Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kasvutekijän reseptorin (EGFR) mutaatio tila on arvokkain indikaattori seulonnassa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla, tyrosiinikinaasin estäjä (TKI) hoito. Tarkka, nopea ja edullinen menetelmiä havaita EGFR mutaatioita on tullut tärkeitä. Käyttämällä kahta mutaatio-spesifisten vasta-aineiden kohdistaminen delE746-A750 eksonissa 19 ja L858R eksonissa 21 tekee tämän tehtävän mahdollista, mutta ei ole yhteisymmärryksessä hyväksyttäviä perusteita positiivisten rajoittaa soveltamisen vasta-pohjainen mutaation havaitsemiseen.

Methods

Keräsimme 399 näytteitä pienisoluista keuhkosyöpää (145 resektio yksilöt, 220 kudosnäytteistä, ja 34 sytologia yksilöt), joiden EGFR-mutaatio asema oli havainnut TaqMan PCR. Immunohistokemiallinen (IHC) analyysit käyttämällä EGFR-mutaatio vasta-aineita käytettiin kaikissa näytteissä. Värjäyksen jälkeen ja pisteytys, herkkyys, spesifisyys, positiivinen ennustearvo (PPV) ja negatiivinen ennustearvo (NPV) laskettiin mukaisesti eri positiivisia laadut verrattuna tuloksiin PCR-määrityksessä.

tulokset

IHC-analyysin perusteella, 144 tapausta pisteytettiin 0, 104 tapausta pisteytettiin 1+, 103 tapausta pisteytettiin 2+, ja 48 tapauksessa pisteytettiin 3+. Kun molekyyli-pohjainen tulokset asetetaan ”kultaisena standardina”, esiintyvyys mutaatio oli 6,94% (10/144), 23,08% (24/104), 67,96% (70/103) ja 100% (48/48 ) vastaavasti näytteissä pistein 0, 1+, 2+ ja 3+. Kun pisteet 3+ pidettiin positiivisena, spesifisyys ja PPV oli 100%; jos vain pisteet 0 pidettiin negatiivinen, 93,06% NPV saatiin.

Johtopäätös

Potilaat, joilla pisteet 3+ on täydellinen PPV (100%), ja voi hyväksyä TKI hoidon suoraan ilman molekyylitason -pohjainen määrityksissä. Potilaat, joilla pisteet 0 oli korkea NPV (93,06%), joka saattaa nousta 97,22%, kun havaitseminen koko EGFR sovellettiin. Kuitenkin näytteitä pisteet 1+ tai 2+ ovat epäluotettavia ja tarvitsevat lisätarkastamista EGFR-mutaatio aseman molekyyli- perustuvissa määrityksissä.

Citation: Jiang G, Fan C, Zhang X, Dong Q, Wang L, Liu Y, et ai. (2013) selvittäminen asianmukaisen diagnostisen algoritmi EGFR mutaatio-spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi EGFR Status in Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (3): e59183. doi: 10,1371 /journal.pone.0059183

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 18 joulukuu 2012; Hyväksytty: 12 helmikuu 2013; Julkaistu: 11 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (avustukset 81071905 ja 81272606 on EHW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

alusta lähtien käyttöön epidermaalisen kasvutekijän reseptorin tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI:) gefitinibin ja erlotinibin hoitoon edenneen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [1], tutkimukset ovat osoittaneet, että pienisoluista keuhkosyöpää EGFR-aktivoivia mutaatioita voivat hyötyä TKI käsittely [2], [3]. Asema EGFR mutaatioita on tullut paras ennustaja vastaus TKI [4] – [9]. Suora sekvensointi on ”kultainen standardi” menetelmäksi EGFR mutaatioita. Kuitenkin sen herkkyys on suhteellisen alhainen; jos prosenttiosuus kasvainsolujen on 25%, todennäköisyys vääriä negatiivisia tulos kasvaa huomattavasti. Puutteen vuoksi riittävä määrä tuumorisolujen käytettävissä louhinta korkealaatuisen DNA, todennäköisyys saada vääriä negatiivisia lisääntyy kun testaus pieni biopsia tai sytologia näyte. Kuitenkin noin 70% keuhkosyövässä diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa, jolloin pienet koepaloja ja sytologiseen yksilöt ovat ainoa materiaali diagnoosia ja mutaatio testaus. Viimeaikaiset edistysaskeleet molekyylimenetelmät ovat mahdollistaneet kehitetään herkempiä menetelmiä mutaatioiden tunnistamiseksi. Tällaisia ​​menetelmiä ovat reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) käyttäen spesifisiä koettimia (TaqMan PCR-määritys), monistettiin tulenkestävät mutaatio järjestelmän (ARMS) ja korkean resoluution sulamisanalyysikokeita (HRMA) [10] – [14]. Ne ovat kuitenkin kalliita ja poikkeuksetta edellyttää hyvää koeolosuhteissa ja hienostunut välineitä. Näin ollen ne ovat harvoin sovelletaan ei-opetussairaaloissa.

immunohistokemiallinen (IHC) analyysit voidaan myös käyttää seulomaan EGFR mutaatioita. Yu et ai. kehittyneiden EGFR-mutaatio-spesifisten kanin monoklonaalisia vasta-aineita EGFR: ää kanssa E746-A750 deleetio eksonista 19 tai L858R pistemutaatio, joka oli hyvä yhdenmukaisuus verrattuna molekyyli perustuvissa määrityksissä [15] – [26]. Kuitenkin käytännön soveltaminen tätä menetelmää rajoittaa huomattavasti, koska tuntuva ero kriteerit positiivisten kesken eri tutkimusryhmää. Jotkut tutkijat sijoitettiin tietojen mukaan värjäytymisen intensiteettiä, ja jakaa näytteet neljään luokkaan: 0, 1+, 2+ ja 3+. Kuitenkin jotkut kirjoittajat kannattivat pisteet edellä 1+ pitää positiivisena, ja toiset jopa väitetty, että pisteet edellä 2+ olisi positiivinen tulos. Erityispiirteet Näiden kahden lähestymistavan olivat suhteellisen lähellä (96-100%), mutta niiden herkkyydet vaihtelivat suuresti (47-92%) [15] – [19]. Jotkut tutkijat myös saanut sijoituksen ilmaisun kertomalla värjäyksen intensiteetin prosenttiosuus värjäyksen alue (0-300 tai 400), ja vastaavasti kannatti pistemäärä 10 tai 20 voidaan luokitella positiiviseksi, mutta huomattava ero in herkkyydet (42,2-100%) ja erityispiirteet (77-100%) havaittiin [20] – [22]. Äskettäin Kawahara et ai. ehdotti, että Immunovärjäyksen pitäisi luokitella positiivinen (pistemäärä 2 +), negatiiviset (pistemäärä 0) tai epäselviksi (pisteet 1 +), joka osoittaa kyseenalainen, negatiivinen tai heikko ilmaisu, vastaavasti, mikä voi saada herkkyys 81,4%, spesifisyys 97,5%, positiivinen ennustearvo (PPV) 94,6%, ja negatiivinen ennustearvo (NPV) 90,6% [23]. Konsensus on yleisesti hyväksytty kriteeri ”positiivinen” puuttuu, mikä vakavasti vaikeuttaa kliinistä käyttöä EGFR-mutaatio-spesifistä vasta-ainetta havaitsemaan EGFR mutaatioita.

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet IHC tulokset 399 näytettä NSCLC potilaat jotka tekee neljän luokitusmenetelmä ottaen huomioon intensiteetti ja alue värjäystä. Sitten verrataan tuloksia molekyyli-määrityksessä tutkia mahdollisuutta seulonta EGFR mutaatioita NSCLC näytteissä IHC analyysejä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kaikki ihmisen kudokset ja solut saatiin mukaisesti ihmiskoe pöytäkirjat hyväksymän China Medical University Review Board. Kasvaimen kudokset ja solut saatiin kirjallinen suostumus aikuisten potilaiden NSCLC.

malli valinta ja molekyylitason perustuva määritys

Keräsimme 399 yksilöitä (145 resektio yksilöt, 220 biopsianäytteistä, ja 34 sytologia yksilöt) peräisin NSCLC potilaat, jotka olivat hakeneet molekyylitason perustuva määritys EGFR mutaatioita patologian osaston of China Medical University (Shenyang, Kiina) elokuusta 2008 elokuu 2012. ikäryhmä keuhkosyöpäpotilaita oli 26 -89 vuotta (mediaani, 62 vuotta); oli 214 miestä ja 185 naista. Histologinen tyypit olivat 341 adenokarsinoomat, 47 okasolukarsinoomia, ja 11 muuta tyyppiä (taulukko 1). EGFR-mutaatio tilan kunkin näytteen havaittiin, että TaqMan-PCR-määrityksen. Resektion ja biopsia kudokset kiinnitettiin 10% formaliinilla ja upotettiin parafiiniin. Supernatantit keuhkopussin-effuusiota näytteet poistettiin sentrifugoimalla, ja loput solukomponenttien kiinnitettiin sitten 10% formaliinia, ja upotettiin parafiiniin. Parafiini lohkot leikattiin paksuuteen 8 um tutkimuksessa PCR-pohjainen EGFR-geenin mutaatioita. Mutaatiot EGFR-geenin tutkittiin eksonit 19 ja 21 käyttäen TaqMan-PCR-määrityksen. Genominen DNA parafinoidut kudoksen tai sytologia näytteitä uutettiin ja puhdistettiin käyttäen QIAamp DNA Micro-kittiä (Qiagen, Valencia, CA, USA). Alukkeet mutaatiota havaitsemiseen ja Taqman kohdistaminen E746-A750 ja L747-P753insS deleetiomutaatiot eksonin 19, ja L858R ja L861Q pistemutaatioita eksonin 21 hankittiin GP Medical Technologies (Beijing, Kiina). TaqMan-PCR-määritys suoritettiin käyttäen 7900HT Real-time PCR -järjestelmää (Applied Biosystems, Foster, CA, USA).

IHC analysoi

Parafiini lohkot leikattiin paksuuteen 4 pm immunovärjäämistä. Tavanomaiset de-vahaus ja nesteytys hoito tehtiin käyttämällä ksyleeniä ja luokiteltujen sarjojen etanolia, vastaavasti. Näytteet keitettiin vesihauteeseen 100 ° C: ssa 20 min 1 mmol /l etyleenidiamiini-tetra-etikkahapon (EDTA) pH: ssa 9,0 ja kohde-haku liuosta (Dako, Glostrup, Tanska), jolloin saatiin antigeenejä. Luonnostaan ​​peroksidaasin aktiivisuus estettiin käsittelemällä peroksidaasin esto reagenssia (Dako) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ei-spesifinen sitoutuminen pistettä blokattiin inkuboimalla normaalin nonimmune vuohen seerumia 15 min huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS, Dako) 15 minuutin ajan, kolme primaarisilla vasta-aineilla (ts EGFR monoklonaalinen vasta-aine (D38B1), delE746-A750-mutaatio-spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta (6B6) ja L858R-mutaation-spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta (43B2) ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) laimennettiin erikseen 1:400 ja lisättiin näytteet. Näytteet inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli, pestiin TBS: ssä, 15 minuutin ajan, ja inkuboidaan leimatun polymeeri-piparjuuriperoksidaasi sekundaarista vasta-ainetta (ChemMate Envision kit, DAKO) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen TBS 15 min, kalvot visualisoitiin käyttämällä 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia.

IHC pisteytys

IHC värjäytyminen pisteet perustui värjäytymisen intensiteettiä ja prosenttiosuus värjäyksen alue kalvon ja /tai sytoplasmassa kasvainsolun. Neljä laadut käytettiin: 0, 1+, 2+, 3+. Zero merkitty mitään värjäytymistä; 1+ merkitään vaaleankeltainen värjäystä ilman ilmeisiä hiukkasia tai keltainen värjäys ilmeisiä hiukkasten 10% syöpäsoluja; 2+ merkitty keltainen värjäys ilmeisiä hiukkasten 10% kasvainsoluja tai ruskea värjäytyminen selviä hiukkasten 10% syöpäsoluja; ja 3+ merkitty ruskea värjäytyminen selviä hiukkasten 10% kasvainsoluja. Värjäys arviointi suoritettiin ainoastaan, jos 5 kasvainsolut olivat läsnä neulabiopsian tai sytologia näyte. Kaikki immunohistokemiallista analyysit arvioitiin kolmella kokeneita tutkijoita (YL, JHY ja YZ), jotka olivat tietoisia potilaan kliinisten tilojen tai patologisen diagnoosin.

Tilastolliset analyysit

herkkyys, spesifisyys, PPV ja NPV ja IHC perustuva määritys laskettiin käyttäen molekyyli- perustuva määritys viitteenä. Välinen sopimus 2 tekniikoita laskettiin Cohen κ. Kaikki tiedot analysoitiin SPSS 13.0 for Windows.

Tulokset

Molecular-pohjainen EGFR mutaatiostatuksesta tilan 399 NSCLC näytteiden

yhteensä 399 NSCLC yksilöitä havaittiin käyttäen TaqMan PCR. EGFR mutaatio havaittiin 162 tapauksessa (40,6%, 162/399). Tämä sisältyi E19 (E746-A750) deleetiomutaation 86 tapauksessa (21,55%, 86/399), E21 (L858R) pistemutaatioiden 70 tapauksessa (17,54%, 70/399), sekä E746-A750 ja L858R mutaatioita 4 tapauksissa, E19 (L747-P753insS) deleetiomutaatiot 4 tapauksessa (1,03%, 4/399), E21 (L861Q) pistemutaatioiden 6 tapauksessa (1,5%, 6/399), eikä mutaatio 237 tapauksessa (59,4%, 237/399). Määrä mutaatioiden resektio yksilöiden oli 40,69% (59/145), in biopsianäytteistä oli 36,82% (81/220) ja sytologia näytteet oli 35,29% (12/34).

Comparative analyysit IHC-pohjainen ja molekyylipohjaisia ​​EGFR mutaatiostatuksesta riippumatta

värjäytymiskuvioissa EGFR-mutaatio-spesifistä vasta-ainetta on esitetty kuvassa 1. Out of 399 NSCLC yksilöitä, 144 tapausta pisteytettiin 0 (jossa 10 tapausta kanna EGFR mutaatioita ja määrä mutaatioita tässä luokassa oli 6,94%, 10/144); 104 tapausta pisteytettiin 1+ (oli 24 tapausta EGFR mutaatioita ja mutaatiovauhti oli 23,08%, 24/104); 103 tapausta pisteytettiin 2+ (EGFR mutaatioita oli läsnä 70 tapauksessa ja korko mutaatioiden oli 67,96%, 70/103); 48 tapausta pisteytettiin 3+ (48 tapausta kanna EGFR mutaatioita, ja määrä mutaatio oli 100%, 48/48). Yksityiskohtaiset tulokset esitetään taulukossa 2. Näytteet sijoitettiin 3+ on täydellinen PPV (100%), ja ne sijoitettiin 0 on hyvä NPV (93,06%).

edustaja immuunivärjäystä sekä histologian ja sytologian näytteet pienisoluista keuhkosyöpää (A, D, G ja J, resektio yksilöitä, 200 x; B, E, H ja K, kudosnäytteistä, 200 x; C, F, I ja L, sytologia yksilöitä, 400 x). Neljä laadut käytettiin: 0, 1+, 2+ ja 3+. 3+ merkitty ruskea värjäytyminen selviä hiukkasten 10% kasvainsoluja (A, B ja C); 2+ merkitty keltainen värjäys ilmeisiä hiukkasten 10% kasvainsoluja tai ruskea värjäytyminen selviä hiukkasten 10% tuumorisolujen (D, E ja F); 1+ merkitään vaaleankeltainen värjäystä ilman ilmeisiä hiukkasia tai keltainen värjäys ilmeisiä hiukkasten 10% tuumorisolujen (G, H ja I); Zero merkitään mitään värjäytymistä (J, K ja L).

välinen sopimus IHC-pohjainen ja molekyylitason perustuvia määrityksiä mukaisesti eri positiivista laadut laskettiin Cohen κ. Kun ryhmien pistemäärä 0 tai 1+ katsottiin negatiivisiksi, ja ne, joilla pistemäärä 2+ tai 3+ pidettiin positiivisena, välisen sopimuksen 2 eri tunnistusmenetelmiä oli korkein (κ = 0,644). Kuitenkin olisi 24 vääriä negatiivisia tapauksia (23,08%, 24/104) ryhmässä pisteet 1+ ja 33 vääriä positiivisia tapauksia (32.04%, 33/103), että on pisteet 2+, jolloin herkkyys of 77,63%, spesifisyys 86,64%, PPV on 78,14%, ja NPV 86,4% havaitsemiseen immunohistokemiallisesti. Mikään näistä arvoista oli ihanteellinen (esitetty taulukossa 3).

molekyylitestin kuin standardi, delE746-A750 mutaatio-spesifistä vasta-ainetta (6B6) voisi havaita 69 86 tapausta, joiden E746 -A750 poisto mutaatio (40 pistemäärällä 2+ ja 29 kanssa pisteet 3+), kun taas se oli negatiivinen loput 17 tapausta (4 pisteet 0 ja 14 kanssa pisteet 1+) (κ = 0,584, herkkyys: 80,23%, spesifisyys: 85,3%, PPV: 60%, NPV: 94.01%); L858R mutaatio-spesifistä vasta-ainetta (43B2) voisi tunnistaa 53 70 tapausta, joiden L858R pistemutaatio (31 pistemäärällä 2+ ja 22 kanssa 3+), kun se oli negatiivinen loput 17 tapausta (7 pisteet 0 ja 10 kanssa pistemäärä 1+) (κ = 0,639, herkkyys: 75,71%, spesifisyys: 91,79%, PPV: 66,25%, NPV: 94,67%).

lisäksi meillä on myös havaittu yhteensä EGFR kaikissa 399 tapauksissa käytetään monoklonaalista vastaan ​​EGFR. Tulokset osoittivat 27 tapausta sai 0, 38 tapausta pisteytettiin 1+, 193 tapausta pisteytettiin 2+, ja 141 tapausta pisteytettiin 3+. EGFR monoklonaalinen vasta-aine (D38B1) on erilainen kuin kahden mutaation-spesifisiä vasta-aineita. DelE746-A750-mutaatio-spesifistä vasta-ainetta (6B6) voidaan spesifisesti tunnistaa EGFR proteiinien kanssa E746-A750 poistetaan eksonissa 19, ja L858R-mutaation-spesifistä vasta-ainetta (43B2) kykenee spesifisesti tunnistamaan EGFR-proteiinin kanssa L858R pistemutaatio eksoni 21; sen sijaan, EGFR monoklonaalinen vasta-aine (D38B1), joka ei ole mutaatiota-spesifistä vasta-ainetta, tunnistaa koko EGFR-proteiinin riippumatta mutaation aseman. Vaikka koko EGFR oli hyvin ilmaistu useimmissa tapauksissa oli vielä 38 tapausta, jossa pisteet 1+ ja 27 tapausta, jossa pisteet 0, jossa 12 tapausta positiivisiksi EGFR geenimutaatioita molekyy- menetelmällä. Tämä voidaan selittää sillä, että veren kokonaiskolesterolia EGFR kasvainsoluissa ovat niin alhaiset, että värjäys kahden mutaation-spesifisten vasta-aineiden voi olla negatiivinen joissakin tapauksissa, vaikka ne ovat EGFR-geenin mutaatiot havaitaan (kuten kuviossa S1). Siksi tunnistamalla taso koko EGFR käyttäen EGFR monoklonaalinen vasta-aine (D38B1) voisi estää vastaavien väärien negatiivisten tulosten yläpuolella, kun taas herkkyyttä delE746-A750 ja L858R mutaatio vasta-aineet voitaisiin nostaa 82,56% ja 90% vastaavasti.

Vertaileva IHC-pohjainen tulosten resektio, biopsia ja sytologia näytteet

värjäytymiskuvioissa resektio yksilöitä käyttämällä EGFR-mutaatio-spesifisiä vasta-aineita on esitetty kuviossa 2. mukaan meidän pisteytys kriteerit, 145 resektio yksilöitä, 52 pisteytettiin 0, jossa 2 tapauksissa kanna EGFR mutaatioita ja mutaatio oli vain 3,85% (2/52); 40 tapausta pisteytettiin 1+, jossa oli 10 tapausta EGFR mutaatioita ja mutaatio oli 25% (10/40); 35 tapausta pisteytettiin 2+, jossa EGFR mutaatioita olivat läsnä 29 tapauksessa, ja mutaatio oli 82,56% (29/35); 18 tapausta pisteytettiin 3+, jossa 18 tapauksessa kanna EGFR mutaatioita, ja mutaatio oli 100% (18/18). Yksityiskohtaiset tulokset esitetään taulukossa 2.

Yhteensä EGFR-proteiinin resektio otokset voitaisiin värjätään EGFR (D38B1) vasta-aine (A, D ja G, 200 x). Näytteet ilman EGFR-mutaatiot eivät värjättiin kahden mutaation-spesifisten vasta-aineiden (B ja C, 200 x). Näytteet, joissa E746-A750 deleetiomutaatio värjättiin E746-A750 poisto (6B6) spesifistä vasta-ainetta (E, 200 x) ja näytteiden L858R mutaatio värjättiin L858R mutantti (43B2) spesifistä vasta-ainetta (I, 200 x).

värjäytyminen piirteet kudosnäytteistä käyttämällä EGFR-mutaatio vasta-aineita oli kuvassa 3. mukaan meidän pisteytys kriteerit, 220 resektio yksilöt, 77 tapausta pisteytettiin 0, jossa 6 kanna EGFR mutaatioita ja mutaatio oli 7,79% (6/77); 55 tapausta pisteytettiin 1+, jossa 10 tapausta kanna EGFR mutaatioita ja mutaatio oli 18,18% (10/55); 60 tapausta pisteytettiin 2+, jossa 37 kanna EGFR mutaatioita, ja mutaatio oli 61.67% (37/60); 28 tapausta pisteytettiin 3+, jossa 28 tapauksessa kanna EGFR mutaatioita, ja mutaatio oli 100% (28/28). Yksityiskohtaiset tulokset esitetään taulukossa 2.

Yhteensä EGFR-proteiini biopsianäytteissä voitaisiin värjätään EGFR (D38B1) vasta-aine (A, D ja G, 40 × ja vasemmassa yläkulmassa 200 x). Näytteet ilman EGFR-mutaatiot eivät värjättiin kahden mutaation-spesifisten vasta-aineiden (B ja C, 40 x ja vasemmassa yläkulmassa 200 x). Näytteet, joissa E746-A750 deleetiomutaatio värjättiin E746-A750 poisto (6B6) spesifistä vasta-ainetta (E, 40 × ja vasemmassa yläkulmassa 200 x) ja näytteiden L858R mutaatio värjättiin L858R mutantti (43B2) spesifistä vasta-ainetta (I, 40 × ja vasemmassa yläkulmassa 200 x).

värjäytyminen piirteet sytologia yksilöitä käyttämällä EGFR-mutaatio vasta-aineita oli kuvassa 4. mukaan meidän pisteytys kriteerit, on 34 sytologia yksilöitä, 15 tapausta pisteytettiin 0, jossa 2 tapausta kanna EGFR mutaatioita ja mutaatio oli 13,33% (2/15); 9 tapausta pisteytettiin 1+, jossa 4 tapauksissa oli EGFR mutaatioita ja mutaatio oli 44,44% (4/9); 8 tapausta pisteytettiin 2+, jossa 4 sisälsi EGFR mutaatioita, ja mutaatio oli 50% (4/8); 2 tapausta pisteytettiin 3+, jossa 2 tapausta kanna EGFR mutaatioita, ja mutaatio oli 100% (2/2). Yksityiskohtaiset tulokset esitetään taulukossa 2.

Yhteensä EGFR-proteiinin sytologian näytteet voitaisiin värjätään EGFR (D38B1) vasta-aine (A, D ja G, 400 x). Näytteet ilman EGFR-mutaatiot eivät värjättiin kahden mutaation-spesifisten vasta-aineiden (B ja C, 400 x). Näytettä E746-A750 deleetiomutaatio värjättiin E746-A750 poisto (6B6) spesifistä vasta-ainetta (E, 400 x) ja näytteiden L858R mutaatio värjättiin L858R mutantti (43B2) spesifistä vasta-ainetta (I, 400 x).

Kun pisteet 3+ katsottiin olevan positiivinen, spesifisyys ja PPV että IHC perustuva määritys oli 100% kaikista kolmesta yksilöiden. Kun pisteet 0 pidettiin negatiivinen, resektio yksilöt johti korkein NPV (96,15%), jonka jälkeen kudosnäytteistä (92,21%), ja sytologia näytteet oli pienin NPV (88,24%). Kun pisteet 0 ja 1+ katsottiin olevan negatiivinen ja pisteet 2+ ja 3+ katsotaan positiiviseksi, spesifisyys resektio yksilöitä oli korkein NPV (93,02%), jonka jälkeen kudosnäytteistä (83,45%), ja sytologia näytteet oli alin NPV (81,82%) (taulukko 3).

oli 12 potilasta, joilla molemmilla resektion ja sytologia yksilöiden meidän näytteitä, ja 6 heistä tunsivat EGFR mutaatioita (3 tapausta E746-A750 deleetiomutaatiolla ja 3 tapauksia L858R pistemutaatio) by molekyyli-pohjaisessa määrityksessä. IHC perustuva määritys on resektio yksilöt, 4 6 näytteiden EGFR mutaatioita tunnistettiin olevan pisteet 3+, ja muut 2 yhteydessä todettiin olevan pistemäärä 2+. Sen sijaan on sytologia yksilöitä, vain 1 tapaus oli pistemäärä 3+ ja 1 tapaus oli pistemäärä 2+, ja toinen 4 tapausta olivat kaikki pisteet 1+. Vuonna 6 näytettä ilman EGFR-mutaatio, vain 1 tapaus oli pistemäärä 1+ IHC perustuva määritys on resektio yksilöitä, ja muut viisi näytettä oli pistemäärä 0. Sen sijaan tuloksia vastaaviin sytologian näytteet mukana pistemäärä 2+ 1 tapauksessa pisteet 1+ 1 tapauksessa, ja pisteet 0 muissa 4 tapauksessa (taulukko 4).

keskustelu

EGFR mutaatioita voidaan havaita NSCLC IHC menetelmillä käyttäen EGFR mutantti-spesifisten vasta-aineiden. Kuitenkin johtuen huomattavia eroja kriteerit positiivisuus määritellään eri tutkimusryhmät, lukijat tai teknikoita voidaan sekoittaa tai jopa harhaan osalta käytännön soveltamista tätä menetelmää. Siksi laajempi tutkimus on tarpeen päästä yksimielisyyteen. Tulokset Tämän tutkimuksen ja muiden raporttien [15] – [19], [23] viittaavat siihen, että pisteytys kriteerit perustuvat värjäytymisen intensiteetti kalvo ja /tai sytoplasmassa kasvainsolujen ja prosenttiosuus värjäyksen alue (joka jaettiin neljään luokkaan: 0, 1+, 2+ ja 3+) voi olla paras kaikista käytettävissä pisteytysjärjestelmät. Välinen sopimus IHC-pohjainen ja molekyylitason perustuvissa määrityksissä laskettiin Cohen κ mukaisesti eri immunohistokemiallisella luokittelu. Vaikka välisen sopimuksen 2 testausmenetelmiä oli korkein (κ = 0,644), kun pisteet 2+ ja 3+ pidettiin positiivisena, oli vielä 33 vääriä positiivisia tapauksia (32.04%, 33/103) in pisteet 2+ tapauksissa ja 24 vääriä negatiivisia tapauksia (23,08%, 24/104) in pisteet 1+ tapauksissa, ja herkkyys on 77,63%, spesifisyys 86,64%, PPV on 78,14%, ja NPV 86,4%, joista yksikään ei ollut ihanteellinen. Siten, jonka mole- koe standardina, vaikka näyte arvostellaan positiivisiksi IHC menetelmällä, molekyyli-pohjainen määritys voidaan vielä tarvita tarkistaa EGFR mutaatio asema, ja näin seulonta EGFR mutaatioiden IHC ei näytä olevan sovelletaan. Vaikka määrä vääriä positiivisia tapauksia on ollut hyvin vähän muissa tutkimuksissa [15] – [19], lisäksi molekyylien osoittamista ei voida kokonaan luovuttu. Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että näytteet pistemäärällä 3+ oli täydellinen PPV (100%), ja pisteet 0 näytteissä oli hyvä NPV (93,06%). Jos pistemäärä 3+ pidetään positiivinen kriteeri, potilaiden positiiviset näytteet IHC-pohjainen määritys voi vastaanottaa suoraan TKI-terapialle ilman tarvetta tarkastusta molekyyli- testi. Sovellettavuus TKI-terapialle voitaisiin arvioida nopeasti immunohistokemialla käyttämällä EGFR-mutaatio-spesifisten vasta-aineiden lähes 50% kaikista potilaista (ne pisteytettiin 0 tai 3+). Mahdollisuus mutaatioiden näytteiden kanssa pisteet 1 + oli noin 23,08%, ja todennäköisyys ei mutaation niistä oli 76,92%, kohti analyysimme. Määrä mutaation näytteiden kanssa pisteet 2 + oli 67,96%, mikä viittaa vahvasti siihen mahdollisuutta EGFR mutaatio tässä ryhmässä. Sen jälkeen, jos niitä käytetään oikein, seulontaan EGFR-mutaatio asema immunohistokemiallisesti voi olla diagnostista arvoa terapeuttisessa päätöksentekoa, varsinkin lääkäriasema, joka ei ole kapasiteettia molekyylitestin.

Koska suositeltu Wu et al. [22], ilmentyminen koko EGFR testattiin myös kaikissa 399 tapauksissa tutkimukseen. Toisin kuin kaksi mutaatiota-spesifisiä vasta-aineita, EGFR monoklonaalinen vasta-aine (D38B1) tunnistaa koko EGFR-proteiinin riippumatta mutaation aseman. Koska veren kokonaiskolesterolia EGFR joissakin tapauksissa on hyvin alhainen, mutantti proteiinit voivat olla havaittavissa käyttämällä kahta mutaatio-spesifisiä vasta-aineita, vaikka tapauksissa Harbor mutatoitu EGFR-geenin (kuten on esitetty kuviossa S1). Kuitenkin, käyttämällä EGFR monoklonaalista vasta-ainetta (D38B1) yhdessä mutaation-spesifisten vasta-aineiden todennäköisesti vähentää väärien negatiivisten tulosten kohti meidän analyysin. Tämän lähestymistavan, herkkyyttä delE746-A750 ja L858R mutaatio vasta-aineet voitaisiin nostaa 82,56% ja 90% vastaavasti. Herkkyys L858R-mutaation-spesifistä vasta-ainetta (43B2) vaikuttaa suurempi kuin delE746-A750-mutaatio-spesifistä vasta-ainetta (6B6), joka on yhdenmukainen sen kanssa, mitä on raportoitu Ambrosini-Spaltro A. et ai. [16]

lisäksi olemme suorittaneet vertaileva analyysi IHC perustuvan tuloksia resektio, koepala ja sytologia yksilöitä. Kun pisteet 2+ katsottiin olevan positiivinen, väärien positiivisten arvojen resektio yksilöitä oli vain 17,14% (6/35), kun taas hinnat väärien positiivisten arvojen koepaloja ja sytologia näytteet olivat 38,33% (23 /60) ja 50% (4/8), vastaavasti. Tämä havainto viittasi siihen, että, johtuen pienemmästä määrästä kudosten ja kasvainsolujen kuin resektion yksilöitä, heterogeenisyys kasvainsolujen koepalan tai sytologia näytteitä voi tulla yhä näkyvämpi, ja siten aiheuttaa enemmän vaihtelua testauksen tulokset. Sen lisäksi, että rajoitettu määrä kasvainsolujen pleuranesteeseen (sytologia näyte), koostumus solukomponenttien oli monimutkaisempi, joka sisältää usein monia punasoluja, tulehdussolujen ja mesoteelisolujen, ja siten laimentaa kasvainsoluja. Vaikka sytologia näytteitä voidaan käyttää sekä molekyylipohjaisia ​​ja IHC perustuvissa määrityksissä, jälkimmäinen määritys näyttää osoittavan enemmän vääriä negatiivisia arvoja verrattuna kudosnäytteiden (varsinkin verrattuna resektio yksilöt). Tämä voi selittää huomattavasti vähentynyt herkkyys mutantin havaitsemiseen sytologian näytteet (taulukko 3). Lisäksi olemme tutkineet 12 tapausta sekä resektion ja sytologia kerätyt näytteet. Näistä 6 harbored EGFR mutaatioita molekyyli- perustuva määritys ja toinen 6 ei. Kun pisteet 3+ käytettiin kynnys, IHC-pohjainen määritys voisi tunnistaa 4 ulos 6 näytteiden EGFR mutaatioita resektio yksilöitä, mutta havaita vain 1 tapaus sytologia yksilöitä. Jos pisteet ≥2 + sovellettiin määritys voisi tunnistaa kaikki 6 tapauksissa EGFR mutaatioita resektio yksilöitä, mutta havaita vain 2 ulos 6 tapausten sytologia yksilöitä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että suhteessa IHC perustuva tunnistus EGFR mutaatioita, resektio näytteet olivat paljon parempia kuin kudosnäytteistä, ja kudosnäytteistä olivat merkittävästi paremmat kuin sytologia yksilöitä.

Teoriassa EGFR proteiineja solukalvon tai sytoplasma erilaisia ​​rooleja kasvainsoluissa ja on eri vuorovaikutus TKI. Kuitenkin hoito vaikutukset TKI potilailla, joilla on erilaiset subsellulaariseen jakautuminen EGFR kasvainsoluissa ei ole hyvin tutkittu vielä. Kuten raportoitu aiemmin, havaitsimme, että EGFR voi paikantaa kasvaimen solukalvon, sytoplasmassa tai sekä kalvon ja solulimassa immunohistokemiallisella analyysillä. Sen määrittämiseksi toiminnalliset ominaisuudet eri subsellulaaristen jakaumat EGFR proteiineja, yritimme analysoida mahdollisen korrelaation EGFR-mutaatio aseman ja subsellulaarisen jakautuminen proteiinien, mutta selvisi mitään korrelaatiota välillä. Sen sijaan värjäytymisen intensiteetti on voimakas korrelaatio EGFR-mutaatio asema. Siksi värjäys ”kalvon ja /tai solulimassa” oli yhtä ja yhdessä katsotaan meidän pisteytysjärjestelmä.

korkea aktiivisuus EGFR-proteiinin keuhkosyöpä johtuu aktivointi mutaatiot, mutta geenin monistuksissa voi myös merkittävä rooli. Tässä tutkimuksessa 334/399 (83,7%) tapauksista NSCLC osoitettiin olevan kohonnut ilmentyminen EGFR-proteiinin (≥2 +) käyttämällä monoklonaalisia vasta-ainetta, määrä paljon suurempi kuin standardi havaitseminen geenien tasolla (40,6%). Jää Tutkimme lisäksi tämä kohonnut ilmentyminen EGFR joissakin tapauksissa ilman havaittavaa mutaatioita välittyy amplifiointitekniikat sen geenin tai muita vaihtoehtoisia järjestelyjä. Vai ei TKI voidaan empiirisesti soveltaa näitä potilaita täytyy todentaa lisä- kokeelliset tutkimukset ja kliiniset kokeet.

Yhteenvetona mukaan meidän analyysejä EGFR-mutaatio aseman IHC, potilaat tuloksella 3 + oli täydellinen PPV (100%), ja se voi hyväksyä TKI hoidon suoraan ilman tarvetta Varmistusmenetelmän molekyyli-pohjaisessa määrityksessä. Potilaat tuloksella 0 oli korkea NPV (93,06%). Kuitenkin näytteitä pisteet 1+ tai 2+ ovat epäluotettavia ja tarvitsevat lisätarkastamista EGFR-mutaatio aseman molekyyli-pohjaisessa määrityksessä. Siksi käyttämällä meidän diagnostisia algoritmia, lähes puolet kaikista potilaista (potilaat pistein 0 tai 3+) ja se sovellettavuus TKI terapia voi määrittää immunohistokemiallisesti ja monimutkaisempia, kalliimpia molekyyli testi välttää. Näytteet, joissa pisteet 0 IHC perustuvaa määritystä kahden EGFR-mutaatio-spesifisten vasta-aineiden pitäisi vielä testata ilmentyminen koko EGFR käyttäen EGFR monoklonaalisia vasta-ainetta (D38B1), jotta edelleen vähentää väärien negatiivisten tulosten osuus (kuva 5). Toteutettava yhdessä, verrattuna käyttämällä IHC-pohjainen määritys yksin, tämä yhdistäen IHC- ja molekyylitason perustuvissa määrityksissä osoittaa suurempi herkkyys (97,37%), spesifisyys (100%) ja κ arvo (0,979), ja on näin ollen käytännöllisempää potilaat seulotaan mahdollisen TKI-terapialle. Meidän diagnostinen algoritmi saattavat optimoida hoitovaihtoehtoja, alentaa kustannuksia ja säästää aikaa.

”IHC” viittaa immunohistokemiallisella analyysillä.

tukeminen Information

Kuva S1.

väärä negatiivinen mutaatio tulokset IHC johtuen alhaisesta koko EGFR. Taso koko EGFR tuumorisoluissa oli niin alhainen, (A ja D, 200 x), joka mutantti proteiinit olivat havaittavissa mutaation kanssa spesifisten vasta-aineiden tietyissä tapauksissa (B, C, E ja F, 200 x), vaikka mutaatiot olivat tunnistetaan molekyyli perustuva määritys tapauksissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0059183.s001

(TIF) B

Kiitokset

tutkimus tehtiin mukaan asetusten institutionaalisten tarkastuslautakunta China Medical University.