Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lämpöshokki sukulais-proteiini 70 (Hsc70) toimii molekyyli- kaperonin ylläpidosta solunsisäisiä proteiineja, mikä mahdollistaa syöpäsolujen hengissä alle proteotoxic stressiä. Yritimme käyttää Hsc70 tunnistamiseen avainmolekyylejä syöpäsolun selviytymistä. Täällä suoritimme massaspektrometrialla-pohjainen proteomiikan analyysi hyödyntäen affiniteettipuhdistusta anti-Hsc70 vasta-aineet; seurauksena, 83 ilmentyvät differentiaalisesti proteiinit tunnistettiin stressiolosuhteissa. Tämä tulos merkitsee sitä, että on tapahtunut muutos, että proteiinit, joiden kanssa Hsc70 vuorovaikutuksessa vasteena stressille. Niiden proteiinien tunnistettiin molemmissa seerumin vaje ja 5-fluorourasiilin saaneista olosuhteissa Rab1A tunnistettiin olennaiseksi molekyyli syöpäsolun selviytymisen. Hsc70 vuorovaikutuksessa Rab1A on kaperonia riippuvalla tavalla. Lisäksi Hsc70 Knockdown laski tasolle Rab1A ja lisäsi taso sen ubikinaa- stressiolosuhteissa, mikä viittaa siihen, että Hsc70 esti hajoaminen Rab1A denaturoitu stressille altistuksen. Olemme myös havainneet, että Rab1A Knockdown solukuolema estämällä autophagosome muodostumisen. Rab1A voi siis auttaa estämään proteotoxic loukkauksia, mikä mahdollistaa syöpäsolujen hengissä stressiolosuhteissa. Analyysi Hsc70 interactors saatiin tietoa muutoksista solunsisäisten tila. Odotamme edelleen tutkiminen Hsc70 interactome tarjota entistä kattavampi käsitys syöpäsolun fysiologian.

Citation: Tanaka M, Mun S, Harada A, Ohkawa Y, Inagaki A Sano S, et al. (2014) Hsc70 Auttaa Cancer Cell Survival estämällä Rab1A Hajoaminen stressiolosuhteissa. PLoS ONE 9 (5): e96785. doi: 10,1371 /journal.pone.0096785

Editor: Ram Nagaraj, Case Western Reserve University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 lokakuu 2013; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2014; Julkaistu: 06 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Tanaka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin kokonaan tai osittain JSPS KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) Grant Numbers 24650637 (Masayuki Shiota) ja 23650617 (Hiroshi Iwao), ja Grant-in- tuki JSPS Fellows (24-2543 varten Masako Tanaka). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lämpöshokkiproteiini 70 perhettä (Hsp70s) on tunnettu ryhmä molekyyli saattajia, jotka tukevat proteiinisynteesiä

in vivo

, auttaa taitto muodostuvien polypeptidien, ja estää muodostumista aggregaatit lopettamalla ei-spesifisiä vuorovaikutuksia [1], [2]. Kun läsnä on väärin laskostuneen ja denaturoidun proteiinien, Hsp70s myös helpottaa niiden uudelleenlaskostuksen tai, jos kyseessä on peruuttamattomasti heikentynyt proteiinien, niiden poiston proteiinin hajoamisen koneen solun [3] – [5]. Hsp70s ilmaistaan ​​korkealla tasolla syöpäsoluissa ja rooli ylläpito proteiinin homeostaasin, joka edistää syöpäsolujen kasvua ja selviytymistä [6], [7]. Hsp70s tiedetään myös olevan osallisena kasvainten kehittymiseen, kuten etäpesäkkeiden invaasio, ja lääkeresistenssin [8] – [11]; sellaisenaan, useita inhibiittorit kohdistuvat Hsp70s on kehitetty syöpälääkkeet [12] – [15].

Hsc70 on konstitutiivisesti molekyyli- kaperonin, joka kuuluu Hsp70 perheen. Siinä on joitakin rakenteellisia ja toiminnallisia yhtäläisyyksiä Hsp72. Kuitenkin Hsc70, joka ei indusoi lämpöshokin tai muun korostaa ylläpitää proteiini homeostaasin alla sekä normaali- että stressiolosuhteissa, kun taas stressi-indusoituva Hsp72 on tärkeää, koska solujen selviytymään akuutti stressi. Hsc70 on raportoitu olevan mukana monia taloudenhoito chaperoning toimintoja, kuten taitto muodostuvien polypeptidien, proteiinien translokaation poikki kalvoja, kaperonia välittämä autophagy, ehkäistä proteiinien aggregaatiota stressiolosuhteissa, ja purkaminen clathrin päällystettyjä rakkulat [16 ]. Siksi Hsc70 hiirten ei voida luoda, koska keskeinen rooli tämän proteiinin solun eloonjäämistä [17].

Syöpäsolut monenlaisen microenvironmental korostaa, kuten hypoksia, ravinteiden puutteesta, ja altistuminen kemoterapia-aineiden [18 ] – [21]. Lisäksi pahanlaatuisia soluja kärsivät sisäisiä jännityksiä, kuten kertymistä mutatoitunut ja väärin taitettu proteiineja ja asiatonta toimintaa vapautettu signalointireittien, joka myös uhkaavat heidän selviytymistään [22]. Näin ollen, syöpäsolut täytyy voittaa proteotoxic stressiä, joka syntyy solunsisäinen kerääntyminen väärin laskostuneen proteiineja. Samanlainen Hsp72, ilmaus Hsc70 on suurempi joissakin syöpäsolulinjoissa kuin normaalissa ne [23]. Vaikka Hsc70 on yli-ilmentynyt syöpäsoluissa, tiedetään vähän, miten Hsc70 vaikuttaa syövän solujen eloonjäämistä verrattuna Hsp72. Normaaleissa kasvuolosuhteissa, sytoplasmisen Hsc70 voi liikkua sisään ja ulos tumasta. Kuitenkin, se on keskittynyt tumaan, kun solut altistetaan rasitukselle, kuten lämpöshokin. Tämä ydinaseiden Hsc70 sitten relocates sytoplasmaan palautumisen aikana [24], [25]. Lämpö myös osoitettu aiheuttavan nopean Hsc70 sitoutumisen liukenemattomaan sytoplasminen rakenteita, jotka ovat erillään solun tukirangan ja sisäisen solukalvon [26]. Hsc70 toimii siis nopeasti vasteena stressille, mutta ilmentyy. Myös muutos proteiinit, joiden kanssa Hsc70 vuorovaikutuksessa altistettaessa stressille. Alle proteotoxic olosuhteissa, toiminta Hsc70 avustaa cotranslational taittuvat keskeytyy ja tämän molekyylin sijasta helpottaa korjausta väärin laskostuneen proteiinien [27]. Siksi Hsc70 asiakas proteiinit ovat tärkeitä solujen homeostaasin ja ovat välttämättömiä molekyylejä stressistä. Koska Hsc70 tarvitaan taitto asiakkaan proteiinien, sen asiakas proteiinit stressiolosuhteissa ovat mahdollisesti avainmolekyylejä eloonjäämisen syöpäsoluja.

Tässä tutkimuksessa, suoritimme massaspektrometrialla-pohjainen proteomiikan analyysi hyödyntäen affiniteettipuhdistusjärjestelmässä anti-Hsc70 vasta-aineiden Hsc70 interactome profiloinnin ihmisen koolonisyöpäsolulinja HT29. Vertaamalla profiilit Hsc70 asiakkaan proteiinien välillä normaali- että stressiolosuhteissa, tunnistimme molekyylejä, jotka ovat mahdollisesti kriittisiä syöpäsolun selviytymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Ensisijainen Vasta-aineet ja kemikaalit

Vasta-aineet Rab1A, ubikitiini, Hsp72, ja p62 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet kaikkia muotoja poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1) ja katkaistun muotoja kaspaasi-3 ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineet β-aktiini ja LC3B vasta-aine hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Anti-Rab1B-vasta-aine hankittiin Abgen (San Diego, CA). HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet hankittiin GE Healthcare Bio-Science (Pieni Chalfont, Bucks, UK). Kaksi eri anti-Hsc70 vasta-aineita, joita käytetään affiniteettipuhdis- tuotettiin laboratoriossamme [25], ja anti-Hsc70-vasta-ainetta käytettiin muissa kokeissa hankittiin Enzo (Farmingdale, NY). MG132 ostettiin Sigma (St. Louis, MO). 5-fluorourasiili (5-FU), ja brefeldin A (BFA) saatiin Wako (Osaka, Japani), laimennettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), ja säilytettiin -20 ° C: ssa.

Soluviljelmä ja kokeellinen Hoidot

ihmisen koolonin adenokarsinooman solulinjan HT29 hankittiin DS Pharma Biomedical (Osaka, Japani) ja pidettiin McCoyn 5A-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa. Solut siirrostettiin joka seitsemäs päivä lähestyttäessä yhtymäkohta. Soluja käsiteltiin 3,2 pM (IC

50 48 h) 5-FU tai ilman FBS: ää (seerumin ehtyminen) kuuden tunnin ajan. Massa-spektrometria-pohjainen proteomiikan, 10 uM 5-FU käytettiin. Kaikki käsittelyt tehtiin lopulliseen konsentraatioon 0,1% DMSO: ta.

Immunoblottaus ja immunosaostus

Solut lyysattiin RIPA-puskurilla ja proteiinit eristää solulysaateista immunosaostuksella, kuten aiemmin on kuvattu [28] . Immunoblottausta, proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä pelkistävissä olosuhteissa, jota seurasi elektroforeettinen siirto PVDF-membraaneille kuten aiemmin on kuvattu [29]. Kalvot tunnistettiin LAS-4000 Lumino-kuva analysointijärjestelmissä (GE Healthcare Bio-Science) käyttämällä tehostettua kemiluminesenssitekniikalla (Immobilon Länsi HRP Substrate; Millipore).

eristäminen ja Proteomiikka analyysi Hsc70 Client Proteiinit

massaspektrometria-analyysi, solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 1% paraformaldehydi huoneenlämmössä 20 min, minkä jälkeen reaktio pysäytetään 125 mM glysiiniä. Kiinnitetyt solut lyysattiin RIPA-puskuriin, joka koostuu 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glyseroli, 100 mM NaF, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 0,2 mM DTT: tä, ja proteaasiestäjäseostabletit. Solulysaateista (1 mg proteiinia) precleaned inaktivoidun NHS-Sepharose-helmiä (GE Healthcare Bio-Science) yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja immunosaostettiin kahdenlaisia ​​in-house-vasta-aineen, joka on spesifinen HSC70 immobilisoitu NHS-aktivoitua Sepharose huoneen lämpötilassa kaksi tuntia. Immunosaostumat pestiin sitten kolme kertaa RIPA-puskurilla, ja altistettiin suolanpoisto ja pitoisuus SDS-PAGE 5-20% polyakryyliamidigradienttigeellä (Wako), mitä seurasi värjäys Quick-CBB (Wako). Geeli irrotettiin klo viipaletta ~ 1 mm paksuus kaistaa kohti. Geeli palat väri poistettiin 25 mM NH

4HCO

3 ja 50% asetonitriiliä, jonka jälkeen ylimääräinen poistamalla väri 25 mM NH

4HCO

3, 30% asetonitriiliä, ja vähennys 25 mM NH

4HCO

3, joka sisälsi 10 mM DTT 56 ° C: ssa yhden tunnin ajan. Alennettu kysteiinitähteet on myöhemmin alkyloida 55 mM jodiasetamidia 25 mM NH

4HCO

3 ja geelipalat pestiin sitten asetonitriilillä ja kuivattiin. Kuivattu geeli kappaletta käsiteltiin 10 ug /ml trypsiiniä (Trypsin Gold, Promega, Madison, WI), 50 mM NH

4HCO

3 jäissä 30 minuutin ajan, ylimäärä poistettiin, ja täydellinen digestio sai tapahtua 37 ° C: ssa 18 tuntia 50 mM NH

4HCO

3. Näytteet suolat käyttäen Zip Tip C18 (Millipore) mukaisesti valmistajan ohjeita. Trifluorietikkahappoa lisättiin sitten loppupitoisuuteen 0,1%, ja jota käytetään nano-nestekromatografia sähkösumutusionisaatiota-tandem-massaspektrometrialla (LC-ESI-MS /MS) analyysi.

Nanoelectrospray LC-MS /MS-analyysi ja Proteiinitunnistus

LC-MS /MS-analyysit suoritettiin DINA-AI nano LC-järjestelmä (KYA Technology, Tokio, Japani), joka on kytketty QSTAR Elite hybridi massaspektrometriin (AB Sciex, Concord, Ontario, Canada) kautta NanoSpray ionilähteen (AB Sciex). Yksityiskohdat Analyysin kuvattu muualla [30]. Tietojen hankinta suoritettiin käyttämällä Analyst QS Software 2.0 (AB Sciex) positiivisessa-ionin tilassa. Molemmat tiedot käsittelivät ProteinPilot käyttämällä Paragon ™ hakualgoritmi (AB Sciex). MS /MS-tiedot käytettiin hakukyselyn NCBI-tietokannasta (RefSeq release 55, syyskuuta 2012 ftp://ftp.hgc.jp/pub/mirror/ncbi/refseq/) käyttäen

Homo sapiens

taksonomia suodatin. Vähimmäisrajaa proteiinin tunnistamiseen asetettiin proteiinin pisteet 0,47, joka vastaa luottamustasolla yli 66% ja väärä löytö osalta 1%.

iTRAQ leimaaminen ja kvantifiointi Protein Expression

proteiineja ohjaus- tai Rab1A-vaiennettu soluja uutetaan kuvatulla immunoblottauksella. Solulysaatit konsentroitiin ja liukeneminen puskuriin (100 mM trietyyli- ammoniumbikarbonaattia, pH 8,0) korvattiin Microcon sentrifugisuodattimet kanssa 3 K nimellinen molekyylipainon raja-ultrasuodatusmembraania, jonka jälkeen pilkkomalla ja merkintöjä 4-Plex iTRAQ reagenssien mukaisesti standardimenetelmiä [31]. Näytteet merkittävä seuraavasti: 114, ohjaus knockdown; ja 115, Rab1A knockdown. Kukin näyte sisälsi 100 ug proteiinia. Proteiini mitattiin BCA proteiinikokeella.

RNA Häiriöitä

Kaikki siRNA ihmisen

Hsc70

(

HSPA8

),

Rab1A

, ja

Ran

, ja äänenvaimennin negatiivinen kontrolli numero 1 siRNA (Control) saatiin Invitrogen. Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) käytettiin kääntämään transfektioon siRNA soluihin (lopullinen pitoisuus 30 nM tai 10 nM) mukaisesti valmistajan ohjeiden.

MTS Analyysit

siRNA-transfektoiduissa soluissa oli ympättiin 96-kuoppalevyille tiheydeksi 1 x 10

4 tai 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti. 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut viljeltiin seerumia köyhdytettyä väliaineessa tai 5-FU: ta (3,2 uM) 24 tuntia. Elinkelpoisuus määritettiin analysoimalla kanssa Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani). Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä Microplate Reader.

Apoptosis Assay

siRNA-transfektoituja soluja siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

4 solua per kuoppa . 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut altistettiin seerumin väheneminen tai 5-FU hoitoa 24 h. Apoptoottiset solut tunnistettiin tumavärjäystä Hoechst 33258 sen jälkeen, kun kiinnityksen 0,5% glutaraldehydillä viiden minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Peitelaseja asennettu Fluoresenssi Mounting Medium (Dako, Glostrup, Tanska). Stained soluja tarkasteltiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Biozero; Keyence, Osaka, Japani), jossa on 20 x kuivaa tavoite.

RNA valmistelu ja Reaaliaikainen käänteiskopioijaentsyymi–polymeraasiketjureaktio Analysis

Yhteensä RNA eristettiin Hsc70- tai Rab1A-knockdovvn tai kontrolli pudotus soluihin käyttäen ISOGEN reagenssia (Nippon Gene, Tokio, Japani). Käänteinen transkriptio suoritettiin sitten käyttämällä 1 ug RNA ja ReverTra Ace qPCR RT Master Mix gDNA Remover (TOYOBO, Osaka, Japani). Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) kanssa LightCycier-FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche, Penzberg, Saksa). RNA-tasolla normalisoitiin käyttämällä

GAPDH

. Kaikki tiedot analysoitiin vertaileva C

T käyttäen 7500 Software ver. 2.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

IncuCyte Cell Growth Measurement määritys

Neljäkymmentä kahdeksan tunnin kuluttua siRNA transfektion, yhteensä 5 x 10

4 HT29 ympättiin 24-kuoppaisille levyille. Transfektoitumattomat solut käsiteltiin 5 ug /ml BFA tai DMSO alkaessa mittauksen. Levyä inkuboitiin käytettäessä IncuCyte kineettistä kuvantamisjärjestelmä (Essen BioScience, Ann Arbor, MI) sisällä soluviljelmässä inkubaattorissa. Kuvat otettiin neljään kenttään kuoppaa kohti kolmen tunnin välein seurata leviämisen.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. Vertailut ryhmien välillä tehtiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

p

0,05.

Tulokset

Hsc70 on kriittinen for Cancer Cell Survival

tutkimiseksi osuus Hsc70 kohteeseen HT29 solujen eloonjäämistä, suoritimme MTS-määrityksellä Hsc70 taintumisen soluissa (Kuva. 1A). Kontrolliin verrattuna, Hsc70 pudotus laski solujen elinkelpoisuus, joka oli riippumaton stressin intensiteettiä. Vaikka HT29 olivat erityisen vastustuskykyisiä seerumistarvaatio, Hsc70 Knockdown lisännyt alttiutta seerumistarvaatio ja johtivat solukuolemaan (Fig. 1 B ja kuviossa. S1). Vaikka myöhemmin induktion Hsp72 adaptiivisen stressin vastetta (kuvio. 1C), Hsp72 ei estä indusoimaa solukuolemaa Hsc70 pudotus. Siksi Hsc70 on kriittinen solujen eloonjäämistä ja Hsp72 voinut täysin kompensoimaan sen menetystä.

(A) knockdovvn Hsc70 laski syöpäsolun elinkelpoisuuden. HT29-soluja transfektoitiin siRNA varten

Hsc70

tai scramble ohjaus. 48 h transfektion jälkeen siRNA, solut altistettiin seerumin nälkään tai käsiteltiin 5-FU on osoitettu pitoisuus 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä. Data pistettä edustavat keskiarvoa ± S.D. (N = 5). (B) vaikutus Hsc70 Knockdown solu- morfologia. Hsc70 tai kontrolli pudotus solut käsiteltiin samalla tavoin kuin

. Faasikontrasti- kuvaa solujen seerumista syötetään tai seerumi-vapaissa olosuhteissa 24 h käsittelyjen jälkeen. Mittakaava, 200 um. (C) Hsc70 Knockdown indusoi korvaava ilmaus Hsp72. 48 h transfektion jälkeen siRNA, Hsc70 pudotus tai kontrolli solut altistettiin seerumin ehtyminen 6, 12 tai 24 h. Solujen hajoamisen jälkeen, Hsc70 ja Hsp72 havaittiin immunoblottauksella. SD, seerumin ehtyminen.

Analyysit Hsc70 interactors Yksilöitiin Serum-köyhdytettyä ja 5-FU-käsitellyn HT29

Koska erilaisia ​​jännityksiä aiheuttaa kertymiseen solun väärin laskostuneen ja denaturoitu proteiinit, Hsc70 sitoutuu ja poimuttuu nämä vaurioituneet proteiineja. Tämä toiminto Hsc70 mahdollistaa solujen hengissä alle proteotoxic jännityksiä. Niinpä yritettiin analysoida Hsc70 interactors stressiolosuhteissa, jotta voidaan tunnistaa avainmolekyylejä syövän solujen eloonjäämistä. Vuokaavio tunnistamiseksi Hsc70 interactors on esitetty kuviossa. 2A. HT29-soluja altistettiin seerumin väheneminen tai 5-FU, ja käsiteltiin DMSO: ajoneuvon ohjaus 6 tuntia. Profiloinnin Hsc70 interactors syöpäsoluissa suoritettiin eristäminen käyttämällä Hsc70 affiniteettihelmillä, jonka jälkeen massaspektrometrialla-pohjainen tunnistaminen. Yhteensä 124 proteiineja identifioitiin 95%: n luottamusväli (Fig. 2B ja Taulukko S1). Näistä 41-proteiinien ainutlaatuinen ajoneuvon ohjaus olivat mukana normaaleissa homeostaattisen prosesseissa. Gene ontologia (GO) analyysi paljasti, että nämä proteiinit olivat mukana mitokondrioiden energiantuotannon, solun tukirangan ja proteiinisynteesiä. Niistä jäljellä proteiinit, 30 proteiineja ainutlaatuinen seerumin ehtyminen oli erityisen mukana proteiinia liikenteen, proteiinisynteesiä ja solukierron, kun taas 29-proteiinien ainutlaatuinen 5-FU-hoidon jälkeen yleisesti liittyvät glukoosiaineenvaihdunnan. Nämä tulokset osoittavat, että siellä oli muutos proteiineja, joiden kanssa Hsc70 vuorovaikutuksessa vasteena eri stressiä. Siksi Hsc70 interactome heijastaa ärsyke riippuvat muutokset vastauksista stressiä ja voitaisiin käyttää valvomaan fysiologisia muutoksia solujen. Analyysimme määriteltiin myös rajoitettu määrä proteiineja, jotka olivat yleisiä molemmissa stressin olosuhteissa, jotka olivat mukana mitokondrioissa solun tukirangan ja proteiinia liikenne. Näistä keskityimme Rab1A Ras-superperheen, joka ilmentyy korkealla tasolla syöpäsoluissa. Tämä molekyyli säätelee keskeisten solun prosessit, kuten signaalitransduktion, solujen lisääntymistä, ja rakkula liikenne (Fig. 2B ja taulukko S2).

(A) näytetään kaavamaisesti tunnistamista Hsc70 interactors. Solut altistettiin seerumin ehtyminen (SD), 5-FU, tai DMSO: ssa 6 tuntia. Hsc70 interactors eristettiin anti-Hsc70 vasta-solu-uutteesta, ja tunnistettiin myöhemmin analyysi nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS). (B) tunnistaminen ja toiminnallinen luokittelu Hsc70 interactors jotka liittyivät muutoksiin stressiä vastausta. Venn kaavio kuvaa Hsc70 interactors tunnistettujen 95% luottamusväli pisteet (1,3 ProtScore) käyttäen ProteinPilot 2.0 -ohjelman. Sarake kuvaajat osoittavat määrän ja toimivuutta tunnistettu proteiineja.

Rab1A Knockdown pahentaa stressi Vahinko seerumin väheneminen ja 5-FU hoito

laajentaa proteomiikka havaintojen me seuraavaksi arvioidaan panos of Rab1A syövän solujen eloonjäämistä. Verrattuna kontrolli- transfektio, Hsc70 knockdown pienentää pesäkkeen koko, ilman muutoksia solun morfologiassa (kuvio. 3A). Kuitenkin Rab1A pudotus aiheutti vaimennus solu-solu-adheesion ja merkittävästi vähensi solujen määrä, joka on parantunut seerumin ehtyminen. Kvantifioimiseksi vaikutuksia Rab1A pudotus, teimme MTS-määritys (Fig. 3B). Solut ympättiin 1 x 10

5 per kuoppa 96-kuoppalevyille, jotta voidaan poistaa vaikutuksen solujen lisääntymisen. Sekä seerumin ehtyminen ja 5-FU hoito oli vähän vaikutusta elinkelpoisuuden valvonnan soluja, mikä osoittaa, että nämä hoidot pelkkiä lievä stressi soluille. Verrattuna kontrolli soluihin, Hsc70 knockdown vähensi merkittävästi solujen elinkelpoisuuden (

p

0,01) huolimatta lievä stressi altistumista. Tämä osoittaa, että Hsc70 Knockdown solukuolema stressiolosuhteissa, kuten myös kuviossa. 1A ja B. Kuitenkin Rab1A knockdown vähensi merkittävästi solujen elinkelpoisuuden (

p

0,05) ilman stressiä altistuminen, osoittaa edelleen, että Rab1A pudotus yksinään solukuolema normaaliolosuhteissa. Lisäksi vaikka lievä luonne korostaa seerumin ehtyminen ja 5-FU käsittely laskivat edelleen elinkelpoisuutta Rab1A pudotus soluja. Nämä tulokset osoittavat, että Rab1A edistää solujen selviytymiseen ja on hyvin tärkeää, stressiolosuhteissa, jotka eivät kuulu kyky Hsc70 varmistamiseksi solun eloonjäämistä.

HT29 transfektoitu

Hsc70

,

Rab1A

tai

ohjaus

siRNA alistettiin seerumin ehtyminen, 5-FU, tai ajoneuvon käsittely 24 tuntia. (A) Vaikutukset tukahduttaminen Hsc70 ja sen interactors solu- morfologia. Edustavia vaihe-kontrastin kuvia soluja. Mittakaava, 100 pm. (B) Rab1A Knockdown vähentynyt solujen elinkykyä. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä. **,

p

0,01, *,

p

0,05 vs. ajoneuvo;

†,

p

0,05 vs. kontrolli pudotus kaksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukey-Kramer post hoc testi; arvot ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 7). Veh, ajoneuvo. SD, seerumi ehtyminen. FU, 5-fluorourasiili.

Hsc70 ehkäistä Rab1A Hajoaminen

vaikutusten tutkiminen Hsc70 on Rab1A stressiolosuhteissa, olemme keskittyneet vuorovaikutusta näiden kahden molekyylin. Varmistimme fyysinen vuorovaikutus endogeenisen Hsc70 ja Rab1A co-immunosaostusmäärityksissä kaupallista vasta-aineilla (Fig. 4A). Tämä vahvisti tulokset massaspektrometrianalyysissä että Hsc70 vuorovaikutuksessa Rab1A seerumista köyhdytettyä olosuhteissa. Olemme edelleen vahvisti, että Hsc70 vuorovaikutuksessa Rab1A on kaperonia riippuvaisella tavalla, koska Hsc70 ja Rab1A oli välimatkan päässä toisistaan ​​ATP. Olemme myös havainneet, että Hsc70 muodostunut homodimeerejä, mutta Rab1A ei. Toissijainen eluointi SDS-näytepuskurissa jäljellä sitoutuneet proteiinit agaroosihelmillä suoritettiin havaitsemiseksi syötti proteiineja, koska ATP: tä ei häiritse antigeenin ja vasta-aineen vuorovaikutuksen. Seuraavaksi arvioimme Rab1A taso, kun Hsc70 tukahdutettiin; se osoitti laskua stressiolosuhteissa huolimatta korvaava kasvua Hsp72 tason (Fig. 4B). Kuitenkin Hsc70 knockdown ollut vaikutusta Rab1A tason valvonnassa olosuhteissa. Tämä downregulation Rab1A stressiolosuhteissa havaittiin proteiinin tasolla, mutta ei mRNA-tasolla (Fig. 4C). Hsc70 sen vuoksi osoitettu ei säännellä Rab1A synteesi, ainakin. Seuraavaksi me havainneet, että Hsc70 tukahduttaminen lisääntynyt taso ubikitinoitu Rab1A alle seerumi-köyhdytettyä olosuhteissa (Fig. 4D). Lisäksi Rab1A hajoaminen, joka on saatu aikaan Hsc70 pudotus stressiolosuhteissa estyi proteasomin inhibiittoria MG132 (Fig. 4E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Hsc70 estää hajoamisen Rab1A, joka on väärin laskostuneet stressiolosuhteissa.

(A) Hsc70-Rab1A vuorovaikutus kaperonitoiminta. HT29-soluja altistettiin seerumin ehtyminen 24 tuntia, ja sitten hajotettiin. Tarkistaa vuorovaikutusta Hsc70 ja Rab1A on kaperonia riippuvalla tavalla, anti-Hsc70 tai anti-Rab1A immunoprecipitant eluoitiin ATP, minkä jälkeen eluoitiin SDS-näytepuskuriin ja immunoblottaus, jotta voidaan vahvistaa syötti proteiineja. (B) Hsc70 Knockdown laski tasolle Rab1A proteiinin stressiolosuhteissa. HT29-soluja, jotka on transfektoitu

Hsc70

tai

ohjaus

siRNA alistettiin seerumin ehtyminen, 5-FU, tai ajoneuvon käsittely 24 tuntia. Immunoblottauksella endogeenisen Rab1A ja Hsc70 proteiineja. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) Hsc70 Knockdown ei laskenut

Rab1A

mRNA-tasolla. Sen jälkeen knockdovvn Hsc70 ja valvonnassa,

Rab1A

mRNA-tasot määritettiin qPCR 48 h transfektion jälkeen. (D) Hsc70 Knockdown edisti ubikinaation of Rab1A. Jälkeen Hsc70 pudotus tai kontrolli solut hajotettiin, immunosaostuksella (IP), anti-Rab1A tai anti-ubikitiini-vasta-aineita suoritettiin, minkä jälkeen immunoblottauksella anti-ubikitiini tai anti-Rab1A vasta-aineita. (E) MG132 hoito esti Rab1A hajoamista. Hsc70 pudotus solut altistettiin seerumin väheneminen tai 5-FU hoitoa, ja sitten MG132 (10 uM) tai vehikkeliä, lisättiin viimeistä 8 h ennen näytteenottoa. SD, seerumi ehtyminen. FU, 5-fluorourasiilin kanssa. Ub, ubikitiini, IgG LC, immunoglobuliinin kevyttä ketjua. Data (paitsi C) edustavat vähintään kahta erillistä koetta saadaan samanlaisia ​​tuloksia.

Rab1A Knockdown aiheuttama solukuolema ei ole peräisin Apoptosis

Sen tutkimiseksi, puuttuessa Rab1A indusoi apoptoosin, tutkimme läsnäolo apoptoottisten solujen tumavärjäystä Hoechst 33258. Ran, jäsen Ras-superperheen, vuorovaikutuksessa Hsc70 kaikissa olosuhteissa mukaan meidän proteomiikka-analyysi (taulukko S2). Ran pudotus suoritettiin positiivisena kontrollina apoptoosin. Ran pudotus solut osoittivat apoptoottisten ydin- pirstoutuminen riippumatta seerumin ehtyminen, kun taas Rab1A knockdown soluja esillä ainoastaan ​​lievää apoptoosin altistuessaan seerumin ehtymisen (Kuva. 5A). Kun laskenta Hoechst-värjättyjen solujen ja ne, joilla ydin- pirstoutuminen, Rab1A knockdown todettiin vähentävän solujen määrä samassa määrin kuin Ran pudotus (kuvio. 5B). Kuitenkin apoptoosi merkittävästi indusoi Ran pudotus mutta ei Rab1A taintumisen (Fig. 5C). Koska me myös ei tunnista tyypillinen PARP-1 ja kaspaasi-3 apoptoottisten allekirjoituksia upon Rab1A taintumisen (Fig. 5D), solukuoleman pahentaa Rab1A Knockdown osoitettiin ei olla vastuussa apoptoosin. Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että Rab1A pudotus solukuolema ei apoptoosin.

HT29 transfektoitu

Hsc70

,

Rab1A

,

Ran

tai

ohjaus

siRNA alistettiin seerumin ehtyminen, 5-FU, tai ajoneuvon käsittely 24 tuntia. (A) Rab1A pudotus oli vähän vaikutusta apoptoosin induktioon. Apoptoosin analysoitiin värjäämällä Hoechstin 33258. White arrowheads osoittavat apoptoottista ytimet kondensoituneilla chromatin. Mittakaava, 50 pm. (B, C) lasku solun numero Rab1A Knockdown ei johtunut apoptoosin. Numbers koko solujen ja apoptoottisten solujen kvantitoitiin laskemalla Hoechst-värjättyjen solujen tai solujen ydin- tiivistyminen (A), tässä järjestyksessä. *,

p

0,05, **,

p

0,01 vs. kontrolli /ajon;

†,

p

0,05,

††,

p

0,01 vs. kontrolli /SD;

##,

p

0,01 vs. Rab1A /SD kaksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferroni /Dunn post hoc testi; arvot ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3). (D) Rab1A tukahduttaminen ei indusoinut apoptoosia. Apoptoosi määritettiin pilkkoutuminen PARP-1 ja kaspaasi-3, havaittiin immunoblottauksella. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Veh, ajoneuvo. SD, seerumi ehtyminen. FU, 5-fluorourasiilin kanssa. Immunoblottausmääritys tiedot edustavat vähintään kolmea erillistä koetta saadaan samanlaisia ​​tuloksia.

Quantitative Differential Proteomiikka in Rab1A Knockdown Solut

tutkia miksi puuttuminen Rab1A solukuolema ilman apoptoosin, suoritimme kvantitatiivinen ero proteomiikka analyysi Rab1A pudotus solujen perustuu iTRAQ tekniikkaa. ITRAQ-leimattujen proteiinien, jotka oli uutettu Rab1A pudotus solut analysoitiin ja verrattiin proteomiin kontrollisolujen. Tämän seurauksena 25-proteiinien kanssa, muutos ilmentymisen ≥1.2-kertainen katsottiin voimistuvan, kun taas 27-proteiinit, joissa on muutoksia 0,8-kertainen oli vaimentua (taulukko S3). Arvioida toiminnallisia eroja näiden kahden alasarjan välisessä proteiineja, suoritimme GO analyysi (Fig. 6A ja B). Voimistunut proteiinit luokiteltiin ryhmiin proteiinin kuljetuksen, mitokondrioita, ja proteasomin, kun taas luokitus ehdoin ribosomin ja transkriptio /translaatio oli erityisen yleisempää vaimentua proteiineja. Nämä tulokset viittaavat siihen, Rab1A Knockdown nostivat muiden proteiinien mukana Endoplasmakalvosto (ER) -Golgi kaupan, mutta ei johtanut korvausta Rab1A toiminto. Toimintahäiriöstä Rab1A helpotti proteiinien hajoaminen ja pysähtyi proteiinisynteesiä, mikä osoittaa, että Rab1A Knockdown soluissa indusoi kertymistä väärin laskostuneen proteiineja. Näin ollen, Rab1A knockdown-soluja voidaan altistaa proteotoxic stressiä, joka myöhemmin indusoi solukuoleman.

HT29-solut transfektoitiin siRNA: lla ja

Rab1A

tai sekoituskoodin ohjaus. Proteiini tunnistus Rab1A pudotus soluissa suoritettiin määrällistä proteomiikka vakaa isotooppi merkintöjä käyttäen iTRAQ. (A) voimistuvan proteiinien iTRAQ suhde ≥1.2. (B) vaimentua proteiinien iTRAQ suhde 0,8.

Rab1A-pudotus-solukuolema aiheutti esto Autophagy muttei ER-Golgin Traffic

Koska Rab1A osallistuu ER-Golgin liikenteen, me seuraavaksi tutkittava, onko keskeytys tämän liikenteen indusoi solukuolemaa. Vaikka hoito BFA, estäjä ER-Golgin liikennettä, solukuolema, morfologia kuolevat solut oli huomattavasti erilainen kuin kun Rab1A pudotus (Fig. 7A ja B). Koska BFA tunnetaan myös ER-stressi indusoija, BFA hoito ennustetaan aiheuttavan kertymiseen solun väärin laskostuneen ja denaturoitu proteiineja. Siksi tutkimme seuraavaksi induktion autophagy. Kuten odotettua, BFA indusoi LC3B-II, kun taas Rab1A knockdown ei. Rab1A pudotus lisäksi johti kertyminen p62, jotka voivat sitoutua LC3, mikä toimii selektiivinen substraatti autophagy (Fig. 7C). Kun Rab1A tukahdutettiin, mRNA taso Rab1B kasvoi kaksinkertaiseksi, kun taas sen proteiinin taso taipumus lisätä hieman (Kuva. S2A ja B). Rab1A voi siis olla ainutlaatuinen tuntematon toiminto, joka Rab1B puuttuu tai koko tasot Rab1A ja Rab1B voi vähentää kynnysarvon alapuolelle tarpeen solujen eloonjäämistä, kun Rab1A tukahdutettiin. Lisäksi, koska Hsc70 pudotus indusoi LC3B-II, joka saa LC3B tulla liittyy autophagic rakkulat, se ei vaikuttanut muodostumista autophagosomes, toisin kuin Rab1A pudotus (kuvio. 7D). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. 2B.