Krooninen sairaus

tiivistelmä

Specific T-solu immuniteetin potilaalla on aktiivinen tuberkuloosi liittyy vähenemiseen monitoiminnallisuus. On kuitenkin epävarmaa, sytokiini profiilit eroavat primaarista infektiota ja ne, joilla etukäteen yhteyttä. Siksi käytetään rakkoon immunoterapia heikennettyjä eläviä Bacille Calmette-Guerin (BCG) potilailla, joilla urothelial karsinooma mallina luonnehtia systeemisen immuniteetin kohti puhdistettua proteiinia derivaatta (PPD) ja tutkia, sytokiinien profiileja vaihdella ennestään immuniteetin . Kahdeksantoista joilla on ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpään rekrytoitiin aikana BCG-induktio kurssi. Viisikymmentäneljä terveet yksilöt toimivat vertailuryhmänä. Interferoni (IFN) -γ ja interleukiini (IL) -2 tuottavat PPD-spesifisten CD4-T-solut analysoitiin pitkittäin ennen jokaista tiputtamisen käyttäen nopean virtauksen metrimittausmenetelmille kokoveren immunomääritys. Lähtötasolle IFN-γ tuottavat PPD-spesifisten T-solujen olivat verrattavissa kontrolleihin. T-solut oli 5-kertainen lisäys 0,23% viikolla 2/3, ja edelleen kasvoi 8-kertaisesti viikon 4/5 (0,42%, p = 0,0007). Systeeminen immuniteetti indusoitiin kaikilla potilailla, vaikkakin kasvu oli vähäisempää potilailla, joilla on ennestään immuniteetin. Kuten aktiivinen TB, sytokiinien profilointi hoidon aikana paljasti alhaisempi monitoiminen IFN-γ /IL-2 double-positiivisten T-solujen kontrolleihin verrattuna (60,2% vs. 71,9%, p = 0,0003). Huomattavaa on, että verrattaessa potilaiden kanssa ja ilman ennalta olemassa olevan immuniteetin, sytokiinien profiileja primaarista immuniteetti oli siirtynyt IL-2 single tuottavien T-solujen (p = 0,02), kun taas potilailla, joilla on ennestään immuniteetti oli siirtynyt IFN -γ single-positiivisuus (p = 0,01). Lopuksi systeeminen T-soluvasteita aiheutettiin jälkeen BCG-hoidon, ja niiden kinetiikan ja sytokiinien profiili riippui ennestään immuniteetin. Vähentynyt toiminnallisuus on tyypillistä spesifistä immuniteettia sekä potilailla, joilla on aktiivinen tuberkuloosi ja BCG-hoitoa. Potilailla, joilla on aktiivinen infektio, siirtymistä IL-2 tai IFN-γ single-positiiviset solut voivat sallia eron primaarisessa infektio ja tapauksia kasvatti immuniteetin etukäteen yhteyttä, vastaavasti.

Citation: Elsässer J, Janssen MW, Becker F, Suttmann H, Schmitt K, Sester U, et al. (2013) Antigeenispesifisen CD4 T-solut indusoituvat jälkeen Virtsarakonsisäinen BCG-tiputtelu Therapy virtsarakon syövän ja Näytä Samanlaisia ​​Sytokiiniprofiilit kuin aktiivinen tuberkuloosi. PLoS ONE 8 (9): e69892. doi: 10,1371 /journal.pone.0069892

Editor: Delia Goletti, National Institute for Infectious Diseases (L. Spallanzani), Italia

vastaanotettu: 02 toukokuu 2013; Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 11 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Elsässer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tuettiin osittain riippumattoman tutkimuksen tukea medac GmbH. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tutkimus tukee osittain riippumattoman tutkimuksen tukea medac GmbH. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen ja tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. NEITI. ja US ovat mukana perustamassa Redflag Diagnostics GmbH ja keksijät varten patenttihakemuksen otsikolla ”In vitro menetelmä nopean määrittämisen potilaan tila liittyvä infektio Mycobacterium tuberculosis” (kansainvälinen patenttihakemus numero WO2011113953 /A1). H.S. toimii konsulttina medac GmbH. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kaikki muut kirjoittajat eivät ilmoita mitään kilpailevia taloudellisia etuja.

Johdanto

Vuodesta 1976, immunoterapia elävällä Bacillus Calmette Guérin (BCG) on osoittautunut tehokkaaksi adjuvantti rakkoon hoito estää edistyksen ja uusiutumisen transuretraalisen poiston jälkeen nonmuscle invasiivisen virtsarakon syöpä [1,2]. Antituumorivaikutuksen vaikutus BCG-hoito on suurelta osin johtuu induktion vahva synnynnäisen immuunivasteen [3], jota seuraa tunkeutumisen T-solujen rakkoon [4,5]. Tämä on pääasiassa tunnusomaista T-auttaja tyyppi vaste [6,7], ja sen laajuus on osoitettu korreloivan kliinisen vasteen [8]. Vaikka terapeuttinen aktiivisuus on rajoitettu virtsarakon, hiiri malleja osoittavat, että eläviä basilleja tulevat virtsarakon tyhjennys imusolmukkeet missä T solualustusta aloitetaan [9]. Tämä viittaa siihen, että paikallinen BCG-tiputuksen voi liittyä systeemisen spesifisten T-solujen, vaikka todisteet niiden induktio kinetiikkaa ja toiminnallisia ominaisuuksia ihmisillä on rajoitettu [10]. Mielenkiintoista, tutkimukset hiiren osoitti, että T-solujen tunkeutuminen jälkeen BCG-tiputuksen on nopeammin havaita, jos eläimet valmiiksi immunisoitu BCG-rokotus, joka viittaa siihen, että olemassa oleva immuniteetti voi olla hyödyllistä nopeuttaa T-solujen induktio ja siten terapeuttista vaikutusta . Tätä tukivat havainnot, että jo olemassa olevat immuniteetin liittyi parantunut kasvaimen vastainen vaste jälkeen BCG-tiputtamisen niin hiirillä ja potilaat [9]. Siten ihonalainen immunisointi ennen tiputusta saattaa edustaa uutta terapeuttista strategiaa, jolla parannetaan hoitotulokseen. Tässä yhteydessä saatavuuden nopea määrityksiä arvioida määrän ja toimivuutta spesifistä immuniteettia yksittäin on olennainen edellytys valvoa tällaisia ​​strategioita [11].

Arviot läsnäolosta systeemisen immuniteetin kohti BCG voi saadaan käyttämällä tuberkuliinikokeesta-testi, joka tunnistaa pohjustettu T-solut kohti mykobakteerin kuin viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio [12]. Puhdistettu proteiini-derivaatta (PPD), käytettyä antigeeni iho-testaus, on ote eri mykobakteeriproteiinien läsnä eri mykobakteerilajeissa, kuten BCG. Iho-testaus on joitakin rajoituksia seurantavälineenä kuten usein tuottaa virheellisesti negatiiviset tulokset [13], ja se voi aiheuttaa lisäämällä reaktioita, jotka eivät ole erotettavissa dynaamiset aiheuttamien muutosten tiputtamisen [14]. Viime vuosina,

in vitro

-assays on kehitetty, joiden avulla yksityiskohtaisempi kvantitoimiseksi

M. tuberkuloosi

erityisiä T-soluja. Useimmat

in vitro

-assays voidaan suorittaa pienistä määristä kokoverta yhden päivän, ovat logistisesti vähemmän vaativia, ja mahdollistaa sarja- testaus ja toiminnallinen karakterisointi antigeenispesifisten T-solujen [15]. Vuonna ympäristössä tartunnan

M. tuberkuloosi

, toiminnallisuuden arviointiin sytokiinin profilointia on jo käytetty erottamaan potilaiden kanssa ja ilman aktiivista tautia [16-21]. Mielenkiintoista, lasku monitoiminnallisuus ja siirtyminen kohti sytokiiniä single-tuottavia soluja äskettäin osoitettu olevan tyypillistä antigeenispesifisten CD4-T-solujen potilaalla on aktiivinen tuberkuloosi [16-18]. Mielenkiintoista on, että potilailla, joilla on alentunut prosenttiosuus IFN-γ /IL-2 double-positiivisia soluja, jotkut osoitti siirtymistä soluihin, jotka ekspressoivat IL-2, kun taas toiset osoittivat IFN-γ yhden positiivisuuden [16]. Syy tähän kahtiajako on tällä hetkellä epäselvä, mutta se voi liittyä läsnäolo tai puuttuminen ennalta olemassa olevan immuniteetin ennen kehittämistä aktiivista tuberkuloosia.

Virtsarakonsisäinen BCG tiputuksen hoitoa voidaan pitää mallina tutkia induktion mykobakteerien immuniteetin määritelty antigeeni kosketukseen ihmisillä. Siksi on käytetty virtauksen metrimittausmenetelmille kokoverimäärityksissä pituussuuntaisesti luonnehtia induktion kinetiikka ja toimivuutta systeemisen PPD-spesifisten T-solujen potilailla ennen ja jälkeen BCG-tiputuksen. Kuten ennestään immuniteetti kohti PPD voi vaikuttaa kinetiikka ja toiminnallinen profiili spesifisten T-solujen altistuksen jälkeen, erityistä huomiota kiinnitettiin luonnehdinta spesifisten immuniteetin potilailla ja ilman todisteita etukäteen herkistymisen mykobakteerin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen komitea (Ärztekammer des Saarlandes) ja kaikki potilaat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa.

potilaille

tutkimus suoritettiin joukossa 18 virtsarakon syöpäpotilasta, jotka saivat BCG-tiputuksen hoitoa ensimmäistä kertaa (keski-ikä 66,7 ± 10,9 vuotta). Kaikki henkilöt kävivät höyläysleikkaus kaikki näkyvät kasvaimet. Potilaan ja kasvaimen ominaisuudet esitetään taulukossa 1. Kaikki potilaat analysoitiin aikana oikosulkumoottoreiden kurssi koostuu kuudesta viikoittain rakkoon BCG-tiputtamista (BCG-medac, RIVM-kanta johdettu kannasta 1173-P2), ja seurasi kliinisesti mukaan nykyisiä suuntaviivoja [ ,,,0],22]. Kahdella potilaalla, kolmas ja viides tiputtamisen viivästyi 2 ja 1 viikkoon nitriitti positiivinen virtsatieinfektio ja logistisista syistä, vastaavasti. Verta otettiin ennen BCG-hoitoa sekä 1, 2 tai 3 ja 4 tai 5 viikon välein, aina ennen tiputtamisen. Ylläpitohoito annettiin 7 henkilöä mukaan keskus käytännössä. Kasvaimen uusiutumisen tai etenemisen määriteltiin perusteella koepala ja virtsan sytologia. Viisikymmentäneljä samanikäisiin terveillä henkilöillä (keski-ikä 65,3 ± 11,0 vuotta, 45 urosta, 9 naista), joille tehtiin analyysit piilevän infektion

M. tuberkuloosi

ilman kliininen epäilys aktiivinen taudin otettiin palvelukseen valvontaa.

Demografiset ominaisuudet

Potilaita (n = 18) B-vuotiaita, keskiarvo ± SD66.7 ± 10.9Sex, mies /female15 /3Tumor ominaisuudet * Single tumor9 /18 (50,0%) Useita tumor9 /18 (50,0%) pTa9 /18 (50,0%) PT16 /18 (33,3%) CIS3 /18 (16,6%) G2 /G3-luokan tumors15 /18 (83,3% ) G211 /15 (73,3%) G34 /15 (26,6%) Alhainen /korkealaatuista tumors14 /18 (77,8%) Alhainen grade9 /14 (64,3%) korkea grade5 /14 (35,7%) Associated CIS0 /18 (0%) toistuva tumor9 /18 (50,0%) perioperatiivinen mitomysiini treatment5 /18 (27,7%) Days terapiaan, keskiarvo ± SD34 ± 25Non responders8 /18 (44,4%) kuukautta taudin uusiutumiseen, keskiarvo ± SD7.5 ± 5.9Table 1. Väestörakenteen ja kliinisen ominaisuudet hoidetuista potilaista Bacille Calmette-Guerin (BCG).

* Ta /T1 – papillaarisen kasvaimet; CIS – karsinooma in situ; SD – keskihajonta. CSV Lataa CSV

kvantitointi PPD-spesifisten CD4-T-solujen kokoverestä

karakterisointi PPD-spesifisten CD4-T-solujen tehtiin suoraan heparinisoidusta kokoverestä yhteensä 6h mukaan vakiintuneen vakiotoimintamenettely kuten aiemmin on kuvattu [23]. Soluja stimuloidaan PPD (7,32 ug /ml, Tuberkulin varten

in vitro

käytössä (RT-50); Statens Serum Institute, Kööpenhamina, Tanska). Käsittely laimentimen (PBS) ja antaen 2,5 /ml

Staphylococcus aureus

enterotoksiini B (SEB, Sigma, Deisenhofen, Saksa) toimi negatiivisena ja positiiviset kontrollit, vastaavasti. Kukin stimuloiva reaktio suoritetaan 300 ui verta läsnä 1 ug /ml anti-CD28 (klooni L293) ja 1 ug /ml anti-CD49d (klooni 9F10, BD, Heidelberg, Saksa). Viimeisen 4h inkubaatioajan (37 ° C, 5% CO

2) 10 ug /ml Brefeldin A: ta (Sigma, Deisenhofen, Saksa) lisättiin kerääntyä sytokiinien solunsisäisesti. Myöhemmin erytrosyytit hajotettiin ja leukosyyttien kiinnitettiin käyttämällä 10 ml BD lyysiliuos /ml kokoverta. Värjäys suoritettiin käyttäen anti-CD4 (klooni SK3), anti-IFN-γ: n (klooni 4S.B3), anti-IL-2: n (klooni MQ1-17H12), ja anti-CD69 (klooni L78, kaikki BD). Vähintään 15,000 CD4-T-solut analysoitiin FACS Canto II (BD) käyttäen Diva Software. Prosenttiosuus spesifisten T-solujen laskettiin vähentämällä taajuus, joka on saatu vastaavien ohjaus stimulaatiota. Alempi havaitsemisraja oli 0,05% CD4-T-solut aiemmin määriteltyä ja soveltaa muissa tutkimuksissa mykobakteeri T-solujen immuniteetti [16,23-25].

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen GraphPad Prism-5.03 (La Jolla, Ca.). Erot kahden ryhmän määritettiin Mann-Whitneyn-testi. Friedmanin-testiä haettiin pitkittäisanalyysin. Vertaamaan PPD-aseman kahden tai useamman ryhmän Fisherin tai chi-neliö testi levitettiin.

Tulokset

PPD-spesifisten CD4 T-solujen immuniteetin ennen hoitoa ei eroa potilaiden välillä ja terveen yksilöt

luonnehtivat laajuuden ennestään solu- immuniteetti kohti PPD, perustason taajuudet PPD-reaktiivisen CD4-T-solut 18 potilasta verrattiin 54 samanikäisillä valvontaa. Antigeenispesifisten CD4-T-solut tunnistettiin perustuen induktion aktivoinnin CD69 ja sytokiinien IFN-γ: n ja IL-2 jälkeen PPD-stimulaatiota. Vaikka CD4-T-solujen taajuuksia esiin negatiivisen kontrollin kanssa ärsyke oli yleensä hyvin alhainen (mediaani 0,008%, IQR 0,016%), yksittäiset prosenttiosuus PPD-spesifisten CD4-T-solujen on laskettu vähentämällä saatu taajuus vastaavilla valvontaa stimulaatiota. Yhdellä potilaalla, perusarvosta ei ollut käytettävissä. Koska tämä potilas ei ollut spesifistä immuniteettia viikon kuluttua hoidon aloittamisesta, lähtötilanteen immuniteetti pidettiin alle määritysrajan. Esimerkkeinä tuottavia soluja IFN-γ, 9/18 potilasta (50,0%) oli PPD-spesifisten T-solujen edellä toteamisraja. Tämä oli verrattavissa valvontaa, jossa PPD-spesifisten T-solujen oli havaittavissa 24/54 yksilöiden (44,4%, p = 0,79, kuvio 1A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun potilaita ositettiin IL-2 tuottaa PPD-spesifisten T-solujen (kuvio 1A), jotka olivat 88,9% yhtäpitävä IFN-γ positiivisuus. Kun kvantitatiiviset analyysit suoritettiin yksilöiden PPD-reaktiivisen CD4-T-solujen taajuuksia edellä toteamisraja, ei ollut eroa mediaani taajuuksilla IFN-γ: n tai IL-2 tuottaa PPD-reaktiivisten T-solujen molemmissa ryhmissä (IFN-γ: potilailla 0,183 %, IQR 0,399% vs. kontrollit, 0,161%, IQR 0,355, p = 0,73 ,; IL-2: potilaat 0,153%, IQR 0,241% vs. kontrollit, 0,156%, IQR 0,347, p = 0,88, kuvio 1 B). Niinpä esikäsittely immuniteetin kohti PPD potilailla näyttää jakelu joka on verrattavissa terveisiin verrokkeihin.

(A) prosenttiosuus yksilöitä, joilla on ennestään immuniteetin kohti PPD (≥0.05% CD69 positiivinen interferoni-γ ( IFN-γ) tai interleukiini-2 (IL-2), joka tuottaa CD4-T-soluja) ja (B) PPD-reaktiivisten T-solujen taajuudet IFN-γ: n tai IL-2 tuottavien CD4-T-solujen määrä määritettiin virtsarakon syövän potilaille ennen BCG-hoitoa ( n = 18) ja ikä-haun terveillä verrokeilla (n = 54). Yhdellä potilaalla, perusarvosta ei ollut käytettävissä. Koska tämä potilas ei ollut spesifistä immuniteettia viikon kuluttua hoidon aloittamisesta, lähtötilanteen immuniteetti pidettiin alle määritysrajan. T-solujen taajuudet kunkin yksittäisen (ympyrät) sekä mediaani ja kvartiiliväli (IQR) näkyvät, ja määritysrajan (0,05% reaktiivisia CD4-T-soluja) edustaa katkoviivalla.

Rakonsisäinen BCG-sovellus indusoi systeemistä T-soluvasteen kohti PPD

induktion PPD-spesifistä immuniteettia arvioitiin sitten ennen kuin 1, 2 tai 3 ja 4 tai 5 viikon kuluttua ensimmäisestä tiputuksen. Pistekuvaajat PPD-spesifisten T-solujen tuottamaan IFN-γ johdettu tyypillinen potilaan on esitetty kuviossa 2A. Vaikka tämä potilas ei osoittanut mitään erityisiä immuniteetti lähtötilanteessa ja viikon kuluttua tiputtamisen, vahva PPD-spesifisten T-solujen vaste oli havaittavissa viikon kuluttua 2

nd tiputusta (viikko 3) ja T-solujen tasot entisestään viikolla 5 . Sen sijaan SEB-reaktiiviset T-solut olivat helposti havaittavissa ja taajuudet olivat melko vakaana ajan kuluessa. Nämä havainnot varmistettiin kun pitkittäin analysoitaessa PPD-spesifisten T-solujen kaikista 18 potilasta. PPD-reaktiivinen T-solujen taajuuksia ei muuta ensimmäisen viikon kuluessa. Kuitenkin mediaani taajuudet IFN-γ tuottavat PPD-spesifisten T-solujen osoitti noin 5-kertainen lisäys 0,05%: iin lähtötilanteesta 0,23% viikolla 2/3, ja edelleen kasvoi 8-kertaiseksi viikon jälkeen 4/5 (mediaani 0,42% , p = 0,0007, tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, kun ositettiin potilaiden kanssa ja ilman ennalta olemassa olevan immuniteetin, kasvu PPD-reaktiivisten T-solujen jälkeen BCG-tiputuksen oli merkitsevästi voimakkaampi henkilöillä, joissa lähtötasot olivat alle määritysrajan, joka piti paikkansa sekä IFN-γ ja IL-2 tuottavien T-solujen (kuviot 2B ja 3). Kuitenkin suurin taajuudet olivat merkittävästi suurempi potilailla, joilla ennestään immuniteetin (p = 0,02, tuloksia ei ole esitetty). Huomattavaa on, että SEB-reaktiiviset T-solut olivat havaittavissa koko seurantajakso, ja niiden taajuudet eivät muutu ajan myötä (kuvio 2C). Kun määrällisesti prosenttiosuus yksilöitä, jotka hankitaan PPD-spesifisen immuniteetin ajan, IFN-γ tuottavien T-solujen stimulaation jälkeen PPD oli havaittavissa 16/18 potilaalla (88,9%) viikolla 2/3, ja kaikilla potilailla viikolla 4 /5 (p = 0,0004, taulukko 2). Tämä katsoi myös totta, kun IL-2 tuottavia T-soluja määrällisesti (p = 0,0013, taulukko 2). Yhdessä, systeeminen induktio soluvälitteisen immuniteetin kohti PPD voidaan kvantifioida suoraan kokoverestä jälkeen BCG-tiputuksen ja PPD-spesifisen immuniteetin indusoitiin kaikilla potilailla.

(A) Edustavia esimerkkejä kinetiikkaan IFN -γ positiivinen CD69 /CD4-T-soluja ennen kuin 1, 3 ja 5 viikkoa alkamisen jälkeen BCG-hoitoa. Tässä potilasryhmässä, kolmas tiputusta viivästyi 2 viikkoa johtuu virtsatieinfektio ilman kuumetta. Numerot oikeassa yläkulmassa neljänneksessä viittaavat prosenttiosuus CD69 /IFN-γ positiivisten solujen kaikkien CD4-T-solujen stimulaation jälkeen PPD, PBS (negatiivinen kontrolli), tai

Staphylococcus aureus

enterotoksiini B (SEB, positiivinen kontrolli ). Tulokset on IL-2 tuottavien solujen tässä potilasryhmässä samasta stimuloiva reaktio sisältyvät kuviossa 4A. Kinetics prosenttiosuuden (B) PPD-spesifisten tai (C) SEB-reaktiivisen CD4-T-soluja, jotka tuottavat IFN-γ tai interleukiini-2 (IL-2): lla kaikista potilaista aikana induktion kurssin. Induktio PPD-reaktiivisten T-solujen on erikseen näytetään potilaiden kanssa ja ilman havaittavaa immuniteetti lähtötilanteessa. Kaikki potilaat tutkittiin PPD-spesifisten T-solujen, ja 12 potilasta sai pituussuunnassa analysoitiin SEB-reaktiivisen CD4-T-solut (6/18 potilasta oli puuttuu perustason arvo). Katkoviivat esittävät kinetiikka kunkin potilaan ja toistuva mittaus yhdeltä potilaalta jälkeen 2 tai 3 ja 4 tai 5 viikkoa on ryhmitelty keskiarvoina. Lihavoitu viiva osoittaa mediaani prosenttiosuuden reaktiivisia CD4-T-solut.

kasvu PPD ja SEB-reaktiivinen CD69 positiivinen IFN-γ tuottavien T-solujen välillä lähtötilanteen ja maksimiarvo aikana BCG-instillations kvantifioitiin kaikille potilaille ja tulokset stratifioitiin potilaille, joilla on negatiivisia ja positiivisia PPD-asema ennen hoitoa. Mediaanit ja kvartiiliväliä osoitetaan.

Hoitoviikkoon

lähtötilanteessa

1

2-3

4-5

kokonaismäärä patients18181818IFN-γ positiivinen ( %) 9 (50,0%) 9 (50,0%) 16 (88,9%) 18 (100,0%) p = 0.0004IL-2 positiivinen (%) 9 (50,0%) 11 (61,1%) 16 (88,9%) 18 (100,0 %) p = 0.0013Table 2. Prosenttiosuus yksilöiden positiivisen immuunivasteen yläpuolella detektioraja 0,05% kohti PPD ennen ja jälkeen BCG-tiputtamisen.

CSV Lataa CSV

Sytokiiniprofiilit PPD-spesifisten T-solujen jälkeen BCG-tiputuksen eroaa havaittu terveillä verrokeilla

Olemme aiemmin osoittaneet, että väheneminen kahden sytokiinin positiivisuus PPD-spesifisten T-solujen on havaittu potilailla, joilla on aktiivinen tuberkuloosi, kun taas suuri osa IFN-γ /IL-2 double-positiivisten T-solujen on tyypillistä yksilöiden epäaktiivisia valtioissa [16]. Sen tutkimiseksi, toistuva antigeenin kosketuksiin elävien BCG liittyy muuttunutta sytokiiniprofiilia ja onko tämä eroaa potilailla ja ilman ennalta olemassa olevan immuniteetin, IFN-γ /IL-2: n ilmentymisen kuviot potilailla jälkeen BCG-tiputuksen verrattiin niille PPD-positiivisesta kontrollista. Varmistaa tilastollisesti vankan analyysi T-solualapopulaatioiden, tämä analyysi rajoitetaan näytteisiin, joissa kokonaismäärä sytokiiniä tuottavat T-solujen stimulaation jälkeen yli 20 tapahtumaa taustan yläpuolella. Edustaja pistekuvaajat of PPD- ja SEB-reaktiivinen sytokiinin profiilit ennen hoitoa ja sen aikana potilaan ja ohjaus on esitetty kuviossa 4A. Tuoreiden kosketuksiin elävien BCG, potilas oli vain 48,1% ja 55,4% IFN-γ /IL-2 double-positiivisten T-solujen jälkeen viikolla 2 ja 5, vastaavasti, kun taas 78,2% PPD-reaktiivisia T-soluja oli kaksinkertainen -positiivinen valvonnassa. Kaikilla testatuilla yksilöitä, prosenttiosuus kaksinkertaisen positiivisten solujen tiputtamisen jälkeen oli merkitsevästi pienempi potilailla verrokkeihin verrattuna (p = 0,0003, kuva 4B). Prosenttiosuus kaksinkertainen positiivisten solujen kesken SEB-reaktiivisia T-soluja, oli suurempi valvontaa, vaikka tämä ero oli vähäisempää (p = 0,03, kuva 4B). Mielenkiintoista, hiljattain aiheutettujen PPD reaktiivisia T-soluja potilailla, joilla ei ennestään immuniteetti oli suurempi prosenttiosuus IL-2 yhden tuottavien T-soluja verrattuna potilaisiin, joilla on ennestään immuniteetin (p = 0,02, kuvio 4C). Kääntäen, PPD-immuniteetin jälkimmäisessä osoitti siirtymistä IFN-γ single-positiivisten T-solujen (p = 0,01, kuvio 4C). Yhdessä tämä osoittaa, että toistuva BCG-kosketin on liitetty muutoksiin sytokiinin ominaisuudet kuin potilailla, joilla on aktiivinen tuberkuloosi. Siirtymistä IL-2 single-positiivisuus on tyypillistä primaarisessa immuniteetti, kun taas siirtymistä IFN-γ single-positiivisuus näyttää liittyvän immuniteetin uudelleenaktivointi.

(A) edustaja pistekuvaajat virtauksen -cytometric analyysi IFN-γ: n ja IL-2: n ilmentymisen profiilit PPD ja SEB-reaktiivisia CD4-T-solut potilaaseen ennen, 3 ja 5 viikkoa sen jälkeen, kun BCG-hoitoa (saman potilaan kuin kuviossa 2A), ja terveellä kontrolli. Prosenttiosuudet on esitetty kolme kvadranteissa viittaavat suhteellinen osuus IFN-γ single-positiivisia, IFN-γ /IL-2 double-positiivisia ja IL-2 yhden positiivisten solujen kaikkien sytokiini-positiiviset CD4-T-solut. (B) prosenttiosuudet IFN-γ /IL-2 double-positiivisten solujen kesken PPD- (ympyrät) tai SEB-reaktiivisia (neliöt) CD4-T-solujen määrä määritettiin kaikille potilaille viikolla 2/3 (PPD n = 16; SEB n = 18) sekä viikko 4/5 (PPD n = 18; SEB n = 18), joka oli riittävän määrän sytokiiniä tuottavia soluja sen jälkeen, kun tietyn stimulaation (≥20 tapahtumat). Alle 20 tapahtumaa mitattiin 2/9 potilailla, joilla kokonaispoistoprosenttiin PPD CD4 T-soluja lähtötilanteessa oli yli 0,05%. Viikolta 2/3, kaikki 9 lähtötason positiivinen potilailla oli tapahtuma määrä on yli 20, kun taas 2/9 lähtötason negatiivinen potilaista oli edelleen alle määritysrajan 0,05% ja oli 20 tapahtumaa. Kaikki muut näytteet olivat tapahtuma laskee yli 20. Sytokiini profilointi CD4-T-solujen suoritettiin 16 ohjaa jälkeen PPD-stimulaation (mustat ympyrät) ja 7 ohjaa jälkeen SEB-stimulaation (musta neliö). (C) osuus IL-2 yhden positiivisen ja IFN-γ yhden positiivisten solujen kesken PPD-spesifisten T-solujen viikon jälkeen 2/3 ositettiin potilailla, joilla on negatiivinen (n = 7) ja positiivinen PPD-tila (n = 9) ennen hoitoa. Kahdessa lähtötason negatiivinen potilasta määrä sytokiinien positiivisten T-solujen oli edelleen alle 20 tapahtumaa. Mediaanit ja kvartiiliväliä osoitetaan.

Olemassa oleva solu immuniteetin PPD ei näytä ennustaa hoidon onnistumiselle

Lopuksi, vaikka tässä tutkimuksessa rajoittaa otoskoko on pieni ja heterogeeninen ylläpitohoito, alustavan analyysin esikäsittelyn PPD-reaktiivisuus ja PPD-spesifisten T-solujen lisääntyminen suhteessa hoidon onnistumiselle suoritettiin. Kahdeksan potilasta luokiteltu ei-vastetta (keskimääräinen aika relapse 7,5 ± 5,9 kuukautta) ja 10 saivat vasteen (keskimääräinen seuranta-30 ± 22,7 kuukautta). Läsnäolo PPD-spesifisten T-solujen lähtötilanteessa ei näytä liittyvän myöhemmän hoidon onnistumiselle, sillä lähtötilanteessa PPD-spesifistä immuniteettia, mitattuna IFN-γ reaktiivisia soluja, oli läsnä 4 ulos 8 reagoimattomat ja 5 ulos 10 vasteen (p = 1,0), eikä ollut mitään eroa uusiutumista elinaika molemmissa ryhmissä (kuvio 5A). Samoin laajuus PPD-spesifisten T-solujen lisäystä ei ennustanut hoidon onnistumisen, koska kasvu IFN-γ reaktiivisia CD4 T-solujen taajuuksia jälkeen BCG tiputtamisen oli 7,1-kertainen (IQR 10,7) ei-vastetta ja 8,2-kertainen (IQR 11,7) hoitovasteen (p = 0,83, kuvio 5B). Siten vaikutus ennestään immuniteetin tai systeemistä lisääntyminen PPD-reaktiivisten T-solujen jälkeen BCG-induktion hoidon onnistuminen ei ollut havaittavissa yhteydessä tässä tutkimuksessa.

(A) uusiutuminen elinaika riippuen PPD-asema ennen hoitoa. (B) kasvu prosenttiosuudet IFN-γ tuottavien CD4-T-solujen kaikkien T-solujen stimulaation jälkeen PPD välillä lähtötilanteen ja maksimiarvo verrattiin ei-vastetta (valkoiset ympyrät, n = 8) ja vasteen (musta ympyrä, n = 10).

keskustelu

tiputtelu elävien BCG-basilleja on tehokas hoito estää etenemistä ei-lihaksen invasiivinen virtsarakon syöpä [26]. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet solunsisäisen sytokiinin värjäystä luonnehtia induktion PPD-spesifisten T-solujen pidättämistä ennen ja sen aikana BCG-hoitoon. Osoitamme, että standardi BCG-induktio kurssi indusoi systeemistä PPD-spesifisten T-soluvasteen, joka kasvaa suuruus ajan, ja on selkeästi havaittavissa kaikilla potilailla 4-5 viikon hoidon jälkeen. Yhdenmukainen havainnot immuniteetti kohti muita taudinaiheuttajia tai rokotteiden [27,28], sekä induktion kinetiikka ja sytokiinien profiileja vaihteli sen mukaan, ennalta olemassa oleva immuniteetti kohti PPD. Koska immuunivaste profiilin tiputtamisen jälkeen elävien BCG-basilleja näyttää olevan samanlainen kuin aktiivisen infektion

M. tuberkuloosi

[16,29], tämä hoito voi elinkelpoisen malli pituussuunnassa tutkia induktion antigeeni-spesifisen immuniteetin ennen ja jälkeen luonnollisen infektion

M. tuberkuloosi

ihmisillä, jossa tietoa on rajoittaa se, että tartunta-aikaa on harvoin tiedossa.

havainnot potilailla, joilla ei ennestään immuniteetti osoittaa, että

de novo

induktio systeemisen T-soluvasteen kohti PPD havaitaan vain 2-3 viikkoa ensimmäisen jälkeen tiputuksen. Tämä viivästynyt ajankulku on tyypillistä hitaasti jäljittelevän bakteereja, ja samankaltainen kuin T-solujen immuniteetin luonnollinen

M. tuberkuloosi

infektion tai rokotuksen jälkeen, joka kestää useita viikkoja induktioon [30,31]. Yhdenmukainen aktiivinen replikaation BCG-bakteerit, sytokiini-ilmentymistä profiili BCG-indusoidun T-solut sekä potilailla, joilla on ilman ennalta olemassa olevan immuniteetin osoitti laskua dual-positiivisuus, joka on samanlainen kuin havaintomme potilailla, joilla on aktiivinen tuberkuloosi [16 ]. Huomattavaa on, että vaikka tämä yhtenäinen lasku dual-positiivisten T-solujen potilaalla on aktiivinen tuberkuloosi, se oli epäselvää, miksi sytokiiniprofiilia joillakin potilailla esiintyi siirtymistä IFN-γ ja muut melko siirtynyt kohti IL-2 [16]. Tulokset Tämän tutkimuksen osoittavat nyt, että tämä näyttää liittyvän läsnäolo tai puuttuminen ennalta olemassa olevan immuniteetin, sillä suurempi prosenttiosuus vasta indusoima T-solut potilailla, joilla ei ole valmiiksi olemassa oleva immuniteetti on siirtynyt kohti IL-2 single-positiivisuus . Tämä on sopusoinnussa määräävän aseman IL-2 positiivisia PPD-spesifisten T-solujen yli IFN-γ positiivisia soluja, jotka oli hiljattain kuvattu vauvoilla varhain BCG-rokotteen [31]. Tämä sytokiiniprofiilia myös muistuttaa akuutisti ratkaista infektioiden ja saattaa pitää lisääntymisaktiivisuus varmistaa laajentamista immuniteetin [27]. Mielenkiintoista, BCG aiheuttama immuniteetti potilailla, joilla on ennestään immuniteetin pikemminkin näytteillä siirtymistä IFN-γ single-positiivisuus, joka on yhdenmukainen sytokiini profiilit antigeenispesifisten T-solujen aikana aktivoiminen infektiot kuten sytomegalovirus, joka on myös ominaista vähennys IFN-γ /IL-2 double-positiivisuus ja samanaikainen siirtyminen IFN-γ single-positiivisten solujen [32]. Nämä havainnot saattavat olla merkitystä myös potilaille, joilla on aktiivinen tuberkuloosi tai niiden yhteyksiä, joissa ennalta infektio tila on harvoin tiedossa. Tässä tilanteessa, ero sytokiini profiilit

M. tuberkuloosi

erityinen T-soluja voidaan käyttää erottamaan yksilöiden ensisijainen tartunnan uudelleen aktivoituminen ja siten voi olla apua jäljittämisessä luonnon historiassa

M. tuberkuloosi

infektio.

PPD-spesifisten T-soluvasteiden osoittavat huomattavaa yksilöiden välistä eroja tietyllä ajankohtana ennen ja annon jälkeen. Tätä havainnollistaa se, että T-solujen tasot, jotka saavutettiin 4-5 viikkoa tiputtamisen jälkeen potilailla, joilla ei ennestään immuniteetin olivat samaa luokkaa kuin lähtötasot potilailla, joilla on ennestään immuniteetin. Koska proliferatiivinen kyky havaittiin lisäävän aikana BCG-hoidon [10], tämä tarkoittaa sitä, että riittävä T-solujen tasot voidaan saavuttaa aiemmin ja vaativat vähemmän tiputtamisen syklien yksilöiden ennestään immuniteetin. Erityisesti rooli ennestään immuniteetin lyhentää aikaa tiputuksen kasvaimen tunkeutuminen tukevat tuoreessa tutkimuksessa hiirillä, jotka vakuuttavasti osoitti, että parenteraalinen ennalta immunisointi BCG paitsi kiihtynyt kasvain tunkeutumista, mutta myös terapeuttinen teho [9]. Vaikka systeeminen immuniteetti voidaan arvioida myös käyttämällä iho-testaus tai proliferaatiomäärityksillä [33,34], virtaus-metrimittausmenetelmille määritys voidaan suorittaa yhden päivän aikana ja käytetään kliinisessä puitteet yksilöidyn seuranta induktion tietyn immuniteetin. Tätä lähestymistapaa voitaisiin käyttää myös tutkia tehoa muiden tiputtamisen strategioita, joilla on alentunut annokset tai vähemmän syklejä, ja siten osaltaan vähentää toksisuutta.

Hiirimallit ovat osoittaneet, että systeemisen immuniteetin BCG-tiputuksen voi toimia -arvioinnin määrä T-solujen terapeuttista potentiaalia paikalla kasvaimen [9]. Todisteet kasvaimen infiltroituneen T-solujen ja sen yhteydessä hoitovaste ihmisillä on myös osoitettu immunohistokemiallisesti biopsioista [35], mutta tämä on vaikea suorittaa niin seulontatyökaluna rutiininomaisesti. Kuitenkin positiivinen iho-testi voidaan pitää tulehdusreaktio, joka perustuu T soluinfiltraat- paikalla ihon kovettuminen, ja iho-testi kovettuminen yleensä korreloi PPD-reaktiivisten T-solujen analysoitiin kokoverestä [23,25]. Niinpä monet tutkimukset ihmisillä ovat sen vuoksi, joiden tarkoituksena on assosioida iho-testi muuntaminen pitkäaikaisesta hoidon jälkeen, mutta tulokset olivat heterogeenisiä [36,37]. Vaikka Tutkimusta ei oltu vankka tulos analyysi, eikä esikäsittely taajuuksia eikä induktion kinetiikka PPD-spesifisten T-solujen havaittu mitään havaittavaa yhdessä pitkäaikaisen hoitotulokseen. Sen lisäksi, että alhainen otoskoko, useat syyt voivat selittää tämän. Mitä tuloksen analyysi, tutkimuksemme rajoitti se, että systeeminen immuniteetti vasta arvioitiin induktion aikana kurssin.