Krooninen sairaus

tiivistelmä

Insuliinin kaltaisen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF1 R) on transmembraaninen reseptori, joka aktivoituu insuliinin kaltaisen kasvutekijä 1 (IGF-1) ja siihen liittyvä hormoni IGF-2. Se kuuluu suuren luokan tyrosiinikinaasireseptoreihin ja sillä on tärkeä rooli paksusuolen syövän etiologiassa ja etenemiseen. Tässä tutkimuksessa käytimme bioinformatiikan analyyseja etsiä miRNA jotka mahdollisesti kohdistuvat IGF1 R. Havaitsimme erityinen tavoite sivustoja miR-143 ja miR-145 (miR-143/145), että 3′-alue (3′-UTR) ja IGF1 R-geenin. Nämä miRNA ovat jäseniä klusterin miRNA, jotka on raportoitu olevan kasvaimia estävä aktiivisuus. Yhdenmukainen bioinformatiikan analyysit tunnistimme käänteinen korrelaatio miR-143/145 tasoilla ja IGF1 R-proteiinin tasot peräsuolen syövän kudoksissa. Yliekspressiolla miR-143/145 Caco2, HT29 ja SW480 peräsuolen syövän soluja, olemme kokeellisesti vahvistanut, että kaikki miR-143/145 suoraan tunnistaa 3′-UTR IGF1 R otteen ja säätelee IGF1 R ilme. Lisäksi biologinen seuraukset kohdentaminen IGF1 R by miR-143/145 tutkittiin soluproliferaatiomäärityksissä

vitro

. Olemme osoittaneet, että tukahduttaminen IGF1 R by miR-143/145 tukahdutti leviämisen Caco2 soluja. Yhdessä meidän havainnot tarjoavat näyttöä roolia miR-143/145 cluster tuumorisuppressorina kolorektaalisyövässä kautta estämällä IGF1 R käännöksen.

Citation: Su J, Liang H, Yao W, Wang N, Zhang S, Yan X, et al. (2014) MiR-143 ja MiR 145 Asetus IGF1 R ohitettavat soluproliferaatiota peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (12): e114420. doi: 10,1371 /journal.pone.0114420

Editor: Cecilia Williams, University of Houston, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 19, 2014; Hyväksytty: 10 marraskuu 2014; Julkaistu: 04 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Su et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta National Basic Research Program of China (973 Program) (nro 2014CB542300), National Natural Science Foundation Kiinassa (nro. 81101330, 31271378 ja 81250044) ja Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (nro. BK2011013 ja BK2012014).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä maailmassa, ja se on yleisempää teollisuusmaissa [1]. On arvioitu, että raakaöljyn keskimääräinen esiintyvyys Paksusuolisyöpä Kaakkois-Aasian molemmilla sukupuolilla oli 6,95 /100000 väestö vuonna 2008 ja ilmaantuvuus lisääntyi iän myötä [2]. Molekyylitasolla, peräsuolen syöpä syntyy useita geneettisiä ja epigeneettisten muutoksia, jotka inaktivoivat kasvaimen synnyssä ja aktivoida onkogeenejä [3]. Kuitenkin perus mekanismeista peräsuolen syövän taudin alkamisen ja etenemisen edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

Insuliinin kaltaisen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF1 R), tyrosiinikinaasin reseptoria IGF-1 ja IGF-2, on usein yli-ilmentynyt kasvaimissa ja on hyvin dokumentoitu soluviljelmässä, eläinkokeista ja ihmisten rooli pahanlaatuisiksi, eteneminen, suojaa apoptoosin, ja etäpesäkkeiden [4], [5]. IGF-reseptorin perhe koostuu kolmesta transmembraaniproteiineja, ja IGF1 R-geeni sijaitsee kromosomissa 15q26, joka koodaa yhden polypeptidiä 1367 aminohappoja, jotka on konstitutiivisesti useimmissa soluissa [5]. IGF1 R aktivointi johtaa autofosforylaatiota on tyrosiinit 1131, 1135 ja 1136 kinaasidomeenissa, minkä jälkeen fosforylaatio jukstamembraani- tyrosiinien ja karboksiterminaalinen seriinien [6]. Tätä seuraa rekrytointi erityisiä telakka välituotteiden, mukaan lukien insuliinin reseptori substraatti-1 (IRS-1), Shc ja 14-3-3-proteiinit [7], [8]. Nämä molekyylit yhdistää IGF1 R erilaisiin signalointireiteissä, jolloin induktion kasvu, transformaatio, erilaistumisen ja suojaa apoptoosin [9]. Kun IGF-1 sitova, IGF1 R aktivoi PI3K /Akt kaskadi, joka edistää G1-S solusyklin etenemisen ja nostaa solujen lisääntymistä [10], [11]. IGF1 R on yli-ilmentynyt aikana peräsuolen syövän synnyn, korkein ekspressiotaso havaittiin lisääntyvissä soluissa juuressa paksusuolen kryptissa [11], [12]. Kuitenkin rooli IGF1 R kolorektaalisyövässä vielä selvittämättä.

Viimeisen kymmenen vuoden aikana, uusi luokka pienten RNA-molekyylien tunnetaan MikroRNA (miRNA) on noussut merkittäviä säätelijöinä aloittamisesta ja etenemiseen ihmisen syöpien, kuten paksusuolen ja peräsuolen syövän [13] – [15]. miRNA ovat pieniä (~22 nukleotidin pitkä), yksijuosteisen ei-koodaavaa RNA-molekyylejä, jotka negatiivisesti säädellä geeniekspressiota sitoutumisen 3′-transloimaton alue (3′-UTR) ja kohde-mRNA-molekyylien, mikä johtaa joko hajoamisen transkriptin tai esto käännös [16] – [18]. Monet miRNA toimivat yhdessä toistensa kanssa hienosäätää proteiiniekspressiossa maailmanlaajuisesti. Siten miRNA on merkittävä rooli jälkeisessä transkription geenisäätelyn. Tärkeää on, viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että dysregulaatio miRNA liittyy ihmisen maligniteettien ja ehdottaa syy rooli miRNA syövän etiologiassa [19]. miRNA oletettavasti rooli syövän, koska ne voivat vaikuttaa käännöksen ja vakautta kohdennettujen onkogeenien tai tuumorisuppressorien, mikä lopulta vaikuttaa solujen fysiologiaa [19], [20]. Esimerkiksi, miR-143 ja miR-145 (miR-143/145), jotka sijaitsevat klusterin sisällä 5q32-33 kromosomaalisen alueen, ovat vaimentua monentyyppisissä syövissä, mukaan lukien peräsuolen syöpä [21], [22] . miR-143 ja miR-145 on osoitettu omaavan antituumorigeenistä aktiivisuutta, mukaan lukien osallistuminen erilaisissa syöpään liittyvien prosessien kuten leviämisen, invaasio ja muuttoliike [23].

Vaikka häiriöstä IGF1 R ja miRNA liittyy tuumorigeneesiin ihmisen peräsuolen syöpä, tiedetään vähän miRNA jotka toimivat IGF1 R. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että IGF1 R oli suoraan säätelee miR-143 ja miR-145 peräsuolen syöpäsoluja. Lisäksi osoitimme, että miR-143/145 voi estää IGF1 R lauseke tukahduttaa leviämisen peräsuolen syövän soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ihmiskudoksen

peräsuolen syöpä kudoksia ja pariksi viereisen noncancerous kudokset saatiin potilailta, joille suoritetaan kirurgisia toimenpiteitä The First Affiliated sairaala Anhui Medical University (Hefei, Kiina). Sekä kasvaimet ja noncancerous kudokset tehtiin histologinen analyysi diagnostisia vahvistusta. Patologinen tyyppi kunkin syöpä todettiin adenokarsinooma. Kirjallinen lupa saatiin kaikki potilaat tai heidän huoltajiensa sekä eettisen komitean ensimmäisen Affiliated sairaalan Anhui Medical University hyväksytty kaikilla tässä tutkimuksessa. Kudosfragmentit jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä leikkauksen aikana ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kliiniset piirteet potilaista ovat taulukossa S1in File S1.

Soluviljely

paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa Caco2, HT29 ja SW480 hankittiin Shanghai Institute of Cell Biology, kiinalainen Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Caco2-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Gibco, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco), kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2; HT29 ja SW480-soluja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco), kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

RNA: n eristys ja kvantitatiivinen RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin viljellystä soluista ja kudoksista käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määrityksiä määrittää kypsä miRNA suoritettiin käyttäen TaqMan microRNA koettimia (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttämällä AMV-käänteistranskriptaasia (TaKaRa, Dalian, Kiina) ja varsi-silmukka-RT-aluketta, ja kymmenesosa cDNA kohti käytettiin qPCR reaktio (Applied Biosystems). Reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 16 ° C 30 min, 42 ° C: ssa 30 min ja 85 ° C: ssa 5 min. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen TaqMan PCR -kittiä ja Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaktioita inkuboitiin 96-kuoppaisilla optinen levy 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Kun reaktiot olivat täydellisiä, syklin kynnys (C

T) tiedot määritettiin käyttämällä kiinteitä kynnys asetukset, ja keskimääräinen C

T määritettiin kolmena kappaleena PCR. Vertaileva C

T menetelmää käytettiin vertaamaan kunkin ehdon vertailureaktioissa. U6 snRNA käytettiin sisäisenä kontrollina, ja suhteellinen määrä miRNA normalisoituna U6 laskettiin yhtälön 2

-ΔΔCT, jossa ΔΔC

T = (C

T miRNA-C

T U6)

kohdennettu- (C

T miRNA-C

T U6)

valvontaa.

määrällisesti IGF1 R ja GAPDH mRNA, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptoituneet cDNA käyttämällä Oligo d (T) 18-alukkeita (Takara) ja Thermoscript käänteistranskriptaasia (Invitrogen). Reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 42 ° C: ssa 60 min ja 70 ° C: ssa 10 min. Reaaliaikainen PCR suoritettiin sitten RT tuote, SYBR Green väriaine (Invitrogen) ja alukkeina IGF1 R ja GAPDH. Sekvenssit alukkeet olivat seuraavat: IGF1 R (sense): 5′-GCCAAGCTAAACCGGCTAAA-3 ’; IGF1 R (antisense): 5’-TATCCTGTTTTGGCCTGGACATA-3 ’; GAPDH (sense): 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ’; ja GAPDH (antisense): 5’-CGCTCATTGCCGATAGTG-3 ’. Reaktioita inkuboitiin 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 30 s, 55 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C 1 min. Kun reaktiot olivat täydellisiä, C

T arvot määritettiin asettamalla kiinteän kynnyksen. Suhteellinen määrä IGF1 R-mRNA: n normalisoitiin GAPDH.

miRNA yliekspressio

miRNA yliekspressio saatiin aikaan transfektoimalla solut miRNA matkivat, synteettinen RNA-oligonukleotidi duplex matkimalla miRNA esiaste. Synteettiset RNA-molekyylejä, kuten esi-miR-143, pre-miR-145 ja salatun negatiivinen kontrolli-RNA (pre-miR-ohjaus), ostettiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Caco2, HT29 ja SW480-solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seuraavana päivänä, kun solut olivat noin 70% konfluentteja. Sillä miRNA yliekspressio kokeita, 100 pmol ennalta miR-143, 100 pmol ennalta miR 145 tai 50 pmol sekä ennen miR-143 ja pre-miR-145 käytettiin. 6 h transfektion jälkeen elatusaine Caco2-solut vaihdettiin DMEM täydennettynä 2% naudan sikiön seerumia, ja väline HT29 ja SW480-solut vaihdettiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 2% naudan sikiön seerumia. Solut kerättiin 24 h tai 48 h transfektion jälkeen eristämiseen kokonais-RNA: n tai proteiinin, vastaavasti.

Plasmidi rakentaminen ja siRNA häiriöitä määrityksessä

nisäkkään ekspressioplasmidin (Preceiver-M02 -IGF1R) on suunniteltu erityisesti ilmaisemaan täyspitkän avoimen lukukehyksen (ORF), ihmisen IGF1 R ilman miR-143/145 reagoivaa 3′-UTR hankittiin GeneCopoeia (Germantown, MD, USA). Tyhjä plasmidi toimi negatiivisena kontrollina. SiRNA (sense: 5′-GCGGCUGGAAACUCUUCUATT-3 ’; antisense: 5′-UAGAAGAGUUUCCAGCCGCTT-3’) kohdistaminen ihmisen IGF1 R on suunniteltu ja syntetisoitiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Salatun siRNA (Invitrogen) sisällytettiin negatiivisena kontrollina. Yli-ilmentyminen plasmidi tai siRNA transfektoitiin Caco2-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA: n tai proteiinin eristettiin 24 h tai 48 h transfektion jälkeen. IGF1 R-mRNA: n ja proteiinin ekspressiotasot arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä ja Western blottauksella.

lusiferaasireporttiterilla määritys

Koko 3′-UTR ihmisen IGF1 R monistettiin PCR: llä käyttäen ihmisen genomista DNA: ta mallia. PCR-tuotteet insertoitiin sitten p-MIR-reportteriplasmidilla (Ambion, Austin, TX, USA). Lisäyskohta vahvistettiin oikeiksi DNA-sekvensoinnilla. Testata sitoutumisen spesifisyys, sekvenssit, jotka ovat vuorovaikutuksessa siementen sekvenssin miR-143 ja miR-145 mutatoitiin (välillä UUGGGAG ja AACCCUC varten miR-143 sitoutumiskohdan ja UUGGGAG ja AACCCUC varten miR 145 sitoutumiskohta), ja mutantti IGF1 R 3′-UTR insertoitiin vastaava lusiferaasireportteriplasmidi. Lusiferaasin toimittaja määrityksiä, Caco2, HT29 ja SW480-solut ympättiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin yhdessä 0,8 ug: tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidi, 0,8 ug β-galaktosidaasin (β-gal) ekspressioplasmidin (Ambion), ja yhtä suuri kuin määrät (20 pmol) ja miR-143/145 matkivat tai salattu negatiivinen kontrolli-RNA käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Β-gal-plasmidia käytettiin transfektiotehokkuuden ohjaus. Solut kerättiin talteen 24 h transfektion jälkeen ja niistä analysoitiin lusiferaasiaktiivisuutta käyttäen Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA).

Protein eristäminen ja VVestern-blottaus

soluja tai kudoksia lyysattiin RIPA lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoksikolaattia ja 1 mM EDTA, pH 8,0), jossa on juuri lisätty proteaasiestäjäseostabletit (Roche), 30 min jään ja sentrifugoitiin sitten 16000 x g 4 ° C: ssa 10 min. Supernatantti kerättiin, ja proteiinikonsentraatio laskettiin BCA-proteiinin määrityskittiä (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla (Bio-Rad). Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin sähköllä PVDF-kalvoille (Bio-Rad), ja sitten blokattiin kuoritun maidon 5%: ssa 1 tunti. Membraanit inkuboitiin sitten primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa 12 tuntia. Kolmen pesun jälkeen TBST: ssä, kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen membraaneja inkuboitiin SuperSignal West Pico kemiluminesenssin substraatti (Pierce). Sama kalvo myös koettimena GAPDH-vasta-aineen, joka toimii lastaus- ohjaus. IGF1 R ja GAPDH vasta ostettiin Cell Signaling (# 3018) ja Santa Cruz Biotechnology (sc-25778), tässä järjestyksessä.

Soluproliferaatiomääritys

Caco2 solut maljattiin 5 x 10

4 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja sitten inkuboitiin yön yli DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Solut kerättiin 12, 24, 48 ja 72 h transfektion jälkeen. Transfektion jälkeen 10 ui Cell Counting Kit-8 (# c0038, Beyotime) lisättiin vastaava testi hyvin ja inkuboitiin 1 h. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 450 nm.

edu runsaudenmäärityksessä

arvioimiseksi soluproliferaation, Caco2-solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille. Soluja inkuboitiin vakio-olosuhteissa täyteen kasvatusliuokseen. Solujen transfektio suoritettiin seuraavana päivänä edellä kuvatulla tavalla. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, soluproliferaatiota havaittiin käyttäen sisällyttäminen 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinin (edu) kanssa edu Cell Proliferation Assay Kit (Ribobio, Guangzhou, Kiina). Lyhyesti, soluja inkuboitiin 50 uM edu: ssa 3 h ennen kiinnitystä, läpäiseväksi ja edu värjäys, jotka suoritettiin valmistajan protokollan. Solutumat värjättiin DAPI (Sigma) pitoisuutena 1 ug /ml 10 min. Solujen osuus, joka on sisällytetty edu määritettiin fluoresenssimikroskopialla.

Tilastollinen analyysi

Kaikki Western blotting ja lisääntymisen määritys kuvat edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. Kvantitatiivinen RT-PCR ja lusiferaasireportteri- määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja kukin koe toistettiin useita kertoja. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SE vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Havaitut erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä p 0,05 käyttämällä Studentin t-testiä.

Tulokset

tunnistaminen säilyneitä miR-143 ja miR-145 kohdesivustot sisällä 3′-UTR IGF1 R

kolme algoritmit, kuten TargetScan [24] ja RNAhydrid [25], käytettiin yhdistelmänä tunnistamaan mahdolliset miRNA että tavoite IGF1 R. Kaikki kolme algoritmit ennustivat miR-143 ja miR 145 säätelijöinä IGF1 R. Ennustettu vuorovaikutukset miR-143/145 ja kohde-sivustojen 3′-UTR: IGF1 R on esitetty kuviossa 1A. Yksi ennustettu hybridisaatio havaittiin molempien miR-143 ja miR-145 ja 3′-UTR IGF1 R. Vaikka kaksi kohdesivustot sisällä 3′-UTR IGF1 R olivat lähellä toisiaan, sivustot eivät olleet päällekkäisiä. Siellä oli täydellinen täydentävät toisiaan siemenen alueen (ydin sekvenssi, joka käsittää ensimmäisen 2-8 emästä kypsä miRNA) ja sukulais tavoitteita. Pienin vapaa energia arvot hybridisaatioiden välillä miR-143 ja IGF1 R välillä miR-145 ja IGF1 R oli -19,8 ja -24,8 kcal /mol, vastaavasti, jotka ovat hyvin erilaisia ​​aitoja miRNA-kohde paria. Lisäksi miR-143/145 sitova sekvenssit IGF1 R 3′-UTR olivat hyvin säilyneitä kaikilla eläinlajeilla. Siten miR-143 ja miR 145 valittiin ehdokkaiksi edelleen kokeellista tarkastusta.

(A) Kaavamainen kuvaus hypoteettisen dupleksit muodostuu vuorovaikutuksesta sitoutumiskohdat IGF1 R 3′-UTR (top ) ja miR-143/145 (alhaalla). Ennustettu vapaa energia-arvo kunkin hybridi on merkitty. Siemen tunnistuskohdat on merkitty, ja kaikki nukleotidit näillä alueilla ovat hyvin konservoituneita useiden lajien, mukaan lukien ihmisen, hiiren ja rotan. (B) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi miR-143 ja miR-145 tasot kuusi paria paksusuolen syövän kudoksen (C) ja noncancerous kudoksen (P) näytettä. (C ja D) Western blot analyysi IGF1 R-proteiinin tasojen kuusi paria C ja P näytteitä. C: edustava kuva; D: kvantitatiivinen analyysi. * P 0,05; ** P 0,01.

tunnistaminen käänteinen korrelaatio miR-143/145 tasoilla ja IGF1 R-proteiinin tasot kolorektaalisyövässä kudoksissa

Kiinnostus miR-143/145 cluster ja IGF1 R tuki myös hiljattain tunnistaminen näiden kahden miRNA ehdokkaaksi tuumorisuppressoreilla [26] ja IGF1 R kuten onkogeenin kolorektaalisyövässä [8]. Me tutkimme seuraavaksi miR-143/145 tasot korreloi käänteisesti IGF1 R-proteiinin ekspression peräsuolen syövän kudoksissa. Sen jälkeen pitoisuuksien määrittämiseksi miR-143/145 ja proteiini tasoilla IGF1 R on kuusi paria paksusuolisyövän kudosten ja vastaavien noncancerous kudoksia, osoitimme että miR-143 ja miR-145 tasot johdonmukaisesti vaimentua kolorektaalisyövässä kudoksissa (kuvio 1 B) , kun taas IGF1 R-proteiinin tasot olivat merkittävästi korkeammat peräsuolen syöpä kudoksiin (kuvio 1 C ja 1 D). Nämä tulokset osoittivat, että miR-143/145 ekspressiotasot ovat korreloi käänteisesti IGF1 R-proteiinin ilmentymistä ihmisen peräsuolen syöpä kudoksiin.

validointi IGF1 R suorana kohteena miR-143/145

korrelaatio miR-143/145 ja IGF1 R tutkittiin edelleen arvioimalla IGF1 R ilmentyminen ihmisen peräsuolen syövän solulinjoissa Caco2, HT29 ja SW480 jälkeen yli-ilmentyminen miR-143/145. Näissä kokeissa, yliekspressio saavutettiin transfektoimalla Caco2, HT29 ja SW480-soluja pre-miR-143 ja /tai pre-miR-145, jotka ovat synteettisiä RNA-oligonukleotidejä, jotka jäljittelevät miR-143 ja miR-145 esiasteita. Tehokas yli-ilmentymisen miR-143/145 kuviossa 2A, 2F ja 2K. Kuten odotettua, yli-ilmentyminen miR-143 ja /tai miR-145 merkittävästi tukahdutti IGF1 R-proteiinin tasot Caco2, HT29 ja SW480-soluissa (kuvio 2B, 2C, 2G, 2 H, ja 2L, 2M). Määrittää erityiset taso, jolla miR-143/145 vaikutteita IGF1 R ilmaisua, me toisti edellä kokeita ja tutki ilmaus IGF1 R mRNA transfektion jälkeen. Yli-ilmentymisen miR-143/145 ei vaikuttanut IGF1 R mRNA vakauteen (kuvio 2D, 2I ja 2 N). Nämä tulokset osoittivat, että miR-143/145 spesifisesti säätelee IGF1 R ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla, joka on yleisin mekanismi eläinten miRNA.

(A, F ja K) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi miR -143/145 tasoa Caco2, HT29 ja SW480-solut käsiteltiin salatun ohjaus, pre-miR-143, pre-miR 145 tai sekä ennen miR-143 ja pre-miR-145. (B, C, G, H ja L, M) Western blot-analyysi IGF1 R-proteiinin tasojen Caco2 käsitellyissä soluissa salatun ohjaus, pre-miR-143, pre-miR 145 tai sekä ennen miR-143 ja esi -miR-145. B, G ja L: edustava kuva; C, H ja M: kvantitatiivinen analyysi. (D, I ja N) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi IGF1 R mRNA tasojen Caco2, HT29 ja SW480-solut käsiteltiin salatun ohjaus, pre-miR-143, pre-miR 145 tai sekä ennen miR-143 ja pre- miR-145. (E, J ja O) Suora tunnustaminen IGF1 R 3′-UTR by miR-143/145. Caco2, HT29 ja SW480-solut kotransfektoitiin tulikärpäsen lusiferaasi toimittajille, jotka sisälsivät joko villityypin (WT) tai mutantti (MUT) miR-143/145 sitoutumiskohdat IGF1 R 3′-UTR ja salatun ohjaus, pre-asennuspalveli- 143, pre-miR 145 tai sekä ennen miR-143 ja pre-miR-145. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut testattiin käyttämällä lusiferaasianalyysissä kit. Tulokset näytetään suhde tulikärpäsen lusiferaasi toiminnan miR-143/145-transfektoitujen solujen aktiivisuuteen kontrollisoluissa. * P 0,05; ** P 0,01.

Voit selvittää kielteiset sääntelyn vaikutuksia miR-143/145 IGF1 R ilmentyminen välittyvä sitoutumisen miR-143/145 ennakoi maalin sivustoja 3 ”-UTR on IGF1 R mRNA, täyspitkä 3′-UTR IGF1 R sisältää kahta ennustettu miR-143/145 sitoutumiskohdista asetettu alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi geenin reportteriplasmidi. Saatu plasmidi transfektoitiin Caco2, HT29 ja SW480-soluja yhdessä transfektion ohjaus plasmidi (β-gal) ja joko ennen miR-143/145 tai sekoitetun negatiivinen kontrolli-RNA: ita. Kuten odotettua, lusiferaasiaktiivisuus huomattavasti pienempi transfektoiduissa soluissa ennalta miR-143 ja /tai pre-miR-145 (kuvio 2E, 2J ja 2O). Lisäksi otimme käyttöön pistemutaatiot vastaaviin täydentävien alueiden 3′-UTR IGF1 R eliminoida ennustettu miR-143/145 sitoutumiskohtia. Tämä mutatoitunut lusiferaasireportterista ei vaikuttanut yli-ilmentymisen miR-143/145 (kuvio 2E, 2J ja 2O). Tämä havainto viittasi siihen, että miRNA sitoutumiskohtien vahvasti myötävaikuttanut miRNA: mRNA vuorovaikutus että välittämän transkription jälkeisellä tukahduttamisesta IGF1 R ilmaisua. Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että miR-143/145 suoraan tunnistaa ja sitoutuu 3′-UTR IGF1 R mRNA transkriptin tukahduttaa IGF1 R ilmaisun peräsuolen syöpäsoluja.

MiR-143 ja miR-145 voidaan hillitsee peräsuolen syöpäsoluissa

seuraavaksi tutkit- roolien miR-143/145 IGF1 R sääntelyä. Koska IGF1 R on välttämätöntä sääntelyn lisääntymistä ja solusyklin etenemisen, arvioimme vaikutuksia miR-143/145 peräsuolen syövän soluproliferaatioon käyttäen CCK-8 määrityksessä. Tukeakseen ajatus, että miR-143/145 toimivat avain syövän tukahdutettu miRNA [26], Caco2, HT29 ja SW480-solut transfektoitu valmiiksi miR-143/145 osoitti tukahdutetaan lisääntymistä (kuvio 3A, 3E ja 3I). Lisäksi arvioimme rooli IGF1 R soluproliferaatioon. Kaataa IGF1 R, siRNA kohdistaminen IGF1 R suunniteltiin ja transfektoitiin Caco2, HT29 ja SW480-soluissa. Ilmentää voimakkaasti IGF1 R, plasmidi joka ilmentää IGF1 R ORF transfektoitiin Caco2, HT29 ja SW480-soluissa. Tehokas yli-ilmentyminen tai knockdovvn IGF1 R on esitetty kuvassa S1 File S1. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimukset osoittavat, että IGF1 R edistää solujen lisääntymistä [27], Caco2, HT29 ja SW480-solut transfektoitu IGF1 R yliekspressio plasmidi lisääntyneet on huomattavasti korkeampi (kuvio 3C, 3G ja 3K), kun taas IGF1 R Knockdown kanssa siRNA merkittävästi tukahdutti leviämisen (kuvio 3B, 3F ja 3J). Näin ollen, anti-proliferatiivista vaikutusta IGF1 R pudotus oli samanlainen kuin miR-143/145 yli-ilmentymisen. Lisäksi rakensimme IGF1 R yliekspression plasmidin resistenttejä miR-143/145 (poistamalla sen 3′-UTR). Verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu pre-miR-143/145, solut, jotka on transfektoitu pre-miR-143/145 ja IGF1 R yli-ilmentyminen plasmidista esillä huomattavasti korkeampi leviämisen hinnat (kuvio 3D, 3H ja 3L), viittaa siihen, että miR-143/145 kestävä IGF1 R pelastettiin tukahduttamista IGF1 R by miR-143/145 ja vaimennetaan antiproliferatiivista vaikutusta miR-143/145.

(A, E ja I) CCK-8 elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin 12, 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen ja Caco2 (A), HT29 (E) ja SW480 (I) solujen kanssa sekoitetun ohjaus, pre-miR-143, pre-miR 145 tai sekä ennen miR-143 ja esi -miR-145. (B, F ja J) CCK-8 elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin 12, 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen ja Caco2 (B), HT29 (F) ja SW480 (J) solut joko salattu ohjaus siRNA tai IGF1 R siRNA. (C, G ja K) CCK-8 elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin 12, 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen ja Caco2 (C), HT29 (G) ja SW480 (K) solut joko kontrollivektorilla tai IGF1 R yli-ilmentyminen vektori. (D, H ja L) CCK-8 elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin 12, 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen ja Caco2 (D), HT29 (H) ja SW480 (L-solut) joko salattu ohjaus, pre-miR -143/145 tai sekä ennen miR-143/145 ja IGF1 R yli-ilmentymisen vektorin. * P 0,05; ** P 0,01.

edelleen testata biologisen vaikutuksen IGF1 R kohdistettujen miR-143/145 kasvuun peräsuolen syöpäsolujen vaikutus miR-143/145 ja IGF1 R solujen leviämisen tutkittiin edu määrityksen immunokemiallinen tunnistusmenetelmä, joka mittaa nukleotidianalogina sisällyttämisestä äskettäin repii DNA. Yhdenmukainen tulokset CCK-8-määrityksessä prosenttiosuus edu-positiivisten solujen oli merkitsevästi pienempi transfektoiduissa soluissa pre-miR-143/145 (kuvio 4A ja 4B). Vastaavasti, huomattavasti enemmän edu-positiivisia soluja havaittiin solujen IGF1 R yliekspressio, kun taas IGF1 R-siRNA transfektoidut solut osoittivat päinvastainen vaikutus soluproliferaatioon (kuvio 4C ja 4D). Nämä tulokset osoittivat jälleen, että vähentynyt IGF1 R tasot tuotti saman fenotyypin havaitsemat miR-143/145 yli-ilmentymisen. Tutkia edelleen toiminnallista suhdetta miR-143/145 ja IGF1 R, Caco2 solut samanaikaisesti transfektoitu esi- miR-143/145 ja IGF1 R yli-ilmentymisen plasmidi. Kuten odotettua, yliekspressio IGF1 R dramaattisesti pelasti tukahduttava vaikutus miR-143/145 soluproliferaatioon (kuva 4E ja 4F). Yhdessä tulokset osoittavat, että miR-143/145 tukahduttaa soluproliferaatiota hiljentäminen IGF1 R.

punaisia ​​fluoresoivia soluja ovat S vaiheessa mitoosin ja siniset fluoresoivat solut edustavat kaikki solut. (A ja B) edu lisääntymisen määritys suoritettiin 48 tunnin kuluttua transfektion Caco2-solujen kanssa sekoitetun ohjaus, pre-miR-143, pre-miR 145 tai sekä ennen miR-143 ja pre-miR-145. V: edustava kuva; B: suhde Edu-positiivisten Caco2 soluja. (C ja D) edu lisääntymisen määritys suoritettiin 48 tunnin kuluttua transfektion Caco2 solujen salatun ohjaus siRNA, IGF1 R siRNA, kontrollivektorilla tai IGF1 R yliekspressio vektori. C: edustava kuva; D: suhde Edu-positiivisten Caco2 soluja. (E ja F) edu lisääntymisen määritys suoritettiin 48 tunnin kuluttua transfektion Caco2-solujen kanssa sekoitetun ohjaus ja valvonta vektori, salatun ohjaus sekä IFG1R yliekspressio vektori, pre-miR-143/145 plus kontrollivektori, tai pre-miR -143/145 plus IFG1R yli-ilmentymisen vektoriin. E: edustava kuva; F: suhde Edu-positiivisten Caco2 soluja. * P 0,05; ** P 0,01.

Keskustelu

Viimeisten vuosikymmenten aikana merkittäviä edistysaskeleita ymmärryksemme paksusuolen syövän biologian ovatkin parantaneet ja ennustavia menetelmiä sekä kehittää uusia kohdennettuja hoitoja. Teho kuitenkin uusien hoitojen edelleen rajallista yhdistelmällä lääkeresistenssin ja meidän heikko käsitys kasvainsolun signalointipolkujen. Äskettäin tärkeä rooli IGF1 R synnyssä ja etenemisessä peräsuolen syöpä on tullut [28] – [30]. Siten IGF1 R tarjoaa erityisen lupaava molekyylikohteena peräsuolen syövän hoidossa. Kuitenkin hyvin vähän tiedetään sääntelyä IGF1 R ilmaisun kolorektaalisyövässä. Siten molekyylitason mekanismeista IGF1 R säätelyreittejä on täysin selvitetty.

Tässä tutkimuksessa olemme ennustettu IGF1 R olevan tavoitteeksi miR-143 ja miR-145, jotka ovat klusterin miRNA, jotka ovat olleet raportoitu monissa tutkimuksissa vaimentua ja toimia tuumorisuppressoreilla useimmissa syövissä [21], [22]. Mittaamisen jälkeen ekspressiotasot miR-143/145 ja IGF1 R ihmisen peräsuolen syövän kudosta ja pariksi noncancerous kudos, havaitsimme käänteinen korrelaatio miR-143/145 tasoilla ja IGF1 R-proteiinin tasoja. Lisäksi yliekspressiolla miR-143/145 Caco2 soluissa, olemme kokeellisesti vahvistanut, että kaikki miR-143/145 suoraan estyy IGF1 R käännös. Lopuksi osoitimme että miR-143/145 esti IGF1 R ilmaisun ja siten tukahdutti leviämisen peräsuolen syöpä solujen

vitro

. Tulokset hahmotella uusi sääntelyverkon työllistää miR-143/145 ja IGF1 R hienosäätää solujen lisääntymistä. Olemme myös näyttöä siitä, että palauttaminen IGF1 R ilmaisun voi kääntää miR-143/145 tukahdutti solujen lisääntymistä. Mielenkiintoista on, että se on aiemmin osoitettu, että miR-145 voi kohdistaa insuliinin reseptori substraatti-1 (IRS-1) ja IGF1 R paksusuolen syöpäsoluissa [31] – [33]. Vaikka IRS-1 resistenttejä miR 145 voi pelastaa koolonkarsinoomasoluissa peräisin miR-145 aiheuttama kasvun estäminen, joka on IGF1 R kestävät miR 145 epäonnistui pelastamaan paksusuolen syöpäsolujen kasvun estäminen [33]. Tämä ei ole sopusoinnussa havaintomme. Näyttää siltä, ​​että onko miR-145 voi kohdistaa IGF1 R säädellä solun kasvu on riippuvainen solun ja kasvaimen tyyppejä. Eri olosuhteissa, miR-145 voi käyttää eri toimintoja. Tuloksista ilmeni kuitenkin meidän ja muiden korostaa, että miR-143/145 voivat toimia kasvaimeen tukahduttava miRNA, ja että kohdentaminen IGF1 R voi olla yksi mekanismi, jolla miR-143/145 klusteri kykenee sen tuumoria tukahduttavan funktion. Siksi modulaatio IGF1 R by miR-143/145 voi selittää, miksi downregulation miR-143/145 aikana peräsuolen syövän synnyn voi edistää syövän etenemistä.

miRNA jotka sijaitsevat lähellä genomissa (10 kb) katsotaan kuuluvan yhteen klusterin. miRNA klusterit transkriboidaan koordinoidusti, kuten polykistronisen yksiköt, joita jalostetaan yksittäisten miRNA jäsenet, jotka johtavat koekspressio miRNA.