 3 kuukautta tiineyden), jotka ilmentävät alhaisia ​​miR21 tai ihmisen keuhkojen adenokarsinooma soluja, joka on saatu ihmisen potilaan (ikä 55, vaihe 2), joka erittäin ilmaista miR21 (kuvio F S1 File). Tämä miR21 ilmentymistaso ei muuttunut, kun transduktoimalla lenti-mCherry-Control snoMEN vektori (kuvio F S1 File). Nämä solut on vaikea transfektoida DNA-plasmideilla käyttämällä yleisiä transfektioreagensseja. Enemmän kuin 90% sekä ensimmäisen ja syövän solut osoittivat mCherry ilmentymisen 24 tunnin kuluttua lentiviruksen transduktion. Ensiöparit transduktio joko pri-miR21 snoMEN, tai pre-miR21 snoMEN, piti kasvaa ja edelleen ilmaista mCherry (kuvio 5B ja kuvio G jätti levyt S1 File). Kuitenkin lentivirus transdusoidut keuhkoadenokarsinooma solut osoittivat voimakasta sytotoksista fenotyyppi 3 päivän kuluessa transduktion (kuvio 5B keskimmäinen paneeli ja kuvio G oikea paneelit S1 File). Vaikka tämä syöpäsolun spesifisten sytotoksisten fenotyyppi havaittu transduktio joko lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, tai lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN vektori, transduktion negatiivinen kontrolli lentivirusvektori ilmentävät snoMEN kohdistaminen EGFP (lenti-mCherry -Control snoMEN; endogeenistä kohde), eivät osoittaneet sytotoksista fenotyyppi joko primaarinen tai keuhkojen adenokarsinooma-soluissa (kuvio 5B oikea paneeli).

transduktio joko lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, tai lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN, osaksi keuhkoadenokarsinooma soluja, jotka erittäin ilmaista miR21, johti kulloinkin ~ 25%: n vähennys tasot kypsän miR21 RNA, verrattuna solujen transduktio negatiivinen kontrolli, lenti-mCherry- ohjaus snoMEN vektori, arvioituna qRT-PCR (Kuva 5C ja kuvio H S1 File). Lisäksi anneksiini-V-määrityksellä, käyttäen FACS, osoitti säätely ylöspäin anneksiini-V keuhkojen adenokarsinooma soluissa transduktio joko lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN tai lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN, mutta ei sen jälkeen siirtoon niin negatiivinen kontrolli lentiviraalinen snoMEN vektori (kuvio 5D).

Olemme päätellä, että lentivirusvektorit pystyy ilmaisemaan snoMEN RNA: t voidaan transduktoitiin nisäkässoluihin korkea hyötysuhde. Toimitus snoMEN kohdennettuja sekvenssejä pri-miR21 indusoi apoptoosia ihmisen keuhkon adenokarsinooma soluissa, mutta ei transformoimattomista ihmisen keuhkojen primäärisiä soluja.

vertailu siRNA /shRNA ja snoMEN pri-miRNA häiriöitä

ottaa edellä esitetty, että M laatikko muunnettuja snoRNAs voi vähentää endogeenistä miRNA ihmissoluissa kun suunnattu sekvenssin sisällä ensisijainen transkriptin miRNA, joka ei ole läsnä kypsässä miRNA, me seuraavaksi verrattiin kykyä siRNA oligoribonukleotidien repiä alas ilmaus miR21 kun kohdistettu sama ensisijainen transkripti sekvenssit (kuvio 6A). Suorittaa näitä vertailuja, kolme siRNA oligoribonukleotidien täydentävät sama ensisijainen transkriptin sekvenssit miR21 pri-miRNA tavoitteen mukaisesti M box-modifioitu snoRNAs in mCherry-pri-miR-21 snoMEN, transfektoitiin HeLa-soluja (kuvio 6A ja minä S1 File). Kaikki kolme pri-miRNA siRNA (si21M1-3), osoitti vähän tai ei knock-down joko kypsän-miR21 tai pre-miR21 tasoilla, samoin edelleen negatiivinen kontrolli siRNA (Scramble), arvioituna qRT-PCR (kuvio 6B vasen paneeli) ja Northern blottauksella (kuvio 6B oikea paneeli). Positiivisena kontrollina, toinen siRNA suunnattu kypsän miR21 sekvenssin (si21), johti ~ 25% knock-down, erityisesti kypsä miR21 mutta ei ennalta miR21, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [12, 13]. Lisäksi samassa analyysit suoritettiin myös käyttämällä shRNA teknologiaa (kuvio 6A ja 6C ja kuvio I S1 File). Siten kolme shRNA ekspressioplasmidit per geeni, joka täydentää sama ensisijainen transkriptin sekvenssien miR21 tavoitteen mukaisesti M box-modifioitu snoRNAs in mCherry-pri-miR21 snoMEN, transfektoitiin HeLa-soluissa (kuvio 6A ja kuvio I S1 File) . Kaikki kolme pri-miR21 kohdistettuja shRNAs (sh21M1-3), osoitti jälleen vähän tai ei knock-down tasojen joko kypsän-miR21, tai pre-miR21, samoin jälleen kielteisiä shRNA ohjaus, arvioituna qRT-PCR ( kuvio 6C vasen paneeli) ja Northern blottauksella (kuvio 6C oikea paneeli). Sen sijaan positiivinen kontrolli shRNA plasmidia antaisi shRNA suunnattu kypsän miR21 sekvenssin (sh21), johti ~ 70% knock-down kypsän miR21.

(a) Alueet on pri-miR21 RNA kohteina snoMEN vektori käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty kaaviokuva (sh /si21M1-M3). Sama pri-miR21 sekvenssit tavoitteen mukaisesti snoMEN vektori oli kohdistettu siRNA oligoribonukleotideja ja shRNA ilmentämisplasmideja. (B) Kaavio esittää tulosta qRT-PCR /qPCR. Kokonais-RNA HeLa-soluista kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen ja qRT-PCR suoritettiin tunnistamiseksi miR21 prekursorimolekyylit käyttäen miR21 esiaste-spesifisiä alukkeita (pre-miR21, punainen). CDNA-synteesin jälkeen, qPCR suoritettiin käyttäen kypsynyt miR21 spesifinen aluke ja yleispohjamaaliksi antamat perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, katso myös menetelmät) (Matured-miR21, Green). U3 käytettiin kontrollina. Kaavio kuvaa keskiarvo ja standardipoikkeama vähintään 4 erillisen kokeen. Oikeassa paneelissa esitetään tulos Northern blot analyysi siRNA kokeita. Detection Endogeenisen miR21 RNA tasoja transfektion HeLa-solujen joko ohjaus siRNA (Scramble: lane1), miR21 siRNA (si21: lane2), miR21 M laatikko siRNA-1 (si21M1: lane3), miR21 M box siRNA-2 (si21M2: lane4), miR21 M laatikko siRNA-3 (si21M3: lane5). Vastaavan määrän HeLa kokonais-RNA: ta ladattiin kullekin kaistalle ja RNA erotettiin PAGE: lla, elektroblotattiin päälle kalvo ja tutkittiin molemmissa miR21 koetin ja tRNA koetin latauskontrollina. (C) Sama sarja kokeita siRNA transfektion, kuten on kuvattu kuviossa 6b, paitsi shRNA ekspressioplasmidit transfektoitiin sijaan siRNA: iden.

päätellä, että snoMEN vektorit voivat aiheuttaa ilmentyminen vähenee erityisten miRNA suuntaamalla tumaprekursori RNA-sekvenssit, jotka eivät näytä olevan mukautuvia knock-alas joko siRNA oligoribonukleotidejä tai shRNA vektoreita. Sen sijaan, sytoplasmisen RNA: t, mukaan lukien kypsät miRNA, voidaan tippuu alas by shRNA vektoreita, jotka kohdistuvat samaan sekvenssit käytetty snoMEN vektorit.

Mekanismi snoMEN RNA interferenssin

Olemme aiemmin osoittaneet että mekanismi, jolla snoMEN voivat moduloida ilmentymistason kohde-mRNA vaatii Argonaute-2 (Ago2), joka on puolestaan ​​osallisena pääasiassa RNAi reitti [32]. SnoMEN mekanismi saattaa myös liittyä up-kehyksenvaihdon-1 (Upf1), jonka ajatellaan olevan välttämättömiä nonsense välittämää hajoaminen (NMD) koulutusjakson [6, 33-35]. Kuitenkin, ei ole selvää, onko snoMEN-välitteisen ekspression modulaatiolle tason kohdennetun ei-proteiinia koodaavan RNA: n, mukaan lukien pri-miRNA, merkitsisi täsmälleen samalla mekanismilla. Siksi me tutki RNAi-välitteinen väheneminen useiden proteiinien, mukaan lukien Ago2, voi vaikuttaa kykyyn snoMEN vektorien muuttaa ilmaus miRNA (Kuva 7). Tulokset osoittavat, että snoMEN riippuva knock-down of pri-miR21 tasot estyi spesifisesti soluissa köyhdytetty Ago2 siRNA hoito, verrattuna soluihin käsitelty salatun siRNA negatiivinen kontrolli (kuvio 7A ja 7B). Lisätarkastuksia osoitti, että taso snoMEN RNA ilmaisua ei vaikuttanut siRNA transfektioita (Kuva J S1 File). Tämä tarkoittaa, että Ago2 voivat olla mukana joko suoraan tai välillisesti mekanismi snoMEN välittämää tukahduttaminen miRNA ensisijaisen transkriptipitoisuuksissa. Havaitsimme kuitenkin, tässä, ettei siRNA-välitteinen väheneminen Upf1, joka oli aiemmin osoitettu vaikuttavan kykyyn snoMEN ja knock-down-proteiinia koodaavan RNA: t [6], eikä Ago1, joka, kuten Ago2 [32], voidaan liittää jossa snoRNAs estäneet inhibition miR21 ilmentymisen snoMEN.