Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Huolimatta alhainen esiintyvyys, munasarjasyövän on viides johtava syy syöpäkuolemista ja se on korkein kuolleisuus kaikista gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia keskuudessa Yhdysvalloissa naiset. Kuolleisuus vähenisivät kanssa varhaishavaintojärjestelmä merkki. Folaatin reseptorin alfa (FRα) on yksi looginen valinta biomarkkereiden koska se esiintyy yli-ilmentymisen munasarjasyövän ja sen yksinomainen ilmaisun vain muutaman normaaleissa kudoksissa. Tunnetussa työtä, havaittiin, että potilailla, joilla on munasarjasyöpä oli kohonneet seerumin proteiini, joka on sidottu FRα-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine terveisiin yksilöihin verrattuna. Kuitenkin, se ei osoittanut, että proteiini havaitaan oli ehjä toiminnallinen FRα. Nykyisessä tutkimuksessa tavoitteena oli selvittää, munasarjasyöpä potilaiden (n = 30) olivat kohonneet seerumitasot täysin toimiva ehjä FRα verrattuna terveisiin (n = 30).

Menetelmät /Principal Havainnot

FRα seerumissa analysoitiin kahdella tavalla, immunoblotting-analyysi ja radioaktiivisesti foolihapon-pohjainen mikrosuodatusta sitoutumismäärityksessä. Käyttämällä immunomääritys, havaitsimme, että tasot FRα olivat korkeammat seerumin munasarjasyövän potilailla verrattuna kontrolleihin. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös käyttämällä mikrosuodatusta sitoutumisen määrityksessä, joka osoitti, että kiertävän FRα on toiminnallinen. Mikä tärkeintä, Huomasimme myös, että tasot FRα vastasivat toisiaan varhaisessa ja pitkälle potilaat.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittavat, että munasarjasyöpä potilaat ovat kohonneet toiminnallisen ehjä FRα. Nämä havainnot tukevat mahdollinen käyttö kiertävän FRα biomarkkerina varhaisen munasarjasyövän.

Citation: Basal E, Eghbali-Fatourechi GZ, Kalli KR, Hartmann LC, Goodman KM, Goode EL, et al. (2009) Toiminnallinen Folaatti Reseptori Alpha on kohonnut veren munasarjasyöpäpotilailla. PLoS ONE 4 (7): e6292. doi: 10,1371 /journal.pone.0006292

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2009; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2009; Julkaistu: 20 heinäkuu 2009

Copyright: © 2009 Basal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Avustus tukivat National Cancer Institute apurahat, K01-CA100764 ja R03-CA121386. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä on viidenneksi suurin syy syövän kuoleman ja on korkein kuolleisuus kaikista gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia keskuudessa Yhdysvalloissa naiset, joiden arvioitu 21650 uutta tapausta ja ennakoitu 15500 kuolemantapausta vuonna 2008 [1]. Valtaosa munasarjasyöpäpotilaalle läsnä kehittynyt sairaus (vaiheiden III-IV) ja on 5-vuoden pysyvyys tyypillisesti 30%. Se, että potilaiden selviytymiseen osuuksilla I-II tauti vaihtelee 60% -90%, riippuen kasvaimen [1], [2] viittaa mahdollisuudet korkea kovettumisnopeus aiempien sairaus havaitsemista. Koska fyysiset oireet ovat poissa alkuvaiheessa munasarjasyövän, yritetään kehittää määrityksiä veren tai kudoksen biomarkkereita.

Vaikka seerumin CA-125, munasarjojen pintaglykoproteiinille (eli musiinialue) tuntematon biologista merkitystä, on koholla 80% potilaista, joilla on edennyt epiteelin munasarjasyöpä, tämä merkki on positiivinen ennustearvo 10% alkuvaiheen tauti [3]. Lisäksi CA-125 liittyy myös erilaisia ​​ei-pahanlaatuisten sairauksien, kuten raskaus, endometrioosi, adenomyoosi, kohdun kohdun, sisäsynnytintulehduksen, kuukautiset, ja hyvänlaatuisia munasarjakystat. CA-125 on myös liitetty muihin pahanlaatuisten sairauksien, kuten haiman, rinta-, keuhko-, maha-, ja paksusuolen syöpiä [4]. Vaikka CA-125 on hyödyllinen seurannassa potilaan kemoterapian havaita varhaisessa uusiutumisen potilailla, joilla on jo tiedossa munasarjasyöpiä, se ei ole hyödyllistä tunnistaa varhaisessa vaiheessa tauti [5].

folaatin reseptorin α (FRα), joka on 38-40 kDa molekyyliä, on hyvin tunnettu jäsen folaatin reseptorin (FR) perheelle suuri affiniteetti folaatit. FRα on ankkuroitu solukalvojen läpi glykosyylifosfatidyyli osan ja kuljettaa folaatit kautta endosyyttisissä prosessi [6]. FRα osoittaa rajoitettu normaalia kudosta, jakauma mitattavissa ilmentyminen rajoittuu apikaalisella pintoihin muutaman epiteelin, pääasiassa keuhkoissa, munuaisissa, ja suonipunoksessa, mutta on yli-ilmentynyt kirjo kiinteiden kasvainten, mukaan lukien munasarjasyöpä, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä , rintasyöpä, munuaissyöpä ja korkea-asteen osteosarkoomaa [7] – [10]. Tämä yli-ilmentymistä korkealla affiniteetilla FRα joidenkin syöpien voinut syntyä vastaamaan solun vaatimukset DNA-synteesiä ja kasvua [11].

Sen lisäksi, että solun pinnan sijaintia, FRα voi levitä myös vereen. Irtoaminen oli alun perin havaitut kehitystä folaatin radioligandin sitoutumismääritykset jota käytetään puhdistettua solutonta FR sitovana proteiinia. Näissä tutkimuksissa todettiin, että oli usein suuri ristiriita arvioitaessa seerumin folaatin analysoituna jälkeen lämpöuuttamalla verrattuna natiivi seerumin [12]. Kun irtoa, FRα sitovat liikkeellä folaattia, koska affiniteetti on nM alueella. Nyt on hyvin selvää, että irtoaminen vaikeuttaa tulkintaa seerumin folaatin määrityksiä ja mahdollisesti peittää läsnä toiminnallisen reseptorin ellei happokäsittely käytetään vapauttamaan endogeenisen folaatin ja anna FRα kyllästetty radioaktiivisesti foolihappoa. Tämä ristiriita foolihappopitoisuuksia natiivin ja lämpöä uutetaan seerumin yksilöitiin kiertävän FRα joissakin näytteitä napanuoraveren ja joissakin äidin seerumissa [13]. Tärkeää on, FRα vapautuu normaalin epiteelisolujen ei tulisi edistää FRα tasoja seerumissa, koska reseptori on aina lokalisoitu apikaalisella pinnalla polarisoidun epiteelin, jossa sen irtoaminen toimittaa vapaata reseptoria onteloon, joka luonnostaan ​​valuu elimistöstä oman aukon.

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että FRα voi levitä myös vereen kasvaimista, mikä tarjoaa mahdollisuuden käyttää ja mitata sitä tuumorimarkkeri alkuvaiheen syöpä. Vallitseva ilmentyminen FRα munasarjasyövän, joukossa kaikki vaiheet, on herättänyt kiinnostusta sen soveltamisesta terapeuttisena kohteena ja biologisten merkkiaineiden [14]. Tavoitteena Nykyisen tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, ehjä toiminnallinen FRα vuodatetaan verenkiertoon ja arvioimaan sen mahdollisuuksia kiertävä biomarkkereiden. Tätä tavoitetta tukee ennen työtä, joka osoitti, että munasarjasyöpä potilaiden kohonneet seerumin proteiinia, joka reagoi anti-FRα vasta [15]. Mitä jäi vastataan oliko vasta-ainetta määrittävät koko FRα ja onko havaittu proteiini oli toiminnallinen folaatti reseptori (FR). Näin ollen, esillä olevassa tutkimuksessa, tasot verenkierrossa FRα veressä munasarjasyöpäpotilaalle tutkittiin käyttämällä

3H-FA-pohjainen mikrosuodatus määritys, joka on kehitetty tunnistamaan toiminnallisia FRα. Lisäksi, immunoblot-määritys käytettiin läsnäolon varmistamiseksi erityisten koko FRα proteiinia. Kuten näkyy, munasarjasyöpä potilaat osoittavat kohonneita FRα verenkierrossa tuetaan sen mahdollinen käyttö sairaudeksi biomarkkereiden.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Mayo Clinic IRB hyväksytty tutkimuksen ja kirjallinen suostumus saatiin kaikista potilaista.

Oppiaineet

Jokaisessa munasarjasyövän tapauksessa ensin sovitetaan naisen valvonnan veren piirtää 6 kuukauden kuluessa (kaikki 30 tapausta Hyväksytty onnistuneesti), ja sitten ikä 5 vuoden kuluessa. Kaksikymmentäyhdeksän tapausta onnistuneesti vastaaviksi. 30. Asian Hyväksytty veren piirtää 6 kuukauden kuluessa ja iän kuluessa 9 vuotta tukikelpoisille valvontaa. Hyväksyttävät tapaukset olivat potilaat, yli ikä 20, jossa on histologisesti vahvistettu ensisijainen epiteelin munasarjasyöpä. 40 ml (ennen leikkausta) verinäyte on kerätty, käsitelty, jaettiin osiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa seerumin. Keskimääräinen ikä (± SEM) on samanikäisiin terveille luovuttajien ja potilasta oli 61 ± 3 ja 60.63 ± 3 vuotta. Muut potilaan ja kasvaimen ominaisuudet esitetään taulukossa 1.

Tarvikkeet ja reagenssit

Foolihappo saatiin Alexis Biochemicals. Sentrifugi suodattimet (10000 Daltonin leikkauksella) ostettiin Millipore (Burlington, MA). Tritioituja foolihappo [3,5,7,9-

3H] natriumsuola, (

3H-FA, 1 mCi /ml) hankittiin American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, Missouri), ja Ready turvallinen nestetuikeseosta oli kotoisin Beckman Coulter. Anti-FRα vasta-aineita, MOv18 /ZEL ja F5753 olivat Alexis Biochemicals (San Diego, CA) ja US Biological (Swampscott, MA), vastaavasti.

valmistaminen kasvaimen solulysaateista ja soluviljelysupernatanttia lähteinä FRα

KB-solut ovat ihmisen nenänielun epidermoidikarsinooma soluja, jotka ilmentävät korkeita FRα [16] – [18]. KB-soluja viljeltiin väliaineessa, joka koostuu folaatti-RPMI 1640, johon oli lisätty 55 uM 2-merkaptoetanolia, 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 10 mM HEPES-puskuria, 100 IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia. Supernatantit valmistettiin sentrifugoimalla elatusaine 4 ° C: ssa poistamiseksi niiltä puuttuisi kiinnekohta soluihin. Alikvootteja 4 päivän supernatantit säilytettiin -80 ° C: ssa, jota käytetään lähteenä ei-soluun FRα. Solulysaatit valmistettiin konfluentteja KB yksisolukerrosten toistuvien jäädytys-sulatus-sykliä, mitä seurasi sentrifugointi jätteiden poistamiseksi. Sekä supernatantit ja solulysaateista, proteiinin pitoisuudet määritettiin optinen tiheys. MCF-7 ihmisen rintasyövän soluja käytettiin FRα-negatiivinen kontrolli ja valmistettiin samalla tavalla kuin KB-soluja. Lysaatit (5-10 ug lysaatit) ja supernatantit (10-20 ui) käytettiin määrityksen kehittämisen ja kontrolleina.

3H-foolihappoa sitoutumismääritys

mittaus folaatin reseptorit tapausten ja kontrollien oli muunnelma aiemmin kuvatun menetelmän [19]. Näytteet (10 ui) ladattiin ylempään kammioon parin suodatinputkiin ja laimennettiin 50 ul: yhteensä kanssa liuottavan liuoksen (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 25 mM

n

oktyyli -β-D-glukopyranosidia, 5 mM EDTA: ta ja 0,02% natriumatsidia). Suodatinputkiin sentrifugoitiin ja suodattimet käsiteltiin 30 mM asetaatti (pH 3,0), poistamaan endogeeninen FA seurasi sentrifugointi, ja kahdella pesulla liuottavan liuoksen. Sitten paria suodatinputkiin inkuboitiin joko 1000x kylmä FA sitovalla (10 mM Na

2P

4, 1,8 mM KH

2PO

4, 500 mM NaCl, 2,7 mM KCI, pH 7,4, ja 25 mM

n-

oktyyli-β-D-glukopyranosidi) tai sitovan ratkaisun yksin, ja näytteitä inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sentrifugoitiin sitten. Sitova liuos, joka sisältää

3H-FA lisättiin sitten kaikkiin näytteisiin seurasi inkubointi yön yli 4 ° C: ssa varovasti sekoittaen. Suodattimet sentrifugoitiin ja pestiin PBS: llä, joka sisälsi 50 mM

n

-oktyyli-β-D-glukopyranosidi poistaa sitoutumattoman

3H-FA. Sitoutunut

3H-FA pitää suodattimet poistettiin 100 ui PBS: ää, joka sisälsi 4% Triton X-100 ja siirrettiin pulloon, jossa nestetuikeseosta, ja aktiivisuus mitattiin Beckman LS6000IC -tuikelaskimella. Spesifinen sitoutuminen määritettiin vähentämällä aktiivisuuden ylimäärän läsnä ollessa kylmä FA aktiivisuus samasta näytteestä ilman FA kilpailua.

immunosaostus ja immunoblot-analyysi FRα

FRα seerumissa oli suoraan mitataan immunoblottausanalyysillä immunopresipitaateista. Seeruminäytteet (100 ui), lysaatit (25 ug KB tai MCF-7) tai KB supernatantit esi-hyväksyi kaksi kertaa proteiini G Sepharose ja 5 ug kutakin monoklonaalisia vasta-aineita, MOv18 /ZEL ja F5753, lisättiin kuhunkin näytteeseen ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Proteiini G plus Sepharose helmet lisättiin sitten ja seoksen annettiin pyöriä yön yli 4 ° C: ssa. Helmet kerättiin sitten sentrifugoimalla ja pestiin 600 ui lyysipuskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na-

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, ja proteaasi-inhibiittorit). Helmet dekantoitiin ja keitettiin Laemmli-puskuriin. Proteiinit erotettiin SDS-PAGElla ei-pelkistävissä olosuhteissa, minkä jälkeen imeyttämällä. Blotit tutkittiin MOv18 /ZEL-vasta-aineen (5 pg /ml 2% rasvatonta maitojauhetta, 0,1% Tween 20 TBS: ssä) ja sen jälkeen sekundäärisen anti-hiiri-IgG-piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoidun vasta-aineen (1:5000 2% ei rasvaton kuiva maito 0,1% Tween 20), ja kehittänyt parannetun kemiluminesenssi Super Signal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla 5 minuuttia (Pierce, Rockford, IL, USA). Blotit valotettiin sitten röntgenfilmille ja bändi kantoja ja bändi tiheydet laskettiin käyttäen tietokoneistetun kuva-analyysi-järjestelmän (UVP Biochem Imaging järjestelmien, Upland, CA).

Tilastollinen analyysi

keskimääräinen Veren FRα, havaitaan joko ligandin sitoutumismääritys tai immunoblottaus analyysin välillä tapausten ja verrokkien verrattiin käyttämällä Wilcoxonin pareittain testi. Joissakin tapauksissa regressioanalyysi käytettiin tutkimaan tilastollisesti merkitsevä korrelaatio. Mittasuhteet testattiin käyttämällä Fisherin testiä. Kaikissa tapauksissa, kaksisuuntaista testiä käytettiin ja ap-arvo on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05 katsottiin merkitseväksi.

Tulokset

havaitseminen FRα käyttäen mikrosuodatusta sitoutumismääritykset ja immunoblottaus

Alustavissa pyrkimyksiä tason mittaamiseksi verenkierrossa FRα mukaan

3H-FA -sitoutumistutkimukset, alustavat tutkimukset tehtiin määrittää määritteitä mikrosentrifugi suodatuksen määrityksessä. KB solusupernatantissa näytteitä inkuboitiin lisääntyvien määrien

3H-FA puuttuessa ja läsnä ylimäärin kylmää FA ja sitten mitataan elpyminen sitoutuneen

3H-FA. Kuten kuviossa 1A on esitetty, välillä 10 ja 120 nmol /L

3H-FA, yhteensä sitoutuminen kasvoi lineaarisesti. Kun ylimäärä kylmää FA lisättiin, sitoutunut määrä laskettiin taustan tasolle. Laskettu FA pitoisuudet yli tämän alueen (10-120 nmol /l) olivat johdonmukaisia ​​ja yksikään arvot olivat merkittävästi erilaiset (ei esitetty). Tulokset osoittavat, että määritys pystyy mittaamaan FRα laajalla FA pitoisuuksina.

Paneeli A: Kymmenen ui alikvootteja KB supernatanttia laimennettiin 50 ui sitomispuskurilla, joka sisälsi kasvavia konsentraatioita

3H-FA pulssi, ilman (Total sidottu) tai 1000x kylmä FA. Inkuboinnin jälkeen sitoutumaton FA poistettiin mikrosuodatus. Siinä on esitetty CPM mikrosuodatin pidättää. Myös esitetään Taustaa joka sitoo ilman KB supernatanttien ja ilman ylimääräistä kylmää FA. * P 0,05. Kukin tietopiste on keskiarvo (± SE) 3 rinnakkaista. Insertti pisteviiva on lineaarinen regressiosuora koko sitoutuneen esitetään vastaavien p ja r-arvot. Paneeli B osoittaa, että määrä spesifinen sitoutuminen on riippuvainen tulon tasolla. Tällöin kasvavia määriä seerumia, joka sisältää KB-proteiinia piikki tutkittiin. Tämä kokeilu on tyypillinen 2 eri kokeita. Paneeli C esittää FA pitoisuus, joka oli sidottu joko KB supernatanteista tai edustava seeruminäyte tapaus ja ohjaus, vertaamalla 30 KD ja 10 sulku mikrosuodattimet. Kokeilu edustaa kahden kokeen. Paneeli D näyttää edustava esimerkki immunoblottianalyysi FRα. Nuoli = M

r 38000-proteiinia; KD = kilodaltonin; IP = immunosaostus. Kaista 1, IP w ei seerumia; kaista 2, IP KB lysaatin; kaista 3, IP esiselkeytettiin seerumin kanssa KB lysaatin piikki; kaista 4. IP seerumin yksin, kaista 5, KB lysaatissa ei IP; kaista 6, IP KB lysaatin ole seerumia.

Jotta voidaan määrittää minimimäärä seerumin tarvitaan, normaali kontrolli seeruminäyte (100 ui), johon oli lisätty KB solulysaattina (5 ug) ja eri määriä (0-40 ui) testattiin sitoutumisen

3H-FA. Kuten esitetään edustava esimerkki kokeilu kuviossa 1B, mikrosihdin määritys voi havaita FA sitova tilavuudessa niin vähän kuin 10 ui. Kuitenkin yli 20 ui seerumia, todettiin, että mikrosuodattimet ei aina helposti valua. Siten vakiomäärä 10-20 ui käytettiin tapauksissa ja valvontaa.

Vaikka ennen työn olivat käyttäneet 30 KD sulku suodattimet mittaamiseksi FRα kudosnäytteistä [19], oli huolissaan siitä, että jotkut menetys voi on syntynyt seurauksena vaihtelu huokoskoko, jolloin läsnä noin huokoset, joka mahdollistaisi kulun 38 kDa FRα. Siksi kokeet tehtiin vertaamalla 30 KD ja 10 KD sulku suodattimet. Yleisesti, oli vain pieniä eroja. Esimerkiksi, kuten on esitetty kuviossa 1C, ei ollut merkittävää eroa sidottu FA käytettäessä KB solulysaateista KB supernatanteista. Sen sijaan pieni nousu havaittiin säännönmukaisesti seeruminäytteessä käytettäessä 10 KD sulku suodattimet. Siten 10 KD cutoff käytettiin mittaamaan FRα seerumeista tapauksissa ja valvontaa.

Kun pyritään vahvistavan mikrosuodatus tuloksia, immunosaostus ja immunoblottauksen menetelmää perustettiin. Kuten kuviossa 1D, FRα voidaan immunosaostettiin seerumeista (100 ui) ja immunoblotattiin tuloksena havaitseminen 38 KD FRα. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että mikrosuodatus määritystä voidaan käyttää havaitsemaan FRα pieniä seeruminäytteitä. Edelleen, immunoblottauksella analyysi osoittaa läsnä ehjä täyspitkän FRα.

Potilaat, joilla on hoitamaton munasarjasyöpä ovat kohonneet keskimääräiset pitoisuudet kiertävässä FRα verrattuna verrokkeihin

Patient (eli tapausta) ominaisuudet yksityiskohtaisesti taulukossa 1. Microfilter sitoutumismääritykset ja immunoblottaus paljasti, että seerumit, jotka ovat peräisin tapauksissa sisälsi huomattavasti korkeammat keskimääräiset tasot FRα kontrolleihin verrattuna (kuvio 2A-C). Lineaarinen regressioanalyysi kaikki mittaukset sekä tapausten ja kontrollien osoitti, että oli olemassa merkittävä korrelaatio tulokset mikrosuodatus ja immunoblot-määritykset (kuvio 2D). Arvioida mikä määritys saattavat soveltua paremmin kehitystä kuin biomerkkitesti cutoffs perustettiin Kontrolliryhmän arvot molemmissa määrityksissä käyttämällä keskimääräistä ja kahden keskihajonnan. Tämän strategian, yli 95% kontrolliarvoista alitti raja. Kuten kuviossa 3 on esitetty, tämän strategian avulla, 13% ja 27% tapauksista katsottiin kohonneet FRα on mikrosuodatus ja immunoblottaus määrityksissä, vastaavasti. Tilastollinen analyysi Fisherin testi osoitti, että osa tapauksista, joissa kohonneet FRα, havaittuna immunoblottaustestiä, oli merkitsevästi erilainen kuin osa valvonnan pitää positiivisena. Sen sijaan osa havaituista tapauksista kanssa mikrosuodatus määrityksessä ei ollut merkittävä, viittaa siihen, että immunoblottaustestiä voi mahdollisesti olla parempi positiivinen ennustearvo.

Paneeli A esittää määrää verenkierrossa folaatti-reseptorin (FR: t) ekstrapoloitu mikrosuodatus määritys olettaen 01:01 moolisuhteessa FA:FR molemmissa tapauksissa ja verrokkia paneeli B esittää densitometristä signaali saadaan käyttämällä immunoblottauksella. P-arvot paneeleissa A ja B lasketaan käyttäen Wilcoxonin pareina testi ja jokainen pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM. Paneeli C: Kaista 1, immunosaostus negatiivinen kontrolli; kaista 2, negatiivinen kontrolli (MCF-7) lysaatin; kaista 3, positiivinen kontrolli (KB) lysaattia); kaista 4, kontrolliseerumi näyte; kaista 5, Hyväksytty munasarjasyövän seeruminäytettä; kaista 6, kontrolliseerumi näyte; kaista 7 Hyväksytty munasarjasyöpä seeruminäyte. Nuoli = M

r 38000-proteiinia; KD = kilodaltonin. Paneelissa D esitetään lineaarista regressioanalyysiä korreloimalla mikrosuodatus sitoutumismääritys datan ja immunoblottaus tiedot. Kukin tietopiste on ainutlaatuinen yksilö. Avoimet symbolit edustavat terveillä verrokeilla ja umpinaiset symbolit ovat potilaita.

paneeli A ja B esittävät tapausten osuus, ja tarkastuksia pidettiin positiivisina mikrosuodattamalla tai immunoblottaustestiä, lla cutoffs perustettu keskiarvo plus kahden keskihajonnan valvonnan arvoja. P-arvo laskettiin käyttäen Fisherin testiä.

Verenkierron FRα ovat vertailukelpoisia aikaisin ja edenneen taudin

Testasimme oliko jokin korrelaatio Veren FRα ja erilaisia ​​kliinisiä piirteitä, sekä FRα ilmaisu tuumorin sisällä. Huomasimme, että kiertävän FRα tasot (arvioituina immunoblottaus) vastasivat toisiaan aikaisin (vaiheiden I /II, n = 15, 16 ± 2 AU) ja pitkälle (vaiheiden III /IV, n = 15, 12 ± 2 au, p = 0,24) potilailla, kuten on esitetty kuvioissa 4A. Erot kiertävä FRα varhaisen ja pitkälle potilaiden arvioimana sitoutumismääritykset ollut myöskään merkittävää (1,4 ± 0,3 vs. 1,0 ± 0,2. P 0,2, kuva 4B). Tärkeää on, tasot FRα alkuvaiheen potilailla olivat huomattavasti korkeampia kuin kaikki tarkastukset (n = 30, 7 ± 0,9 au, immunoblottauksella, p 0,0001 ja 0,6 ± 0,1 nmol /l sitova, p = 0,02).

paneelit A ja B esitetään vertailu varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa densitometristen ja mikrosuodatus määrityksen signaalien, vastaavasti. Kukin tietopiste on ainutlaatuinen yksilö ja vaakasuora viiva edustaa keskiarvoa. p arvot laskettiin käyttäen Studentin t-testiä.

Ei merkittäviä korrelaatioita kiertävän FRα ja joko iän, luokka, uusiutuminen tilaa tai laajuus debulking (optimaalinen vs. optimaalisia) havaittiin (p & gt 0,05). Kasvaimet 27 30 potilaista oli korkea FRα ilmaisun Kuten aiemmissa työtä, ja siksi meidän otoskoko ei ollut tarpeeksi suuri onko kasvain FRα ilmentyminen liittyi tasot FRα veressä. Kuitenkin kolmen kasvaimet (1 serous rajatapaus ja 2 mucinous rajatapaus) vähäisin kasvaimeen liittyvien FRα, vain 1 mucinous rajalla todettu olevan alhainen verenkierrossa FRα tasolle. Tämä viittaa siihen, että kiertävä FRα eivät välttämättä korreloi hyvin kasvain tasoilla. Itse asiassa meidän aikaisempien tutkimusten, havaitsimme joitakin eroavaisuuksia FRα värjäystä eri kasvainkeskusten (toistuvat ja etäpesäkeleesioita) [14].

Keskustelu

Usein munasarjasyöpä eludes havaitsemisen takia puute lopullisen varhaiset oireet. Siksi munasarjasyöpä esittelee jo pitkällä vuonna -70%: lla potilaista. Biomarkkerit käytössä nykyään eivät ole riittäviä havaitsemiseen varhaisessa vaiheessa syöpä. Siksi ei ole yllättävää, että munasarjasyöpä on numero yksi kuolinsyy kaikki gynekologisten maligniteettien viime vuosina. Tällä hetkellä saatavissa markkereita CA-125 ja proteomiikka profiilit puuttuu herkkyys, spesifisyys ja /tai toistettavuus. On selkeä tarve diagnostisia markkereita havaita munasarjasyöpään varhaisessa vaiheessa. Molekyyli ilmaisi lähes yksinomaan patogeenisten kudoksessa tekisi ihanteellinen biomarkkereiden ja yksi tällainen lupaava ehdokas on folaatti-reseptori (FR-α). FR-α on erittäin yli-ilmentyy useimmissa munasarjasyöpiä mutta esittelee rajoitettu ilmentymistä kudoksissa, jotka ovat vastuussa koko kehon säilyttämisestä folaatit (esim istukka, suonipunoksessa ja munuainen). Nykyisessä tutkimuksessa testasimme, oliko mahdollista havaita verenkierrossa FRα munasarjasyövän potilaille ja onko kiertävän FRα oli täyspitkä ja toimiva.

tiedot osoittavat, että potilailla, joilla on munasarjasyöpä ovat kohonneet FRα suhteessa terveisiin kontrolleihin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kiertävä FRα mahdollisesti kehittää biomarkkerina. Lisääntynyt tasot FRα alkuvaiheen tauti osoittaa, että säätelyä FRα voi tapahtua aikaisin munasarjojen syövän syntymistä joillakin potilailla. Todellakin, Toffoli ja työtovereiden totesi, että lähes 79%: lla varhaisen vaiheen (I ja II) munasarjasyöpä yli-ilmentyy FRα, joka oli olennaisesti identtinen osuutta pitkälle potilaista, joilla oli FRα ilmaisun [9]. Havaitsimme meidän tutkimuksissa että Veren FRα alkuvaiheen potilailla ei ollut erilainen kuin pitkälle potilailla. Kuitenkin Toffoli ja työtovereiden totesi, että kun osuus oli samanlainen, tasot FRα kasvaimen olivat huomattavasti korkeammat pitkälle potilaat. Korrelaation puuttuminen voi osoittaa, että on olemassa muita sääteleviä tekijöitä seerumin. Esimerkiksi Mantovani ja työtovereiden totesi, että normaalin ihmisen virtsanäytteet olivat vahvasti positiivisia FRα immunoreagoivuuden, mikä viittaa siihen, että on olemassa mekanismi sen nopean munuaisen puhdistumaan [15]. Koska proksimaalitiehyeet munuaisen voimakkaasti ilmentävät proteiinia, voisi päätellä, että munuainen on hyvin kehittynyt strategia poistamiseksi FRα estää sen kertyminen vereen ja estää FA ottoa kudoksiin [19]. Tätä tukee kineettinen hiiren mallintamistutkimukset jotka ovat osoittaneet, että kun kasvain edetessä nousta virtsassa tasoilla FRα edeltävät seerumit tasoa huomattavasti [15].

Ehjä FRα on 38 kDa proteiinin ja meidän immunoblottimäärityksessä, anti-MOv18 /ZEL vasta-aine havaitaan proteiinin on sama molekyylipaino. Lisäksi osoitimme, että mikrosuodatus määritys havaittu funktionaalisen proteiinin, joka yhdessä viittaavat siihen, että FRα vuodattamansa munasarjasyöpä on ehjä ja toimiva. Läsnäolo FRα verenkierrossa potilaiden on terapeuttista merkitystä useita hoitoja on kehitetty, että kohdesolun pinnalla FRα syöpäpotilailla [20]. Nämä kiertävä FR: voi sitoutua ja häiritä kliinistä tehoa. Tämä saattaa selittää korkea keskeyttäneiden määrää havaittu joillakin FRα suunnattua immunoterapioiden potilailla, joilla on munasarjasyöpä. Esimerkiksi, Kershaw ja kollegat kehitettiin lähestymistapa, jossa autologisia T-soluja potilasta-geenin muunnettu kimeerisen reseptorin, joka sisälsi FRα-spesifisten yksiketjuisten vasta-aine, joka on kytketty Fc-reseptori-gamma-ketjun [21]. Kun soluja erittää IFN-γ vastauksena FRα, ne eivät ole paikallistaa kasvaimen päällä, vika, joka voidaan selittää kierrättämällä FRα josta tyydyttyneitä kimeerisiä reseptoreja. Siksi analyysi verenkierrossa FRα syöpäpotilaiden voisi auttaa määritettäessä tasot anti-FRα kohdennettuja kimeerisiä reseptoreita tarvitaan onnistuneen hoidon. Lisäksi olemme myös havainneet, että kohonnut kiertävän FRα oli toiminnallinen, mikä viittaa mahdollisen häiriön useita foolihappoa-konjugoidun lääkehoitoja, jotka on kehitetty, jotka vaativat toiminnallinen sitoutumiskohta [20], Yksi ongelma kuitenkin seerumin tasot FRα on puute laadun määrityksessä. Vaikka meidän sitoutumismääritykset pystyivät havaitsemaan eron tapausten ja kontrollien välillä, saadut tulokset viittaavat siihen, että immunoblottaustestiä voi olla mahdollisesti hyödyllisempiä havaitsemisessa kohonneet. Kuitenkin, kuten minkä tahansa blotting määrityksessä, apuohjelma rajoittaa sen tekninen monimutkaisuus (eli immunosaostus ja sitä seuraava immunoblottaus) ja tuloksia tässä kokeessa vain puolikvantitatiivinen.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että munasarjasyöpä potilaat, myös ne, joilla aikaisin tauti, ovat kohonneet toiminnallisten ehjä FRα verrattuna terveisiin verrokkeihin. Edelleen kehitys, mukaan lukien suuremmat varhaisessa vaiheessa munasarjasyöpään otoskokoja ja parantaa määrityksen suorituskyky, käyttö FRα biomarkkerina munasarjasyöpä voi olla mahdollista.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Dr. Linda E. Kelemen hänen arvokkaasta keskusteluja käsikirjoituksen.