Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kuvaamme tässä kaksi uutta endogeeninen variantteja ihmisen Endoplasmakalvosto (ER) rahti reseptoriin SEL1LA, nimetty p38 ja p28. Biokemialliset ja RNA-interferenssi tutkimukset tuumorigeenisemmiksi ja ei-tuumorigeeniset solut osoittavat, että p38 ja p28 ovat N-terminaalista, ER-ANCHORLESS ja vakaampi suhteessa kanoninen transmembraanisen SEL1LA. P38 ilmaistaan ​​ja konstitutiivisesti erittää kasvaessa jälkeen ER stressin, että KMS11 myeloomalinjaan ja rintasyövän MCF7 ja SKBr3, mutta ei ei-tuumorigeenisen rintojen epiteelin MCF10A linja. P28 havaitaan vain heikosti eriytetty SKBr3 solulinja, jossa se erittyy jälkeen ER stressiä. Johdonmukaisesti läsnäolon p38 ja p28 elatusaineissa, morfologiset tutkimukset SKBr3 ja KMS11 solujen havaita N-terminaalista SEL1L immunoleimaus in sekretorisen /hajottavia osastoja ja solun julkaissut kalvovesikkeleiden. Tulosten perusteella näyttää, että kaksi uutta SEL1L variantteja harjoittavat endosomaalista ihmiskaupan ja erityksen kautta rakkulat, jotka voivat edistää lievittää ER stressiä tuumorigeenisiä soluissa. P38 ja P28 voisi siten olla merkitystä diagnostisina markkereita ja /tai terapeuttisia kohteita syöpään.

Citation: Cattaneo M, Lotti LV, Martino S, Alessio M, Conti A, Bachi A, et al. (2011) eritys Novel SEL1L Endogeenisen vaihtoehdot edistävät ER Stressi /UPR kautta endosomeista ja Shed Rakkulat ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (2): e17206. doi: 10,1371 /journal.pone.0017206

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 lokakuu 2010; Hyväksytty: 22 tammikuu 2011; Julkaistu: 17 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Cattaneo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia MIUR-FIRB nRBIP064CRT Ministero Università e Ricerca (MIUR), ja MAPLOMBARDIA, Grant 7/193 ar 3 IB, MIUR 60% apurahoja yliopiston La Sapienza LVL, MIUR 60% avustusta 2008-2010 G . d’Annunzio yliopisto RMC, ja vuonna 2009 avustusta Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) ja RMC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useita homeostaattisina mekanismeja, jotka ohjaavat proteiinin laskostumista ja kokoonpano sekä edistää hävittäminen viallisten proteiinien sovelletaan eri solun osiin suojaamista endogeenisista proteotoxic stressiä [1] – [4]. Endoplasmakalvosto (ER) on kokoontaitettava ja asennuspaikalle kotimaisille rakenteellisia proteiineja ja entsyymejä, sekä eritys- ja solukalvon proteiineihin [5]. Tämä merkittävä työmäärä hallinnoi tehokas ja hifi-proteiinin laskostumista ja laskostumaan väärin-korjaus järjestelmiä, jotka perustuvat ATP-riippuvainen chaperones ja disulfidi isomeraaseihin rinnakkain laadunvalvontamekanismit jotka sallivat Golgi kauttakulku vain oikein taitettu proteiineihin [6]. Lisäksi puhdistuma poikkeavien proteiinien säilytetään ER välittyy ER-liittyvän hajoamisen (ERAD) reitti [7], joka on monivaiheinen prosessi, joka vaatii tunnustamista viallisten proteiinien, retro-translokaatio sytosolin puolella ER kalvo, ubikinaation ja hajoamista 26S-proteasomin [8].

kuitenkin, solun proteiini-taitto kapasiteetin ja ERAD reitti voi olla heikentynyt ja /tai ylikuormitettu erilaisilla patologisia tiloja, jotka hämmentää energiaa ja kalsiumhomeostaasiin, lisäys eritys- proteiinisynteesiä ja /tai estävät proteiinisynteesiä glykosylaatio ja disulfidisidosmuodostus [6], [9]. Tällaisissa tapauksissa intralumenal kertymistä unfolded /väärinlaskotuneen proteiinien määrää ER stressiä, joka puolestaan ​​aktivoi mutkikkaan selviytymisen signalointipolkujen, kollektiivisesti kutsutaan laskostumattoman proteiinivaste (UPR). Tällä pyritään lievittämään ER stressiä lieventävien määrä proteiinisynteesiä ja jopa säätelevä proteiini taitto entsyymeillä ERAD koneet ja erityskykyä [6], [10], [11]. Jos homeostaasiin ei voida palauttaa, UPR-aktivoitu koneistoja voi laukaista kuolemaa /vanhenemista ohjelmia [12].

On yhä selvempää, että UPR on merkittävä rooli syövän, jos sitä vaaditaan pitämään pahanlaatuinen fenotyyppi ja kehittää vastustuskykyä kemoterapiaa [13]. Itse syöpäsoluja on sopeuduttava ravinteiden nälkään ja hypoksiaa, jotka vaikuttavat solujen redox tilaa ja käytettävyyttä energiaa ATP hydrolyysin. Tämän odotetaan vaarantaa heidän proteiinilaskostumisen valmiuksia, altistavia ER stressin [14] – [16]. Näin ollen ajan sääntely ERAD-UPR reittejä voidaan edistää huomattavasti monimutkaisia ​​solujen muutoksia tarvitaan syövän etenemisen [17], [18]. Tässä suhteessa tiedetään, että monet ER asuva proteiineja vapautettu, modifioitu translaation jälkeen, poikkeuksellisen erittyvä ja /tai solun pinnan uudelleen lokalisoitu eri syöpätyyppejä [13], [19] – [21].

monipuolinen ERAD geeni

SEL1L

(sel-1 vaimennin on lin-12,

C.elegans

-kuten) koodaa vähintään kolmea eri proteiini-

eli

, kanoninen ER asuva SEL1LA, lasti reseptorin assosioituu E3 ubikitiinistä proteiini ligaasi HRD1 [22] – [25], ja pienempi, äskettäin kloonattu SEL1LB ja -C, että puuttuu C-terminaali SEL1LA membrane- kattavat alueen työntämistä ER [26]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että SEL1L proteiinin ilmentyminen vaihtelee ihmisen kasvaimissa verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin, mikä viittaa osallistuminen syövän etenemisessä [27] – [32].

Tässä raportoidaan tunnistamista, kuvaamista ja subsellulaarisista lokalisoinneissa kaksi novel ANCHORLESS endogeeninen SEL1L variantteja, p38 ja p28, tutkittu rintasyövän solulinjoissa SKBr3 ja MCF7, useita myeloomalinjaan KMS11 ja ei-tuumorigeenisen linjat MCF10A (rinta) ja 293FT (sikiön munuaisen). Olemme havainneet, että:

i.

P38 ja p28 koodaa 5 ’päähän

SEL1L

-geenin;

ii

. p38 on säädelty ja konstitutiivisesti erittää syöpäsoluja, toisin kuin ei-tuumorigeenisen MCF10A linja;

iii.

P28 ilmentyy vain heikosti eriytetty SKBr3 rintasyöpä linja;

iv.

ER stressiä /UPR voimakkaasti parantaa p38 eritystä syöpäsoluja;

v

. N-terminaalinen SEL1L on läsnä eritys- ja hajottavia osastoissa SKBr3 ja KMS11 soluja, ja rakkulat vapautuu solunulkoiseen tilaan. Kaiken biokemiallisten ja morfologisten näyttö tukee näkemystä, että SEL1L p38 ja p28 ovat sekaantuneet väyliä yhdistää ER stressin /UPR on endosomaalista ihmiskaupan ja erityksestä solun ulkopuolella-irtoa rakkulat. Lisäksi ilmaus p38 ja p28 ja niiden leviämistä viljelyväliaine yliaktiivista tuumorigeenisia suhteellisen ei-tuumorigeenisiä soluissa, mikä viittaa syöpään liittyviä toimintoja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, kulttuuri olosuhteissa, transfektiot

Ihmisen multippeli myelooma KMS11, rintasyöpä MCF7, SKBr3, MDAMB453, lymfooma Namalwa, kohdunkaulan syöpä HeLa- ja glioblastooma G144, G166, ja G179-soluja ylläpidettiin RPMI, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Euroclone, Celbio, Pero, Italia). Ihmisen alkion 293 FT munuaisen soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Euroclone, Celbio, Pero, Italia). Non-tuumorigeenisiä rintojen MCF10A soluihin [33] pidettiin MEBM (Lonza, Treviglio, Italia), täydennettynä EGF, 20 ng /ml; bFGF, 20 ng /ml; insuliinia, 10 ug /ml; ja hydrokortisonia, 0,5 ug /ml. Ei-tuumorigeeniset ihmisen sikiön aivojen CB660 soluja, saatu professori Austin Smith (Cambridge, UK), pidettiin ihmisen hermo kantasolujen keskipitkän laminiinille kuorrutettu ruokia. Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ilmaistuilla plasmideilla ja siRNA Lipofectamine 2000 (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia) ja otettiin talteen sen jälkeen, kun osoitetun ajan. Soluja käsiteltiin DTT (2 mM) 3 tunnin ajan, MG132 (10 uM) 3 tai 22 tuntia, sykloheksimidi (200 ug /ml) 3, 6, 18 tunnin ajan, kuten on osoitettu.

Rakenteet

Tagged TPD52 isoformin 1-rakenteet muodostettiin kloonaamalla täyspitkä TPD52 isoformi 1 koodittavan sekvenssin, fuusioitu myc tai GFP tag 3′-päässä, otetaan pCDNA3.1myc-Hys (-) A tai peGFPN3 vektoreita vastaavasti (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia). Myc-merkitty

SEL1LB

konstruktit aikaisemmin kuvatulla tavalla [26].

RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRI-reagenssia liuosta (Applied Biosystems, Monza Italia) . RNA käänteistranskriboitiin Superscript TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Semi-kvantitatiivinen PCRmonistukset suoritettiin 2 ui RT tuotteen kohti reaktiota ja 0,15 yksikköä Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia), käyttäen Mastercycler väline (Eppendorf, Milano, Italia). PCR-olosuhteet Kaikissa kokeissa tässä kuvatut olivat: denaturaatio 95 ° C: ssa 3 min, jonka jälkeen 22 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, sitten 60 ° C: ssa 72 sekunnin ajan. Seuraavia spesifisiä alukkeita käytettiin:

SEL1LA

: sense: 5′-ctcgctaacaggaggctcagtagtac-3 ’; antisense: 5’-gccactggcatgcatctgagc-3 ’

HRD

1: sense: 5′-ggccagggcaatgttccgc-3′; antisense: 5′-gtccattgcctggagctcc-3 ’.

BIP

: sense: 5′-tgcagcaggacatcaagttc-3′; antisense: 5′-cgctggtcaaagtcttctcc-3 ’

ATF6

: sense: 5′-ctgatggctgttcaatacac-3′; antisense: 5′-aatgactcagggatggtgct-3 ’

CHOP

: sense: 5′-gatggcagctgagtcattgc-3′; antisense: 5′-atgcttggtgcagattcacc-3 ’

XBP-1

: sense: 5′-ccttgtagttgagaaccagg-3; antisense: 5′-ggggcttggtatatatgtgg-3 ’

GADD45β

: sense: 5′-ggaagagctcgtggcgtgcg-3′; antisense: 5′-gtctcgggcctcggtggtgc-3 ’

SEL1LB

: sense: 5′-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3′; antisense: 5′-ggggaaacatagataccatg-3 ’

SEL1LC

: sense: 5′-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3′; antisense: 5′-ggggcaatcagccaaactaatca-3 ’

HPRT

: sense: 5′-aattatggacaggactgaacgtc-3′ antisense: 5′-cgtggggtccttttcaccagcaag-3 ’

Western blotting, immunosaostus, viljelmäsupernatanttien, N-glykosidaasi F ja endoglykosidaasi H ruoansulatusta

Monoklonaalinen SEL1L vasta-aine nostettiin vastaan ​​N-terminaalinen peptidi, ihmisen SEL1L [34]. Affiniteettipuhdistettu polyklonaalinen vasta-aine SEL1L N-päähän oli ystävällisesti toimittanut Dr. H. L. Ploegh [35]. Affiniteettipuhdistettua polyklonaalista C-terminaalinen SEL1L vasta-aine nostettiin vastaan ​​bakteereissa ilmennetyn yhdistelmä-DNA-fragmentti, joka koodaa aminohappoja 575-738 ihmisen SEL1L (Primm, Milano, Italia). Monoklonaalinen anti-vinkuliinin ja anti-myc-vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Polyklonaalista TPD52 luovutti ystävällisesti professori J. Byrne (University of Sydney, Sydney, NSW, Australia). Solut lyysattiin 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% NP40: tä, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (Pierce, Celbio, Pero, Italia). Proteiinikonsentraatiot määritettiin Bradfordin menetelmällä; Näytteet erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä, blotattiin PVDF kalvoja, koetettiin spesifisten vasta-aineiden ja kehitettiin ECL (Genespin, Milano, Italia). Immu- solulysaatit ennalta selvitetty ja inkuboitiin vasta immobilisoitiin proteiini G-sepharose (Invitrogen S. Giuliano M.se, Italia). Immunosaostumat pestiin kahdesti 10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl: a, 0,25% NP40: tä, kerran 5 mM Tris-HCI: ää, ja eluoitiin näytepuskurissa ennen geelielektroforeesia. Analysointiin supernatantit solut pestiin ja niitä inkuboitiin OPTIMEM (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia) 16 tunnin ajan. Supernatantit otettiin talteen, sentrifugoitiin, saostettiin 10% TCA: lla, suspendoitiin uudelleen 1 M Tris-HCI, pH 7,4, ja eroteltiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Kaikki Western blotit suoritettiin käyttämällä X-BLOT jaosto (www.isenet.it).

ruoansulatus

N

-glycosidase F (PNGaasi F) tai endoglykosidaasi H (endo H), solulysaatit denaturoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa 0,05% SDS, 0,1% merkaptoetanolia, 10 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h tai ilman PNGaasi F tai endo H (New England Biolabs, Celbio, Pero, Italia) mukaan toimittajan merkkejä.

Immunofluoresenssimikroskopia

SKBr3 soluja, kasvatettu peitinlaseilla, käsittelemättömän tai käsitelty DTT, kuten edellä on kuvattu, fiksattiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 30 minuutin ajan, pestiin 0,1 M glysiiniä 20 minuutin ajan, ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 vielä 5 min. Tutkia solunsisäisen lokalisoinneissa SEL1L, soluja inkuboitiin N-terminaalisen anti-SEL1L monoklonaalinen vasta-aine [34] ja polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​ER markkeri kalretikuliinin (Affinity Bioreagents, Breda, Alankomaat) ja Golgin markkeri Giantin (Covance , Princeton, NJ, USA). Tumat värjättiin 4,6-diamido-2-fenyyli (DAPI, Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Ensisijainen vasta-aineet visualisoitiin käyttäen fluoreskeiini-isotiosyanaatti-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Cappel Research Products) tai Texas-Red-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: llä (Jackson Immunoresearch Laboratories) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut analysoitiin käyttäen Apotome Axio Observer Z1 käännettyä mikroskooppia (Zeiss, Oberkochen, Saksa), joka on varustettu AxioCam MRM Rev. 3 suurennoksella 40X. Rinnakkaispaikantumisen fluoresenssisignaalien analysoitiin AxioVision 4.6.3 ohjelmisto. Kuva-analyysi suoritettiin käyttäen Adobe Photoshop.

Cryoimmunoelectron mikroskopia

Solut käsitellään cryoimmunoelectron mikroskoopilla kasvatettiin kuten edellä ja kiinnitetään 2% paraformaldehydi, 0,2% glutaraldehydiä 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4, 2 tuntia 25 ° C: ssa. Solut raaputettiin peitelasit, sentrifugoitiin, upotettu 10% gelatiinia (Sigma-Aldrich) 0,1 M PBS: ssä, pH 7,4, ja jähmettynyt jäällä. Sen jälkeen infuusiona 2,3 M sakkaroosia yön yli 4 ° C: ssa, solu lohkoja kiinnitettiin alumiini- nastat ja jäädytettiin nestetypessä. Ultrathin kryoleikkeet (60 nm) leikattiin -120 ° C: ssa käyttäen Ultracut EM FC6 cryoultramicrotome (Leica Microsystems, Wien, Itävalta), kerättiin 1% metyyliselluloosaa 1,15 M sakkaroosia ja yksi- tai double-immunolabelled primaarisilla vasta-aineilla. Sitoutuneet vasta-aineet visualisoitiin käyttäen vuohen anti-hiiri-konjugoitu 5- tai 15-nm: n kolloidisen kullan (British BIOCELL International, Cardiff, UK) tai proteiini-A on konjugoitu 10 nm kolloidisen kullan (syötetään G.Posthuma ja J. Slot , Utrecht, Alankomaat). Immunoleimaus suoritettiin seuraavat ensisijaiset vasta-aineet: monoklonaalinen anti-SEL1L N-päähän [34], polyklonaalinen anti-SEL1L N-päähän [35], polyklonaalinen anti SEL1L-C-pää, polyklonaalinen anti-kalretikuliinin (Affinity Bioreagents), anti-CD63 monoklonaalinen H5C6 kehittämä JT Elokuussa ja J.E.K. Hildreth, saatu Developmental Studies Hybridoma Bank kehitetty suojeluksessa NICHD ylläpitää The University of Iowa, Biologian laitos (Iowa City, IA 52242), ja monoklonaalinen anti-c-Myc (Sigma-Aldrich) ja

SEL1LBmyc

-transfected 293 FT-soluja [26]. Yhden ja kahden hengen immunoleimaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23], [36]. Kryoleikkeet analysoitiin Philips CM10 transmissioelektronimikroskoopin.

Off-geeli proteiinien fraktiointiin

Semi-nestefaasi iso- fraktiointi suoritettiin Off-Gel 3100 laitteeseen (Agilent Technologies, Cernusco, IT ) käyttäen 24 cm liuska immobilisoidulla pH gradienttigeeleissä on 4-7 välillä. Kokosolulysaattia näytteet (360 ui, joka vastaa 1300 ug proteiineja) sekoitettiin 3240 ui isoelektrisen fokusoinnin puskuria (Agilent Technologies) ja ladattiin laitteeseen. Proteiini fraktiointi suoritettiin 26 tunnin mahdollisimman 8000 voltin yhteensä 60.000 V /h, mukaan valmistajan protokollaa. Saatu neste fraktiot (150 ui), jossa oli 0,25 pH-alueella kerättiin ja alikvootit proteiinien päätti lisäksi 10% akryyliamidi SDS-PAGE Western blot koettimena.

Proteiinin tunnistaminen MALDI-TOF-massaspektrometriaa (MS) analyysi

Bändit kiinnostusta SDS-PAGE leikattiin geeleistä, vähentää, alkyloidut ja pilkottiin yön yli naudan trypsiini (Roche, Milano, Italia), kuten aiemmin on kuvattu [37]. Yksi ui (1 ui) eriä supernatanttia käytettiin massan analyysi käyttäen kuivattiin pisaran tekniikkaa ja α-syano-4-hydroksikanelihappoa matriksina. Massaspektrit saatiin MALDI-TOF Voyager-DE STR massaspektrometriä (Applied Biosystem, Foster City, CA). Vaihtoehtoisesti, happamia ja emäksisiä peptidin uutto geelipalat jälkeen tryptinen digestio suoritettiin, ja tuloksena peptidi seoksia suoritetaan yksi suolanpoisto /väkevöintivaihe ennen MS-analyysi yli Zip-TipC18 (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Spektrit sisäisesti kalibroitu käyttäen trypsiiniä autolyysin ja jalostettujen kautta Data Explorer ohjelmisto. Proteiinit yksiselitteisesti etsimällä kattava ei-tarpeeton proteiinin tietokanta National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ja massaspektrometria proteiinisekvenssitietokannassa (msdb, http: //msdn.microsoft.com/en-us/library/ms187112.aspx), valitaan oletuksena käyttämällä talon tietokoneohjelmien ProFound v4.10.5 ja Mascot v1.9.00 vastaavasti [38], [39]. Yksi jäi pilkkominen per peptidi annettiin, ja ensimmäinen massa toleranssi on 50 ppm käytettiin kaikissa hauissa.

Tulokset

Novel ER-ANCHORLESS SEL1L variantit

monoklonaalinen vasta-aine nosti vastaan ​​N-päähän SEL1L proteiini [34], käytettiin seulomaan paneelin koko lysaatit viiden ihmisen solulinjoissa, mukaan lukien MCF7 ja SKBr3 (rintasyöpä), KMS11 (Ig-K-erittävien multippeli myelooma), 293FT ( sikiön munuaisen) ja ei-tuumorigeenisen epiteelisolujen rintojen solulinjassa MCF10A. Lisäksi tunnettu 95 kDa: n SEL1LA proteiinin, kahden lisäaineen bändejä, nimetty p38 ja p28, visualisoitiin noin 38 kDa: n ja 28 kDa: n (kuvio 1A). Vaikka P28 on yksinomaan havaittu SKBr3 linja, p38 voimakkaasti ilmaisi, korkeammalle tasolle SEL1LA, kaikissa syöpäsolulinjoissa testattu, melko pienet MCF10A, jossa SEL1LA lauseke (proteiini ja RNA) oli myös pienempi (kuvio 1a- B). Polyklonaalinen vasta-aine on nostatettu SEL1L C-pää, joka käsittää SEL1LA hännän ankkuri työnnetään ER kalvo, havaittiin 95 kDa: n SEL1LA proteiinia, mutta ei p38 ja p28, mutta ylimääräinen vyöhyke osoitti noin 55 kDa, joka voisi osoittavat karboksiterminaalinen fragmentti johtuvat pilkkomalla natiivin proteiinin (kuvio S1A). Erityisesti p38-variantti ilmentyy voimakkaasti myös muut testatut syöpäsolulinjoissa, kuten Namalvva (lymfooma), MDAMB453 (rintasyöpä), HeLa (kohdunkaulan syöpä), ja G144, G166, G179 (glioblastooma), jotka kaikki johtivat negatiivinen p28 (Kuva S1B). Analyysi SEL1L proteiinin profiili ei-tuumorigeenisen ihmisen sikiön aivojen solulinjaa CB660 verrattuna kolmen glioblastoomasolulinjoissa (kuvio S1B) edellyttäen lisäksi,

in vitro

todisteita siitä, että p38 oli ilmaistu todellakin korkeammalla tasolla kasvainsoluissa.

. Western blot-analyysi: lysaatit (50 ug) eri solulinjojen, mukaan lukien 293FT (sikiön munuaisen), MCF10A (ei-tuumorigeenisen rinta), MCF7, SKBr3 (rintasyöpä) ja KMS11 (multippeli myelooma), erotettiin SDS-PAGE ( 10%), ja tutkittiin monoklonaalisella on SEL1L N-päähän. Vinkuliinin käytettiin latauskontrollina. Lisäksi SEL1LA (95 kDa), N-terminaalisen SEL1L vasta-aine tunnisti kaksi pienempää koodattua tuotetta, noin 38 ja 28 kDa: n (nimetty p38 ja p28). P38 oli runsaammin kuin SEL1LA ja molemmat olivat ajan moduloitu syöpäsolulinjoissa verrattuna MCF10A. P28 oli havaittavissa vain SKBr3. Bändit edellä p38, joka todennäköisesti vastasi kehittymätön esiasteita tai translaation jälkeen muunnettuja tuotteita, mitattiin joskus nähdään testattujen solu- linjojen. Blot edustaa neljä toisistaan ​​riippumatonta koetta. B. RT-PCR-analyysi: RNA: iden KMS11, MCF10A ja SKBr3 solut analysoitiin RT-PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita

SEL1LA

. Näkyvät signaalit saatiin 27 sykliä

SEL1LA

.

HPRT

käytettiin latauskontrollina.

SEL1LA

was up-moduloitu syöpäsolun linjat suhteessa ei-tuumorigeenisiä MCF10A linja. Kuva edustaa kolmea eri määritykset perustuu riippumattomaan hoitoja. C.

sisäinen /keskinäinen

-molecular disulfidisidoksia analyysi p38. 293FT solulysaatit erotettiin SDS-PAGE (10%) pelkistävissä (R) ja ei-pelkistävissä (NR) edellytykset ja blotattiin monoklonaalisella anti-SEL1L N-pää. P38 kulkeutui dubletti ei-pelkistävissä olosuhteissa (kaistat verrataan p38 muuttoliike pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa ovat samassa geelissä). D. Down-modulaatiota SEL1LA, P28 ja p38 by SEL1L Sirna (siRNA): Vasen paneeli: SKBr3 soluja (3 x 10

5) hoidettiin salattu siRNA tai siRNA ominaisia ​​SEL1L (siRNA SEL1L) 48 tuntia, jonka jälkeen toinen siRNA hoito edelleen 48 tuntia. Hiljentäminen tehokkuus varmistettiin Western blot. SEL1LA, P28 ja p38-proteiinin tasot laskivat lähes 55%, 30% ja 16% verrattuna soluihin käsitelty salattu siRNA. Vinkuliinin käytettiin latauskontrollina. Oikea paneeli: 293FT-soluja (6 x 10

5) käsiteltiin salattu siRNA tai siRNA-SEL1L 48 tuntia. SEL1LA ja p38-proteiinin tasot laskivat lähes 45% ja 23% verrattuna soluihin käsitelty salattu siRNA. Vinkuliinin käytettiin latauskontrollina. Histogrammit osoittavat arvot normalisoitiin suhteessa siivous signaaleja ja ilmaistiin kertaisesti modulaatio suhteessa kontrolleihin, Densitometrinen analyysi määritettiin käyttäen Scion kuvankäsittelyohjelma. (Www.scioncorp.com). Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta, ± SD; Studentin t-testiä käytettiin määrittämään tilastollista merkittävyyttä *

p

0,1; **

p

0,05. E. Analyysi p38 ja SEL1LA vakaus: 293 FT-soluja (6 x 10

5) käsiteltiin 3, 6 ja 18 tuntia sykloheksimidillä (CHX, 200 ug /ml). Alikvootit lysaatit (50 ug) erotettiin SDS-PAGE (10%) ja tutkittiin monoklonaalisella anti-SEL1L ja anti-vinkuliinin vasta-aineita. Toisin SEL1LA, joka vähitellen laski Sykloheksimidin valotuksen jopa noin 90%, p38 tasot eivät muuttuneet merkittävästi. Histogrammi näyttää densitometristä määrällisiä saatu Scion kuvankäsittelyohjelma (www.scioncorp.com). Arvot normalisoitiin suhteessa siivous signaaleja ja ilmaistiin kertaisesti modulaatio suhteessa hoitamattomiin näytteitä. Tiedot ovat keskiarvoja kahdesta riippumattomasta kokeesta ± SD.

Kun analysoidaan 293FT solujen SDS-PAGE ja immunoblottaus pelkistävissä edellytyksellä, p38 kulkeutui monomeerin, kun se esiintyi dubletti kohdassa ei vähentävä este olosuhteissa (kuvio 1 C). Näin ollen, vaikka monet proteiinit, jotka sisältävät molekyylin sisäinen disulfidisidokset siirtyä nopeammin ei-pelkistävissä olosuhteissa johtuen kompaktimpi natiivi rakenne [40], p38 siirtynyt nopeammin vähensi kuin hapettuneessa tilassa, ilmiö viittaa siihen, että hitaammin siirtymässä muodossa voitaisiin harjoittaa in molekyylien välisiä disulfidisidoksia [41] – [43]. P28 signaali esiintyi yhtenä vyöhykkeenä sekä pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty).

Sen varmistamiseksi, että p38 ja p28 olivat

bonafide

endogeenisen

SEL1L

-koodattua proteiineja, SKBr3 ja 293FT-solut transfektoitiin siRNA: t kohdistuvat SEL1L N-päähän. Tasot Kolmen SEL1L signaalit olivat merkittävästi alhaisemmat soluissa käsitelty

SEL1L

vs. salattu siRNA: t, lasku oli 55% ja 45% varten SEL1LA ja 16% ja 23% p38 SKBr3 ja 293FT solujen vastaavasti, ja 30% p28 SKBr3 (kuvio 1 D). Vuonna 293FT soluja, estämällä proteiinisynteesiä sykloheksimidillä 3 ja 6 tuntia, aika ikkunat, jotka eivät johtaneet solukuolemaan, vähensi SEL1LA tasolla noin 50%, mutta oli lähes mitään vaikutusta p38 (kuvio 1 E). Klo 18 h, Sykloheksimidin aiheutti solukuolemaa, samanaikainen rajuun ehtyminen SEL1LA (noin 90%), mutta ei muuttanut p38 tasolla. Tämä osoittaa, että p38 on vakaampi kuin SEL1LA, mikä voi selittää vaatimaton p38 ehtyminen, jonka siRNA: t on SEL1L N-päähän.

Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että p38 ja p28 ovat SEL1L proteiinin variantteja koodaa 5 ”loppuun

SEL1L

geenin. Vaikka p38, johti ilmaistu testatuista solulinjoista, korkeammat tasot syöpälinjojen, P28 havaittiin vain heikosti eriytetty metastaattisen rintasyövän linja SKBr3 [44].

p38 ja p28 variantteja näyttää erittävien ominaisuudet

tutkia käyttäytymistä ja eritystä p38 ja p28 soluissa alle ER stressin /UPR, me analysoitiin SDS-PAGE ja immunoblottaus solulysaateista ja supernatantteja of MCF10A, SKBr3 ja KMS11 solujen normaaleissa olosuhteissa ja hoidon jälkeen DTT, joka aiheuttaa proteiinin väärinlaskostumista pelkistämällä disulfidisidokset [45] (kuva 2A-C). Kaikissa testattujen solujen DTT laukaisi ER stressiä /UPR, arvioi

XBP-1

liitos yhdistetty

BIP

,

ATF6

ja

CHOP

ylös -modulation, ja lisäsi

SEL1LA

mRNA ilmaisu (kuvio 2A1, C1, kuvio S2A-C), kun taas SEL1LA proteiinin taso ei noussut merkittävästi (kuva 2A-C, C2). P38, mutta ei SEL1LA, oli helposti havaittavissa SKBr3 ja KMS11 supernatantit, yhä lähellä kolmen ja viiden kertaiseksi jälkeen DTT (kuvio 2B-C). Ei ole todisteita p38 havaittiin MCF10A supernatanteissa, sekä tavanomaisissa että DTT-korosti olosuhteissa (kuvio 2A). P28 oli yksinomaan todettu jälkeen DTT hoidon ja vain supernatantissa SKBr3 solulinjan, joka ilmentää tätä vaihtoehtoa (kuvio 2B).

. Western blot-analyysi käsittelemättömän ja DTT-käsitelty MCF10A solut: MCF10A solut altistettiin DTT (2 mM) 3 tunnin ajan ja peräkkäin ylläpidetään 24 tuntia in OPTIMEM. Erittyvä proteiini (50 ug) uutetaan kasvatusalustasta TCA-saostuksella, ja alikvootit solulysaateista (50 ug) erotettiin SDS-PAGE (10%) ja blotattiin monoklonaalisella anti-SEL1L ja anti-vinkuliinin vasta-aineita. P38 ei ollut havaittavissa viljelyalustassa, niin kuin ilman DTT. Lisäksi p38, MCF10A solut osoittivat korkeampaa bändi, joka todennäköisesti vastasi kehittymätön esiaste tai translaation jälkeen modifioidun tuotteen. Kuva on tyypillinen kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta. A1. RT-PCR-analyysi käsittelemättömän ja DTT-käsitelty MCF10A solut: RNA uutettiin näytteistä kuvattu paneeli A ja analysoitiin RT-PCR: llä UPR vasteen. Histogrammi näyttää ilme arvot normalisoitu suhteessa siivous signaaleja ja ilmaistiin kertaisesti modulaatio suhteessa käsittelemättömän näytteitä; Densitometrinen analyysi suoritettiin Scion kuvankäsittelyohjelma. UPR aktivointi upon DTT hoito on merkitty ajan modulaatio

BIP

ja

CHOP

ja

XBP-1

liittämiseen, samanaikaisesti

SEL1LA

kasvatetaan ( harmaa palkki). Vastaavat kuvat on esitetty kuvassa S2A. Tiedot ovat keskiarvoja kahdesta eri määritykset, jotka perustuvat riippumattomaan hoidoista, ± SD. B. Western blot analyysi käsittelemättömien ja DTT-käsiteltyjen SKBr3 solut: eritys p38 ja p28 arvioitiin käsittelemättömiä ja DTT-käsiteltyjen SKBr3 soluissa. Solut altistettiin DTT (2 mmol) 3 tuntia tai ole alttiina ylläpidettiin 24 tunnin OptiMEMiin. Erittyvä proteiini (50 ug) uutetaan kasvatusalustasta TCA-saostuksella, ja alikvootit solulysaateista (50 ug) erotettiin SDS-PAGE (12%) ja blotattiin anti-SEL1L ja anti-vinkuliinin vasta-aineita. ER stressi /UPR edistettävä voimakkaasti eritystä p38 ja vähemmässä määrin, P28 kasvualustaan. Kuva edustaa viisi toisistaan ​​riippumatonta koetta. C. Western blot-analyysi KMS11 soluja käsiteltiin DTT ja MG132: KMS11 solut altistettiin DTT (2 mM) tai MG132 (10 uM) 3 tuntia ja peräkkäin ylläpidetään 24 tuntia in OPTIMEM. Erittyvä proteiini (30 ug), uutetaan kasvatusalustasta TCA-saostuksella, ja alikvootit solulysaateista (50 ug) erotettiin SDS-PAGE (10%) ja blotattiin anti-SEL1L ja anti-vinkuliinin vasta-aineita. Molemmat hoidot merkittävästi indusoi p38 erityksen viljelyalustaan. Kuva edustaa viisi toisistaan ​​riippumatonta koetta. C1. RT-PCR-analyysi KMS11 soluja käsiteltiin DTT ja MG132: RNA uutettiin samoista näytteistä on kuvattu paneeli C ja analysoitiin RT-PCR: llä UPR vasteen. Histogrammi näyttää ilme arvot normalisoitu suhteessa siivous signaaleja ja ilmaistiin kertaisesti modulaatio suhteessa hoitamattomiin näytteitä; Densitometrinen analyysi määritettiin Scion kuvankäsittelyohjelma. UPR aktivointi upon DTT hoito ilmaistaan ​​ajan modulaatio

ATF6

,

BIP

, ja

CHOP

ja

XBP-1

liitos ( katso kuva S2C), samanaikaisesti ilmaus

SEL1LA

,

HRD1

ja

GADD45β

kasvatetaan (harmaa palkki). Vastaavat kuvat on esitetty kuvassa S2C. MG132 hoito ei laukaista UPR aktivointia, kuten puuttuminen

ATF6

ja

BIP

un-modulaatio ja puute

XBP-1

liitos (katso kuva S2C) kuitenkin

CHOP

ja

GADD45β

olivat selvästi ylös-moduloidaan ja

SEL1LA

ja

HRD1

alas-moduloitu (mustat palkit). Tiedot ovat keskiarvoja neljästä eri määritykset, jotka perustuvat riippumattomaan hoidoista, ± SD. C2. SEL1LA proteiinin ilmentymistä KMS11 soluissa käsitelty DTT ja MG132: Histogrammi näyttää SEL1LA proteiinin ilmentymistä-arvoja näytteistä kuvattu paneeli C, normalisoitu suhteessa siivous signaaleja ja ilmaistiin kertaisesti modulaatio suhteessa käsittelemätön näyte; densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen Scion kuvantamisen ohjelman. MG132 määräytyy SEL1LA proteiinien kertymistä jopa 2 kertaa suhteessa kontrolliin tasolle (musta palkki). Tiedot ovat keskiarvoja neljästä riippumattomasta kokeesta ± SD.

MG132, joka määrittää ER stressiä ERAD tukkima proteasomin esto [46], testattiin KMS11 myeloomalinjaan, on tunnettu siitä, että rintasyövän solulinjat ovat melko resistenttejä tällaista hoitoa [47]. Noin jopa viisinkertaisen p38 että KMS11 keskipitkällä tapahtui kolmen tunnin MG132 altistumisen samanaikaista merkittävään kasvuun

CHOP

ja

GADD45β

ilmaus, joka osoittaa ER stressin /UPR aktivointia, vaikka jos puuttuessa

XBP-1

liitos ja

BIP

ja

ATF6

up-modulaatio (kuva 2C-C1; Kuva S2C). MG132 hoito lisäsi myös SEL1LA proteiinin taso (kuvio 2C, C2), joka on yhdenmukainen raportoidun todisteita siitä, että SEL1LA hajoaa kautta proteasomin [22].