Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ongelma eturauhassyövän eteneminen androgeeniriippumattomuuteen on tutkittu laajasti. Useat tutkimukset analysoidaan systemaattisesti geeniekspressioprofiilien yhteydessä biologisten verkkojen ja polkuja, paljastamiseksi uusia näkökohtia eturauhassyöpää. Huolimatta huomattavista tutkimustyötä, mekanismeista syövän etenemiseen tunnetaan huonosti. Käytimme uutta lähestymistapaa rekonstruoida järjestelmän laajuisesti molekyylitason tapahtumia stimulaation jälkeen LNCaP eturauhassyövän solut synteettisellä androgen ja tunnistaa mahdolliset mekanismit androgeenista riippumattoman etenemisen eturauhassyöpä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Olemme suorittaneet samanaikaisen mittaukset geenin ilmentymisen ja proteiinin tasot käsittelyn jälkeen käyttäen mikrosiruja ja iTRAQ proteomiikka. Sarjaa up-geenien ja proteiinien analysoitiin käyttämällä uudenlaista ”topologinen merkitystä”. Tämä menetelmä yhdistää korkean suoritustehon molekyyli datan maailmanlaajuinen verkosto proteiinivuorovaikutussuhteiden tunnistaa solmuja, jotka vievät merkittävän verkoston kantoja suhteessa differentiaalisesti ilmentyvien geenien tai proteiinien. Analyysimme tunnistettu verkko kasvutekijän säätely solusyklin pääasiallisena vastauksena moduuli androgen hoitoon LNCaP-soluissa. Osoitamme, että suurin osa signalointi solmujen tässä verkossa miehittää merkittäviä asemia suhteessa havaitun geeniekspression ja proteomiikka profiileja aikaansaama androgeenistimulaatiota. Tuloksemme osoittavat lisäksi, että kasvutekijä signalointi luultavasti edustaa ”toista vaihetta” vastaus, ei ole suoraan riippuvainen alkuperäisestä androgeenistimulaatiota.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme päätellä, että eturauhasen syöpäsolujen proliferatiivinen signaalit ovat todennäköisesti lähetetään monista kasvutekijän reseptorien lukuisia signalointipolkujen yhdentyvät useita keskeisiä säätelijöitä lisääntyminen kuten c-Myc, sykliini D ja CREB1. Lisäksi nämä reitit eivät ole erillisiä, vaan muodostavat toisiinsa verkon moduuli sisältää useita vaihtoehtoisia reittejä panosten ja tuotosten. Jos koko verkko on mukana, tarkasti muotoiltu yhdistelmähoito voi olla tarpeen torjua kasvaimen kasvua tehokkaasti.

Citation: Vellaichamy A, Dezső Z, JeBailey L, Chinnaiyan AM, Sreekumar A, Nesvizhskii AI, et ai . (2010) ”Topological merkitys” Analysis of Gene Expression ja proteomiikan profiilit syöpäsolujen paljastaa keskeiset mekanismit Androgeenien Response. PLoS ONE 5 (6): e10936. doi: 10,1371 /journal.pone.0010936

Editor: Patrick Tan, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu 13 marraskuuta 2009; Hyväksytty: 06 toukokuu 2010; Julkaistu: 03 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Vellaichamy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Michigan proteomiikan Alliance for Cancer Research National Institutes of Health (NIH) avustus CA134175-01 myöntää R01CA126239 ja GeneGo, Inc. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Andrej Bugrim, Zoltan Dezső ja Lellean JeBailey ovat työntekijöitä GeneGo, Inc., joka on osittain rahoitettu tässä tutkimuksessa. Kirjoittajat vahvistavat, että tämä seikka ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu syöpien ja toinen johtava syöpään liittyvän kuoleman Pohjois-Amerikan miesten [1]. Vaikka androgeenireseptorin peruuttaminen hoito on usein tehokas aluksi useimmiten edetä paljon aggressiivisemmin androgeenista riippumaton fenotyyppi. Huolimatta huomattavista tutkimustyötä, mekanismeista syövän etenemiseen tunnetaan huonosti. Rooleja useiden signalointipolkujen on perustettu, mutta ei systeemistä kuva. Esimerkiksi IGF: n signalointi on osallisena etenemistä androgeeniriippuvaisen androgeenin riippumattoman todetaan [2], mutta on myös osoitettu tukahduttaa AR trans-aktivoitumisen kautta FoxO1 ja näin on estäviä vaikutuksia kasvuun eturauhassyöpäsolujen [ ,,,0],3], EGR raportoitu matkivat vaikutuksia androgeenin geenin ilmentymisen ja riippumatta kasvun stimuloimiseksi androgeeniriippuvaisen syöpäsolujen [4]. Muut tutkimukset ovat tuottaneet todisteita vuorovaikutuksesta androgeenireseptorin signalointi ja TGF-beeta [5], [6], FGF [7], [8] ja VEGF [9].

Suurin osa tutkimuksen edellä mainitussa on ollut hypoteesi perustuva sijaan data-driven. Hypoteesi muotoilu on altis bias takia tutkijat mieltymysten ja nykyinen tutkimus suuntauksia siitä, mitä pidetään ”mielenkiintoinen”. Täydentävä data-lähestymistapaa käyttäen suuren läpimenon molekyyli- profiloinnin ja kehittyneitä data-analyysin algoritmit voisivat tehostaa ymmärtämistä monissa solun prosesseja, jotka taustalla etenemisen eturauhasen syövän androgeenisäädellyn riippumattoman vaiheessa ja voisi tasoittaa tietä uusien hoitomuotojen ja saavuttaa suuremman tehon paremmasta suunnattu olemassa olevia hoitoja.

genominlaajuiset ilmentymisen profilointi Haven laajasti sovellettu monimutkaisia ​​sairauksia, mukaan lukien eturauhassyöpä [4], [10], [11], [12], [13], [14]. Useat viimeaikaiset tutkimukset analysoidaan systemaattisesti geeniekspressioprofiilien yhteydessä biologisten verkkojen ja polkuja, paljastamiseksi uusia näkökohtia eturauhassyövän [15], [16], [17]. Tästä edistyksestä huolimatta todella systeeminen analyysi, jossa otettaisiin huomioon sekä geenien ilmentyminen ja proteomiikka tiedot samasta näytteestä jää vaikeasti tavoite. Kriittinen haasteena on tehdä vankka integroitu analyysi aineistojen tuottamien niin erilainen molekyylien alustoilla. Tämä on kova tietotekniikan ongelma, koska microarray ja proteomiikan tietoja ei useimmissa tapauksissa voida suoraan verrata toisiinsa. Esimerkiksi tutkimukset hiiva ovat osoittaneet, että korrelaatio mRNA ja vastaavien proteiinien riitä luotettavasti ennustaa proteiinin tasot geenien ilmentyminen tietoja [18]. Tuoreessa tutkimuksessa eturauhassyövän yksilöiden osoitti vastaavuutta välillä proteomic ja genomista tiedot vaihtelevat 46%: sta 68% perustuen ”poissa /läsnä” puhelujen kuitenkin, korrelaatiot olivat alhaiset, kun todellinen ekspressiotasot verrattiin [19]. Kuten esitetään tuoreessa työssä [20], paljon laajempi määrällinen proteiinia luonnehdinta johtaa merkittävää parannusta korrelaatio tasojen proteiinin ja geenin ilmentymisen. Silti on useita luontaisia ​​lähteitä ristiriita, kuten mRNA: n hajoamisen, vaihtoehtoisen silmukoinnin, translationaalisen sääntely, translaation jälkeiset modifikaatiot, ja proteiinien hajoaminen [21]. Näitä ei voida ratkaista teknologian kehittyessä yksin on määrä käsitellä uusia analyyttisiä lähestymistapoja tietojen integroinnin. Aiemmin toimiaan tällä alalla hyödynnetään ennalta määriteltyjä sarjaa geenien (polkuja, Gene ontologia luokat) etsiä vastaavuutta välillä proteomic ja genomista tietoa tällä tasolla [22], [23].

Viime aikoina olemme kehittäneet uusia laskennallisia menetelmiä, jotka voivat auttaa edistämään integroidun analysoidaan eri tyyppisten tietojen askeleen pidemmälle [24]. Lähestymistapamme yhdistyvät taudista tai tila-erityisiä, suurikapasiteettisten molekyyli datan maailmanlaajuinen verkosto proteiinivuorovaikutussuhteiden tunnistaa solmuja, jotka vievät merkittävän verkoston kantoja suhteessa ilmentyvät eri geenien tai proteiinien esittelyyn molekyyli aineistot. Vaikka on merkittävä melu ja yhteensopimattomuus datan itse ennusteita algoritmi todennäköisesti lähentymässä yhteiset signalointi proteiineja, jotka ovat vastuussa muutosten ilmentymistä kohde- geenien ja proteiinien. Usein tällaiset toiminnot signalointi proteiineista muokataan hienovarainen translaation jälkeisiä modifikaatioita, sitoutuminen toisiolähettejä, tai rekrytointia tietylle solukomponenttien locale. Nämä tapahtumat eivät nimenomaisesti näy vastaava molekyyliprofiilien; Näin ne pysyvät ”piilotettu” standardin molekyyli määrityksissä. Menetelmämme on löytää monia tällaisia ​​”piilotettu” proteiinit tunnistamalla sarjaa niiden todennäköinen loppupään tavoitteet sekä arvioidaan rikastaminen näiden aineistojen differentiaalisesti ilmentyvien geenien tai proteiinien. Kutsumme tätä menettelyä ”topologinen scoring” (katso ”Menetelmät” -kappaleessa lisätietoja).

Meidän aikaisempi työ tätä menetelmää testattiin joukko microarray geenien ilmentyminen tietoja psoriatic potilaista missä se kykeni oikein tunnistaa monet keskeiset säätelyproteiineihin jonka suhteen tauti on vahvistettu riippumattomissa tutkimuksissa [24]. Tässä tutkimuksessa olemme soveltaneet topologinen pisteytyksen lähestymistapa tutkia vaste LNCap eturauhasen syöpäsolujen hoitoon synteettisen androgeenin (R1881), kuten hyvin tutkittu mallijärjestelmä eturauhassyövän etenemiseen. Otimme data-lähestymistapaa, ilman ennakkoasenteita hypoteesi koskien solun prosesseja aktivoidaan androgen näissä soluissa. Olemme keränneet ja analysoineet sekä geenien ilmentyminen ja proteomiikka tiedot, jotta rajat vahvistaa perustuvia ennusteita erityyppisiä tietoja ja arvioida hyödyllisyyttä tämän lähestymistavan integroiva tietojen analysointi.

Tulokset

Genes ja proteiinit vaikuttavat androgen hoito tunnistetaan microarray ja proteiini massaspektrometrialla

jotta kuulustella rooli androgen eturauhassyövässä, androgeenireseptorin reagoiva eturauhassyöpä LNCaP käsiteltiin synteettisellä androgeenien R1881 (katso ” menetelmät ”yksityiskohdat osasta). LNCaP-solut käsiteltiin androgeenireseptorin osoittivat lisääntynyttä solujen lisääntymistä kun taas kontrolli solujen kasvu pysähtyi androgen köyhdytetyn välineellä. Käyttämällä tilastollinen analyysi geenien ilmentyminen tietojen olemme tunnistaneet 347 ja 257 geenit, jotka olivat ylös- ja alas-säädellä vastaavasti käsitellyissä vs. käsittelemättömissä soluissa (FDR≤1%) (taulukko S1). Ylös geenien mukana tunnettuja androgeenin indusoima geenien kuten Kallikrein 3 (

KLK3

; alias

PSA

), FK506 sitovaa proteiinia 5 (FKBP5), N-myc loppupään säännelty 1 (NDRG1 ) ja rasvahappojen syntaasia (FASN). Käyttäen iTRAQ 2DLC-MS /MS-pohjainen proteomic profilointi androgeenin käsitellyn vs. hoitamaton LNCap-soluissa, olemme tunnistaneet 70 ja 39 proteiinit, jotka olivat koholla tai alas-säädellä, vastaavasti, käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin (taulukko S1) ( tiedot massaspektrometrian ja tilastollisia analyysejä kuvataan [25]). Androgeenisäädellyn proteiini tietokokonaisuus mukana geenin tuotteita tunnetuissa geenien edellä mainittiin, sekä useita muita proteiineja aikaisemmin tunnettuja ja tuntemattomia säänneltävä androgen. Sarjaa up-geenien ja proteiinien on 13 yhteistä jäsentä, joka on on noin 17%: a pienemmäksi. Saat alas geenien ja proteiinien taso vastaavuustaulukkoa on ~8%.

topologisesti merkitsevä solmuja globaalissa signalointiverkon

Tutkiakseen otaksuttu signalointimekanismeja jotka aktivoivat geeni ja proteiinin ilmentymisen jälkeen androgeenistimulaation, olemme käyttäneet meidän äskettäin kehitetty tekniikka topologinen merkitys analyysi [24]. Olemme esittäneet luettelot up geenien ja proteiinien on-line versio meidän topologinen naarmutustyökalu (https://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi) tunnistaa keskeiset säätelyproteiineihin joiden toiminta käsitellyissä soluissa saattaisi osuus on ollut muutoksia geenien ja proteiinien tasoja. Geenien ilmentyminen ja proteomiikka tiedot toimitettiin scoring menettelyn erikseen, jolloin kaksi topologisesti merkittävät sääntelyyn proteiineja. Jokainen solmu globaalissa verkostossa proteiinivuorovaikutussuhteiden annettiin topologinen tulokset (topologinen p-arvot) osalta jokaisen sarjan molekyylitason tietoa. Kontrolloida vääriä löytö määrä (FDR) merkitsevyystaso suodatin on sovellettu. Käyttämällä FDR≤5% tunnistimme 962 topologisesti merkitsevä proteiinien geenien ilmentyminen tietoja ja 577 topologisesti merkitsevä proteiinit proteomic (taulukko S2). Mielenkiintoista, kaksi topologisesti merkitsevä proteiinit sisältävät 301 yhteisiä elementtejä (eli 52% pienemmäksi) .Tämä tulos on jyrkässä ristiriidassa vain 17% päällekkäisiä luetteloita jopa geenien ja säädelty proteiineja.

Kasvukerroin signalointi verkko on erittäin osallisena androgeenireseptorin vastauksena

toiminnallinen analyysi, molemmat topologisesti merkitsevä proteiinit ladattiin MetaCore ™ ohjelmistopaketti (GeneGo, Inc.), jossa laskimme rikastumista ontologian toiminnallisia prosesseja määritelty ”GeneGo prosessi verkot”. Käytimme kaikki proteiinit MetaCore verkossa ( ”default” -asetus) ohjearvon listan laskemiseksi rikastamiseen p-arvot. Kuten olisi odotettavissa, top-pisteytys prosessi on ”Androgeenireseptorin ydinaseiden signalointi” (kuva 1a). Yllättäen kuitenkin tämä prosessi on hyvin rikastettu vain proteiineja, joiden topologinen tulokset ovat peräisin geeniekspressioprofiili; 82 126 solmuja tähän prosessiin verkon katsotaan merkittävästi suhteessa yli-ilmentynyt geenejä. Sitä vastoin vain 19 solmut katsotaan merkittävästi suhteessa sääteli proteiineja iTRAQ aineisto. Seuraava korkeasti rikastetun prosessi verkko on ”Kasvu tekijä säätely solusyklin”. Toisin kuin androgen signalointi, tämä verkko on hyvin rikastettu proteiineja, jotka ovat topologisesti huomattavat molempien geenien ilmentyminen ja proteomiikka tiedot. 186 solmut tähän verkostoon, 95 ovat erittäin sijoitettiin suhteessa yliekspressoitu geenit taas 63 ovat erittäin sijoitettiin nähden iTRAQ-tunnistettu proteiineja säädellään ylöspäin jälkeen androgeenien hoitoon. Yhdistelmänä 49 solmut vahvistetaan topologisesti merkittäviä molempien molekyylien tietoja. Lähempi tarkastelu tämän prosessin paljastaa, että topologisesti merkitsevä proteiinit ovat läsnä kaikilla tasoilla signaloinnin riippumatta, sekä useat kasvutekijät (EGF, FGF, VEGF-A), reseptorit (IGFR, EGFR, ActRIIB, VEGFR-2), signalointikinaasit (AKT GSK3, PI3K, JNK, ERK1 /2, PKC), transkriptiotekijöitä (c-Myc, IRF1, Tcf (Lef), Smad3, Smad4, STAT1, STAT3) ja lopuksi sykliini kinaasit (sykliini D, sykliini E), joka suoraan säätelevät solusyklin (kuva 2). Tärkeää on, topologinen merkitys monien näiden proteiinien varmistettiin molempien aineistoja. Vertailun olemme myös suorittaa koulutusjakson rikastamiseen analyysi alkuperäisen sarjaa ylös geenien ja proteiinien. Mielenkiintoista on, että suurin osa havaittu reitin karttoja sekä geenien ilmentyminen ja proteomiikka sarjaa liittyvät aineenvaihduntaan, useimmat niistä rasvahappoaineenvaihdunnan (taulukko S3). Lisäksi useat signalointipolkujen havaittujen tässä analyysissa, nimittäin Kasvukerroin signaloinnin kautta MAPK ja di pIK3, sääntely rasva-aineenvaihdunnan ja yksi polku kartta liittyvät solusyklin. Kuitenkin mikään signalointipolkujen on erittäin korkealle rankattu ja yleinen merkitys rikastus on alhainen verrattuna saadut tulokset proteiineja tunnistetaan topologinen pisteytys. Rikastaminen GeneGo verkkojen sääteli proteiineja ei paljasta Androgeenien signaloinnin verkkoon, mutta se on myös alareunassa luettelo (p = 0,007). Paitsi insuliinin signalointi näyttää olevan mitään johdonmukaisuus verkkojen rikastettu jopa geenien ja sääteli proteiineja. Kaiken näyttää siltä, ​​että funktionaalinen analyysi differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja proteiinien taipumus tunnistaa ydinkohderyhmään reittejä, kuten aineenvaihdunta, kun taas anaylysis on topologisesti merkitsevä proteiinien paljastaa avain signalointi käsitellään aktivoitu androgeeni-stimuloiduista soluista.

(A) rikastaminen GeneGo prosessin verkkojen topologisesti merkitsevä proteiinit tunnistettiin kaikki ylös geenien ja proteiinien. (B) rikastaminen GeneGo prosessin verkkojen topologisesti merkitsevä proteiinit tunnistettiin käyttämällä katkaistun tietueeseen (pois lukien geenien ja proteiinien suoraan säätelee androgeenireseptorin). Oranssi palkki-väkevöimisen merkittävät proteiinit tunnistettiin käyttämällä proteomiikka tietokokonaisuutta. Siniset palkit-väkevöimisen merkittävät proteiinit tunnistettiin käyttämällä geenien ilmentyminen tietoja.

Red pisteet osoittavat proteiinit tunnistettu topologisesti merkitsevä käyttäen geeniekspressioprofiili. Siniset pisteet osoittavat proteiinit tunnistettu topologisesti merkitsevä käyttäen proteomiikka profiilin. Red laatikot-proteiinit tunnistettu topologisesti merkittäviä kyseisiä tietoja.

Sen tutkimiseksi, onko merkittäviä eroja koot sarjaa käytetään analyysimme voineet vaikuttaa tuloksiin me satunnaisesti näytteitä altaan geenejä ja proteiineja ja lisätä ne ilmentyvät eri sarjaa. Tämä vaihe seurasi rikastaminen analyysi laajennettu sarjaa. Tulokset kuitenkin osoittavat, että uusia karttoja tai verkostojen tulee merkittäviä suuremmille sarjaa ja lisäksi merkitys aiemmin tunnistettu karttojen ja verkkojen tasaisesti vähenee enemmän satunnaisia ​​geenejä lisätään. (Katso taulukko S4).

rajaamista androgeeniriippuvaisen ja androgeenista riippumaton aktiivisuus

Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että suurin osa proteiinien signalointi verkossa yhdistämällä useita kasvutekijöiden säätely solusyklin voi tulla aktiivinen jälkeen androgeenistimulaation. Tuloksena aktivoituminen soluproliferaation voisi tulla yksi keskeinen mekanismi kytkin androgeeniriippumattomuuteen eturauhassyövässä. Edelleen varmistamiseksi tämän otaksuma meidän täytyy tutkia, onko tämä tulos riippuu suoraan toimintaan androgeenireseptorin. Niinpä seuraava askel oli hahmotella signalointi vaikutuksia, jotka ovat riippumattomia suoria aktivaation androgeenireseptorin.

Ensimmäinen, käytimme MetaCore ™ tunnistaa, mitkä yli-ilmentynyt geenien ja säädelty proteiinit ovat kohdistu suoraa transkription sääntelyä androgeenireseptorin. Tätä varten rakensimme ”naapurit” verkosto ympäri androgeenireseptorin kanssa vuorovaikutuksessa suodattimen MetaCore asettaa sallimaan vain ”transkription säätelyyn” sidoksia. Luettelot up-geenien ja proteiinien kartoitettiin päälle syntyvä verkko. Käyttämällä tätä verkko me vielä valittu solmut, jotka ovat sekä ”alavirtaan” androgeenireseptorin ja on kokeellista tietoa niihin liittyviä. Löysimme 45 kohdistu suoraa androgeenireseptorin keskuudessa yli-ilmentynyt geenien ja 9 tavoitteiden joukossa joukko sääteli proteiineja. Nämä molekyylit jätettiin alkuperäisestä luetteloista ja katkaistun sarjaa analysoitiin uudestaan ​​kanssa topologinen merkitys työkalun myöhemmin toiminnallinen analyysi topologisesti maalin solmuja MetaCore ™. Havaitsimme 565 merkittäviä proteiineja perusteella iTRAQ tietojen ja 668 merkittäviä proteiineja perusteella geeniekspression aineisto (jossa FDR 5%, Taulukko S5). Yksi havainto heti havaittavissa tutkittaessa rikastamiseen kaavio on poissa ollessa androgeenireseptorin signaloinnin verkkoon (kuva 1b). Tämä puuttuminen vahvistaa, että monet proteiinit androgen koulutusjakson sai hyvät topologinen pistemäärän vahvuus yli-ilmentymisen suuri määrä kohdistu suoraa androgeenireseptorin. Kun nämä tavoitteet on eliminoitu huomioon pisteytykset proteiinit androgeenisäädellyn reitin putosi alle merkitsevyystasolla. Sen sijaan korkea rikastuminen verkoston kasvutekijän säätely solusyklin pysyi käytännössä ennallaan. Vaikka määrä solmuja tässä verkossa teki pohjalta microarray tietojen laski 95-78, solmujen määrä pisteytetään perustuu iTRAQ tietoihin kasvoi 63 71. päällekkäisiä kahden merkittävän proteiinien myös kasvoi 54 (tai 76%: n pienemmäksi). Tämä havainto tukee ehdotusta, että toiminta tämän reitin on riippumaton suora androgen toimintaa ja voi edustaa tärkeitä mekanismeja kytkin androgeenista riippumattoman leviämisen eturauhasen syöpä.

Ansiokkaimmille säätelevien proteiinien ja niiden reitit

Seuraavaksi tutkimme ansiokkaimmille molekyylien sarjaa topologisesti sijoitettiin proteiineja. Tavoitteena oli selvittää tiettyjä transkriptiotekijöitä, jotka ajavat geeniekspression vaste androgen hoidon ja tunnistamaan sääntelyssä kaskadeja että aktivoimiseksi. On olemassa useita transkriptiotekijöitä, jotka voivat säädellä ilmentymistä merkittävä määrä ”targets” oli yli-ilmentyvien geenien tai säädelty proteiineja tai molempia (taulukko 1). Esimerkiksi c-Myc on 25 tavoitteiden joukossa 70 sääteli proteiinit tunnistetaan iTRAQ ja 63 tavoitteet keskuudessa 347 yliekspressoitujen geenien tunnistaa mikrosiruanalyysillä. c-Myc on sijalla # 1 topologinen pisteytys perustuu iTRAQ tietoihin ja # 11 pisteytyksen perustuu geenien ilmentymisen (vielä top 2%). Muita transkriptiotekijöiden, jotka saivat korkeat topologinen tulokset suhteen molemmat aineistot ovat SREBP1 ja YY1, jotka ovat tärkeitä säätelijöitä osallistuvien entsyymien lipidien ja rasvahappojen aineenvaihduntaan. Sen sijaan CREB1 ja ATF-4 ovat top-pisteytys transkription sääntelyviranomaisten suhteen microarray tietoja, mutta ne eivät saa pisteet perustuvat iTRAQ tietoihin. Syy tällaiseen ero on puute merkittävä määrä CREB1 ja ATF-4 tavoitteiden joukossa sääteli proteiinit tunnistettu massaspektrometrialla (taulukko 1). Tämä voi osoittaa toimintaa noin posttranskriptionaalisella prosessien estää synteesi tai indusoimaan hajoaminen näiden proteiinien on näytteenottohetkellä. Vaikka transkriptiotekijät saavat usein korkea topologinen pisteytys vuoksi huomattava määrä niiden kohderyhmiä kokeellisen aineistoja, alkupään signalointi molekyylit pisteytetään perustuvat rikastuminen sarjaa heidän ”kauko tavoitteensa” -genes ja proteiinit muutaman askeleen alajuoksulla signalointi polkuja.

Examination yksittäisten signalointikaskadien johtaa huipulle transkription sääntelyviranomaisten paljastaa, että PI3K signalointi tukee jatkuvasti korkealla topologinen tulokset saadaan sekä proteomiikan ja mikrosirujen aineistoja. Kuvio 3 esittää tämän kaskadin yhteydessä IGF-signalointia. PI3K Cascade on korostettu punainen viiva, vaikka kaikki sen osat, jotka saavutetaan korkea topologinen tulokset suhteen molemmat on merkitty punaisella laatikoita. Tällainen johdonmukainen pisteytys ehdottaa keskeistä roolia tämän reitin säätelyssä tapahtumiin, jotka seuraavat androgen hoito. Todennäköisesti, sen rooli tässä järjestelmässä on esto GSK3-kinaasi ja sen kyky fosforyloida c-Myc ja sykliini D (Fig. 3). Tavallisesti tällaiset fosforylaatio kohdistaisi näitä molekyylejä proteolyysin, mikä rajoittaa solujen lisääntymisen. Tässä tilanteessa kuitenkin, c-Myc näyttää jatkuvasti aktivoida päätellen suuri määrä sen kohdistu suoraa läsnä kummassakin. Yksi todennäköinen syy pysyviä PI3K: n aktiivisuus signalointi on homotsygoottinen mutaatio PTEN LNCaP-soluissa johtaa puute sen ekspression tässä järjestelmässä [26]. Tämä vaikutus voi pahentaa yhdistelmä korkean Kallikrein 3, yli-ilmentyminen IGF-reseptoriin, ja alle-ilmentyminen IGF-sitovia proteiineja (liiketoimintasuunnitelmissa). Kallikreiini 3 (tunnetaan myös PSA) on erittäin säädellään ylöspäin eturauhassyövän ja on jatkuvasti yli-ilmentyy sekä mRNA ja proteiini tasoilla meidän kokeellisten tietojen. Se oli aiemmin osoittaneet, että PSA on proteolyyttinen potentiaalia suhteessa IGF sitovia proteiineja [27], [28]. Lisäksi ehdotettiin, että tämä voisi olla mekanismi, jolla hyötyosuus IGF on lisääntynyt, edistää kasvua eturauhasen syöpäsolujen [29], [30].

Red tasolla ”lämpömittarit” edustaa suhteellista (prosenttipisteen) proteiinin vastaavaan luetteloon topologisesti merkittäviä proteiineja. Numero tunnistaa aineisto, josta merkitys on laskettu: 1-iTRAQ, 2-Affymetrix. Red laatikot ja korosti polku havainnollistavat signalointiryöpyn voimakkainta tukea sekä sarjaa.

Meidän analyysi olemme saaneet useita muita todisteita tukemaan tätä hypoteesia. Ensinnäkin, IGF sitovia proteiineja saivat korkeita topologinen tulokset perustuvat sekä microarray ja iTRAQ tiedot. Tämä tulos vahvistaa sen, että ne ovat erittäin tärkeitä havaittu muutoksia geenien ja proteiinien ilmentyminen seuraavien androgen hoitoon LNCaP. Toiseksi, kun androgeeni hoidon havaittiin, että ekspressiotasot ainakin yksi IGF-sitovia proteiineja (IBP3) ja IGF-reseptorin siirtyminen vastakkaisiin suuntiin. IBP3 on 30% alle ilmaistuna käsitellyissä soluissa, kun taas IGF-reseptori on 46% yli-ilmentynyt. Down-regulation IBP3 genomitasolla lisäksi proteolyyttisen aktiivisuuden PSA edistäisi alhaisempi pitoisuus IBP3 proteiinin ja parempi saatavuus IGF. Tuloksena korkeampi IGF vertoja yli-ilmentyminen sen reseptorin, mikä johtaa suuriin aktiivisuuden alavirran polkuja.

Keskustelu

Kasvukerroin verkossa kuin päävastaus moduuli androgeenistimulaation LNCaP solut

topologinen analyysi tunnistaa verkon kasvutekijän säätely solusyklin pääasiallisena vastauksena moduuli androgen hoitoon LNCaP-soluissa. Kuten on kuvattu johdannossa, eri näkökohtia kasvutekijän signalointi on tutkittu laajalti yhteydessä eturauhassyövän kytkin androgeenistä riippumaton tilassa. Tuloksemme tukevat näitä aikaisemmin huomautuksia täydentävä järjestelmätason, data-driven näkökulmasta. Sen sijaan, että keskitytään toiminnan yksittäisten proteiinien, osoitamme, että valtaosa signalointi verkon solmujen yhdistää useita kasvutekijöitä keskeisille säätelijöinä solukierron miehittää merkittäviä asemia suhteessa havaittujen geenien ilmentymistä ja proteomiikka profiileja aikaansaama androgeenistimulaatiota. Tämä verkko sisältää useita tavanomaisia ​​”väyliä” signaalien kasvutekijäreseptoreista. Näitä ovat signaloinnin kautta MAP-kinaasien, PI3K koulutusjakso ja signaloinnin kautta Smad: ien ja cross-talk keskuudessa näitä järjestelmiä. Näin ollen on perusteltua päätellä, että eturauhasen syöpäsolujen proliferatiivinen signaalit lähetetään kasvutekijäreseptoreista mukana lukuisia signalointipolkujen yhdentyvät useita keskeisiä säätelijöitä lisääntyminen kuten c-Myc, sykliini D ja CREB1. Lisäksi nämä reitit eivät ole erillisiä, vaan muodostavat toisiinsa verkon moduuli sisältää useita vaihtoehtoisia reittejä panosten ja tuotosten.

Tuloksemme osoittavat lisäksi, että kasvutekijä signalointi luultavasti edustaa ”toista vaihetta” soluvastetta androgeenistimulaatiota. Kun kaikki suorat tavoitteet androgeenireseptorin poistetaan huomioon, useimmat proteiinit kasvutekijän verkko ovat edelleen erittäin sijoitettiin suhteessa jäljellä sarjaa yli-ilmentyvien geenien ja proteiinien. Tämä vastaus voi olla välittämää yhdistetyt vaikutukset korkea PSA: n ja kasvutekijän reseptorit ja alhainen kasvutekijän estäjät, kuten IGF-sitovia proteiineja (liiketoimintasuunnitelmissa) (Fig. 3). , Proteolyyttisen toiminnan PSA voi lisäksi myötävaikuttaa alentamiseen liiketoimintasuunnitelmissa tasoilla. Samaan aikaan, PSA ilmentymistä voidaan ylläpitää riippumatta androgeenireseptorin mukaan CREB1 ja joidenkin muiden transkriptiotekijöiden [31]. Kun nämä tekijät aktivoidaan kasvutekijä signalointireittien, positiivinen takaisinkytkentäsilmukka syntyy jotka voivat pitää yllä korkeita PSA: n ja solujen lisääntymisen jopa ilman aktivoitujen androgeenireseptorin. Olemme todenneet, että CREB1 on sijalla # 1 topologinen pisteytys geeniekspression data, mikä tarkoittaa, että se on erittäin aktiivinen tässä järjestelmässä.

Vaikka vielä kokeellista työtä, kuten siRNA tutkimuksia tarvitaan vahvistaa näitä päätelmiä, jos osoittautui oikein ne voivat johtaa meidät uudelleen lähestymistapaamme löytää kohdistettuja hoitomuotoja eturauhasen syöpä. Biologiset verkot ovat vankkoja siinä mielessä, että on olemassa monia vaihtoehtoisia tapoja lähettää molekyyli signaali yhdestä pisteestä toiseen. Koska korkea mutaationopeudet geenien syöpäsoluissa, on todennäköistä, että vaikka me estää tietyn Cascade kohdennetun huume, siellä on ainakin osa-populaatio solujen kasvain, joka voisi kiertää tällaisen lohkon käyttämällä vaihtoehtoinen signalointi reitti. Jos koko verkko on mukana, joka on laadittu täsmällisesti yhdistelmähoitoa vaaditaan taistelemaan kasvaimen kasvua tehokkaasti. Lisäksi tällainen yhdistelmä hoitoja voisi olla spesifinen pienelle alaryhmästä potilaista tai jopa yksittäisten potilaiden annetaan potilaan erityisten ominaisuuksien onkogeenisten verkkoja.

Dynaaminen luonne soluvasteiden ja integroinnin tuottamien tietojen eri tekniikoiden

tässä tutkimuksessa samanaikainen mittaukset geenien ilmentymisen ja proteiinin tasot hoidon jälkeen synteettisellä androgen tehtiin, ja satoja geenejä ja kymmeniä proteiinien jonka pinta nousi jälkeen ärsyke oli tunnistettavissa. Kuitenkin on vain vaatimaton päällekkäisyys (noin 17%) havaittiin välinen sarjaa ylös geenien ja proteiinien. Vaikka alun perin tämä kuulostaa yllättävä, tämä tulos olisi odotettavissa. Solut ovat monimutkaisia ​​dynaamisia järjestelmiä, joissa prosesseissa esiintyy useita aikajänteellä. Kun määritystä biologisessa näytteessä otamme tilastollisen kuvan tämän dynaamisen käyttäytymisen. Esimerkiksi mRNA voi lisätä jälkeen 20-60 min käsittelyn jälkeen, mutta proteiinisynteesiä voitaisiin viivästyä, ja tilastollisesti merkitsevää muutosta proteiinikonsentraatioilla kestää paljon kauemmin kehittää ja saada pienempiä suhteita. Mennessä proteiinit syntetisoidaan jonkin mRNA voitaisiin hajonnut, jättämättä jälkeäkään geenin yli-ilmentyminen. Niinpä kun tutkitaan mikrosiru tai proteomic tietoja, olemme tekemisissä hajanaista jälkiä toiminnan, jotka ovat jääneet ohimenevä dynaamisia prosesseja eri tasoilla cellular koneita. Jopa kokeissa, joissa näytteet analysoidaan useissa eri aikapisteissä olemme edelleen tarkastelemalla pieni kokoelma yksittäisiä otoksia pikemminkin kuin täydellistä kuvaa solujen dynamiikkaan.

Tässä käytimme käsitettä topologinen merkitys rekonstruoida ylävirran polkuja, jotka saattoivat johtaa nämä määrät dynaamista toimintaa, jonka me havaittu havaittavissa molekyyliprofiilien. Tulokset osoittavat, että tämä lähestymistapa on onnistunut ennustamaan keskeisten säätelyproteiineihin ja reittejä kuten androgeeni- signalointi, kasvutekijä signalointi ja säätely solusyklin jotka välittävät vasteita LNCaP hoitoon synteettisen androgeenin (R1881). Mikä tärkeintä, olemme havainneet, että verran päällekkäisyyttä sarjaa säätelevien proteiinien ennustettu geenien ilmentyminen ja proteomiikka data on paljon suurempi kuin päällekkäisyyden kokeellisen asettaa itse (52% vs. 17%). Lisäksi, kun kasvutekijän säätely solusyklin joka näyttää olevan keskeinen prosessi tässä järjestelmässä, päällekkäisyys saavuttaa 76%.