Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on aggressiivinen, nopea kasvu ja usein luun etäpesäke; kuitenkin, sen yksityiskohtainen molekyylimekanismin edelleen huonosti. Täällä raportoimme kriittinen rooli varhaisen kasvutekijän 4 (EGR4), DNA-sitovan, sinkki sormen transkriptiotekijä, soluproliferaatioon SCLC. EGR4 yliekspressio HEK293T-soluissa siirrettävä merkittävää voimistumista erityisiä silmukointivariantit ja lisäkilpirauhashormonin kaltainen proteiini (

PTHrP

) geenin, jolloin parantaminen eritystä PTHrP-proteiinin, joka on tunnettu välittäjänä osteolyyttiset etäpesäke. Vielä tärkeämpää on, ehtyminen

EGR4

ilmentymisen siRNA merkittävästi tukahdutti kasvun SCLC solulinjojen, SBC-5, SBC-3 ja NCI-H1048. Toisaalta, käyttöönotto

EGR4

osaksi NIH3T3-solut huomattavasti korkeampia solujen kasvua. Havaitsimme neljä

EGR4

kohdegeenien,

SAMD5

,

RAB15

,

SYNPO

ja

DLX5

, jotka olivat merkittävästi vaimentua geenit kun ehtyminen

EGR4

ilmentymistä kaikissa SCLC-solujen tutkitaan, ja osoittivat suoraa rekrytointia EGR4 niiden promoottorien Chip ja lusiferaasireportterilla analyysi. Erityisesti, pudotus ja näiden geenien ilmentymistä siRNA merkittävästi tukahdutti kasvua kaikkien SCLC-soluja. Yhdessä havaintomme viittaavat siihen, että EGR4 todennäköisesti säätelee luumetastaasipotilailla leviämisen SCLC-solujen kautta transkription säätelyyn useiden kohdegeenien, ja voi siis olla lupaava kohde kehittämiseen syöpälääkkeiden varten SCLC potilaille.

Johdanto-osan : Matsuo T, Dat LT, Komatsu M, Yoshimaru T, Daizumoto K, Sone S, et ai. (2014) Early Growth Response 4 osallistuu Cell leviämisen pienisoluinen keuhkosyöpä kautta transkription aktivaatio Sen Downstream Genes. PLoS ONE 9 (11): e113606. doi: 10,1371 /journal.pone.0113606

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 elokuu 2014; Hyväksytty: 27 lokakuu 2014; Julkaistu: 20 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Matsuo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tulevien huippututkimuksen yliopistosta Tokushima. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syövistä, ja sen ilmaantuvuus kasvaa maailmanlaajuisesti [1]. Korkea kuolleisuus ja huonon ennusteen keuhkosyöpään johtuvat vaikeuksista varhaisen diagnoosin ja sen korkea metastaattinen potentiaali. Keuhkosyöpä on luokiteltu kahteen päätyyppiin, pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joiden osuus on noin 25% ja 75%: ssa tapauksista, vastaavasti. SCLC esittelee aggressiivinen kliininen käyttäytyminen ominaista nopea kasvu ja usein etäpesäkkeitä aivoihin, keuhkoihin, maksaan ja luuhun [2]. Erityisesti luumetastaasin aiheuttaa vakavia komplikaatioita SCLC ja voi johtaa luun kipua, patologiset murtumat, hyperkalsemia, selkäydinkompressio ja muut hermopuristuksesta oireyhtymien [3], [4], ja se liittyy usein korkea sairastuvuus ja huonon ennusteen. Nykyiset hoidot ovat yleensä lievittävä. Siksi on erittäin tärkeää estää ja hoitaa osteolyyttiset etäpesäkkeet.

Bone etäpesäke on yleisesti luokiteltu osteolyyttisiä, mikä johtaa luun tuhoutumista; osteoblastien, mikä johtaa uuden luun muodostumista; tai sekoitettuna perustuu ensisijaisesti mekanismi puuttumista normaaliin luun. Tasapainoinen aktiivisuus osteolyyttisiä ja osteoblastic tekijät sen ajatellaan säätelevän luumetastaasipotilailla [4], [5]. Viime aikoina useat molekyylit on raportoitu tärkeitä rooleja niin osteoblastic tekijöitä osteoformation [4] – [6]. Kuitenkin hienomekanismin vastuussa kasvaimen kasvua luita pysyvät tutkimaton.

Kattavat transkriptomiikka antaa tarkkaa karakterisointia yksittäisten syöpiä, joiden pitäisi auttaa parantamaan kliinistä strategioita kasvainsairaudet kehittämällä uusia lääkkeitä. Näin ollen ”omiikka” teknologia lähestymistavat ovat tehokkaita kohderyhmien tunnistamiseen molekyylien mukana karsinogeenisia ja metastaattisen polkuja, mukaan lukien luun etäpesäke. Tätä varten genomin laajuinen transkriptomiikka ihmisen SCLC mukana elimessä-etuoikeutetut etäpesäke hiirillä analysoitiin, ja useat geenit mahdollisesti mukana luumetastaasipotilailla todettiin [7]. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet varhaisen kasvureaktio 4 (

EGR4

), joka on merkittävästi yliaktiivista luun etäpesäkkeitä verrattuna muihin elimen etäpesäkkeitä (keuhko-, munuais- ja maksa) johdettu ihmisen SCLC-solujen [7].

EGR4

geeni kuuluu varhaisen kasvureaktio perheen välittömän varhaisen geenejä, jotka koodaavat neljä DNA-sitovan, sinkki-sormen transkriptiotekijöiden (

EGR1

osoitteeseen

EGR4

) [8]. Tämä geeni (

pAT133

,

NGFI-C

) oli ensimmäinen tunnistettu sinkki sormen proteiini välittömästi aiheuttama mitogeenisesta stimulaatiosta T-lymfosyyteissä ja fibroblastit [9], [10]. On raportoitu, että

EGR4

-null hiirillä on miesten hedelmättömyys takia pidätetty spermatogeneesin mutta ei naisten hedelmättömyys havaita [11], [12], mikä viittaa siihen, että EGR4 on ratkaiseva merkitys joidenkin ihmisen idiopaattisen miespuolinen hedelmättömyys. Lisäksi EGR4 tiedetään olevan hermostoputken ekspressio kuvio rotilla [13] ja säädellä aivoperäinen neurotrofinen tekijä (BDNF) -välitteisen neuronispesifiset kaliumkloridia kotransportteri 2 (KCC2) transkription kautta ERK1 /2 signalointireitin epäkypsissä neuronien [14]. Kuitenkin patofysiologisia roolia EGR4 in syövän syntymistä SCLC, ei ole selvitetty. Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että EGR4 toimii transkriptioaktivaattorina säätelemällä erityisiä alavirran geenien SCLC-solujen lisääntymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Ihmisen SCLC solulinjat SBC-3 ja SBC-5 oli ystävällisesti Drs. M. Tanimoto ja K. Kiura Okayama University [15]. NSCLC solulinja PC14PE6 luovutti ystävällisesti Dr. I. J. Fidler M. D. Anderson Cancer Center [16]. Ihmisen SCLC solulinjaa NCI-H1048 ja ihmisen NSCLC solulinjat A549 ja NCI-H1048 ostettiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Ihmisen ACC-LC319 /bone2 solulinja perustettiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. MC3T3-E1 hiiren osteoblastic jatkokloonin 4 noomasolulinjasta toimittanut Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokio, Japani). Ihmisen pienet hengitysteiden epiteelisolujen linja (SAEC) ostettiin Lonza (Walkersville, MD, USA). Kaikki solut viljeltiin sopivissa olosuhteissa.

Plasmidi rakentaa

koko koodaava sekvenssi ihmisen

EGR4

(NM_001965), monistettiin PCR: llä käyttäen KOD plus-DNA-polymeraasia (Toyobo, Osaka, Japani). PCR-tuote insertoitiin

Eco

RI ja

Xho

I-kohtiin pCAGGSn3FH vektori, joka sisältää N-terminaalisen FLAG-tag. Sillä lusiferaasireportteri plasmidit, DNA-osia 5′-reunustavat alueet on

FTHrP-V3

ja

V4

(NM_198964.1 ja NM_198966.1, vastaavasti),

SAMD5

(NM_001030060.2),

RAB15

(NM_198686.2),

SYNPO

(NM_007286.5) ja

DLX5

(NM_005221.5), johon sisältyy mahdollisia EGR sitoutumiskohtia ennustaa Matlnspector-ohjelman (Genomatix, https://www.genomatix.de/matinspector.html), monistettiin PCR: llä ja insertoidaan sopivaan restriktioentsyymikohtiin pGL3-tehostaja-vektoriin (Promega, Madison, WI , USA). PCR-alukesarjat Tässä tutkimuksessa käytetty on esitetty taulukossa S1. DNA-sekvenssit kaikki konstruktit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla (ABI 3500xL sekvensseri, Life Technologies, Foster City, CA, USA).

RNA käänteistranskriptio, semi-kvantitatiivinen PCR ja reaaliaikaisella PCR: llä

Yhteensä RNA, käänteistranskriptiotuotteiden, semikvantitatiivinen RT-PCR ja Reaaliaikainen PCR-kokeet suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Ilmentymistasojen kussakin näytteessä normalisoitiin

β

aktiini-mRNA: n sisältöä. Sekvenssit kutakin aluketta set on esitetty taulukossa S2.

Western blot-analyysi

Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. SDS-PAGE, kalvot blotattiin proteiineja inkuboitiin anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, F3165) tai anti-β-aktiini (AC-15, Sigma-Aldrich, A-5441) hiiren monoklonaaliset vasta-aineet oli laimennettu 1:5000. Membraanit inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääristä vasta-ainetta 1 tunnin ajan, ja proteiinivyöhykkeet visualisoitiin parannetun kemiluminesenssin (ECL) detektioreagensseja (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).

mittaus PTHrP erityksen

HEK293T-soluja (1,5 x 10

5 solua /12-kuoppaisen levyn) transfektoitiin pCAGGSn3FH-EGR4 tai mock (ei insertti) plasmideja käyttäen FuGENE 6 (Promega). 48 h transfektion jälkeen elatusaine kerättiin talteen ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 15000 rpm. FTHrP proteiinipitoisuus käytettyä alustaa määritettiin immunora- (IRMA) määritys (SRL Inc., Tokio, Japani).

vaikutus kunnostettua alustaa peräisin EGR4-yliekspressoivassa HEK293T solujen

RANLK

,

IL-6

ja

IL-8

ilmentymisen

HEK293T-soluja (2,6 x 10

6 solua /10 cm: n levy) transfektoitiin ohimenevästi kanssa pCAGGSn3FH-EGR4 tai mock vektorin 48 tuntia, ja kasvatusliuos korvattiin sitten DMEM plus 0,1% FBS: ssa vielä 48 tuntia. Viljelyväliaine kerättiin seuraavaksi, ja elatusaine siirrettiin hiiren MC3T3-E1-osteoblastisolujen, että esi-viljeltiin erilaistumisen elatusaineessa, joka sisältää askorbiinihappoa (100 ug /ml) 5 päivää. 48 h jälkeen ekspressiotasot hiiren

RANKL

,

IL-6

, ja

IL-8

analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä, kuten edellä on kuvattu.

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys

HEK293T soluja (2,5 x 10

6 solua /10 cm malja) transfektoitiin 8 ug pCAGGSn3FH-EGR4 tai mock vektorin 48 tuntia ja sitten chIP-kokeet suoritettiin käyttäen EZ-chIP kit (Millipore, Billerica, MA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [19]. PCR-alukesarjoja havaitsemiseksi EGR-sitovia paikkoja, joita käytetään, on lueteltu taulukossa S3.

lusiferaasianalyysissä

HEK293T-soluja (2,5 x 10

4 solua /48-kuoppaisen lautasen) olivat kotransfektoitiin joko 100 ng pGL3-tehostaja-promoottori edellä kuvatulla vektorilla tai mock vektorin yhdessä 100 ng pCAGGSn3FH-EGR4 tai mock vektorin (100 ng). PRL-TK käytettiin sisäisenä kontrollina. 48 tunnin kuluttua solut kerättiin talteen ja analysoitiin

Firefly

lusiferaasi ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus käyttäen dual lusiferaasireportterigeenin määritys (Promega), kuten aiemmin on kuvattu [19]. Data ilmaistiin kertainen kasvu yli mock-transfektoituja soluja (set 1,0) ja edustettuina keskiarvo ± SE kahden itsenäisen kokeen.

NIH3T3-solujen lisääntymisen määrityksessä

NIH3T3-soluja (0,5 x 10

5 solua /6-ja malja) transfektoitiin ohimenevästi 3 ug pCAGGSn3FH-EGR4 tai mock-vektorin kanssa käyttämällä FuGENE 6 (Promega). Soluproliferaatiomääritykset suoritettiin 48, 72 ja 96 h transfektion jälkeen, vastaavasti, käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani), kuten aiemmin on kuvattu [18]. Nämä kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Western blot -analyysi suoritettiin kuten edellä on kuvattu.

geenien vaikutusten siRNA hoito

Käytimme siRNA oligonukleotidien (Sigma-Aldrich Japan KK, Japani) kaataa

EGR4

DLX5, SYNPO SAMD5

ja

RAB15

ilmentymistä SBC-5, SBC-3, NCI-H1048 tai PC14PE6. Sekvenssit kohdistaminen kunkin geenin on lueteltu taulukossa S4. Solut maljattiin 12-kuoppaisilla levyillä (SBC-5 ja PC14PE6; 1,5 x 10

4 solua /kuoppa, SBC-3, 2,5 x 10

4 solua /kuoppa, NCI-H1048; 5,0 × 10

4 solua /kuoppa). Transfektio 100 nM siRNA ja SBC-5 ja PC14PE6 soluja suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000-reagenssia (Life Technologies) kuten aiemmin on kuvattu [20]. SBC-3 ja NCI-H1048-solut transfektoitiin 50 nM siRNA: ita käyttäen Lipofectamine RNAi Max transfektioreagenssia (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 48, 96 tai 120 tuntia transfektion jälkeen kokonais-RNA uuttamalla, reaaliaikaista PCR: ää ja soluproliferaatiomääritykset suoritettiin kuten edellä on kuvattu.

tunnistaminen EGR4 alavirran geenien DNA-siru

SBC- 5-soluja (1 x 10

6 solua /35 mm lautasen 24 h) transfektoitiin 10 nM vastaan ​​suunnattu siRNA EGR4 (EGR4-2) tai EGFP (siEGFP; kontrollina) käyttäen Lipofectamine RNAi Max transfektioreagenssi (Life Technologies ). Kokonais-RNA uutettiin kustakin näytteestä 48 ja 72 h transfektion jälkeen siRNA. DNA microarray ja tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Agilent Whole Human Genome Microarray (4 x 44K, G4110F, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja GeneSpring (versio 11.5, Agilent Technologies) kuten aiemmin on kuvattu [21]. Korjattu

P

arvo laskettiin Benjamini Hochberg vääriä löytö määrä (FDR) analyysi, ja

P

0,05 pidettiin merkittävänä. Laajuus ja suunta ero ilmaisun välillä ajankohtina (48 ja 72 h) määritettiin laskemalla kertaisesti muuttaa arvoja. DNA mikrosiruanalyysi tiedot on toimitettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokantaan sarja GSE40558.

RNAseq data-analyysi keuhkosyövässä

Julkisesti saatavilla geenien ilmentyminen data (normalisoidut arvot Illumina RNAseq v2, taso 3, LUAD ja LUSC) The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://cancergenome.nih.gov/) ladattiin TCGA matriisi. Ero ilmentymistä (jonka kertainen muutos arvo) välillä syöpäkudosten ja viereisen normaalin keuhkokudoksen laskettiin normalisoitu geenin ilmentymisen arvo kunkin näytteen.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi.

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

EGR4 suoraan säätelee transkription aktiivisuutta

FTHrP

geeni

Analysis genomin laajuinen geeniekspressioprofiili elimen etuuskohtelun etäpesäke ihmisen SCLC solulinjaa SBC-5 hiirillä havaita ajoissa kasvureaktio 4 (

EGR4

), joka oli merkittävästi yläreguloituja luun etäpesäkkeitä (

p

0,001, suhde; 2,22) verrattuna muihin elimen etäpesäkkeitä (keuhko-, munuais- ja maksa) [7]. Ensinnäkin selventää rooli EGR4 transkriptiotekijänä osallisena luun etäpesäke keskityimme lisäkilpirauhashormoniryhmässä liittyvä proteiini (

PTHrP

) geeni ehdokkaaksi alavirran kohde EGR4 koska

PTHrP

-geenin tiedetään olevan voimakas aktivaattori osteoklastien luun resorption [4], ja koodaa proteiinia, joka erittyy SBC-5-soluja [22], [23]. Lisäksi on raportoitu, että hoito anti-FTHrP neutraloivat vasta-estää tuotannon SBC5 solun luun etäpesäke SCID-hiirimallissa [22], [23].

National Center for Biotechnology Information ( NCBI) tietokantaan,

FTHrP

geeni raportoitu olevan neljä transkription variantteja, nimetty

FTHrP

variantti 1 (PTHrP-V1, GenBank ei. NM_198965.1), vaihtoehto 2 (PTHrP- V2, NM_002820.2), variantti 3 (PTHrP-V3, NM_198964.1) ja variantti 4 (PTHrP-V4, NM_198966.1). Täyspitkän cDNA: t

FTHrP-V1

,

V2

,

V3

ja

V4

koostuvat 1331, 1881, 1862 ja 1312 nukleotidin että koodaavat 177, 175, 175 ja 177 aminohappoa, vastaavasti, ja ne koostuvat 5, 4, 3, ja 4 eksonia, vastaavasti. V1 variantti puuttuu eksoni 3, ja V2 muunnos puuttuu eksoni 3 ja sillä eksonin 5b, joka on 1027 bp pitempi 3′-päässä kuin eksonin 5a. V3 ja V4 varianttien yleisesti puuttuu eksonit 1 ja 2 sekä hallussaan eksonin 3, joka sijaitsee intronin 2, jonka pituus on 281 emäsparia. V3 variantti edelleen puuttuu eksoni 6, ja hänellä eksonin 5b ja V2 variantti. V4-variantti hallussaan eksonin 5a ja eksonin 6, mikä osoittaa, että

FTHrP-V1 /V2

ja

V3 /V4

versioiden eri promoottorialueille (kuvio 1A). Myöhemmät reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi vahvisti, että

FTHrP-V3

ja

V4

silmukointivariantit olivat pääasiassa voimistunut transkriptionaalisella tasolla EGR4-yliekspressoivassa HEK293T soluissa verrattuna mock-transfektoituja soluja ( kuvio 1 B). Näin ollen saada suoria todisteita säätelyä

FTHrP-V3

ja

V4

by EGR4, ensin etsittiin otaksuttu EGR DNA sidosmotiivien kanssa Matlnspector ohjelman (kuvattu edellä), koska se on on raportoitu, että EGR-perhe, mukaan lukien EGR4 proteiini sitoutuu ensisijaisesti EGR konsensus-motiivin (5′-GCGG /TGGGCG-3 ’) [24] – [27]. Löysimme potentiaalinen EGR DNA sitova motiivi sisällä

FTHrP-V3

ja

V4

promoottorialue (-515–499). Sen jälkeen, tutkimme transkriptionaalista aktiivisuutta EGR4 jonka lusiferaasireportteri- määritys käyttäen pGL3 lusiferaasia sisältävän plasmidin EGR4 sitova motiivi

PTHrP-V3 /V4

promoottorin. Merkittävä kasvu lusiferaasiaktiivisuudeksi havaittiin FLAG-EGR4 transfektio verrattuna mock ohjaus vektorin HEK293T soluissa (kuvio 1 C). Tutkia tarkemmin, ovatko EGR4 voisi sitoutua mahdollisen

FTHrP-V3

ja

V4

EGR sitova motiivi, suoritimme siru määritystä. Genominen fragmentti, mukaan lukien mahdolliset EGR sitova motiivi (-515–499) on

PTHrP-V3

ja

V4

on spesifisesti sitoutunut EGR4 proteiinin tuotteiden immunosaostettiin anti-FLAG-vasta-ainetta, viittaa siihen, että EGR4 suoraan sidottu promoottorialueen

FTHrP-V3

ja

V4

variantteja (kuvio 1 D). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että EGR4 voisi suoraan upregulate

FTHrP-V3

ja

V4

variantit SCLC soluissa.

V: Genomisen rakenteet neljän silmukointivarianteista on

FTHrP

. Harmaa ja valkoinen ruutu osoittaa, koodaus- ja ei-koodaavia alueita, vastaavasti. Nuolet osoittavat alukesarjat suorittamiseen käytetty RT-PCR kunkin transkriptin. Suluissa osoittavat pituus kunkin eksonin. B: Ylempi paneeli: western blot-analyysi HEK293T soluja, jotka ilmentävät eksogeenisiä FLAG-merkitty EGR4 (FLAG-EGR4) tai transfektoitujen solujen mock vektori. Alempi paneeli: reaaliaikainen RT-PCR-analyysi

FTHrP

silmukointivarianteista (

V1 /V2

ja

V3 /V4

) in EGR4-yliekspressoivassa HEK293T soluissa. C: lusiferaasianalyysissä on

FTHrP-V3

ja

-V4

(

V3 /V4

) promoottorialueille (n = 2, *

P

0,05). Tämä koe suoritettiin käyttäen osa lysaatit soluista, jotka ekspressoivat eksogeenista FLAG-EGR4 tai ne, jotka on transfektoitu mock käytetty vektori B. D: ChIP-määritys

PTHrP-V3 /V4

promoottorialueen. ChIP määrityksiä käytettiin määrittämään suoraan EGR4 sitoutumisen

PTHrP-V3 /V4

promoottorin. PCR-tuote oli -620–318 alueen ylävirtaan 5 ’päähän eksonin 3

PTHrP-V3 /V4

, joka nimettiin +1 asentoon.

parakriinisen vaikutukset PTHrP erittää EGR4 yli-ilmentäviä soluja

on raportoitu, että PTHrP erittyvä syöpäsolujen säätelee ilmentymistä

RANKL

,

IL-6

ja

IL-8

geenejä, jotka ovat osallisina tekijöitä, jotka lisäävät osteoklastien muodostumista ja luun tuhoutuminen pahanlaatuisten sairauksien [28] – [30] osteoblastien soluissa. Näiden tietojen mukaan, ja myös havainnot, kuten on esitetty kuviossa 1, me arveltu, että PTHrP proteiini erittyy EGR4 yli-ilmentäviä soluja. Tuloksemme osoittivat, että FTHrP proteiinipitoisuus oli lisääntynyt media konditiointiin EGR4-yliekspressoivassa HEK293T soluja (14,43 ± 1,04 pmol /l) verrattuna elatusainetta valetransfektoiduista soluista (11,83 ± 0,15 pmol /l,

P

0,05; kuvio 2A).

V: eritys FTHrP proteiinin EGR4-yliekspressoivassa HEK293T soluissa (n = 3, *

P

0,05). B: Mittaus järjestelmän osalta parakriinisen vaikutuksia väliaine peräisin EGR4 yli-ilmentäviä soluja. C: Reaaliaikainen PCR-analyysi ja parakriinisten vaikutuksia ilmentymisen

RANKL, IL-6

ja

IL-8

geenejä, kun väliaine EGR4 yli-ilmentyvä HEK293T-soluja viljeltiin hiirellä MC3T3-E1 osteoblastisoluja (n = 2, *,

P

0,05, **,

P

0,01).

Seuraavaksi arvioitiin parakriinisen vaikutukset kunnostettua alustaa peräisin EGR4-yliekspressoivassa HEK293T solujen osteoblastisolujen. Kuten on esitetty kuviossa 2B, siirsimme saadun sopeutetun elatusaineen HEK293T-solut transfektoitiin FLAG-EGR4 konstruktin MC3T3-E1-hiiren osteoblastisolujen ja sitten suoritettiin reaaliaikainen PCR-tutkia vaikutuksia vakioitu väliaine on ilmentymistason

RANKL

,

IL-6

ja

IL-8

geenejä. Kaikki kolme geeniä olivat merkittävästi yläreguloituja osteoblastisolujen käsiteltiin saadun sopeutetun elatusaineen HEK293T-solujen ektooppisesti ilmentävät FLAG-EGR4 verrattuna mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kasvu PTHrP eritystä EGR4 yli-ilmentäviä soluja voidaan lisätä ilmentymisen

RANKL

,

IL-6

ja

IL-8

geenien osteoblastien soluissa.

vaikutus

EGR4

solujen kasvuun

tutki ensin

EGR4

ilmentymistä SCLC soluissa semikvantitatiivinen RT-PCR ja havaitsivat, että

EGR4

oli hyvin ilmaistu SBC-3, SBC-5 ja NCI-H1048-soluissa, mutta ei pienten hengitysteiden epiteelisolujen line SAEc (kuvio 3A). Seuraavaksi sen arvioimiseksi, onko EGR4 on välttämätön kasvulle SBC-5-solut, käytimme RNA-interferenssi lähestymistapaa, jossa on kaksi eri siRNA oligonukleotideja. Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että

EGR4

erityisiä siRNA: t (siEGR4-1 ja siEGR4-2) suppressoi merkitsevästi ilmaus EGR4 verrattuna siEGFP kontrollina (kuvio 3B). MTT-analyysi osoitti, että käyttöönotto siEGR4s (siEGR4-1 ja siEGR4-2) suppressoi merkittävästi kasvua SBC-5-soluja (kuvio 3C), mikä on mukaisesti EGR4 pudotus tuloksia. Olemme myös vahvistaneet merkittävää kasvua estäviä vaikutuksia

EGR4

Knockdown muissa SCLC solulinjoissa SBC-3 ja NCI-H1048 yliekspressoivia

EGR4

(kuva S1). Edelleen vahvistaa kasvua edistävää vaikutusta

EGR4

, FLAG-EGR4 rakentaa tai mock-vektori transfektoitiin lyhytaikaisesti NIH3T3-solut, ja MTT-analyysi suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Kuten on esitetty kuviossa 3D, FLAG-EGR4-transfektoidut solut kasvoivat huomattavasti nopeammin kuin transfektoitu mock vektorilla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen

EGR4

saattaa olla mukana kasvun SCLC-solujen.

V: n ilmentyminen

EGR4

vuonna SCLC ja NSCLC solulinjoissa määritettiin semi -quantitative RT-PCR: llä. B: Effects of

EGR4

Knockdown soluproliferaatioon in SBC-5-soluissa. Reaaliaikainen PCR

EGR4

vuonna siEGFP- tai siEGR4 (siEGR4-1, siEGR4-2) saaneista soluista 5 päivän kuluttua siRNA hoidon (n = 2, *

P

0,05).

ACTB

käytettiin kvantitatiivista ohjaus reaaliaikaisen RT-PCR: llä. C: Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksellä 5 päivää sen jälkeen, kun siRNA hoidon (n = 3, ***

P

0,005). (Si-1, siEGR4-1, si-2, siEGR4-2). D: Kasvua edistävää vaikutusta eksogeenisen EGR4 NIH3T3-solut (*

P

0,05, **

P

0,01,

NS

, ei ole merkitystä). Western blot-analyysi suoritettiin 96 h transfektion jälkeen (vasen paneeli). MTT-analyysi suoritettiin 48, 72 ja 96 h kuluttua transfektion FLAG-EGR4 (musta) tai mock vektorin (valkoinen) (oikea paneeli). Nämä kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

tunnistetiedot

EGR4

kohdegeenien

Jos haluat saada lisää tietoa biologisen roolin

EGR4

solujen kasvua, yritimme tunnistaa alavirran geenien nimenomaan säätelee EGR4 sisään SCLC soluissa. siEGR4 tai siEGFP (kontrolli siRNA) transfektoitiin SBC-5-solut, joissa

EGR4

oli ilmentyy voimakkaasti (kuvio 3A), ja muutokset geenin ilmentymisen kahdessa ajankohtina seurattiin DNA microarray-analyysi. Tunnistaa geenien oletetusti säätelee EGR4, valitsimme geenien kanssa seuraavat kaksi perustetta: (i) ilmentymistaso oli vähentynyt yli kaksinkertaisesti 48 ja 72 h transfektoiduissa soluissa siEGR4 verrattuna transfektoitu ohjaus siEGFP, ja (ii) oletettu EGR sitova motiivi oli ennustettu esiintyy 500 emäsparia transkription aloituskohdasta, jonka Matlnspector-ohjelman (edellä kuvatulla tavalla). Havaitsimme 13 geenejä, jotka vaimentua heti knockdovvn EGR4 ilmaisun (taulukko S5). Reaaliaikainen PCR-analyysi vahvisti, että seitsemän transkriptit olivat merkittävästi vaimentua sekä ajankohtina EGR4-knockdown-soluja (kuvio 4A). Myöhemmin olemme myös arvioineet säätelyä näiden geenien kun eksogeenisen EGR4 ilmentymistä HEK293T soluissa ja lopulta valitsi neljä EGR4 ehdokas kohdegeenien, kuten distaalisen-vähemmän homeobox 5 (

DLX5

), synaptopodin (

SYNPO

), steriili alfa motiivi domain sisälsi 5 (

SAMD5

), ja RAB15, jäsen RAS onkogeeni perhe (

RAB15

), jotka merkittävästi voimistuvan

EGR4

yli-ilmentyminen (kuvio 4B). Olemme vahvistaneet merkittäviä downregulation

DLX5

,

SYNPO

ja

SAMD5

geenien

EGR4

Knockdown in SBC-3-soluissa (kuvio S2).

V: Reaaliaikainen PCR

EGR4

ja seitsemän alavirran geenien (

DLX5, SYNPO, SAMD5

,

MREG, AHNAK, RAB15

, ja

PTPN23

) in siEGFP- tai siEGR4-käsitellyn SBC-5-soluissa (n = 2, *,

P

0,05, **

P

0,01, * **,

P

0,005). B: Reaaliaikainen PCR on

DLX5

,

SYNPO

,

SAMD5

, ja

RAB15

geenejä jäljitellyistä tai EGR4-yliekspressoivassa HEK293T soluissa (n = 2, *,

P

0,05, ***,

P

0,005). Tämä koe suoritettiin käyttäen kokonais-RNA soluista, jotka ilmentävät eksogeenisiä FLAG-merkitty EGR4 (FLAG-EGR4) tai ne oli transfektoitu mock käytetty vektori kuvassa 1B. C: lusiferaasianalyysissä on

SAMD5

,

RAB15

,

SYNPO

ja

DLX5

geenejä. (N = 2, *,

P

0,05, **,

P

0,01). D: ChIP määrityksiä käytettiin määrittämään suoran sitoutumisen EGR4 sen edistäjiä

SAMD5

,

RAB15

,

SYNPO

ja

DLX5

geenit .

Jos haluat saada suoraa näyttöä varten transaktivaatiota neljä EGR4 ehdokas kohdegeenien, mittasimme transkriptionaalista aktiivisuutta EGR4 jonka lusiferaasireport- määritys. FLAG-EGR4-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi korkeammat lusiferaasiaktiivisuutta kuin mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 4C). Seuraavaksi tutkimme rekrytointi EGR4 kuhunkin EGR4-sitomiskohta Chip määrityksessä. EGR4 osoitettiin sitoutuvan ennustetun EGR sitova motiivi sisällä promoottorialueet kaikki kohdegeenien (kuvio 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EGR4 suoraan transaktivoi

SAMD5

,

RAB15

,

SYNPO

ja

DLX5

. Sen jälkeen, tutkimme biologisen roolin neljän EGR4 kohdegeenien leviämisen SCLC-solujen. Esittely siRNA: iden osaksi SBC-5, SBC-3 ja NCI-H1048-soluissa johti merkittävään vähenemiseen ilmaus kohdegeenien mukana merkittävä solujen proliferaatio (kuvio 5A-D, kuva S3), mikä viittaa siihen, että nämä geenit todennäköisesti myös keskeinen rooli leviämisen SCLC-solujen kautta EGR4 transkription aktivaation.

vaikutukset

EGR4

alavirran geenien

SAMD5

(A),

RAB15

(B),

SYNPO

(C) ja

DLX5

(D) soluproliferaatioon määritettiin siRNA pudotus on SBC-5-soluissa. Vasemmassa paneelissa näkyy reaaliaikainen PCR-tulokset kohdegeenien siRNA-käsitellyissä soluissa (n = 2). Oikea paneeli näyttää tulokset solujen lisääntymisen analyysit mitattuna MTT: llä (

SAMD5

ja

RAB15

: n = 2,

DLX5

ja

SYNPO

: n = 3, *,

P

0,05, **,

P

0,01, ***,

P

0,005).

keskustelu

tässä tutkimuksessa tavoitteenamme oli tunnistaa ja kuvata molekyylejä tai reittejä mahdollisesti osallisena syövän etäpesäkkeiden, erityisesti luun etäpesäke. Kautta genominlaajuisia transcriptomic analyysi elin-etuoikeutetut etäpesäke ihmisen SCLC-solujen hiirissä, huomasimme, että

EGR4

, jäsen perheen neljä liittyvän sinkki sormen Cys

2-His

2 tyypin proteiineja (

EGR1

osoitteeseen

EGR4

), on merkittävästi yliaktiivista luun etäpesäkkeitä verrattuna muihin elimiin eli, keuhkojen, munuaisten ja maksan [7]. EGR4 identifioitiin aluksi sinkkiä sormen transkriptiotekijän välittömästi aiheuttama mitogeeniseen stimulaatioon T-lymfosyyteissä ja fibroblastit [31]. Gene kohdistaminen hiirillä ovat osoittaneet, että EGR4 säätelee useita kriittisiä geenien alkuvaiheissa meioosi ja on korvaamaton rooli miespuolisilla hiiren hedelmällisyyteen [11], [12]. Lisäksi on raportoitu, että EGR4 sitoutuu tumatekijä aktivoitujen T-solujen (NF-AT) tai tumatekijä kappa B (NFkB) parantaa transkription alavirran geeneissä, jotka koodaavat inflammatoristen sytokiinien, kuten IL-2, TNF-α ja ICAM-1 [32], [33]. Aiempi kuvattiin että ilmentymistason

PTHrP

, voimakas aktivaattori osteoklastien luun resorption, luuetäpesäkkeissä yleensä korkeampi kuin etäpesäkkeitä munuaisiin, maksa ja keuhkot käyttäen genominlaajuisten transkriptomiikka ihmisen SCLC-solujen hiirissä [7]. Niinpä tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet

PTHrP

, voimakas aktivaattori osteoklastien luun resorptiota, kuin EGR4-alavirtaan geenistä selventää patofysiologista roolia EGR4 kuin transkriptiotekijän SCLC luustometastaaseja.

FTHrP tiedetään olevan keskeinen välittäjäaine humoraalisen hyperkalsemian maligniteettien ja osteolyyttisiä keuhkosyövän etäpesäkkeet [22], [23], [34]. Noin 80% potilaista, joilla oli kiinteä kasvain ja hyperkalsemiaa ovat lisääntyneet FTHrP pitoisuuksina niiden plasmassa [35]. On raportoitu, että PTHrP erittyvä syöpäsolujen säätelee ilmentymistä

RANKL

,

IL-6

ja

IL-8

geenejä, jotka on osallisina tekijöitä, jotka lisäävät osteoklastien muodostumista ja luun tuhoutuminen pahanlaatuisia sairauksia [28] – [30] osteoblastien soluissa. Huomasimme, että EGR4 suoraan transaktivoi erityinen variantteja (

V3

ja

V4

) on

PTHrP

geeni, siten mahdollisesti edistää eritystä FTHrP proteiinin EGR4 yli-ilmentäviä soluja , jolloin myöhemmin transaktivaation

RANKL

,

IL-6

ja

IL-8

geenien kautta parakriinisen toiminnan FTHrP. RANKL on tunnettua sitoa RANK reseptorin osteoklastien esiasteiden ja indusoivat osteoklastien muodostumista. IL-6 ja IL-8 on myös raportoitu olevan tärkeä osteoklastogeneesiä ja osteoklastien aktivoitumisen, vastaavasti [30]. Sen vuoksi nämä tulokset viittaavat siihen, että induktio PTHrP mukaan EGR4 yli-ilmentyminen saattaa olla vastuussa luun etäpesäkkeiden SCLC keuhkosyövän soluja.