Krooninen sairaus

tiivistelmä

paksusuolen syöpä, erittäin aggressiivinen tauti, etenemisensä pahanlaatuinen sekvenssi liitetään yhä lukuisia kromosomi uudelleenjärjestelyt. Asuttaa kohde-elimiin, invasiivisia soluja rajat useissa kudoksissa eri kimmoisuusmoduulien. Olipa pehmytkudoksen kasvaa maligniteetti tai päinvastoin rajojen invasiivisia paksusuolen solun levittää edelleen avoin kysymys. Käyttämällä polyelektrolyytti monikerroksisia kalvoja jäljitteleviä mikroympäristöihin eri kimmoisuusmoduulien, me paljasti, että ihmisen SW480 paksusuolen syöpäsoluissa näkyy yhä useammin kromosomi eriytymistä poikkeavuuksia viljeltynä alustoille pienentyessä jäykkyys. Tuloksemme osoittavat, että vaikka vähentämällä jäykkyys korreloi lisääntynyt solujen kuolleisuutta, merkittävä osa SW480 syöpäsolujen ei paeta erittäin pehmeä alustoille, vaikka otetaan epänormaali kromosomi eriytymistä, saavuttaa mitoosin ja tehdään uusi sykli replikaation toisin kuin ihmisen paksunsuolen HCoEpiC solut kuolleista pehmeä alustoille. Tämä havainto avaa mahdollisuuden, että kyky syöpäsolujen voittaa vikoja kromosomi eriytymistä hyvin pehmeä alustoille voitaisiin lisätä kromosomi uudelleenjärjestelyihin ja kasvainsolun aggressiivisuus.

Citation: Rabineau M, Kocgozlu L, Dujardin D, Senger B, Haikel Y, Voegel JC, et ai. (2013) osuus Soft alustat maligniteetin ja tuumorisuppressiogeeneksi aikana Colon Cancer Cell Division. PLoS ONE 8 (10): e78468. doi: 10,1371 /journal.pone.0078468

Editor: Thomas Claudepierre, Lääketieteellinen tiedekunta University of Leipzig, Saksa

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty 13 syyskuuta 2013 Julkaistu 22 lokakuuta 2013

Copyright: © 2013 Rabineau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustusta Alsace Contre le Cancer. M. R. on velkaa Faculté de Chirurgie Dentaire Strasbourgin taloudellista tukea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viimeisten 10 vuoden aikana on käynyt ilmeiseksi, että solu käyttäytyminen riippuu paitsi kemiallisia vihjeitä mutta mekaaniset ominaisuudet solutilassa olla yhtä tärkeä rooli. Tämä on näyttävästi osoittaa maamerkkinä kokeet DISCHER ryhmä, joka osoitti, että mesenkymaaliset kantasolut voivat joko erilaistua osteoblasteiksi, fibroblastien tai neuronien riippuen Youngin moduuli tarttumissubstraattina [1]. On myös yleisesti hyväksytty, että erilaisia ​​solutyyppejä tarvitsevat alustoille eri Young moduli kunnolla kiinni ja lisääntyä. Osteoblastien vaativat Young moduli on välillä MPa kiinni taas fibroblastit tarttuvat pehmeämpiä alustoille joiden taivutusvastukset noin 10 kPa [2] ja hermosolujen kasvaa erittäin pehmeä alustoille noin 1 kPa [1]. Nämä erottuva arvot ovat yhdenmukaisia ​​sen Youngin moduli, jotka luonnehtivat ympäröiviin kudoksiin näiden eri solutyyppejä. Nämä tulokset ovat ensiarvoisen tärkeitä esimerkiksi kudosteknologian suunnitella tukirunkoja mahdollistaa asianmukaisen solujen kasvua tai implantin yhdentymistä. Silti tartunta ei ole ainoa seikka, joka luonnehtii solun käyttäytymistä: solunjakautumisen on myös äärimmäisen tärkeä solun kohtalon. Ryhmämme alkoi äskettäin tutkimaan vaikutusta mekaanisten ominaisuuksien substraatin solunjakautumisen [3]. Nämä tiedot korostettava, että mekaaniset ominaisuudet substraatin kriittinen rooli kromosomissa segregaatiota mitoosin aikana epiteelisolujen. Todellakin, havaitsimme asteittain lisänneet kromosomi erottelu poikkeavuuksia vähenee alustan jäykkyys ei-syöpä rotan kenguru munuaissoluissa PtK2 [3]. Lisäksi pehmeät materiaalit (alle 50 kPa) kuvattiin fyysisenä mikroympäristön esteen lähes kokonaan estämällä PtK2 solut [3].

Viime vuosina on todettu, että kudosten jäykkyys vaikuttaa syövän etenemiseen ja voi edistää pahanlaatuinen käytös [4-6]. Tuomalla syöpäsolujen osaksi 3-ulotteinen fibriinimatriisit, Liu et al. osoittivat, että pehmeä matriisit Youngin moduuli noin 100 Pa edistänyt kasvua kierroksen pesäkkeiden kasvaa aggressiivisuus kun ksenosiirrettyjä immuunivajaissa hiirillä [7]. Aivan hiljattain, Tang et al. paljasti vaimennus solun mechanosensitivity kasvainsolujen, kun viljeltiin pehmeässä alustoille [8]. Paksusuolen syöpä, erittäin aggressiivinen tauti, etenemisensä pahanlaatuinen sekvenssi liittyy lisäämällä kromosomi uudelleenjärjestelyt [9-12]. Asuttaa kohde-elimiin, invasiivisia soluja rajat useissa kudoksissa eri kimmoisuusmoduulien (kuten esimerkiksi 175, 918, 320, 120 ja 640 Pa tyvikalvon, strooman imusolmuke, imusolmuke ja maksassa, vastaavasti) [2,4] ja, kun taas useimmat näistä solut kuolevat matkan aikana, harvat vastustaa ja voi tuottaa etäpesäkkeitä [13]. Olipa pehmytkudoksen kasvaa maligniteetti tai päinvastoin rajojen invasiivisia solunlevitys- edelleen avoin kysymys. Käyttämällä polyelektrolyyttiä multilayers elokuvat (PEM) [14-18], me paljasti, että ihmisen SW480 paksusuolen syöpäsoluissa näkyy yhä useammin kromosomi eriytymistä poikkeavuuksia viljeltynä alustoille laskiessa jäykkyys (kuva 1) ja [3]. Esillä paperi, me raportoimme että substraattien jäykkyys 50 kPa ja alempi aiheuttaa massiivinen kuolema mitoosi soluissa, mutta että vain harvat solut vastustaa ja saavuttaa mitoosin poistamalla epänormaali kromosomi eriytymistä. Tätä tarkoitusta varten synkronoidaan SW480-soluja ympättiin useita elokuvia valmistettu poly-L-lysiiniä /hyaluronihappoa (PLL /HA)

24 ositteessa rajattu poly (styreeni) sulfonaatti /polyallyyliamiinimonomeerit (PSS /PAH)

n

kerrostumista (

n

= 0, 1 ja 2; lisääminen

n

lisää alustan jäykkyyttä [19]) ja sen jälkeen elävien solujen kuvantamiseen.

Fisher Exact Test näyttää osuus E

50 (18 solujen kromosomi poikkeavuuksien 121 analysoitujen solujen) on merkittävästi erilainen kuin lasi (6/153,

p

0,003), ja osuus E

20 (14/78) on merkittävästi erilainen kuin lasi (

p

0,001). Virheet pylväät edustavat 95%: n luottamusväli.

Tulokset ja keskustelu

1. Influence of pehmeä alustan kasvaimen mitoosi etenemistä

Voit selvittää kasvainsolut pystyvät edetä mitoosin hyvin pehmeä alustoille, SW480-soluissa, synkronoidaan käyttämällä mitoosi shake-off menetelmä, ympättiin PEM elokuvaa vähenee jäykkyys (Young moduli pienenee 50 alas 0 kPa, taulukko 1) ja sen jälkeen elävien solujen kuvantamisen aikana 2h30. Kalvot koostuu (PLL /HA)

24 ositteessa rajattu toisella (PSS /PAH)

n

stratum (

n

= 0, 1 ja 2 ). Tyypillinen esimerkki konfokaali z-osassa havainto kalvon koostuu PLL /HA ositteessa ja PSS /PAH kattojärjestelmästä näkyy kuvassa 2. Vaikka pintakemiallisten lasin ja polyelektrolyytin multilayers on erilainen, osoitimme aiemmassa työssä että määrä FBS proteiinien talletettu pinnalle ei riipu ei pinnan kemian tai sen kerrosten lukumäärä muodostaa polyelektrolyytin multilayers elokuva [16]. Lisäksi solut tuntuu oleellisesti proteiinien seerumista että adsorboi- pinnalla ennen solun laskeuman. Niinpä tärkein muuttuja, joka muuttuu välillä lasi, E0 ja E50 /E20 on jäykkyys ja sen pitäisi olla alkuperä erot solussa käyttäytymistä havaittu järjestelmäämme. E

0, solut nopeasti kävi läpi lyyttistä prosessi, kuten on osoitettu vapauttamaan sytoplasmaan viljelyalustan havaittiin 100%: ssa tapauksista (kuvio 3A, nuolenkärki rivillä E

0, Elokuva S1). Kuitenkin E

50 ja E

20 alustojen seuranta kromosomi erottelu, DNA decondensation ja sytokineesiin (kuvio 3A ja Elokuva S2-S4) paljasti, että vastaavasti 60% ja 10% soluista pystyivät saavuttamaan mitoosia 2h30 (kuvio 3C). Loput solut joko hajottavat (18% E

50 ja 88% E

20) tai pidetään estetty mitoosin (22% E

50, ja 2% E

20). Tilghman et ai. osoittivat, että syöpäsolut viljeltiin pehmeässä polyakryyliamidigeelillä substraatteja esillä pidemmän solusyklin, koska laajennus G1 vaiheen solusyklin, verrattuna syöpäsolut kasvavat jäykempi alustoille [20]. Osoittaakseen, että merkittävä osa SW480-solujen mahdollisuus edetä mitoosissa E

50 liittyi syöpä luonne näiden solujen, niiden käyttäytyminen verrattiin ei-syöpä ihmisen paksusuolen epiteelisolujen HCoEpiC. Tuotanto mitoosi HCoEpiC solujen mekaanisella shakeoff pieneni huomattavasti. Siten standardi asynkroninen HCoEpiC soluviljelmiä tutkittaessa käytettiin vaikutuksen E

50 ihmisen paksusuolen epiteelisoluihin. Tulokset osoittavat, että kun 6h kulttuurin E

50, asynchronized HCoEpiC solut antoi pyöreä morfologia (kuvio 4A) toisin leviämisen muoto näiden solujen havaittiin lasi (kuvio 4A). E

50, HCoEpiC solut meni läpi lyyttistä prosessi, kuten on osoitettu vapauttamaan sytoplasmaan kasvualustaan ​​100%: ssa tapauksista (kuva 4A). Jotkut näistä soluista osoitti pirstoutuminen niiden ydin viittaa apoptoosikuoleman (kuvio 4C). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, ilman asennusta mikrotubulusten ja aktiinifilamenttien voitiin havaita immunofluoresenssilla kokeellisesti spesifistä vasta α-tubuliinin ja phalloidin (kuvio 4C). Kaikki interphase HCoEpicC soluja kuoli E

50 (kuva 4B) paljastaa, että nämä solut eivät luonnollisesti pysty etenemään solusyklin ja palata mitoosissa. Voimme todeta, että meidän tutkimukset suoritettiin alustoille pienten moduli on välillä 1-50 kPa ja havaitsimme, että ei-syöpäsoluja ei selvinnyt tällaisia ​​pehmeitä alustoille. Tämä tulos näyttää ensi näkemältä ristiriitaisia ​​sen havainnon kanssa solunjakautumisen paksusuolen joiden Youngin moduuli on 2-25 kPa [21]. Silti, paksusuolen solut ovat erikoistuneet 3D kudoksen solujen /solun yhteyksiä, jotka vaikuttavat voimakkaasti solu käyttäytymiseen. Tällainen vaikutus ei ole toistettu meidän 2D in vitro kokeissa. Kuitenkin, meidän in vitro malli on sopivampi yhden kasvainsolujen tai pienten soluja, jotka paeta kasvain massa hyökätä strooman ja osallistumaan prosessiin, joka johtaa etäpesäkkeiden muodostumiseen pitkän matkan jälkeen kudosten läpi hyvin erilaisia ​​Young taivutusvastukset. Kaiken kaikkiaan, tuloksemme osoittavat, että lasku jäykkyys korreloi lisäys solujen kuolleisuutta in vitro terveiden sekä syöpäsoluja. Siitä huolimatta, mikä tärkeintä, havaitsimme, että jotkut syöpäsolut voivat paeta erittäin pehmeä alustoissa ja voi saavuttaa mitoosin. Nämä havainnot ovat erittäin tärkeitä sekä normaalissa homeostaasiin kiinteiden kudosten ja patologisen asetuksia.

Arkkitehtuuri

E

ap (kPa)

Notation

(PLL /HA)

24 ~ 0E

0 (PLL /HA)

24 – (PSS /PAH)

1 ~ 20E

20 (PLL /HA)

24 – (PSS /PAH)

2 ~ 50E

50Table 1. näennäinen kimmokerroin (PLL /HA)

24- (PSS /PAH)

n

kanssa

n

= 1 ja 2.

kalvot koostuu hyaluronihappoa /poly-L-lysiiniä (HA /PLL)

24 ositteessa rajattu toisella poly (styreeni) sulfonaatti /polyallyyliamiinihydrokloridilla (PSS /PAH)

n

ositteessa. Kalvot tunnusomaista niiden kimmomoduuli (

E

ap: näennäinen kimmokerroin), määritetään atomivoimamikroskooppi nanoindentaatiomenetelmällä kokeita, mikä vastaisi todellista kimmomoduuli kerroksen jos se käyttäytyi tiukasti elastisesti. Kimmomoduuli natiivi (PLL /HA)

24 arkkitehtuuri on noin 0 kPa.

arvoihin otettu [19]. CSV Lataa CSV

Pystyleikkaus kuva (PLL /HA)

23-PLL

FITC-Ha- (PSS /PAH)

2-PSS

Rho-PAH monikerroksisen kalvon noudatettava CLSM.

A) kylvämisen jälkeen synkronoitu SW480 solujen lasi, E

50, E

20 ja E

0, nopeutus kuva otettiin joka 5 min 2h30; edustavat kuvat näytetään. Nuoli osoittaa alkuasento mitoosissa. Sulautunut kuvia fluoresenssin (DNA punaisella) ja vaihekontrastimikroskoopilla (harmaa); asteikko bar: 20 pm. B) Ajastettu seuranta kromosomi eriytymistä SW480-soluissa kuvatussa A. Kuvat ovat kromosomin eriytymisen poikkeavuuksia näytetään E

50 ja E

20; asteikko bar: 10 um. C) Prosenttiosuus SW480-solujen loppuun mitoosia tarkasteltava, määritellään 2 yhdistettiin itsenäisestä kokeesta. Fisherin tarkka testi osoittaa, että solujen osuus valmiiksi mitoosin E

50 (46 solut 77 solujen mitoosin) on huomattavasti pienempi päässä osuutta lasi (185/212,

p

0,001) . Osuus E

20 (16/161) on huomattavasti pienempi kuin E

50 (

p

0,001) ja osuus E

0 (0/146) on huomattavasti pienempi kuin E

20 (

p

0,001). D) Prosenttiosuus solujen jääneet kromosomeja. C, D, virhepalkkien edustavat 95%: n luottamusväli.

A) edustavat kuvat HCoEpiC solujen jälkeen 6h kulttuurin lasi ja E

50, nuolenkärki osoittaa hajotettiin solu; asteikko bar: 50 pm. B) Prosenttia lysoitiin HCoEpiC solujen katsotaan A, määritettiin 2 yhdistettiin itsenäisestä kokeesta. Fisherin tarkka testi osoittaa osuus lysoitiin solujen lasi (5/142) on huomattavasti pienempi kuin E

50 (112/112,

p

0,001). Virhe pylväät edustavat 95%: n luottamusväli. C) Fluoresenssi kuvia DNA, α-tubuliinin ja aktiini jälkeen 6h kulttuurin E

50 kiinteän HCoEpiC soluista; asteikko bar: 20 pm.

2. Käyttäytymistä kasvainsoluja kromosomi eriytymistä poikkeavuuksia

Aikaväli seuranta kromosomi erottelu osoitti SW480-solut ympätään E

50 ja E

20 näytetään laahaa kromosomeja (kuvio 3B, nuolet), joka osoittaa puutteet kromosomi eriytymistä mekanismeja. Vuoden telophase, ytimet uudistettu ja sytokineesiin päätökseen (kuvio 3B, 3D ja elokuva S5 ja S6). Niistä SW480 solujen etenemässä mitoosia 4,8%, 11% ja 13% osoittivat kromosomi erottelu poikkeavuuksia lasi, E

50 ja E

20, tässä järjestyksessä. Nämä tulokset osoittivat, että vaikka yhä useammin poikkeavuuksien aiheuttamien pehmeä alustoille, jotkut SW480 syöpäsolut pystyvät edetäkseen mitoosin. Joka on yhdenmukainen havainto tehty jäykät pohjat että soluja, joilla on puutteellinen kara tarkistuspiste mekanismit voivat edetä mitoosia vaikka läsnä kromosomien misconnected kara [22].

3. Β1-integriinin sitoutumista mitoosi kasvainsolujen vasteena pehmeän substraattien

Vuorovaikutus soluväliaineen läpi integriinien on osoitettu vaikuttavan eri näkökohtia sukkularihmaston organisaation [23,24]. Erityisesti on tunnettua, että mitoosi solut tulevat pyöristetty valmistauduttaessa sytokineesiin ja jäävät kiinni alustaan ​​kautta takaisinveto kuitujen kautta integriinin sitoutuminen [25]. Sisäänvetoarvoa kuidut tarjoavat resistiivinen voima, joka etenee sisällä mikrotubuluskimppujen suunnata sukkularihmaston [23-26]. Meillä on siis tutkineet vaikutuksia eri alustan jäykkyyttä β1-integriini SW480-soluissa. Vastauksena pehmeä alustoille (E

50 ja E

20), β1-integriini sitoutumista mitataan ligandin indusoiman sitoutumiskohtia (aktivoitu β1-integriini LIBS) käyttäen konformationaalisia vasta-aineita oli samalla tasolla kuin lasisubstraatin (kuva 5A-C, MAPK kaista vastaavat valvoa lastaus). Kiinnostavaa kyllä, nämä tiedot ovat ristiriidassa aiemman tutkimuksen avulla ei-kasvain PtK2 solut osoittavat asteittain vähenee ja β1-integriinin sitoutumista pehmeä alustoille [3]. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa muiden tutkimusten osoittavat, että hiiren rintasyövän solujen säilyttää suuria määriä aktiivista β1-integriini jälkeen 24h kulttuurin pehmeälle alustalle [27]. Integriini kertymistä soluun puolivälissä vyöhyke on myös tarpeen aiheuttaa mitoottisiin soluadheesiota ja tukemaan sytokineesiin antamalla mekaanisella ankkurointi varten supistuvien actomyosin rengas [28]. Tutkia lokalisointi β1-integriinin, immunofluoresenssimenetelmällä suoritetaan soluissa telophase paljasti β1-integriini kertymistä keskivartalon, E

50 ja E

20, kuten lasi (kuvio 5D). Lasi, E

50 ja E

20 aktiini kertynyt myös tässä solussa puolivälissä vyöhykkeen (kuvio 5D). Nämä tulokset viittaavat siihen, jatkuva β1-integriinin sitoutumista mitoosin aikana huolimatta pehmeä alustoille, yhteensopiva osallistumisen tukemiseksi sytokineesi.

A) Western blotit β1-integriinin LIBS ja MAPK proteiinia SW480-solut ympätään 30 min jälkeisen synkronointi lasi, E

50 ja E

20. Histogrammi näyttää vastaavan skannauksia B) β1-integriinin LIBS ja C) p44 /p42 MAPK ohjaus lastaus. Kuvaava ja tulokset 2 itsenäisen kokeen (virhepalkkien edustavat SEM .; mielivaltainen arvo 1 johtui keskiarvo vastaa solujen lasi). D) α-tubuliinin ja β1-integriini jakelu 30 min jälkeisen synkronointi lasi, E

50 ja E

20 kiinteästä SW480 soluista, superpositio solujen anti-α-tubuliinin (vihreä) ja anti-β1 integriinivasta (punainen) (α-tubuliinin /β1-integriini). Nuoli osoittaa hieno pisteen β1-integriinin keskittyi keskivartalon. Kuvat ovat näkyvät 2 itsenäistä koetta varten yhteensä 10 solua kullekin kunnossa; asteikko bar: 10 um. Lasi, E

50 ja E

20 kiinteästä SW480 soluista, superpositio solujen DNA (sininen) ja aktiini (punainen) (DNA /aktiini). Nuolenkärki osoittaa aktiini kertymistä soluun puolivälissä vyöhyke. Kuvat ovat näkyvät 2 itsenäistä koetta varten yhteensä 10 solua kullekin kunnossa; asteikko bar: 10 pm.

4. Sukkularihmaston järjestäminen kasvainsolujen vastauksena pehmeiden alustoille

Seuraava tarkastetaan sukkularihmaston kokoonpano pehmeillä matriisit immunofluoresenssilla anti-α-tubuliinin ja DNA värjäys Hoechstin. Mitoosi karan SW480-solujen, näkyvät jäykkä alustoille (lasi), säilyivät E

50 ja jopa E

20 (kuva 6A ja B). Tämä tulos on ristiriidassa mitä havaittiin ei-syöpä mitoottisiin PtK2 soluja ympätään pehmeä matriisi koska nuoret kimmokerroin ≤ 50 kPa, sukkularihmaston ei voitu havaita [3]. Vastaa meidän elävän solun analyysi (kuvio 3B ja D), epänormaali kromosomi eriytymistä tapahtumia voitiin havaita (kuvio 6B ja D), mutta ilman näyttöä moninapaista tai monopolar karat on erilaisia ​​alustoja johtunee pi 1-integriinin sitoutumista pidetään yllä hyvin pehmeä alustaan. Todellakin, moninapainen karat havaittiin solujen laakerin mutatoitunut β1-integriini [23].

SW480-solut 30 min-2h jälkeinen synkronointi lasi, E

50 ja E

20 kiinteästä soluista. Kuvat ovat päällekkäisiä anti-α-tubuliinin (valkoinen) ja Hoechst DNA (punainen) (α-tubuliinin /DNA). Nuoli osoittaa sukkularihmaston ilman anomalia (A), jossa on anomalia (B), nuolenkärki osoittaa anomalia; asteikko bar: 10 um. C) Prosenttiosuus SW480 solujen sukkularihmaston A, määritettiin 3 yhdistettiin riippumattoman kokeen. Fisherin tarkka testi osoittaa, että solujen osuus, joiden sukkularihmaston E

50 (93/140) eroaa merkittävästi osuutta lasi (139/142,

p

0,001). Osuus E

20 (16/50) on huomattavasti pienempi kuin E

50 (93/140,

p

0,001). D) kantavien solujen prosenttiosuus kromosomi eriytymistä poikkeavuuksia, joukossa solut sukkularihmaston harkita C. C ja D, virhepalkkien edustavat 95%: n luottamusväli.

5. Rac1 ekspressio kasvainsolujen vasteena pehmeän substraattien

Rac1, proteiineja pienen GTPaasi Ras perhe, ovat mukana suunta sukkularihmaston ja sen aktiivisuus kasvaa solukalvon polaaristen puolin aikana sytokineesiin [29 ]. Olemme edelleen synkronoitu kokoelma SW480-solujen ja analysoitiin Rac1 ilmaisun Western blot kokeissa [29]. Ei ollut eroja Rac1 lauseke mitoosi SW480-solut ympättiin joko pehmeä alustoille (E

50 ja E

20) tai jäykkä alustalle (lasia) (kuvio 7A-C). Tuloksemme osoittivat, että mitoosi kasvaimen SW480-solujen ylläpitämiseksi Rac1 ilme pehmeillä alustoilla. Päinvastoin, olemme aiemmin havaittu, että ei-syöpä PtK2 solut vähitellen pienenee tätä ilmaisua pehmeillä alustoille [3]. Tärkeää on, β1-integriini sitoutumista ja Rac1 ilme säilytetään pehmeä alustoille (E

50, E

20) eivät olleet riittäviä, jotta massiivinen jako kasvain SW480-solujen. Todellakin, seuraavilla alustoille vain 60% (E

50) ja 10% (E

20) solut kykenevät etenemään mitoosin

A) Western blotit Rac1 ja MAPK proteiinin SW480 solut lasi, E

50 ja E

20, 30 min post-synkronointia. Histogrammi esittää vastaavaa etsii Rac1 (B) ja p44 /p42 MAPK (C). Kuvaava ja tulokset 2 itsenäisen kokeen (virhepalkkien edustavat SEM .; mielivaltainen arvo 1 johtui keskiarvo vastaa solujen lasia).

6. DNA-replikaation aktiivisuutta kasvainsolujen vasteena pehmeän substraattien

Sen määrittämiseksi, onko SW480-soluja, jotka pystyivät edetä mitoosin kykenivät palaisi solusyklin, tutkimme niiden kyky läpikäydä DNA-replikaatioon 4h jälkeen ympättiin eri alustoille. SW480-solut ympätään E

50 ja E

20 näyttelypaikalta lisääntymään tasaisesti tumassa (kuvio 8A) ja vastaavasti 60% ja 23% soluista Ydinvoimalla BrdU signaali (kuvio 8B). On huomionarvoista, että prosenttiosuudet SW480-solujen sisältävät BrdU korreloi solujen prosenttiosuus saavuttaa mitoosin E

50 ja E

20 (kuviot 3C ja 8B), mikä viittaa siihen, että SW480-solut pystyvät saattamaan kromosomiin erottelun pehmeällä alustoille ovat edelleen mahdollisuus osallistua uuden jakson DNA-replikaation.

A) BrdU visualisoitiin epäsuoralla immunofluoresenssilla of SW480-solujen 4h jälkeisen synkronointi lasi, E

50 ja E

20; asteikko bar: 10 um. B) Prosentuaalinen solujen ydin- BrdU määräytyy 3 yhdistettiin riippumattoman kokeen. Fisherin tarkka testi osoittaa, että solujen osuus ydin- BrdU E

50 (108/170) on huomattavasti pienempi kuin lasi (400/400,

p

0,001) ja osuus E

20 (35/150) on huomattavasti pienempi kuin E

50 (

p

0,001). Virhe pylväät edustavat 95%: n luottamusväli.

Johtopäätös

Yhteenvetona me raportoimme että huolimatta massiivinen solukuolema äärimmäisen pehmeä alustoille (E

0), kasvainsolut kuten SW480 paksusuolen syöpäsoluissa, vaikka otetaan epänormaali kromosomi eriytymistä, vastustaa hyvin pehmeä substraattien (E

20 ja E

50) ja saavuttaa mitoosin. Nämä havainnot saattavat olla erittäin tärkeitä patofysiologia syövän ja levittämistä koolontuumorisolut. Todellakin, niiden syöpä luonne ainakin joidenkin kasvainsolujen saattaisi auttaa heitä voittamaan kromosomi eriytymistä poikkeavuudet liittyvät muutoksen alustan jäykkyyttä ja näin ollen koske pehmeä alustoille jatkamaan matkaansa sijaintipaikan etäpesäkkeiden muodostumista. Lisäksi tämä kyky voittaa eriytymisen poikkeavuudet voivat aiheuttaa enemmän kromosomi uudelleenjärjestelyt, jotka voivat auttaa lisäämään kasvainsolun aggressiivisuus. Edelleen tutkitaan vastetta syöpäsolujen fyysisen ympäristön muutokset voivat auttaa tunnistamaan uusia potentiaalisia syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

1. Materiaalit ja valmistus PEM

PLL (MW = 5.7 x 10

4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier, Ranska) ja HA (MW = 4,0 x 10

5 Da, BioIberica, Barcelona ) käytettiin kertyminen (PLL /HA)

24 elokuvaa, ja PSS (MW = 7,0 x 10

4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier) ja PAH (MW = 7,0 x 10

4 Da , Sigma) (PSS /PAH)

n

rajaaminen kalvojen (

n

vastaa määrää kerroksen paria), joka talletettiin päälle (PLL /HA)

24 kerrostumiin. PLL, HA, PSS ja PAH liuotettiin 1 mg /ml puskurissa, joka sisälsi 150 mM NaCl: a ja 20 mM tris (hydroksimetyyli) -aminomethan (TRIS, Merck) pH: ssa 7,4, ja kaikkia huuhtelu vaiheet suoritettiin samalla puskurilla. (PLL /HA)

24 kerrostumista ja (PSS /PAH)

n

rajaaminen kalvot valmistettiin käyttämällä kastamalla kone (Dipping Robot DR3, Riegler Kirstein GmbH, Berliini, Saksa), lasilevyille (VWR Scientific, Fontenay sous Bois, Ranska). Jäykkyys (PLL /HA)

24- (PSS /PAH)

n

elokuva kasvaa määrä talletetaan PSS /PAH kerros parit (taulukko 1) [19]. Lyhyen käytetyt merkinnät E

0, E

20 ja E

50 ovat (PLL /HA)

24, (PLL /HA)

24- (PSS /PAH)

n

elokuvien

n

= 0, 1 ja 2, vastaavasti.

2. PEM luonnehdinta

CLSM havaintoja tehtiin Zeiss LSM 510 mikroskoopilla käyttäen x40 /1,4 öljyssä Objectif. FITC-fluoresenssia havaittiin sen jälkeen, kun viritys 488 nm: ssä sulku puoliläpäisevä peili 488 nm ja emissio kaistanpäästösuodattimen 505-530 nm. Rho-fluoresenssi havaittiin virittämisen jälkeen 543 nm, puoliläpäisevä peili 543 nm, ja emissio pitkä pass suodatin 585 nm.

3. Solut ja synkronointi

peräsuolen adenokarsinooma epiteelisolujen SW480-soluja (ATCC, CCL-228) kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty Glutamax, 10% FBS (Invitrogen), 100 ug /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen), 0,025 U /ml insuliinia, 50 mg /ml hydrokortisonia ja 1,25 mg /ml G418: aa pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Kolme päivää ennen synkronointia, solut maljattiin uudelleen 1.2×10

4 per cm

2. Solut synkronoitu mekaanisesti shakeoff. Mitoosi solut sentrifugoitiin (800

g

, 7 min), uudelleensuspendoitiin elatusaineeseen, ja maljattiin uudelleen 1.2×10

4 per cm

2 kalvopäällysteistä peitelaseja jatkotutkimuksiin. Ihmisen paksusuolen epiteelisolujen (HCoEpiC, ScienCell Research Laboratories) kasvatettiin Paksusuolen epiteelisolujen Medium (CoEpiCM, ScienCell Reserach Laboratories) täydennettynä paksusuolen epiteelisolujen kasvuun täydentää (CoEpiCGS, ScienCell Research Laboratories) ja penisilliiniä /streptomysiiniä liuosta (P /S, ScienCell, Research Laboratories), jota pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. 2 populaation kaksinkertaistumista maljattiin 5×10

5 senttimetrillä

2 alustoille jatkotutkimuksiin.

4. Immunoleimaus

Solut kiinnitettiin /läpäiseviksi 3,7% (w /v) PFA PBS plus 0,1% Triton X-100: ssa 15 minuuttia ja blokattiin 10% decomplemented FBS (Invitrogen). Soluja inkuboitiin β1-integriini (laimennus 1:20, Santa Cruz seurasi Rhodamin-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennus 1: 250, Santa Cruz), tai anti-α-tubuliinin (laimennus 1: 100, Santa Cruz), jota seuraa FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennus 1: 500, AnaSpec, CA) ja DNA-paljastettiin Hoechst 33258 (20 ug /ml, Sigma). Jos DNA-replikaation tutkimuksia varten solut aikaisemmin kasvatettiin BrdU (37 ° C) (01:50 , RPN 201, GE Healthcare) kiinteään /läpäiseviksi, inkuboitiin anti-BrdU ja DNaasi 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa (laimennus 1: 100, RNP 202, GE Healthcare), minkä jälkeen TRITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1: 500 , AnaSpec).

5. DNA Replication

1,2 x 10

4 synkronoitu solua siirrostettiin cm

2 ja inkuboitiin BrdU (37 ° C) (50 yli 1 , RPN 201, GE Healthcare). solut kiinnitettiin /läpäiseviksi 3,7% PFA PBS: ssä plus 0,5% Triton X-100: ssa 15 minuuttia. pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin anti-BrdU ja DNaasi 1 tunnin ajan 37 ° C (laimennettu 1: 100; RNP 202, GE Healthcare). Pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin TRITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1: 500; AnaSpec).

6. Fluoresenssimikroskopialla

Näytteet kiinnitettiin Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). fluoresenssi kuvat otettiin käyttäen Nikon Elipse TE200 63 × PL APO (1,4 NA) objectif varustettu Nikon digitaalikamera (DS-Q11MC kanssa NIS-elementit ohjelmistot), ja niitä käsitellään ImageJ (https://rsb.info.nih.gov /ij /).

7. Elävien solujen kuvantamisen

jakamalla määrityksiä, soluja inkuboitiin 20 min Hoechst 33242 (0,1 ug /ml, Sigma) ennen mekaanista shakeoff, maljattiin uudelleen 1.2×10

4 per cm

2 kalvopäällysteinen peitinlaseille ja asennettu Ludin istuntosalissa (Life Imaging Services, Basel Sveitsi) 37 ° C: ssa, 5% CO

2, Leica DMIRE2 mikroskooppi varustettu 40 × HCX PL APO PH2 (0,75 NA) tavoite ja Leica DC350FX CCD (Leica FW4000 ohjelmisto). Kuvat otettiin joka 5. min 2h30, fluoresenssin ja faasikontrastimikro-.

8. Western Blot

Solut pinnoille (Nunc) 2 x 10

5 senttimetrillä

2 ja inkuboitiin 30 minuuttia jälkeisen synkronointi viljelyväliaineessa 37 ° C: ssa. Solut lyysattiin 20 mM Tris-base, pH 8, (0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 10% glyserolia, 1 mM natriumortovanadaattia, joka sisälsi 1%: proteaasiestäjäseostabletit; Sigma). Uuttaminen seoksia ravisteltiin 4 ° C: ssa ja sentrifugoitiin (3 min, 13k rpm 4 ° C: ssa). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen DC-proteiinin määritystä (Bio Rad, USA). Yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia uutteet altistettiin SDS-PAGE (NuPAGE, Invitrogen, Ranska) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Iblot Transfer Stack, Invitrogen, USA) estänyt T-TBS: ää (0,1% Tween 20: tä, 50 mM Tris-base, pH 7,6, 0,15 M NaCl), joka sisälsi 1% BSA: ta (Euromedex, Ranska) ja tutkittiin yli yön 4 ° C: ssa. Blotteja inkuboitiin 2h, jossa primaarinen vasta-aine: p-integriiniin aktivoitu LIBS, (klooni B44) (laimennettu 1: 1000, Millipore), anti-Rac1 (laimennettu 1: 1000, Millipore) ja p44 /p42-MAPK (laimennettu 1: 1000, Cell Signaling, USA) käytettiin. Blotteja inkuboitiin 2 h HRP-konjugoitua anti-kani-anti-hiiri-vasta-aineita (laimennettuna 1: 2000, GE Healthcare). Vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL Western blotting analysointi System Kit (RNP2109, GE Healthcare). Autoradiograafit määrällisesti Kodak Digital Science 10 Ohjelmisto. Edustavia keskiarvoja vähintään kahden itsenäisen kokeen kanssa keskivirheet (neljä ajankohtina bandeittain) esitetään.

tukeminen Information

Movie S1.

Elokuva vastaa kuviota 3A SW480 solujen E

0.

doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s001

(AVI) B Elokuva S2.

Elokuva vastaa kuviota 3A SW480 solujen E

50.

doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s002

(AVI) B Elokuva S3.

Elokuva vastaa kuviota 3A SW480 solujen E

20.

doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s003

(AVI) B Elokuva S4.

Elokuva vastaa kuviota 3A SW480 soluja lasille.

doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s004

(AVI) B Elokuva S5.

Elokuva vastaa kuviota 3B SW480 solujen E

50.

doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s005

(AVI) B Elokuva S6.

Elokuva vastaa kuviota 3B SW480 solujen E

20.