Krooninen sairaus

tiivistelmä

suppressori sytokiinisignaloinnin (SOCS) perhe on tärkeä negatiivinen säätelijä sytokiinisignaloinnin ja sääntelyn purkaminen SOCS on ollut mukana monissa syöpien riskiä. Kaikki kohdunkaulan syövän solulinjat testattiin osoitti pienempi ilmentyminen SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 kuin normaali kudos tai solulinjoja. Immunohistokemia tulos SOCS proteiinien ihmisen kohdunkaulan kudos vahvisti myös, että normaali kudos ilmaistaan ​​korkeampaa SOCS proteiinien naapuripisteitä kasvain. Samanlainen sääntelyä SOCS vuonna muiden syöpien, DNA: n metylaatio vaikutti SOCS1 downregulation in CaSki-, ME-180, ja HeLa-solut. Kuitenkin ilmaus SOCS3 tai SOCS5 ei talteen inhibitio DNA: n metylaation. Histonien deasetyloitumisen voi olla toinen sääntelyn mekanismi, joka osallistuu SOCS1 ja SOCS3 ilmaisun kuitenkin SOCS5 ilme ei ollut vaikuttanut DNA: n metylaatio eikä histonien deasetylaatiolla. Kohdunulkoinen ilmaus SOCS1 tai SOCS3 siirrettävä radioresistance HeLa-solut, jotka hiljaista SOCS signalointi säätelee vaste säteilyn kohdunkaulan syöpä. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että SOCS ilmaisua tukahdutettu, osittain epigeneettiseltä ja muuttunut SOCS1 ja SOCS3 ilmaisun voitaisiin edistää säteilylle fenotyyppi kohdunkaulan syövän.

Citation: Kim MH, Kim MS, Kim W, Kang MA, Cacalano NA, Kang SB, et ai. (2015) suppressori sytokiinisignaloinnin (SOCS) Genes vaiennetaan DNA hypermetylaation ja Histone deasetylointi ja säännellä vastaus Sädehoito vuonna kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 10 (4): e0123133. doi: 10,1371 /journal.pone.0123133

Academic Editor: Rodney John Scott, Newcastlen yliopisto, AUSTRALIA

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 22 helmikuu 2015; Julkaistu 7 huhtikuuta 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: tietoja ei voi saataville johtuen eettisistä rajoituksista. Tiedot ovat saatavilla KIRAMS Institutional Data Access /eettinen komitea tutkijat, jotka täyttävät pääsyä luottamuksellisia tietoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Nuclear T D ohjelma tiede, ICT ja Future suunnittelu, Korean tasavalta (KIRAMS RTR: 504580-2012). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jäsenet vaimennin on sytokiinisignaloinnin (SOCS) perheen proteiinien avainrooleja negatiiviseen säätelyyn sytokiinien signaalitransduktion. Nämä proteiinit toimivat negatiivista palautetta silmukka, estämällä sytokiiniaktivoitujen Janus-kinaasi /signaalimuunta- ja aktivaattorien transkription (JAK /STAT) signalointireitin moduloimaan soluvasteiden [1]. SOCS1 näyttää olevan kasvaimia estävä aktiivisuus [2] ja palauttaminen SOCS1 geeniekspression aiheuttaa kasvun hidastuminen ja apoptoosin induktiosta HCC-soluissa [3]. Äskettäin Sobti et al osoittivat menetys SOCS1 ilmaisun promoottorin metylaation yli 60% kohdunkaulasyöpätapauksista ja ehdotti, että on tärkeää SOCS1 downregulation HPV aiheuttaman kohdunkaulan syövän synnyn [4]. SOCS3 on mukana kehittämässä ja etenemiseen useiden maligniteettien, ja on olemassa merkkejä siitä, että SOCS3 on eri toimintoja riippuen kasvaimen alkuperän. Ihmisen keuhko [5], hepatosellulaarinen [6], sekä pään ja kaulan alueen syöpä [7], SOCS3 on vaiennetaan hypermetylaation, joka antaa kasvun etua syöpäsoluja. Sen sijaan, SOCS3 on havaittavissa rintasyövän [8], ja SOCS3 ilmentyminen kasvoi kehittymistä ja etenemistä eturauhassyövän [9].

On yleisesti hyväksyttyä, että kohdunkaulan syövät ovat säteilylle ja hoidon tulokset yhä lupaava vaikka kasvain on diagnosoitu liian myöhäistä hoitoon käytetään radikaali kohdunpoisto. Koreassa, kohdunkaulan syöpä on merkittävä terveysongelma naisten osuus 9,8% uusista naisten syöpätapauksista. Vaikka ilmaantuvuus ja kuolleisuus ovat vähentyneet, kohdunkaulan syövän vanhuksilla on kasvussa [10]. Kuitenkin suurin osa hoidon epäonnistumisista pitkälle kohdunkaulan cancersoriginate päässä kehittämistä radioresistance, ongelma, että emme ole vielä ratkaistu. Mielenkiintoista on, SOCS1 herkistää glioblastoomasolut säteilylle, kun taas SOCS3 parantaa kasvainsolun eloonjäämistä ja radioresistance [11]. Zhou et al. ehdotti, että kohdistaminen SOCS ilmentymistä tai toimintaa glioblastoomasoluissa voi olla hyödyllinen strategia herkistää kasvainsolut säteilylle. Vaikka DNA-vaurio vastereitissä on kriittinen hallintaan genotoksinen stressi, tulos vaste on erittäin riippuvainen solujen yhteydessä. On selvää, muut signaalinvälitysreittien aktivoidaan solussa aikaan DNA-vaurion voivat moduloida vastetta ja muuttaa lähdön DNA-vaurion aiheuttaman signaalitransduktion [12].

Esillä olevassa tutkimuksessa, olemme analysoineet SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 geeni-ilmentymisen paneelin solulinjoja, jotka edustavat ensisijaista,

de novo

ihmisen kohdunkaulan cancersthat ovat säteilylle. Olemme osoittaneet, että SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 ilmentyminen on tukahdutettu, osittain epigeneettiseltä DNA hypermetylaation ja histonien deasetylaatiolla. Osoitamme, että muuttunut SOCS1 ja SOCS3 ilmentyminen voi myötävaikuttaa säteilylle fenotyyppi kohdunkaulan syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, normaali kohdunkaula kudosten ja estäjähoidon

Ihmisen kohdunkaulan sinoomasolulinjoja CaSki-, HeLa, ME-180, ja SiHa saatiin Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea). Normaalit ihmisen fibroblastisolulinjat CCD-18Lu, CCD-18Co, ja Wi-38 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). CaSki ja ME-180-solulinjoja ylläpidettiin RPMI-1640 (PAA Laboratories, Pasching, Itävalta) ja HeLa, SiHa ja normaali fibroblastisolulinjat pidettiin DMEM: ssä (PAA Laboratories), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ( Lonza, Walkersville, MD, USA) ja 100 yksikköä penisilliiniä ja streptomysiiniä (PAA Laboratories). Kaikki solut viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa. Eston DNA metyylitransferaasi, solut ympättiin tiheydellä 2-5 x 10

5/100 mm ruokia ja käsiteltiin 5-atsasytidiini (5-azaC) 10 uM: ssa 72 tuntia. Media ja 5-azaC vaihdettiin 24 tunnin välein. Eston histonideasetylaasi, soluja käsiteltiin Trichostatin A (TSA), 100 tai 200 nM: ssa 16 tuntia. Molemmat inhibiittorit ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA). Normaalin kohdunkaulan kudos saatiin potilaalta, joille tehtiin kohdunpoisto myoma kohtu. Saimme kirjallinen suostumus potilaalta ennen leikkausta. Institutionaalinen Review Board hyväksyi lupamenettelyssä ja tutkimussuunnitelman (K-1103-003-016) klo Koreassa Institute of säteily- ja lääketieteen.

RealtimeqRT-PCR

Yhteensä solujen RNA ja kudos eristettiin käyttäen Hybrid-R Kokonais-RNA Purification Kit (GeneAll, Seoul, Korea). Yhteensä 1 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Japani) ja 25 pmol oligo-dT-aluketta ja 50 pmol satunnainen hexamer. cDNA laimennettiin 1/10 EZ laimennuspuskuria (Takara Bio Inc.), ja 2 ui käytettiin templaattina 20 ul: PCR-reaktion. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen Esiseos Ex Taq (Takara Bio Inc.) on CFX-96 lämpösyklilaitteessa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Seuraavia alukkeita käytettiin PCR: Syklofiliiniesimerkkeihin A (CypA) (sense, ACG GCG AGC CCT TGG, antisense, TTT CTG CTG TCT TTG GGA CCT), SOCS1 (sense, TTT TCG CCC TTA GCG TGA A; antisense, CAT CCA GGT GAA AGC GGC), SOCS3 (sense, GCT CCA AAA GCG AGT ACC AGC; antisense, AGT AGA ATC CGC TCT CCT GCA G), ja SOCS5 (sense, AAA AGT TGG ATC TGT TCC TAT GCC; antisense, ACT ATT ATC TGA CTT GTT TG). Fluorogeeniset koettimet (6-karboksifluoreskeiini) olivat: CypA, CGC GTC TCC TTT GAG CTG TTT GCA; SOCS1, CCT CGG GAC CCA CGA GCA TCC; SOCS3, TTG CGC ACG GCG TTC ACC AC; SOCS5, AGG ATG ATT TTG TGA ACC GTG AAG TAC GTG A. DNMT1 geenin ilmentyminen mitattiin käyttämällä SYBR esisekoite Ex Taq II (Takara Bio Inc.) alukkeilla (sense, CTT CTT CAG CAC AAC CGT CA, antisense, GAA GAG CCG GTA GGT GTC AG). Suhteellinen kvantifiointi geenin ilmentyminen oli laskettu ddC (t) menetelmä, jossa CypA mRNA käytettiin normalisointi. PCR-ohjelma oli seuraava: sen jälkeen, kun ensimmäinen ennalta inkubointivaihe 95 ° C: ssa 3 min, oli 45 sykliä, joista kukin koostuu 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C: ssa 60 s. Viimeinen vahvistus jakson seurasi sulaa käyräanalyysi jotta varma spesifisyys qRT-PCR.

immunohistokemia

Kaikki kudosnäytteet saatiin täysin eettisten hyväksyntää KIRAMS Institutional Review lauta (IRB nro K-1103-003-016). Immunohistokemiallinen värjäys SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 suoritettiin automaattisen immunohistokemiallinen värjäyslaitteesta (Autostaineriin 480, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA) formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin kudososaa okasolusyöpää saatu kohdunkaulan. Kohdat poistettiin parafiini ksyleenillä 15 min ja esikäsitelty mikroaaltouunissa käyttäen 0,01 M sitraattipuskuria (pH 6,0) 30 minuutin ajan. Leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vastaan ​​suunnattuja vasta SOCS1 (1:25, ab62584, Abcam, Cambridge, UK), SOCS3 (1: 100, ab16030, Abcam) ja SOCS5 (1: 100, sc-100858, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA, USA) 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja havaitaan käyttämällä UltraVision LP Detection System HRP Polymer DAB Plus Kromogeeni (Thermo Fisher Scientific).

Metylaatiospesifinen PCR (MSP) B

MSP suoritettiin tutkimaan metylaatiostatuksen promoottorin alueiden SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 geenit . Bisulfiittikäsittelyn jälkeen muuttaa DNA, PCR suoritettiin erottaa metyloitua päässä metyloitumattoman DNA, kuten ovat kuvanneet Herman et ai [13]. Genomi-DNA uutettiin solulinjoista käyttämällä Exgene Cell SV Kit (GeneAll, Korea) ja bisulfiittimodifikaatio genomista DNA: ta suoritettiin käyttäen EZ DNA: n metylaation Kit (Zymo Research, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vetysulfiitilla käsiteltyä DNA: ta monistettiin joko metylaatiospesifistä alukkeita tai alukkeita spesifisiä metyloimaton sekvenssi. Lyhyesti, 20 ui reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 25 ng bisulfiitti muunnettu DNA, 1 x PCR-puskuri, 1,5 mM MgCl

2, 0,25 mM dNTP, 0,5 uM nalliseoksesta ja 1 yksikkö Ex-Taq Hot Start entsyymiä (Takara BioInc) oli käyttää. PCR-tuotteet elektroforoitiin 2% agaroosigeelillä, värjättiin RedSafe Nucleic Acid Värjäys Solution (Intron, Korea) ja visualisoitiin UV-valo. Primer luettelot ja PCR-olosuhteet MSP on koottu S1 taulukossa.

bisulfiittimodifiointi sekvensointi

bisulfiittimodifiointi-käsitelty genomista DNA: ta monistettiin alukkeilla lueteltujen S2 taulukossa. PCR-tuotteet kloonattiin Topo TA-kloonausvektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) tai T-blunt PCR kloonaus Kit (Solgent, Daejeon, Korea). Viisi sattumanvaraisesti kloonit sekvensoitiin ja rinnastettiin käyttämällä QUMA (kvantifiointi työkalu metylointianalyysi).

geenien mukaan shRNA

Lentivirusvektorit shRNA ekspressioplasmidit kohdistaminen DNMT1 kertyi kloonaamalla oligonukleotidien osaksi pLKO. 1. puro vektori. Sekvenssit hiusneulat kohdistaminen DNMT1 ovat: GCCGAATACATTCTGATGGATCTCGAGATCCATCAGAATGTATTCGGC (TRCN0000021890) ja GCCCAATGAGACTGACATCAACTCGAGTTGATGTCAGTCTCATTGGGC (TRCN0000021891). Ohjaus salattu shRNA ilmentävät plasmidi saatiin Addgene seuraavat hiusneula sekvenssi: CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG. Pakkaamiseen, pCMV-dR8.2 dvpr ja pCMV-VSVG käytettiin, jotka molemmat hankittiin Addgene (Cambridge, MA, USA). Tuotannon viruspartikkeleita ja transduktio kohdesoluihin tehtiin sen jälkeen, kun pLKO.1 protokollan Addgene. Supernatantit 293T-solut transfektoitiin shRNA ja pakkaus vektorit kerättiin 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen ja sen jälkeen pitoisuus virus. Tiivistetty virusta käytettiin infektioiden läsnä ollessa 8 ug /ml polybreeniä. Yksi päivä infektion jälkeen, puromysiiniä (1 ug /ml) sovellettiin 4 päivää valita transdusoituja soluja, jotka kerättiin reaaliajassa PCR-analyysiin.

kloonaus SOCS yli-ilmentävät retrovirus- konstrukteja

Rakennelmat yli-ilmentävät SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 tehtiin kloonaamalla SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 ORF osaksi pLNCX2 retrovirusvektoriin (Clontech). SOCS1 ja SOCS3 geenit hiiren peräisin olevat ystävällisesti toimitti Dr. Cacalano NA (UCLA, CA).

Bam

HI-fragmentti, joka sisälsi SOCS1 cDNA koodattu Myc C-päähän tai SOCS3 cDNA merkitty FLAG C-terminaalissa subkloonattiin

Bgl

II sivusto pLNCX2. Klooneja oikeassa suunnassa seulottiin

Eco

RI ruoansulatusta ja sitten varmistettiin sekvensoimalla. SOCS5 geeni hiirestä peräisin ostettiin Openbiosystems (MMM1013-9202191) ja monistettiin sense (5′-AAACTCAGATCTACCATGGATGGATAAAGTGGGGAAAATG-3 ’) ja antisense (5′-AGATATGGATCCCTCGAGCTACTACTTATCGTCATCATCTTTATAATCGATCTTTGCCTTGACTGGTTCTC-3’) alukkeina.

Bgl

II ja

SalI

-fragmentti, joka sisältää SOCS5 FLAG C-päähän, subkloonattiin

Bgl

II ja

Xho

I -kohtaan pLNCX2 retrovirusvektori.

Virus tuotanto sekä vakaiden solujen

SOCS yli-ilmentävät retrovirusvektorit ja pakkaus plasmidit, pCMV-Gag-Pol ja pCMV-VSVG, kotransfektoitiin 293T soluun. Supernatantit 293T-solut kerättiin 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen ja sen jälkeen pitoisuus retrovirus ja käytettiin infektoimaan HeLa-soluja, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä. Yksi päivä infektion jälkeen, G418 (200 ng /ml) levitettiin, kunnes vakaa muodostuneiden pesäkkeiden. Pesäkkeet yhdistettiin tarkistaa SOCS yli-ilmentymisen ja käytetään klonogeenisten määrityksessä.

Western blot-analyysi

Solut hajotettiin SDS-näytepuskuria (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS , 15% glyserolia, ja 0,004% bromifenolisinistä) ja sitten keitettiin 10 minuuttia. Proteiinipitoisuus mitattiin BCA Protein Assay Reagent (Intron). Yhtä suuret määrät solulysaattia erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin nitroselluloosakalvolle, immunoblotattiin ja kemiluminesenssilla käyttämällä ECL detektioreagensseja. Anti-myc, anti-aktiini ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA) ja anti-FLAG-vasta-aine oli Sigma Chemical Co.

klonogeeninen määritys

klonogeeninen eloonjääminen määritettiin solujen kyky ylläpitää klonogeeniset kapasiteettia ja muodostaa pesäkkeitä. Lyhyesti, solut kerättiin eksponentiaalisen vaiheen viljelmistä trypsinoimalla, laskettiin ja ympättiin pesäkkeiden muodostumista. Seuraavana päivänä, gammasäteily toimitettiin käyttäen dual-lähde

137Cs yksikkö annoksella nopeudella 3,2 Gy /min, jossa on GC-3000 Elan säteilyttäjällä (MDS Nordion, Ontario, Canada). Jälkeen 14 päivää, pesäkkeet värjättiin 0,4% kristallivioletilla (Sigma Chemical Co.). Pesäkkeet laskettiin ja ryhmiä 30-soluja pidetään pesäkkeitä. Maljaustehokkuus (PE) edustaa solujen prosenttiosuus ympättiin että kasvaa pesäkkeiden tietyllä viljelyolosuhteissa tietyn solulinjan. Hengissäsäilymisosuus ilmaistuna funktiona säteilytys, laskettiin seuraavasti: Survival jae = pesäkkeiden /(solujen ympätty x PE /100). Olemme toistaneet kokeissa viisi kertaa varmistaa toistettavuutta.

Tilastollinen

Data annetaan keskiarvona ± SD. Pariksi Opiskelijan

t

-testi tehtiin ja

p

-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

SOCS mentymisprofiili incervical syöpä solut

paljastaa mahdollista roolia SOCS kohdunkaulan syövän kehityksen ja leviämisen, ilmaus SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 tutkittiin useissa ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa, CaSki-, HeLa, ME-180, ja SiHa. MRNA taso SOCS1 (kuvio 1A), SOCS3 (kuvio 1 B), ja SOCS5 (kuvio 1 C) oli huomattavasti alhaisempi kaikissa kohdunkaulan syövän solut testattiin kuin normaalissa kohdunkaula kudosten ja perustettu normaali paksusuoli (CCD-18Co) tai keuhkon fibroblasti (CCD -18Lu, WI-38) solulinjat,

Expression of SOCS1 (A), SOCS3 (B), ja SOCS5 (C) geenin tutkittiin qRT-PCR normaalissa kohdunkaulassa (N Cx) kudoksen, kolme normaali fibroblastisolulinjat (CCD-18Co, CCD-18Lu, WI-38) ja kohdunkaulan syöpä solulinjoja (CaSki-, HeLa, ME-180, SiHa). Ilmentymistaso normaalin kontrollinäytteitä merkitty avoin baari ja kohdunkaula syöpäsolun suljettu bar. Tähdellä (*), tilastollisesti merkitsevä (

p

0,05).

Varmista, että alempi ilmaus SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 kohdunkaulan syöpäsolut on yleinen ilmiö havaittu ihmisen kasvaimissa, immunohistokemiallisella värjäyksellä SOCS proteiinien suoritettiin ihmisen kohdunkaulan syövän kudoksen ja ympäröivän normaalin kudoksen kontrollina (kuvio 2). Kaikki kolme SOCS proteiinit värjättiin tummempi normaalissa (N) kudosta verrattuna kasvaimen (T) alueella. Kaikki nämä tulokset johtivat päätelmään, että SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 ilmaisun ishigher normaalissa kudoksessa kuin kohdunkaulan syöpä, ja tukevat sitä mahdollisuutta, että downregulation SOCS voisi edistää kasvaimien syntyyn tai ylläpitoon kohdunkaulan syöpä.

Expression taso SOCS1 (a), SOCS3 (B), ja SOCS5 (C) kasvaimen (T) ja lähialueiden normaali (N) epiteelisolujen on kirurgisesti poistettu potilaan näytteestä verrattiin.

DNA: n metylaatio analyysi SOCS geenin promoottori

Voit selvittää DNA: n metylaatio edistää downregulation SOCS proteiinien kohdunkaulan syöpä, joka on metylaatiospesifistä PCR (MSP) analyysi suoritettiin. SOCS1 ilmentyminen korreloi ero DNA: n metylaation vain CaSki-, HeLa, ja ME-180-soluissa (kuvio 3A). SOCS1 promoottori SiHa- solussa ei metyloitu tällä alueella, vaikka SOCS1 transkription vaimentua SiHa- solujen samanlainen levelas muita kohdunkaula solulinjat. Sen sijaan ei ole DNA: n metylaation havaittiin SOCS3 ja SOCS5 promoottorialueen, ainakin CpG-rikastettu alueella tarkastellaan tässä kokeessa kaikista kohdunkaulan syövän solulinjoissa (kuvio 3A).

(A) Metyyli- erityisiä PCR-analyysillä. Bisulfiitti-käsitelty genomista DNA: ta monistettiin metyloitumattomilla (U) tai metyloituja (M) DNA-spesifisiä alukkeita. (B-D) bisulfiittimodifiointi sekvensointi SOCS1 (B), SOCS3 (C), ja SOCS5 (D). Metyloimattoman CpG sivusto monistettu promoottorialue osoitti avoimena ympyrä ja metyloituja CpG kuin suljettu kehä.

Vahvista MSP seurauksena promoottori alueille SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 geenit käsittää CpG-saarekkeiden kloonattiin ja viisi itsenäistä kloonia sekvensoitiin (kuvio 3B-3D). Metyloimattoman CpG alueet ilmoitetaan avoin ympyrä ja metyloituja CpG sivustot ovat merkitty ympyrä. DNA: n metylaatio havaittiin SOCS1 geenin promoottori CaSki, HeLa ja ME-180-solut, mutta ei SiHa (kuvio 3B), vastaavat MSP tulos (kuvio 3A). Vuonna CaSki- ja HeLa, metyloitua aluetta SOCS1 lähes yhtä suuri metyloitumattomalla alueella, kun taas ME-180-soluissa suurin osa promoottorialue metyloitu. Metyloitu CpG sivustoja ei havaittu SOCS3 ja SOCS5 promoottorit kohdunkaulan syövän cellsor normaaleja soluja (kuvio 3C ja 3D), jolloin myös MSP kokeessa (kuvio 3A).

esto DNA hypermetylaation palauttaa SOCS1 ilme

sen määrittämiseksi, onko DNA: n metylaatio on SOCS1 promoottorin edistää downregulation SOCS1 geeniekspression

in vivo

, käsittelemällä 5-azaC käytettiin inhiboimaan DNMT1 (kuvio 4). In CaSki- (kuvio 4A) ja HeLa (kuvio 4B), SOCS1expression oli näkyvästi lisääntynyt jälkeen 5-azaC hoitoa. SOCS1 ilmentymistä ME-180 on hieman lisääntynyt käsittelemällä DNMT1 inhibiittori (kuvio 4C), mikä mahdollisesti johtui tothe suurempi metylaatio SOCS1 geenin promoottorin ME-180-soluissa (kuvio 3A ja 3B) kuin muita solulinjoja. SOCS3 ja SOCS5 ekspressiota ei vaikuta 5-azaC hoitoa, tuetaan edellinen tulos (kuvio 3), joka DNA: n metylaatio ei mukana downregulation of SOCS3 ja SOCS5. Tämä tulos vahvistettiin shRNA välittämä knock-downof DNMT1 (Kuva 4D-4F). RNA-interferenssi (RNAi) on reitti, jonka lyhyt häiritsevä RNA (siRNA) tai lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) käytetään inaktivoimaan ilmentymisen kohdegeenien [14]. SOCS1 ekspressio lisääntyi estämällä DNMT1 taas SOCS3 ja SOCS5 ilmaisun lisääntyi hieman. Nämä havainnot yhdessä MSP ja bisulfiitti sekvensointi tuloksia, viittaavat mahdollisuuteen, että sääntelymekanismeja muut kuin hypermethylationare tärkeää valvoa SOCS ilme.

CaSki- (A, D), HeLa (B, E), ja ME-180 (C, F) soluja käsiteltiin 10 uM 5-atsasytosiini (5-atsa) 72 h (AC) tai infektoitu lentiviruksen (shSCR) tai lentivirus ilmentävät shRNA kohdistaminen DNMT1 (shDNMT1) (DF). Knock-alas DNMT1 ja SOCS geenin ilmentyminen tutkittiin qRT-PCR. Tähdellä (*), tilastollisesti merkitsevä (

p

0,05).

histoni asetylaatio säätelee SOCS1 ja SOCS3 geeniekspression

histoni deasetylaatiolla on tunnettu epigeneettiset sääntelyn mekanismi testasimme varten yhdessä downregulation SOCS geenin ilmentymisen. Hoito Trichostatin A (TSA), selektiivinen luokan I ja II nisäkkäiden histonideasetylaasi (HDAC) perheille entsyymien lisääntynyt SOCS1 geeniekspression CaSki-, HeLa, ja SiHa mutta ei ME-180-solut (kuvio 5A). SOCS3 geeniekspressio myös talteen CaSki- ja SiHa solujen jälkeen TSA hoidon (kuvio 5B). Kuitenkin näiden geenien ilmentymistä eivät vaikuttaneet TSA WI-38, normaali kontrolli keuhkojen fibroblastisolulinja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SOCS1 ja SOCS3 ovat vaimentua HDAC useissa kohdunkaulan syövän soluja. Tämä on ensimmäinen raportti, joka SOCS ilmentyminen vaikuttaa paitsi hypermetylaation vaan myös histonien deasetylaatiolla kiinteässä kasvainsoluissa. Sen sijaan, SOCS5 geenin ilmentyminen ei muuttunut lainkaan HDAC inhibitio WI-38 tai mikä tahansa kohdunkaulan syövän soluja testattiin (kuvio 5C). Lisätutkimuksia tarvitaan kuvaamaan mekanismeja tukahduttamalla SOCS geeniekspression kohdunkaulan syöpä.

Normaali keuhko fibroblastisoluja (WI-38) ja kohdunkaulan syövän soluja käsiteltiin 0, 100 tai 200 nM TSA 16 tuntia ja SOCS1 (A), SOCS3 (B), ja SOCS5 (C) geenien ilmentyminen mitattiin qRT-PCR: llä. Tähdellä (*), tilastollisesti merkitsevä (

p

0,05).

yli-ilmentyminen SOCS1 tai SOCS3 antaa radioresistance HeLa-solut

olevien biologisten vaikutusten tutkimiseksi lisääntyneen SOCS geenin ilmentymistä kohdunkaulan syöpäsolujen useita HeLa solut vahvistettu infektio retrovirusten yli-ilmentävät SOCS geeni. Ulkosyntyisen SOCS geenin neomysiiniresistentistä HeLa-soluissa varmistettiin western blottauksella (kuvio 6A). Ei ollut mitään merkittävää eroa havaittu solujen lisääntymisen tai elinkelpoisuuden välillä mock tai SOCS yli-ilmentäviä HeLa-soluja (tietoja ei esitetty). Kuten SOCS1 ja SOCS3 ovat olleet mukana vastauksena säteilylle glioblastoma [11], klonogeeniset määritykset suoritettiin arvioimaan mahdollisia osuutta SOCS geenin ilmentymisen radioresponsivity. Kuten on esitetty kuviossa 6, yliekspressio SOCS1 tai SOCS3 tehdä HeLa-solut vastustuskykyisiä säteilylle kuin kontrolli-soluissa (kuvio 6B). Kuitenkin radioherkkyyttä HeLa-solujen yli-ilmentävät SOCS5 ei ole muutettu.

SOCS1, SOCS3 tai SOCS5 yli-ilmentää HeLa-solut määritettiin käyttämällä pLNCX2 retrovirusvektori, ja yli-ilmentyminen vahvistettiin Western blot -analyysillä (A). Klonogeenisten määritys suoritettiin sen jälkeen, kun altistus osoitettuun säteilyannoksen SOCS yli-ilmentäviä soluja (B). Arvot ovat keskiarvoja ± keskihajonta triplikaattikaivoissa kunkin annoksen pisteen. Tähdellä (*), tilastollisesti merkitsevä (

p

0,05)

Keskustelu

SOCS on suuri superperheen proteiinien katsotaan yleensä antagonisteina sytokiinin indusoimaan Janus-aktivoitu kinaasi-STAT-signalointia. Kuitenkin SOCS osallistuu säätelyyn ylimääräisiä signalointireittien, kuten fosfatidyyli 3-kinaasi ja ERK MAPK [15]. Tutkimukset koskevat SOCS ja kohdunkaulan syöpä ovat harvassa. SOCS1may osansa säätelyssä tasojen proteiinin E7 ihmisen papilloomaviruksen, ja vaikuttaa niiden muuttamassa potentiaalia [16]. He havaitsivat IFN-γ hoitoa HeLa ja CaSki solulinjoja johti vähentäminen E7-proteiinin. Kamio et ai. osoitti yli-ilmentyminen SOCS1 alennettu proliferaationopeus sekä HeLa ja CaSki solulinjoissa. Ne vahvistivat myös SOCS1 tukahdutti DNA-synteesiä tarkkailemalla pienentää sisällyttämällä BrdU [16]. Kuitenkin näkökohta immuunivasteen, SOCS1 hiljentäminen parannettu ekspressiotasot proinflammatoristen sytokiinien, kuten interleukiinit, TNF-α: n, IFN-γ mikä parantaa antigeenin esittelyä dendriittisolujen [17]. Siksi ehdotamme nettovaikutus SOCS1 tukahduttaminen menee epäsuotuisa isännät. Tuloksemme viittaavat myös siihen mahdollisuuteen, että SOCS proteiinit toimivat tuumorisuppressoreilla. SOCS1, SOCS3, ja SOCS5 ekspressio oli pienempi kohdunkaulan syövän kuin ympäröivä normaali kudos (kuvio 2), ja mRNA-tasot SOCS geenejä olivat alhaisempia kohdunkaulan syövän solulinjoissa kuin normaalissa kohdunkaulassa kudoksessa tai fibroblastisolulinjat (kuvio 1). Aiemmin on raportoitu, että selvästi tukahduttamisen transkription SOCS geenien johtui DNA hypermetylaation promoottorialueella [6,7,9]. Pitkä lista hypermetyloitunut geenien on yhteinen tunnusmerkki kaikenlaisten ihmisen syövän. Vaikka monet tuumorisuppressorigeeneille vaiennetaan DNA: n metylaatio aikana Karsinogeneesin downregulation SOCS3 ja SOCS5 ollut riippuvainen DNA hypermetylaation (kuviot 3 ja 4). Toinen epigeneettiset geenien mekanismi, histoni hypoacetylation, sovittelee SOCS1 downregulation in CaSki-, HeLa, ja SiHa solut ja SOCS3downregulation vuonna CaSki ja SiHa-soluissa (kuvio 5). SOCS5 geenin ilmentyminen ei muuttunut lainkaan estämällä DNA: n metylaation ja histoni asetylaatio. Koska geenien usein yhdistelmä DNA: n metylaation ja chromatin histoni asetylaatio, tutkimme myös yhdistelmän vaikutusta 5-atsa ja TSA SOCS1 ilmentymistä ME-180 solua. Ei kuitenkaan merkittävää kasvua SOCS1 ilmentyminen havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Epigeneettiset sääntelyn SOCS geenien kohdunkaulan syövän soluissa yhteenveto S3 taulukossa. On syytä muistaa, että olemme analysoineet epigeneettisellä SOCS geenisäätelyn vain neljässä perustettu kohdunkaulan syövän solulinjat ja edelleen tarvitaan vahvistusta, onko tämä asetus mekanismi on sovellettavissa ensisijainen kohdunkaulan syöpään.

tiedot osoittivat, että muuttunutta ilmentymistä SOCS1or SOCS3 vaikutti säteily vastetta kohdunkaulan syöpäsoluja. Yliekspressio SOCS1 ja SOCS3 parantaa solujen selviytymistä jälkeen ionisoiva säteily (Kuva 6). SOCS1 on tärkeä aktivaattori p53 ja DNA-vaurioita vastaus [18]. Koska SOCS1 vaatii SOCS laatikko muodostaa kompleksin ATM, v-Abl- tai Pim kinaasin välittämän fosforylaation saattaisi häiritä tätä vuorovaikutusta ja lohko p53 aktivaation. Näin ollen näyttää siltä, ​​että poikkeava fosforylaatio onkogeeninen kinaasien voi häiritä tuumorisuppressorigeenin toimintaa SOCS1 ainakin kaksi eri mekanismia: (1) fosforyloitu SOCS1 ei pystyisi estämään JAK /STAT-reitin ja vuorovaikutuksessa ATM ja edistää p53 aktivointi [18]. (2) SOCS3improves solu survivalin glioblastoma [11], mutta toiminut kuten chemosensitizer in anaplastinen kilpirauhassyöpä [19]. Keratinosyyttispesifisestä yliekspressio SOCS3 johti atrophied haavan marginaali epiteelissä ja täydennetty tulehdusreaktio haavan keratinosyyttien lisääntyminen kemokiini (MIP-2) ja tulehduksellisten-entsyymiä (COX-2 ja iNOS) ilmaisu [20]. COX-2 vaikuttaa osaltaan etäpesäkkeiden kohdunkaulan syövän edistämällä autokriinistä tai parakriinistä VEGF-ilmentymisen sekä ensisijainen ja metastaasien [21]. Näin ollen on perusteltua olettaa, että SOCS3 yleensä toimii solujen eloonjäämistä tekijä, paitsi anaplastinen kilpirauhassyöpä. Kuitenkin SOCS1 toimi kuten säteilyherkiste glioblastoomasoluissa [11]. Se keskeytti muutosta normaalin kohdunkaulan epiteelin osaksi kasvainsolujen kautta E7-proteiini, kuten kasvain vaimennin. Toisaalta, SOCS1 esti apoptoosin saarekesiirrännäiset vuoksi kaspaasi 3 ja apoptoosia indusoivan tekijän reittejä haimasta rotilla [22], mikä osoittaa, että, sopusoinnussa myös dataa, se edistää solujen eloonjäämistä.

Wild tyyppinen kohdunkaulan syövän solulinjat osoittivat tukahdutettua ilmentymistä SOCS1, SOCS3, ja SOCS5. Sekä DNA: n metylaatio, ja histoni deasetylointi voidaan edistää downregulation SOCS 1, 3, 5 geenien kohdunkaulan syövän soluissa. Talteenotto SOCS1 ja SOCS3 geeniekspressiota vähensi radioherkkyyttä HeLa soluja. Vaikuttaa epätodennäköiseltä, että toiminta SOCS1 ja SOCS3 kiinteissä kasvaimissa toimittava tasaisesti yhteen suuntaan

in vivo

.

tukeminen Information

S1 Taulukko. Primer lista ja PCR edellytys MSP.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0123133.s001

(DOCX)

S2 Taulukko. Primer lista käyttää bisulfiittia sekvensointiin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0123133.s002

(DOCX)

S3 Taulukko. Yhteenveto epigeneettiset sääntelyn SOCS geenien kohdunkaulan syöpäsoluja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0123133.s003

(DOCX) B