Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdunkaulan syövän solut osoittavat lisääntynyt vaatimus ubikitiinistä riippuvaisten proteiinien hajoaminen liittyy kohonnut metabolisen vaihtuvuus. Ubikitiini, joka on pieni, erittäin konservoitunut proteiini, joka ilmentyy kaikissa eukaryoottisoluissa, voidaan kovalenttisesti tiettyihin kohdeproteiinit merkitä ne hajoamista ubikitiinipromoottori-proteasomin järjestelmä. Aiemmat tutkimukset korostavat keskeistä roolia Ubiquitin B (UBB) ja UBB riippuvaisen proteasomaalisten proteiinin hajoamisen histonideasetylaasi estäjä (HDACi) aiheuttaman kasvaimen valikoivuus. Oletimme, että UBB on ratkaiseva rooli funktiona kohdunkaulan syövän kantasoluja. Mittasimme endogeenisen UBB tasoilla mammospheres

in vitro

reaaliaikaisella PCR ja Western blotting. Funktio UBB syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja arvioitiin jälkeen knockdovvn UBB ilmaisun pitkittynyt Trichostatin A-valittujen HeLa-soluja (HeLa /TSA) mittaamalla

in vitro

solujen proliferaatiota ja apoptoosin, invaasio, ja kemoterapia vastustuskykyä sekä mittaamalla

in vivo

kasvu käytettäessä potilaalle tehdä mallin kohdunkaulan syöpä. Olemme myös arvioinut syövän kantasolujen taajuus, tumorsphere muodostumista, ja

in vivo

kasvua ihmisen kohdunkaulansyövän ksenograftien jälkeen UBB hiljentäminen. Huomasimme, että HeLa /TSA oli resistenttejä kemoterapiaa, erittäin ilmaisi UBB geenin ja kantasolujen merkkiaineita Sox2, Oct4 ja Nanog. Nämä solut näytetään myös indusoi erilaistumista kykyjä, kuten parannettu muuttoliike /invaasio /pahanlaatuisen ominaisuudet

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi kohonnut ilmentyminen UBB on esitetty tuumorin näytteissä kemoterapiaa potilailla. Hiljentäminen UBB esti tumorsphere muodostumista, alensi ilmaus kantasolujen merkkiaineiden ja laski kohdunkaulan ksenograftin kasvua. Tuloksemme osoittavat, että UBB lisääntyi merkitsevästi pitkittynyt Trichostatin A-valittujen HeLa-soluissa ja se oli keskeinen rooli ylläpidossa kohdunkaulan syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja.

Citation: Tian Y, Ding W, Wang Y, Ji T, Sun S, Mo Q, et al. (2013) Ubiquitin B Kohdunkaulan syöpä: Kriittinen ylläpidosta Cancer Stem-Like Cell merkkiä. PLoS ONE 8 (12): e84457. doi: 10,1371 /journal.pone.0084457

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 elokuu 2013; Hyväksytty: 22 marraskuu 2013; Julkaistu: 18 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Tian et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science Foundation of China (nro 81372806, 81101962, 81101965, 81202060). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on toiseksi yleisin syöpä naisilla alle 65-vuotiailla, ja yleisin kuolinsyy gynekologisista syövistä maailmanlaajuisesti. Naisen riski sairastua kohdunkaulan syöpään 65-vuotiaita vaihtelee 0,69% kehittyneissä maissa 1,38% kehitysmaissa. Vuonna 2010 noin 75 000 uutta tapausta kohdunkaulan syöpä diagnosoitiin Kiinassa [1,2]. Tällä hetkellä noin 35% naisista diagnosoitu kohdunkaulan syöpä on uusiutuva sairaus, jossa 90% näistä löytyi 3 vuoden kuluessa hoidon aloittamisesta [3]. Koska monilääkeaineresistenssi ja myös resistenssi sädehoidon, perinteiset menetelmät eivät ole tehokkaita toistuvia tapauksia. Parannettu kohdennettu hoitojen ja Chemo /radio-herkistymistä strategiat ovat välttämättömiä vähentää kuolleisuutta tämän tuhoisan maligniteetti.

tunnistaminen syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja kiinteissä kasvaimissa avaa uusia lähestymistapoja kemoterapian; ymmärtää paremmin mekanismeista karsinogeneesin ja hoidolle resistentin ominaisuuksia syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja on tarpeen. Viime vuosina saatu todisteita on ehdottanut, että mahdolliset aloittaa kasvaimen, mukaan lukien kohdunkaulan syöpä, on melko ainutlaatuinen piirre pieni joukko kantasolujen kaltaisia ​​soluja kutsutaan ”syöpä kantasolut” (CSCS) tai ”kasvaimeen aloittamista solut”. CSCS on yksinoikeus kyky itse uudistaa siten laajentaa altaan CSCS ja sallii kasvaimen erilaistua heterogeeninen ei-tuumorigeeniset syöpä [4]. CSCS hypoteesi on jännittävä kliininen merkitys kohdunkaulan syövän: se selittäisi hoidon epäonnistumisen ja sairauden uusiutumisen seurauksena vastus CSCS kuolemaan ärsykkeisiin. Itse asiassa, säilyttämällä biologinen tunnusmerkkejä kudoksen kantasolujen, kuten liikkumattomuus, itsestään uudistuminen ja monilääkeresistenssi, CSCS muodostavat luontaisen tulenkestävän kasvainsolujen populaation, joka on resistentti hoitoja on kehitetty poistamaan nopeasti jakautuvia soluja. Siksi tunnistamiseen ja CSCS ovat välttämättömiä ennustetta ja kohdunkaulan syöpä [5].

Aikaisemmassa tutkimuksessa, suoritimme SMART tunnistaa keskeiset geenien vastuussa kasvaimen selektiivisen toiminnan Trichostatin A ( TSA), joka on yksi laajimmin tutkituista HDACis. Havaitsimme Ubiquitin B (UBB), joka voi kovalenttisesti tietyille keskeisille proteiineja merkinnällä niitä hajoamista ubikitiinipromoottori-proteasomin järjestelmä (UPS), välittäjänä syöpäsolun indusoiman apoptoosin TSA. Menetys UBB geenien toiminnan siirrettävä vahvin vastustuskyky TSA hoitoon [6].

Ensimmäinen havainto tässä tutkimuksessa oli, että solut, jotka selvisivät TSA seulonta on joitakin ominaisuuksia CSCS. Vahvista ominaisuudet näiden syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, me eristetty pallo muodostavien solujen (SFC) seulomalla kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Luonnehdinta nämä SFC määriteltiin CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten korkeammat tuumorigeenisuus kuin vanhempien HeLa-soluissa; kohonnut ilmentyminen Sox2, Oct4 ja Nanog; ja monilääkeresistenssin. Ilmentyminen UBB näissä kantasolujen kaltaisia ​​soluja tutkittiin lisätutkimuksia. Huomasimme, että ylläpito syövän kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia korreloi UBB ilme, ja hiljentäminen UBB ilmaisun voisi kääntää syöpä kantasolujen ominaisuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaksikymmentäkaksi potilaalla diagnosoitiin kohdunkaulan okasolusyöpä ja tehtiin ensisijainen leikkaus suoraan tai käsitelty säännöllisesti Cisplatin kemoterapian valittiin osallistumaan tähän tutkimukseen ja kaikki potilaat kunhan kirjallinen lupa. Leikkauksen kudosnäytteiden keräsi Kliininen patologia, Tongji sairaala, Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia (HUST). Tiedot histopatologisten diagnoosi tarkasteli vähintään kaksi asiantuntijaa gynekologiset patologian. Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt eettinen komitea Tongji Hospital, Tongji Medical College, HUST.

Vieraslajisiirteen kasvain tutkimus

Nämä kokeet suoritettiin käyttäen 6- 8-viikkoisen naaras-liikalihava diabeetikon /sekamuotoinen immuunivajavaisissa (NOD /SCID) hiiriä ostettiin HFK (Peking) ja majoitettu klo Experimental Animal Center, Tongji Medical College, HUST. Hiiret valittiin satunnaisesti kussakin ryhmässä; yhteensä kuusi hiirtä ryhmää kohti käytettiin ja sijoitettu kolme häkkiä kohden. HeLa ja HeLa /TSA-solut trypsinoitiin, laskettiin ja suspendoitiin uudelleen 100 pl: aan Dulbeccon PBS: ää, ja sitten ruiskutettiin ihonalaisesti. Kasvunopeudet Ksenograftien mitattiin kolmen päivän välein, ja tilavuus laskettiin käyttäen, jolla on kaava: P × L

2 x 0,5. Valokuvat ksenograftien jälkeen otettiin hiirille annettiin tappava yliannos natriumpentobarbitaalia anestesian. Kaikki koemenettelyn hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitealle HUST, ja tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti ARRIVE (Animal Research: ilmoittaminen

In vivo

Kokeet) suuntaviivat [7] {Kilkenny 2012 # 29}.

Soluviljely ja transfektio

HeLa-solut hankittiin ATCC ja ylläpidetään meidän lab. HeLa /TSA-solut määritettiin käsittelemällä HeLa-solujen kanssa 1 uM Trichostatin A (TSA, sigma) 24 tuntia ja sitten ylläpitämällä soluja 200 nM TSA toisen 7-10 päivää. Elossa Solujen annettiin toipua vielä 4-7 päivää. Sitten ne otettiin talteen ja sen annettiin lisääntyä.

siRNA: iden (Invitrogen) transfektoitiin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. ShRNA lentivirus käytettiin infektoimaan soluja seuraten valmistajan protokollaa.

UV-altistuksen solujen

UV-säteilyllä, solut ympättiin tiheydellä 2 x 10

5 /ml ja kasvatettiin, kunnes kiinnitys saavutettiin ja jopa yksikerroksista muodostettiin. Sitten solut pestiin kahdesti esilämmitetyllä PBS: llä ja altistettiin UV-, kun PBS: ssä. UV-valoa, muodostettiin 15-W UVB lamppu (UVP), joka säteilee suurin osa energiasta sisällä UVB alueella 280-370 nm, jossa päästöjen huippu 310 nm. Intensiteetti UVB oli standardoinut UVB mittari ja asetettu 200J /m

2. Säteilytyksen jälkeen, lisättiin tuoretta väliainetta.

Transwell migraatiokokeessa

HeLa- ja HeLa /TSA-solut ympättiin transwell kammioon 48 tuntia. Solut, jotka vaelsivat kalvon läpi kiinnitettiin ja värjättiin 0,1% kristalliviolettia ja tutkittiin sitten valomikroskoopilla.

tunnistaminen SP solujen

HeLa- ja HeLa /TSA solut trypsinoitiin ja inkuboitiin 5 ug /ml Hoechst 33342 väriaineet (Roche), 37 ° C: ssa 90 min; reaktio lopetettiin inkuboimalla jäävedessä 10 minuutin ajan. Värjätyn solun Näytteet analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (BD) käyttäen 355 nm: n UV-eksitaatio; fluoresenssiemissio- kerättiin käyttämällä 450 nm kaistanpäästösuotimen Hoechstin sininen ja 670 nm kaistanpäästösuotimen Hoechstin punainen. Tietojen hankinta ja analysointi suoritettiin CellQuest Pro -ohjelmisto (BD).

Pesäkkeenmuodostusta, mammosphere muodostumista ja rajoittavan laimennuksen määritykset

HeLa- ja HeLa /TSA solut laskettiin ja maljattiin samaan tiheyteen osaksi 6-kuoppaiselle levylle 7 päivää. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan. Sitten solut pestiin tislatussa vedessä 5 minuutin ajan kaksi kertaa ja inkuboitiin 0,1% kristalliviolettia värjäys liuoksessa 10 minuuttia. Lopuksi solut pestiin tislatussa vedessä 5 minuutin ajan kaksi kertaa tai kunnes ylimääräinen väriaine poistettiin täysin.

Mammosphere muodostumista ja rajoittavan laimennoksen analyysit suoritettiin, kuten on kuvattu aiemmin Calcagno AM [8]. Yleisesti, olemme suoritetaan näissä kokeissa HeLa ja HeLa /TSA-soluja voidaan arvioida mammosphere muodostumista ultra-low kiinnitys viljelykuoppiin (Costar) seerumittomassa DMEM /F12-väliaineessa, johon on lisätty rekombinantti ihmisen epidermaalinen kasvutekijä (EGF, 10 ng /ml, Peprotech); rekombinantti ihmisen fibroblasti-kasvutekijä-basic (bFGF, 10 ng /ml, Peprotech); insuliinia (50 ug /ml, Sigma); B27 (100 yksikköä /ml, Invitrogen), penisilliiniä (100 yksikköä /ml, Invitrogen) ja streptomysiiniä (100 ug /ml, Invitrogen). Mammospheres tunnistettiin, kuten on kuvattu [9] 3 päivän välein mukaan pesäkkeen leviämisen hinnat. Rajalaimennusmenetelmällä määritys suoritettiin maljaamalla eri määriä soluja (500 solua vain yhden solun) kuoppaa kohti kolmeen 96-ultra-low kiinnityslevyt. Sferoidit laskettiin 14 vuorokautta tai vanhempia, riippuen kasvuvauhdin palloset. Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja lasketaan keskiarvot on esitetty.

RNA: n eristämistä, käänteistranskriptio ja kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Qiagen RNeasy Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitointi määritettiin käyttäen NanoDrop mikro-tilavuus spektrofotometrillä (Thermo Fisher), ja mRNA: n eheys varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Käänteinen transkriptio-polymeraasi ketjureaktio (RT-PCR) Sen jälkeen suoritettiin käyttäen 2 ug kokonais-RNA: ta. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin CFX96 Touch

TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) käyttäen seuraavaa lämpösyklilaitteesta ohjelma kaikille geenit: 5 min esi-inkuboitu 95 ° C: ssa seurasi 40 sykliä 15 s 95 ° C: ssa, 15 s 60 ° C: ssa, ja 30 s 72 ° C: ssa. Alukkeet kaikki kohdegeenien ja viite-geeni on lueteltu taulukossa S1. Tiedonkeruu, mukaan lukien kertainen muutos geenien ilmentyminen, määritettiin sama määrä kokonais-RNA.

Western blotting -analyysi

Yhteensä solun proteiinit uutettiin ja erotettiin 10% SDS-PAGE, siirrettiin PVDF-polyvinylideenidifluoridi (PVDF), (350 mA 1 h), ja tutkittiin vasta-aineiden UBB, UbC, UbA52, UbA80, pSTAT3, vimentiinistä, Pakt ja β-aktiini (ProteinTech Group), MDR-1 ja Oct4 (Santa Cruz), Sox2 ja Nanog (Millipore). Proteiinit saatiin näkyviin käyttämällä piparjuuren peroksidaasiin konjugoidulla johdetun vasta-aineiden SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Pierce) ja valokuvattiin ChemiDoc ™ XRS + System Image Lab ™ Software (Bio-Rad).

Immunofluoresenssikoe of mammospheres

Mammospheres kerättiin noin 14 vrk kuluttua, riippuen koosta ja kasvu, ja sitten pestiin PBS: llä kaksi kertaa ja sentrifugoitiin 300 g. Mammospheres suspendoitiin uudelleen kanssa Optimaalinen leikkaus lämpötila yhdistettä (O.C.T., Sakura) ja laitetaan nestetypessä. Jäädytetyt sferoidit Sitten leikataan 5-pm paksu osissa. Immunofluoresenssimenetelmällä näistä jääleikkeitä suoritettiin ensisijaisen vasta-aineen valmistajan protokollaa. Fluoresenssikuvantamiseen suoritettiin käyttäen konfokaalista laserskannaus mikroskoopilla.

Virtaussytometria

HeLa- ja HeLa /TSA-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 1 gM TSA, 30 uM DDP (Sigma, P4393), tai 75 nM Paclitaxol tai säteilytettiin UVB. Sitten solut trypsinoitiin ja inkuboitiin anneksiini V-FITC: llä ja PI mukaan valmistajan protokollaa. Apoptoosi prosenttiosuus määritettiin käyttäen BD FACSCalibur virtaussytometriä ja CellQuest Pro -ohjelmaa (BD).

tilastolliset menetelmät

Tilastollinen merkittävyys määritettiin parittomia Studentin t-testiä käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston (versio 5.01) lukuun ottamatta vertailun UBB ilmentymisen kliinisissä kohdunkaulan syövän kudosnäytteitä, jotka analysoitiin kautta kaksisuuntainen ANOVA-testi. Merkitys kaikissa testeissä asetettiin

p

0,05.

Tulokset

Pitkittynyt HDACi-valittu HeLa /TSA-solut olivat resistenttejä kemoterapiaa

Incubation HeLa-solujen kanssa, TSA (500 nM) eri ajankohtina (6, 12, 18 ja 24 tuntia), indusoi ajasta riippuva nousu UBB mRNA ja Ubiquitin proteiinin tasot (kuvio 1A), kun taas ilmaisuja kolmen muun ubiquitin- koodaus geenit (UbA52, UbA80 ja UbC) ei ollut vaikutusta. Vastaavasti, inkubaatio eri pitoisuuksilla (200, 400, 600 ja 800 nM) TSA 24 tunnin ajan johti myös kasvua UBB geenin ilmentymisen, kun taas mitään muutosta ilmauksia muut kolme ubikitiini-koodaavat geenit havaittu. TSA antoa, tietyllä pitoisuusalueella, 24 tunnin ajan johti tiettyyn konsentraatiosta riippuvaisen stimulaation UBB mRNA ja proteiinin ilmentyminen (kuvio 1 B).

A, HeLa-soluja käsiteltiin 500 nM TSA varten osoitettu ajat ja joutuvat analyysiin mRNA taso UBB, UBC, UbA52 ja UbA80 reaaliaikaisella PCR ja vastaavan proteiinin tason western blottauksella. B, HeLa-solut inkuboitiin TSA 24 tunnin ajan annoksena 200-800 nM ja alistettiin analyysiin mRNA tasolla UBB, UbC, UbA52 ja UbA80 reaaliaikaisella PCR: llä ja vastaavan proteiinin tason western-blottauksella. C, Ylähavas: edustaja ruokia pesäkkeitä muodostavien määrityksessä vuorokautena 7, 10 ja 14. Alempi paneeli: lukumäärät siirtomaa muodostettu HeLa ja HeLa /TSA päivänä 7, 10 ja 14. Pylväät edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä kokeesta ; virhepalkkien, SD; *,

p

0,05. D, HeLa /TSA-soluja käsiteltiin TSA (1 uM), DDP (30 uM), ja PTX (75 nM) 48 h tai UV, apoptoosin solut kvantitoitiin anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaussytometria-analyysi. Edustaja esimerkkejä virtaussytometrialla Tulokset on esitetty. E, Soluja käsiteltiin kuten on kuvattu D, prosenttiosuudet apoptoosin soluja raportoitu kuvaajia. Arvot, keskiarvo prosenttiosuudet; virhepalkkien, SD; *,

p

0,05 (n = 3 toistot).

asti suurin HeLa-solujen tehtiin apoptoosia käsittelyn jälkeen TSA (1 uM 24 tuntia ja pidettiin 200 nM 7-10 päivää), elossa solut (HeLa /TSA) ympättiin muodostamiseksi klooneja. Sen jälkeen toinen 10 14 päivää kasvun, kristalliviolettia värjäys osoitti, että HeLa /TSA-solut oli merkittävä proliferatiivinen kyky verrattuna vastaavaan ohjaus soluja. Määrä HeLa- /TSA pesäkkeitä oli noin 16-kertaisesti enemmän kuin valvonta 14. päivänä (

p

0,01) (kuvio 1 C).

edelleen tutkia herkkyyden HeLa /TSA solujen TSA, käsittelimme HeLa /TSA-solujen kanssa TSA ja muiden yhteisten solunsalpaajiin. Kuten esitetään FACS tulokset, HeLa /TSA-solut osoittivat merkittävä vastus ei ainoastaan ​​TSA (keskiarvo 9,48% vs. 25,53%,

p

= 0,014), mutta myös Sisplatiini (DDP) (keskiarvo 13,25% vs. 53.76%,

p

0,01), Paclitaxol (PTX) (keskiarvo 8,69% vs. 35,36%,

p

0,01), ja jopa ultraviolettivalolla (UV) (keskiarvo 15,38 % vs. 44,8%,

p

0,01) (kuvio 1 D, E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HeLa /TSA-solut voivat sisältää rikastettua solualaryhmän vastustuskykyisiä yhteisiä kemoterapeuttisten aineiden, jopa UV.

HeLa /TSA-solut osoittivat ylös-säätely UBB ilmaisun ja nousi mammosphere muodostumista

tutkimiseksi edelleen vastuksen HeLa /TSA soluja kemoterapiaa ja UV-valon liittyi ilmaisun UBB, mRNA ilmaisun HeLa /TSA-solut arvioitiin. Havaitsimme merkittävää lisäystä UBB HeLa /TSA-soluissa, kun taas mitään havaittavaa muutosta kolmen muun ubikitiinipromoottori geenien (kuvio 2A). Samoin myös havaittu merkittävää kasvua proteiinin tason UBB, eivät muut kolme ubikitiini-koodaus geenit. Lisäksi olemme myös löytäneet säätely ylöspäin pSTAT3, vimentiinistä ja MDR-1 yhdessä alas-säätely Pakt HeLa /TSA-soluissa verrattuna vanhempien HeLa-solujen (kuvio 2B). Nämä tiedot osoittivat, että HeLa /TSA-solut Chemo-resistenttejä, ja se voi olla yhteydessä korkean ilmentymisen UBB. Lisäksi suurin HeLa /TSA soluja erilaistumattomassa tilassa ja saava epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Havainnot ilmoitetaan tässä ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten, mikä osoitti, että UBB on olennainen välittäjä TSA aiheuttaman kasvaimen selektiivisen tappamisen [6].

, HeLa /TSA-solut analysoitiin UBB, UbC, UbA52 ja UbA80 mRNA-tasoja. Pylväät edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä kokeesta; virhepalkkien, SD; *,

p

0,05. B, HeLa /TSA-solut analysoitiin proteiinin tasot Ub proteiinien, pSTAT3, vimentiinin, Pakt ja MDR-1, β-aktiini käytettiin latauskontrollina. C, kvantitatiivinen analyysi leviämisen indeksi määritetään CCK-8 määritys osoitetut ajat. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo kolmen erillisen kokeen; virhepalkkien, SD. D, edustavia esimerkkejä tranwell määrityksen valokuvattiin 200 x suurennoksilla. E, Themorphologic ulkonäkö edustaja mammosphere varten osoitetut ajat oli photograghed 200 x suurennoksilla. F, sferoidi muodostumisen määritykset suoritettiin rajoittavan laimennuksen kanssa 256-solujen yksi solu kuoppaa kohti 96-Ultra-Low Tarttuva levy. Tämä koe suoritettiin kolminkertainen kertaa kuusi kuoppaa kohti hyvin laimennus. Pesäkkeiden määrä laskettiin päivänä 14. G, Mammosphere solut HeLa ja HeLa /TSA otettiin uudelleen viljeltiin tavallisessa tarttuva levy 24 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin TSA, DDP, ja PTX 48 tuntia tai UV: ssa 5 min. Apoptoosin solut kvantitoitiin käyttäen anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaussytometria-analyysi. Arvot ovat keskiarvo ja SD (virhepalkkeja) 3 eri kokeesta, *,

p

0,05. H, HeLa /TSA mammosphere solut analysoitiin UBB, UbC, UbA52 ja UbA80 mRNA-tasoja. GAPDH käytettiin referenssinä ohjaimella.

tutki vielä biologisia ominaisuuksia HeLa /TSA soluja ja totesi, että leviämisen HeLa /TSA-soluissa oli merkittävästi suurempi kuin HeLa kontrolli-soluissa, erityisesti pitkissä -term kulttuuri (kuvio 2C). Lisäksi nopeus maahanmuuton HeLa /TSA-soluissa oli merkittävästi lisääntynyt TranswellTM Migration Assay (kuvio 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, HeLa /TSA-solut osoittivat korkean pahanlaatuinen potentiaalia.

Aikaisemmin raportoitu tutkimukset ovat osoittaneet, että pitkäaikainen jatkuva valinnan solujen lääkeresistenssin rikastaa solupopulaatioiden syöpään kantasolujen kaltaisia ​​solujen ominaisuudet [8]. Tiedot ilmoitetaan edellä osoittaneet, että HeLa /TSA solut osoittivat korkean pahanlaatuinen potentiaalia, mikä on saattanut kehittyivät selektiivisen paineen kemoterapiaa. Suoritimme kokeita testata HeLa /TSA-soluja rikastettu syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja. HeLa /TSA-soluja viljeltiin tarttumattoman tilan muodostamiseksi mammospheres. Huomasimme, että HeLa /TSA-soluissa oli merkittävästi suurempi mammosphere muodostumista potentiaalia. Hela /TSA mammospheres olivat suurempia ja kasvoi nopeammin kuin HeLa mammospheres, jotka olivat pieniä soluklusterit että kiinni astian ja oli vaikea pisteet rajoittavan laimennuksen määrityksen (kuvio 2E). Vaikka HeLa-solut oli taipumus muodostaa mammospheres, he eivät voineet olla maalinteossa, kun kylvö on vähemmän kuin kahdeksan solua, kun taas vain yksi HeLa /TSA solu oli todennäköisyys 66,7% muodostaen mammosphere (kuvio 2F). Sen varmistamiseksi, palloset olivat identtisiä toisissaan kiinni viljeltyjen solujen me trypsinoitiin pallosia ja viljeltiin uudelleen ne tarttuva tilassa; Näiden uudelleen kiinnittyvä HeLa /TSA-solut olivat edelleen resistenttejä TSA, DDP, PTX ja UV, toisin kuin tulokset uudelleen kiinnittyvä HeLa-solut, jotka eivät olleet resistenttejä (kuvio 2G). Lisäksi UBB geenien ilmentyminen HeLa /TSA mammospheres oli edelleen huomattavasti suurempi kuin kontrolliryhmässä HeLa mammosphere soluja (kuvio 2 H).

Edellä olevat tiedot osoittivat, että HeLa /TSA-solut osoittivat ylös-säätely UBB, pSTAT3 , vimentiinistä, kun taas Pakt oli alassäädetty. Lisäksi nämä solut olivat erilaistumattomia ja tilassa quiescence ja niillä on suurempi mammosphere muodostava kyky tarttumattoman tilannetta. Nämä ominaisuudet korosti, että HeLa /TSA-solut voivat sisältää syöpää kantasolujen kaltaisia ​​soluja, ja tämä ilmiö voisi liittyä säätely ylöspäin UBB.

HeLa /TSA-solut ovat syöpä varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia

edelleen tutkia HeLa /TSA-solut rikastettiin syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, suoritimme real-time PCR havaita geenin ilmentymistä kantasolujen biomarkkereita. Huomasimme, että Sox2, Oct4, ja Nanog olivat huomattavasti säädellään ylöspäin HeLa /TSA-soluissa verrattuna HeLa mammospheres (kuvio 3A). Western blotting vahvisti, että HeLa /TSA mammospheres erittäin ilmaisi kantasolujen biomarkkereita. Lisäksi löysimme myös MDR-1 ja UBB olivat korkealla ilmaistaan ​​HeLa /TSA-solut (kuvio 3B). Vastaavasti, immunofluoresenssimäärityksellä tulokset osoittivat, että lähes kaikki HeLa /TSA-solut hallussaan ensisijainen ominaisuudet kantasolujen kaltaisia ​​soluja, nimittäin ne, jotka oli kantasolujen biomarkkerit (kuvio 3C).

A, HeLa /TSA mammosphere solut analysoitiin Sox2, Oct4 ja Nanog mRNA-tasoja. Pylväät edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä kokeesta; virhepalkkien, SD. B, kvantitatiivinen analyysi Sox2, Oct4, Nanog, MDR-1 ja UBB proteiinin tasot Western-blottauksella. C, HeLa /TSA mammosphere solut analysoitiin immunofluoresenssilla varten Sox2, Oct4 ja Nanog. Edustaja valokuvat otettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (alkuperäinen suurennos, x 200). Ytimet esitettiin havaittiin käyttämällä

DAPI

(4 ’, 6-diamino-2-fenyyli) värjäys. D, analyysi sivu- väestön solufraktio HeLa ja HeLa /TSA soluviljelmissä. Vasen paneeli: HeLa; oikea paneeli: HeLa /TSA. E, analyysi CD44 ja CD24 ekspressio HeLa- ja HeLa /TSA-soluissa. Vasen paneeli: HeLa; oikea paneeli: HeLa /TSA.

On raportoitu, että ABC transporter välittämää ulosvirtaus palveluksessa Hoechst 33342 väriaine eristää väriaineen ilman puolella populaatiot (SP) on rikastunut solujen syöpä varsi kaltainen ominaisuuksia erilaisissa kasvaimissa [10]. Käyttämällä ero Hoechst 33342 värjäytyminen tunnistaa SP vuonna kiinnittyneet solut, havaitsimme merkittävää lisäystä SP-positiivisten solujen HeLa /TSA-soluissa verrattuna vanhempien HeLa-solujen (keskiarvo 8,3% vs. 0,8%,

p

0,01, pariksi opiskelijan t-testi) (kuvio 3D). Aiemmat tutkimukset osoittivat, että rintojen CSCS peräisin mammosphere soluista osoittivat pinta merkkiaineiden CD44

+ CD24

– [9,11]. Koska HeLa /TSA näytteillä korkea muodostumista nopeudella pallosia, tutkimme CD44 ja CD24 ekspressio HeLa /TSA-soluissa. Tulokset osoittivat, että 52,4% HeLa /TSA oli CD44

+ CD24

-, joka oli samanlainen kuin edellinen raportoitu rintasyövän CSCS (kuvio 3E).

Nämä tiedot osoittivat, että pitkäaikainen huumeiden valinta HeLa /TSA-soluissa indusoi suuren ilmaus kantasolujen biomarkkereita ja rikastuminen CD44

+ CD24

– soluja. Näin ollen, HeLa /TSA-solut voidaan rikastaa solujen, joilla on syöpä varsi-kaltaisia ​​ominaisuuksia.

UBB siRNA voi alas-säädellä SP ja pallomainen muodostumista

Resistance syövän kantasoluja kemoterapeuttisten on aikaisemmin kuvattu eri kasvaintyypeissä, mukaan lukien munasarjasyöpä [10]. Vahvistamaan, että pahanlaatuinen fenotyyppi ja korkea SP solujen suhde HeLa /TSA-solut liittyvät korkean ilmentymisen UBB geenin, käytimme siRNA on pudotus UBB soluissa. Transfektion jälkeen HeLa-solujen kanssa 3 eri siRNA: t, jotka kohdistuvat CDS on UBB geenin, valitsimme käyttää UbBsi2, koska se osoitti 77% pudotus on UBB geenin mukainen reaaliaikainen PCR-ja Western blotting tulokset (kuvio 4A, B) . Tehokkaasti transfektoimiseksi siRNA: t otetaan palloset, otimme käyttöön UbBsi2 osaksi lentiviruksesta vektoriin (LV-UbBsi). Jälkeen knockdovvn UBB geenin sekä HeLa ja HeLa /TSA pallosia käyttäen LV-UbBsi (kuvio 4C), real-time PCR tulokset osoittivat, että vaikka UBB geenin ilmentyminen HeLa /TSA-LV-UbBsi pallosia oli edelleen huomattavasti suurempi kuin HeLa-LV-UbBsi pallosia (

p

0,01) (kuvio 4D), ero näiden ryhmien välillä oli vain 1,74-kertainen, mikä on paljon pienempi kuin 9,25-kertainen ero ei-vaimennettu HeLa /TSA ja ohjaus HeLa pallosia (kuvio 2 H). Samalla ilmentymisen Sox2, Oct4 ja Nanog HeLa /TSA-solujen väheni merkittävästi, kun LV-UbBsi infektion (kuvio 4E, F), ja SP

+ -suhde HeLa /TSA-LV-UbBsi soluissa oli merkittävästi vähentynyt 2,58% 1,25% (

p

0,01) (kuvio 4G). Sen jälkeen uudelleen viljellään UBB-hiljainen rakeita jousitus, havaitsimme, että määrä pallosia muodostettu HeLa /TSA-LV-UbBsi solujen aleni keskimäärin 49-32 (

p

= 0,04) ( Kuva 4H). Nämä tulokset osoittivat, että hiljentäminen UBB vähenevät selvästi kasvaimeen varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia HeLa /TSA-soluissa viittaa siihen, että syöpä varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia HeLa /TSA-solut voivat liittyä korkean ilmentymisen UBB.

, HeLa -solut transfektoitiin 10 nM UBB kohdistaminen siRNA, tai stealth RNAi-ohjaus, 72 tunnin ajan. Reaaliaikainen PCR-analyysi suhteellisen UBB mRNA: n ilmentymisen annettiin edetä. GAPDH: ta käytettiin viite-ohjaus. B, kvantitatiivinen analyysi UBB proteiinin tason western blottauksella. Solut käsiteltiin, kuten on kuvattu julkaisussa A. Beta-aktiini käytettiin viite-ohjaus. C, HeLa ja HeLa /TSA mammosphere solut infektoitiin LV-UbBsi, joka kloonattiin UbBsi2, 72 tunnin ajan ja altistettiin analyysi western-blottauksella ja UBB proteiinin tasolla. D, LV-UbBsi-tartunnan mammosphere solut analysoitiin UBB, UbC, UbA52 ja UbA80 mRNA-tasoja. GAPDH: ta käytettiin viite-ohjaus. Pylväät edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä kokeesta; virhepalkkien, SD. E, LV-UbBsi-tartunnan HeLa /TSA mammosphere soluja analysoitiin Sox2, Oct4 ja Nanog mRNA-tasoja. GAPDH: ta käytettiin viite-ohjaus. Pylväät edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä kokeesta; virhepalkkien, SD. F. LV-UbBsi-tartunnan HeLa /TSA mammosphere soluja analysoitiin Sox2, Oct4 ja Nanog proteiinin tasot. Beeta-aktiini käytettiin viite-ohjaus. G, analyysi sivu- väestön solufraktio LV-UbBsi-tartunnan HeLa ja HeLa /TSA soluviljelmissä. H, Rakeiden muodostuminen määritykset suoritettiin LV-UbBsi-infektoiduissa soluissa.

Vähemmän HeLa /TSA-solut voisivat muodostaa ksenografteissa

in vivo

edelleen vahvistaa varsi kaltainen potentiaalin HeLa /TSA-solut, suoritimme

in vivo

kokeissa ihon alle ruiskuttamalla 100-5000 solujen NOD /SCID-hiiriin. Emme havainneet mitään eroa aiheuttavan kasvaimia välillä HeLa /TSA ja HeLa-solut pistettäessä yli 1000 soluja (kuvio 5A, B). Kuitenkin, kun vähemmän kuin 500-solut istutettiin, HeLa /TSA-solut osoittivat potentiaalisesti tuumorigeenisemmiksi tilassa (kuvio 5C, D). Lisäksi erot keskimääräinen kasvaimen kasvua, HeLa /TSA-soluja aloitettu kasvaimia useammin (6/6 injektiota) kuin vanhempi HeLa (3/6 injektiot) solut (

p

= 0,04) vasteena injektion 500-soluja (taulukko 1). Lisäksi HeLa /TSA soluja aloitettu kasvaimia 6/6 injektiot, kun taas HeLa-solut eivät aloittaneet kasvaimet (0/6 injektioista) 100 solua istutettiin. Suurempi kyky tuumorikasvulle

in vivo

oli yhdenmukainen pahanlaatuista kasvua kiinnittynyt soluviljelmässä. Sen jälkeen pudotus on UBB LV-UbBsi, vaikka HeLa /TSA-LV-UbBsi voisivat muodostaa ksenografteissa samalla taajuudella kuin HeLa /TSA-LV-con, kun ruiskutettiin 500 infektoituja soluja (kuvio 5E), koko ja paino -ksenografteja vähensi merkitsevästi (kuvio 5F, G, H). Nämä tulokset vahvistivat, että HeLa /TSA-solut osoittivat korkean Tuumorigeenisuustutkimuksissa että voitaisiin vähentää hiljentäminen UBB.

HeLa- ja HeLa /TSA solua injektoitiin ihonalaisesti NOD /SCID neljällä eri solujen tiheydet. A-E, Kasvaimen tilavuus on piirretty ajan funktiona. A, 5000 solua; B, 1000 solua; C, 500 solua; D, 100 solua; E, 500 LV-con tai LV-UbBsi-tartunnan HeLa /TSA-soluissa. F, valokuvat ihon alle muodostunut LV-con tai LV-UbBsi-tartunnan HeLa /TSA kasvaimet näkyvät. G, Tuumorin koko pieneni suhteen UBB estävää LV-UbBsi infektion HeLa /TSA-ksenografteissa. Vaakasuorat viivat edustavat keskikoko; virhepalkin, SD;

p

= 0,001, kaksisuuntainen ANOVA testi; 6 hiirtä /ryhmä. H, Kasvain painot ksenograftien kuvattu G. vaakasuorat viivat edustavat keskipaino; virhepalkin, SD;

p

0,001, kaksisuuntainen ANOVA testi; 6 hiirtä /ryhmä.

Cell line

No. Ruiskutettujen solujen

No. Kasvainten /Ei. Hiirten

Maximum kasvaimen tilavuus (mm

3) B Suurin kasvaimen paino (g) B-Day kasvaimen harvest

HeLa50006/66750.485110005/66280.41545004/66680.46571000/6☆0☆HeLa/TSA50006/68520.595110006/65730.39545006/68100.53571006/65700.3960Table