Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia, efriini-A1 ja endoteelin typpioksidin nopaliinisyntaasin (eNOS ) ovat osoittautuneet kriittisiä rooleja kasvaimen angiogeneesiä. Kuitenkin miten efriini-A1 säätelevät hypoksia ja onko efriini-A1 yhteistyössä eNOS modulaatioon angiogeneesin edelleen hoitamatta yksityiskohtaisesti. Tässä osoitimme, että molemmat efriini-A1 okasolusyöpä soluja (SCC-9) ja erityisesti liukoinen efriini-A1 supernatantit ajan säännellään hypoksinen kunnossa. Lisääntynyt typpioksidin (NO) tuotantoa ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) havaittiin efriini-A1-angiogeneesiä, joka oli päinvastainen jälkeen rinnakkaisviljelemällä eNOS spesifinen estäjä, N-nitro-L-arginiini-metyyliesteri-hydrokloridi (L -NIMI). Western blot-analyysi vahvisti, että molemmat fosforylaatio Akt

Ser473 ja eNOS

Ser1177 olivat säädellään ylöspäin efriini-A1 stimuloiman HUVEC, jossa koko eNOS ilme ennallaan. Erityiset estäjä fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K), LY294002, merkittävästi alassäädetty efriini-A1-indusoidun ilmentymisen fosforyloidun Akt:

Ser473 sekä fosforylaation eNOS

Ser1177. Nämä tulokset paljastivat mahdollisen uuden mekanismin, jolla efriini-A1 säännellään kasvaimen mikroympäristössä ja edistää angiogeneesiä koordinoidun rajat puhua PI3K /Akt-riippuvaisen eNOS aktivointi, jotka voivat koskea normaalin verisuonten kehitykseen ja kasvaimen uudissuonittumisen.

Citation: Song Y, Zhao XP, Song K, Shang ZJ (2013) Efriini-A1 Is Up-säätelemä Hypoksia syöpäsoluissa ja edistää angiogeneesiä HUVEC: ien kautta Coordinated Cross-Talk kanssa eNOS. PLoS ONE 8 (9): e74464. doi: 10,1371 /journal.pone.0074464

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 18 tammikuu 2013; Hyväksytty: 03 elokuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81172570 ja nro 30872893). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

erilaisia ​​pro-angiogeenisten ja anti-angiogeenisten tekijöiden osallistua angiogeneesin kontrollointiin, joka on olennaisia ​​rooleja kasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden [1] – [3]. Efriini-A1 ja primaarireseptorinaan, EphA2, eivät vain ilmaistu useita maligniteettien, vaan myös keskeinen rooli normaalissa angiogeneesissä ja kasvaimen uudissuonittumisen [4]. Yli-ilmentyminen efriini-A1 kasvainsoluissa voi edistää angiogeenisen prosessin, kun taas kaataa of efriini-A1 kasvainsoluissa vaikuttaa merkittävästi hidastanut kasvaimen aiheuttaman endoteelisolujen migraatiota in vitro ja mikrovaskulaarisen tiheyden in vivo [5]. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että yli-ilmentynyt EphA2 voi myötävaikuttaa kasvaimen angiogeneesiä ja ovat ennusteen arvioinnissa in kielen syöpä [6]. On riittävästi kokeellista näyttöä siitä, että aktivointi EphA2 endoteelisoluissa (EC: issä) tarvitaan efriini-A1 käyttämään sen angiogeeninen vaikutus in vitro ja in vivo [7]. Kuitenkin säätö- tekijät ja mekanismit, joilla efriini-A1 /EphA2 edistää kasvaimen angiogeneesiä eivät olleet hyvin selvitetty.

On raportoitu, että useat kasvutekijät ja sytokiinit voivat indusoida Efriini ligandien, kuten tuumorinekroositekijä tekijä-α (TNF-α), interleukiini-1β (IL-1β), et al [8]. Hypoksia on yksi yleisimmistä ja tärkeitä ominaisuuksia kasvaimen mikroympäristössä, ja edistää induktioon eri angiogeenisten tekijöiden [9]. Äskettäin, HIF-1α, hypoksian indusoitavissa transkriptiotekijä, on todettu säätää ylös Efrii- ja Eph-reseptorien hiiren ihon [10]. Pään ja kaulan syöpien, lisääntynyt efriini-A1 ilmentyminen liittyi pO

2 kasvaimen mikroympäristössä [11]. Vaikka efriini-A1 on kriittinen rooli kasvaimen angiogeneesiä ja näyttää olevan mukana vastauksena hypoksia, useimmat aikaisemmat tutkimukset ovat pääasiassa keskittyneet efriini-A1 kalvoon sitoutunut proteiini. Tietääksemme, on suhteellisen vähän suoraa näyttöä siitä, hypoksia voi aiheuttaa syövän solut tuottamaan efriini-A1, erityisesti liukoista muotoa, tai ei.

Mekanismit efriini angiogeneesissä ei ole täysin ymmärretty vielä. Tähän asti vain muutamia signalointireittejä, kuten MAP /ERK ja PI3K: [12], [13], on havaittu vaikuttavan efriini-A1. Lisäksi edistämisen sekä esto saman signalointireitin, jonka efriini-A1 havaittiin eri soluissa tai syövän tyypit. On hyvin tiedossa, että eNOS ja NO on ratkaiseva merkitys endoteelisolujen muuttoliike ja angiogeneesi [14]. Riittävät todisteet osoittivat, että Enos ilmentyy pääasiassa kasvaimen verisuonten endoteelisoluissa, ja sen tuotanto NO toimii suoraan effektorimolekyylin eri angiogeenisten tekijöiden aiheuttamaa tuumoriangiogeneesissa [15], [16]. Siksi se ei ole yllättynyt olettaa, että eNOS /EI voi myös välittää efriini-A1 aiheuttama tuumoriangiogeneesi. Valitettavasti ei ole suoraa tietoa on saatavilla rajat yhteys efriini-A1 ja eNOS aikana modulaatio angiogeneesiä endoteelisolujen toistaiseksi.

Nykyinen Tutkimuksessa selvitettiin mekanismeista efriini-A1 modulaatio angiogeneesin kautta tutkimalla vaikutusta hypoksia efriini-A1 ilmentymisen ja erityksen kasvainsoluissa ja mahdollinen yhdistys efriini-A1 eNOS /NO kasvaimen angiogeneesiä. Tuloksemme vahvistivat, että molemmat efriini-A1 ilmaisun ja liukoisen efriini-A1 eritystä kasvainsoluissa korotettiin hypoksiaolosuhteissa stimulaatiota. Efriini-A1 angiogeneesissä oli mukana eNOS fosforylaation ja NO tuotantoa, joka esti L-NAME. Lisäksi tutkimus osoitti, että aktivoituminen PI3K /Akt signaalireitin vaaditaan välinen ylikuuluminen efriini-A1 ja eNOS angiogeneesin edistämiseen. Tuloksemme ehdotti, että säädelty efriini-A1 kasvaimen hypoksinen mikroympäristössä voi edistää angiogeneesiä kautta PI3K /Akt /Enos reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Rekombinantti ihmisen efriini A 1-Fc-kimeeran ja rekombinantti-ihmisen IgG1 Fc hankittiin R Lonza, Walkersville, MD), johon oli lisätty 2% naudan sikiön seerumia (FBS) ja EGM-2 kasvutekijä seosta (Lonza). HUVEC Tässä tutkimuksessa käytetyt rajoitettiin kulku 4 kulku 6. Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Tutkimuksemme hyväksyttiin komiteoiden etiikkaa School ja sairaalan hammaslääketieteen (Wuhan University, viitenumero 055/2011).

Cell migraatiokokeessa

Solun muuttoliikettä tutkittiin käyttäen naarmu haava määritys . Confluent HUVEC 24-kuoppalevyllä oli nälässä yön yli 0,1% BSA EBM-2 kunnes haava tehtiin käyttämällä 200 ui pipetin kärki. Huuhtelun jälkeen PBS: llä kolme kertaa poistamiseksi irrottaa solut ja solujäte, kasvutekijä-väliaineessa, jossa efriini-A1-Fc: tä (1 ug /ml) yksinään tai yhdessä L-NAME (100 uM) tai LY294002 (10 uM) oli lisättiin kuhunkin kuoppaan. Kasvutekijä-väliaineessa tai ilman rekombinantti-IgG1 Fc (1 ug /ml), otettiin kontrollina. Kuvat samassa kohdassa pitkin naarmu haava otettiin 0 h, 24 h. Prosenttiosuus haavan jokaisena ajankohtana laskettiin seuraavan kaavan mukaan: [1- (nykyinen haava-alueen /alkuperäisen haava-alueen)] x 100.

In vitro Putken muodostumisen määritys

Sub -confluent HUVEC suspendoitiin uudelleen kasvutekijöiden-free EBM-2, joka sisältää efriini-A1-Fc: tä (1 ug /ml) yksinään tai yhdessä L-NAME (100 uM) tai LY294002 (10 uM), ja ympättiin pre-kiinteytyi BD Matrigel (BD Bioscience) 96-kuoppaisella levyllä (3 x 10

4 solua /kuoppa). Levyjä inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 6 tuntia. Kuvat otettiin kustakin ryhmästä. Kaikki haarapisteet putken rakenteita kussakin kuopassa laskettiin määrällisesti astetta putken muodostumiseen. Kasvutekijä-väliaineessa tai ilman rekombinantti-IgG1 Fc (1 ug /ml), otettiin kontrollina. Prosenttiosuus putken muodostumiseen laskettiin ottamalla rekombinantti IgG1 Fc kontrolliryhmän 100% putken muodostumiseen. Kokeet toistettiin ainakin kolme kertaa samanlaisissa olosuhteissa.

NO pitoisuus Detection Pitoisuus

Yhteensä NO pitoisuus viljelyväliaineessa havaittiin mittaamalla pitoisuus nitraatti- ja nitriitti muunnellulla Griess reaktion menetelmällä. Yhteensä typpioksidin Assay Kit (Beyotime, Kiina) käytettiin. Optinen tiheys 540 nm aallonpituudella mitattiin käyttäen Micro-levyn lukija (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja pitoisuudet NO laskettiin standardikäyrän.

Estä määritys

Estä määritys suorittaa toiminnan arviointiin eNOS in efriini-A1 aiheuttama HUVEC angiogeneesiä ja efriini-A1 vaikutus P-eNOS

Ser1177 kautta PI3K-Akt-reitin. L-NAME (100 uM) tai LY294002 (50 uM) lisättiin elatusaineeseen estää eNOS tai PI3K. HUVEC-soluja ja kontrolliryhmien viljeltiin kasvutekijä-väliaineessa tai ilman rekombinantti-IgG1 Fc (1 ug /ml).

immunofluoresenssimääritystä

HUVEC kasvaa peitinlasit inkuboitiin 2% FBS EBM-2, joka sisälsi 1 ug /ml efriini-A1-Fc 0 h, 8 h ja 24 h. Peitelaseja pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 4% kylmässä paraformaldehydillä 10 minuutin ajan. Hoidon jälkeen 5% BSA-PBS: ssä 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, soluja inkuboitiin ensisijaisen kanin polyclone vasta-ainetta vastaan ​​eNOS (laimennus 1:600) tai EphA2 (laimennus 1:400) 4 ° C: ssa yön yli. Sitten solut pestiin PBS: llä kolme kertaa 15 minuutin ajan ja altistettiin Alexa Fluor 488-konjugoitu vuohen anti-kani-IgG (laimennus 1:300) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Tumat värjättiin 2 min Hoechst (laimennus 1:10000) (Sigma, USA), jota seurasi kolme pesua PBS: ssä 15 min. Kaikki peitelaseja peitettiin dioja ja asennettu fluoresenssimikroskooppia (Leica DM4000B, Saksa) havaitsemista varten. Negatiiviset kontrollit käsiteltiin samalla tavalla, mutta ilman primaarista vasta-ainetta.

proliferaatiomääritystä

HUVEC 96-kuoppalevyllä (1 x 10

3 100 ul /kuoppa) altistuvat efriini-A1-Fc: tä (1 ug /ml) ja 0 h, 24 h ja 48 h. Solulisäkasvumäärityk- nopeus mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Tokio, Japani) lisäämällä 10 ui WST-8 kussakin hyvin ilmoitetuilla aikoina. Absorbanssi 450 nm aallonpituudella tallennettiin käyttäen Micro-levyn lukija (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

polymeraasiketjureaktio

Yhteensä RNA eristettiin tutkimuksessa ryhmien . cDNA syntetisoitiin RevertAid ™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Maxima ™ SYBR Green qPCR Master Mix Kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) ja spektrofluorimetri terminen iCycler1 (Bio-Rad, Hercules, CA). Sillä eNOS primeerisekvenssit ovat 5′-GTGGCTGTCTGCATGGACCT-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CCACGATGGTGACTTTGGCT-3’ (reverse), tuote kokoa 121 emäsparia. Ihmisen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) otettiin sisäisenä kontrollina. MRNA ilmentymistaso kussakin ryhmässä laskettiin vertaileva ΔΔCt.

Hypoksia Experiment

SCC-9 solut altistettiin hypoksinen olosuhteet (1% O

2) tai happiolosuhteissa ( 21% O

2) 0 h, 6 h, 12 h, 24 h ja 48 h. Solut kerättiin ja lysoitiin SDS-näytepuskurissa Western blot -määritys. Supernatantit kerättiin ja sentrifugoitiin 3000 x g: ssä 10 min poista roskat. Sama määrä supernatantti ladattiin havaitsemiseksi liukoisen muodon efriini-A1 by Western blot-analyysi [18].

Cell pyöristys määritys

Supernatantit (24 h) edellä otettiin väliaine (CM) ja konsentroitiin 6 × ennen solujen pyöristystä koetta käyttäen 10 kDa MWCO Amicon Ultra Centrifugal suodatin laitteet (Millipore). U-251 GBM-soluja käsiteltiin CM tai 1 ug /ml ihmisen rekombinantti-efriini-A1-Fc. Käännettyä mikroskooppia käytettiin tarkkailla solun pyöristys 15 min, 30 min, ja 2 h sen jälkeen.

Western blot -analyysi

HUVEC 90% konfluenssiin käsiteltiin efriini-A1-Fc ( 1 ug /ml) 2% FBS: ää EBM-2 osoitti kertaa. Proteiini kerättiin lyysipuskurissa, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail (Roche, Saksa). Sama määrä proteiinia (30 ug) ladattiin ja erotettiin 8% SDS-PAGE. Ja sitten proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Millipore Co., Billerica, MA, USA) 200 mA: ssa 2 h (100 mA, 1 h efriini-A1) 4 ° C: ssa, estää TBS: ssä, joka sisälsi 5% BSA: ta (w /v) ja 0,1% Tween-20: ssa 1 h, ja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli. Laimennus vasta oli seuraava: efriini-A1 (1:500), eNOS (1:600), P-eNOS

Ser1177 (1:1000), Akt (1:1000), P-Akt

Ser473 (1:1000) ja β-aktiini (1:2000). Viiden 5 min pesua, lohkot inkuboitiin piparjuuren peroksidi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennus 1:10,000) (Jackson Immunoresearch Laboratories) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Vihdoin, nauhat tutkittiin käyttämällä ECL plus western blotting tunnistus reagenssit (Beyotime, Kiina). Western blot-analyysi toistettiin vähintään kolme kertaa samanlaisissa olosuhteissa.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± SEM. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin vertaamaan niiden erot tutkimus ryhmiä.

P

arvot alle 0,05 pidettiin merkittävästi erilainen.

Tulokset

Efriini-A1 Enhanced angiogeneesin in vitro

EphA2 reseptorin ilmentää positiivisesti meidän viljellyissä HUVEC (Kuva S1A-C). Ei-pre-aihekokonaisuuksien ihmisen rekombinantti efriini-A1-Fc määrittämiseen käytettiin vaikutusten efriini-A1 jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja putki muodostumista HUVEC. Tuloksemme osoittivat, että efriini-A1-Fc voisi lisätä merkittävästi HUVEC muuttoliike (kuvio S2A, B) ja putken muodostumiseen Matrigelillä (Kuva S3A-D), vaikuttamatta soluproliferaatioon (kuva S4). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [19], jossa vahvistetaan efriini-A1 angiogeneesin modulointi.

Efriini-A1 angiogeneesin induktio välittyy eNOS Aktivointi ja NO Production

Vaikka eNOS /NO on pidetty elintärkeä efektori kasvaimen angiogeneesissä, ei aiemmat tutkimukset ovat käsitelty onko eNOS /NO välittävät efriini-A1 angiogeneesissä. NO havaitseminen testi osoitti dramaattinen kasvu on NO-tuotannon supernatantissa viljeltyjen HUVEC-inkubaation jälkeen 1 ug /ml efriini-A1-Fc: ssa 24 tuntia (kuvio 1). Oli merkitsevä tilastollinen ero NO-tuotannon välillä kontrolliryhmässä (10,4 ± 3,4 uM) ja efriini-A1-Fc-stimulaation ryhmässä (42,1 ± 4,1 uM). Kun NO-tuotannon inhiboitui L-NAME (100 uM), haavan korko tukahdutettiin dramaattisesti (kuvio 2A) (Kuva S2A, B), ja vähemmän ehjä putkirakenteissakin ja haarautumispisteet havaittiin efriini-A1-stimuloidun HUVEC (kuva 2B) (Kuva S3A-D), joka osoittaa merkittävä lasku solujen vaeltamiseen ja putken muodostumiseen (kuvio 2C, 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, eNOS /EI voi olla keskeinen rooli efriini-A1 aiheuttama angiogeenisen prosessin.

Data osoitti merkittävästi lisääntynyt NO tuotantoa EA1-Fc ryhmä. (*,

P

0,05, n = 3).

V: Cell migraatiokokeessa osoitti, että L-NAME ja LY294002 esti efriini-A1 stimuloiman migraation HUVEC ( 200 x). B: Tube muodostumisen määritys osoitti, että L-NAME ja LY294002 esti efriini-A1-stimuloi putken muodostumiseen HUVEC (200 x). Arrowheads esitteli HUVEC ulottuneen riittämättömästi. C: kvantitointi A. D: kvantifiointi B. (*,

P

0,05, n = 3).

lisätutkimuksia, eNOS ilmaisun ja fosforylaatio tila oli tarkastellaan efriini-A1-stimuloidun HUVEC. Kuten on esitetty kuviossa 3A, 3B, 3C, ei merkittäviä eNOS ilmentymistä havaittu muutoksia immunofluoresenssilla, reaaliaikaista PCR: ää ja western blot-analyysi. Kuitenkin efriini-A1-Fc stimulaatio aiheutti nopean aikariippuvainen lisäys eNOS fosforylaation päällä Ser1177 (kuvio 3D) (kuvio S5). P-eNOS

Ser1177 alkoi nostaa merkittävästi noin 10 min ja saavutettu suurin vaikutus 30 min ja laski sen jälkeen (kuvio 3E). Nämä tiedot osoittivat, että P-eNOS

Ser1177 aktivointia, mutta ei lisätä eNOS ilmaus on pääasiassa vastuussa kohonnut NO tuotantoa efriini-A1 angiogeneesissä.

Immunofluoresenssitesti (A), Reaaliaikainen PCR ( B) ja Western blot-analyysi (C) osoittivat, että efriini-A1-Fc ei ollut vaikutusta eNOS ilmentymistä HUVEC (#,

P

0,05, n = 3). D: Western blotit osoittavat, että P-eNOS

Ser1177 ja P-Akt

Ser473 oli up-säännellään efriini-A1-Fc stimulaatiota ajasta riippuva tavalla. E: Määrä analyysi P-eNOS

Ser1177. F: Määrä analyysi P-Akt

Ser473. (*,

P

0,05, n = 4).

PI3K /Akt tarvitaan efriini-A1 aiheuttama P-eNOS

Ser1177 vuonna HUVEC

kuten kuviossa 3D, 3F, efriini-A1-riippuvainen P-eNOS

Ser1177 myös mukana samanlaista nopeaa fosforylaation ja aktivaation Akt

Ser473, mikä viittaa siihen, Akt voi toimia tärkeänä ylävirran modulaattorin joka edistää P-eNOS

Ser1177 tässä prosessissa. Vaikka PI3K on otettu välittömänä valvojana Akt [20] – [22], LY294002 (50 uM) levitettiin tutkimuksessamme vahvistamaan vaikutusta fosforylaatioon Akt ja eNOS. Tuloksemme osoittivat, että ei ainoastaan ​​P-Akt

Ser473 vaan myös P-eNOS

Ser1177 heikennettiin käsittelemällä LY294002 (kuva 4A-C) (kuva S6), paljastamiseksi että PI3K on olennainen Akt fosfory- ephrin- A1 ja vuorostaan ​​fosforyloi eNOS työmaalla Ser1177. Lisäksi sen selvittämiseksi, onko PI3K /Akt aktivaatio oli mukana efriini-A1 aiheuttama solufunktiot, LY294002 lisättiin viljelyaineeseen ja sen vaikutukset hankittua arvioitiin tyhjästä haava määrityksen ja putken muodostumisen määritys. Kuten kuviossa 2A, 2B, altistumisen jälkeen LY294002, haavan sulkeminen oli pienentynyt merkittävästi verrattuna EA1-Fc ryhmä (kuvio 2C); HUVEC Matrigelillä venytetty riittämättömästi, vähemmän haarautumispisteet tallennettiin ja vähemmän ehjä putkirakenteissakin havaittiin EA1-Fc + LY294002 ryhmä (Fig. 2D). Nämä havainnot ehdotti, että Akt fosfory- on ratkaiseva rooli efriini-A1 aiheuttama HUVEC angiogeenisten toimintoja. Yhdessä voimme vetää johtopäätös, että efriini-A1 indusoi aktivoitumista eNOS kautta PI3K /Akt-riippuvaisen signaalireitin sen angiogeneesiä toimintoja.

V: edustaja Western blotit P-eNOS

Ser1177 ja P-Akt

Ser473 päässä HUVEC jotka nälässä 0,1% BSA EBM-2: ssa yön yli ja stimuloitiin efriini-A1-Fc: tä (1 ug /ml) 30 minuutin ajan yksin tai yhdessä esikäsitelty LY294002. B: Määrä analyysi P-Akt

Ser473. C: Määrä analyysi P-eNOS

Ser1177. (*,

P

0,05, n = 4) (#,

P

0,05, n = 4).

Hypoksia Up-säännelty efriini-A1 Expression ja liukoista efriini-A1 eritys syöpäsoluissa

Syöpäsolut viljeltiin hypoksiaolosuhteissa ja normoksia olosuhteissa. Solut ja supernatantit kerättiin efriini-A1 analyysi Western blot. Verrattuna soluja viljeltiin normaaleissa happiolosuhteissa, SCC-9-soluja altistetaan hypoksia havaittiin huomattavasti enemmän efriini-A1 ilmentymistä ajan riippuvalla tavalla, jolloin maksimaalinen vaikutus esiintyy 24 h (kuvio 5A) (kuvio S7A, B). Vielä tärkeämpää on, efriini-A1-proteiini havaittiin myös positiivisesti ja kasvoi merkittävästi supernatanteista hypoksia ryhmien taso oli paljon suurempi verrattuna normoksia ryhmien (kuva 5B) (Kuva S7C, D), mikä viittaa siihen, että syöpäsolut voivat myös erittää liukoinen muoto efriini-A1 kasvaimen hypoksinen mikroympäristössä. Kiehtovan, kuten kuvassa 5A, sekä normoksia ja hypoksia ryhmässä oli samanlainen efriini-A1 ilmentymisen suuntaus SCC-9 solua. Efriini-A1 alkoi kasvaa noin 6 tuntia, saapui suurimmillaan vaiheessa 12 tunnista 24 tuntiin ja laski sitten myöhemmin. Mahdollinen negatiivinen palaute mekanismi on ehkä mukana tässä erityinen prosessi. Efriini aiheuttama reseptorin endosytoosin on tutkittu useissa biologisissa järjestelmissä. Kun vuorovaikutus efriini-A1 ligandi ja EphA2 reseptori, ligandi-reseptori-kompleksien voidaan sisäistää kaksisuuntaisesti kasvainsoluissa [23], [24]. Tämä ligandi-reseptori-kompleksien sisäistämisen voi lisäksi toimia negatiivista palautetta motivaatio kontrolloinnissa efriini-A1 ilme. Joten on mahdollista, että yhä EphA2 aktivointi sekä kalvoon sitoutuneita ja liukoisen efriini-A1 SCC-9 solua oli johtanut alas-säätely efriini-A1. Mitä miksi efriini-A1 on lisääntynyt dramaattisesti välillä ajankohtina 6 h ja 12 h jopa normoksia ryhmässä, se on vielä lisätutkimuksia.

V: Western blotit osoittavat, että hypoksia kohonnut kalvoon sitoutuneen efriini-A1 ilme SCC-9 solua. B: Western blotit, jotka osoittavat hypoksian sääteli liukoisen efriini-A1 supernatanteissa SCC-9 solua. SCC-9 solutiheys 70-80% konfluenssiin otettiin 0 h, kun tuoreella viljelyalustalla lisättiin. C: Cell pyöristäminen määritys osoittaa, että liukoinen efriini-A1 CM voisi aktivoida EphA2 U-251 GBM-solujen. Efriini-A1 (S), liukeneva efriini-A1; N, normoksia väliaine ryhmä; H, hypoksia väliaine ryhmä.

Solun pyöristäminen on ominaisuus vastaus toiminnallinen efriini-A1 [18], [25]. U-251 GBM-solujen luonnollisesti yliekspressoivat EphA2 ja on erittäin alhainen efriini-A1 [26]. Kyky liukoisen efriini-A1 CM aiheuttamaan soluissa pyöristäminen U-251 GBM-solujen tutkittiin. Kuten kuviossa 5C (Kuva S8), hoito U-251 GBM-solujen joko CM tai efriini-A1-Fc johti jyrkkä muutos solujen morfologia, mikä solujen pyöristämällä jo 15 minuuttia, saapuu kurkistaa vaikutus 30 min ja vähenevä 2 h kuluttua CM ja efriini-A1-Fc hoitoa. Vaikka morfologiset muutokset U-251-solujen havaittiin alle CM stimulaatio, lisäksi toiminnallinen kokeet ovat vielä tarpeen sen osoittamiseksi, onko hypoksian aiheuttaman liukoisen efriini-A1 voi aiheuttaa EphA2 fosforylaation tai jopa kasvaimen angiogeneesiä.

signalointiryöpyn mukana efriini-A1 angiogeneesissä on ominaista kaavamaisesti kuvassa 6.

keskustelu

nykyinen tutkimus paljasti mekanismin, jolla efriini-A1 moduloi angiogeneesiä ja ajo tekijä efriini-A1 up -säätö. Efriini-A1 angiogeneesissä liittyy lisääntynyt NO-tuotannon, joka on jälkeen PI3K /Akt-riippuvaisen aktivaation P-eNOS

Ser1177 endoteelisoluissa. Hypoksia voisi aktiivisesti aiheuttaa parantaminen sekä kalvoon sitoutuneen ja liukoisen efriini-A1 kasvainsoluissa. Nämä tulokset antavat ensimmäistä näyttöä siitä, että PI3K /Akt /eNOS signalointiryöpyn voi edustaa yhteistä koulutusjakson hypoksia-indusoituvaa efriini-A1-riippuvaista angiogeneesistä verisuonten kehitykseen ja syövän etenemiseen.

Kertyvät todisteita vahvisti, että tehokas angiogeneesin edellyttää bioaktiivisten NO syntetisoitiin eNOS, joka ilmentyy pääasiassa verisuonten endoteelisoluissa. On raportoitu, että NO on kriittinen välittäjä VEGF-angiogeneesiä, joka voi estää L-NAME [27]. Vastaavasti Statiinit voivat säätää ylös eNOS ilmaisun, ja edistää NO-riippuvainen angiogeneesistä vähentämällä caveolin-1 runsaus [28]. Ensimmäistä kertaa, huomasimme, että NO-tuotantoa on myös olennaista angiogeneesiä vastauksena angiogeneesiä molekyyli efriini-A1. Efriini-A1-Fc aiheuttaman solujen vaeltamiseen ja kapillaarinen kokoonpano oli vaimentunut, kun hankittua käsiteltiin L-NAME. Kiehtovan, meidän lisäksi tutkimus osoitti, että kohonnut NO synteesiä efriini-A1 aiheuttama hankittua oli pääasiassa johtuvan eNOS fosforylaation Ser1177 jäämiä, mutta ei parantamiseksi eNOS ilmaisua. On hyvin tunnettua, että fosforylaatiota on yksi tärkeimmistä jälkeisen siirtymäkauden sääntely mekanismeista eNOS aktivointi [20], [29]. Lisänäyttönä meidän havainnon, monenlaisia ​​ärsykkeitä, jotka edistävät eNOS aktivointi myös havaittu aiheuttavan fosforylaatiota eri paikoissa, kuten Thr495, Ser633 ja Ser1177 [30]. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy ensimmäiset todisteet että efriini-A1 on koordinoitu rajat puhua eNOS /NO angiogeneesin edistämiseen.

Vaikka korrelaatio lisääntyneen eNOS toimintaa efriini-A1-angiogeneesiä havaittiin tässä tutkimuksessa signaalireitin mukana efriini-A1 aiheuttama tehostaminen eNOS aktiivisuuden vielä lisätutkimuksia. On raportoitu, että leikkausjännityksen indusoiman NO-tuotanto näyttää olevan ohjataan Akt-riippuvaisen fosforylaation eNOS viljellyissä EC [31]. Lisäksi, Akt proteiinikinaasi on osoitettu toimivan EY eloonjäämistekijä ja edistää putken muodostumista in vitro [32]. Aikaisemmat tutkimukset ovat myös ehdottaneet, että PI3K /Akt-reitin välittäjänä indusoiman angiogeneesin useita angiogeenisten ärsykkeiden, kuten VEGF: n [33], forskoliini [34], mikrogravitaatiota [35], ja niin edelleen. Tutkia toiminnallinen osallistuminen PI3K /Akt-reitin efriini-A1-eNOS cross-talk, vaikutus LY294002 on efriini-A1 aiheuttama signalointi tapahtumien määritettiin. Stimulaation jälkeen efriini-A1-Fc: ssa 30 minuuttia, fosforylaatio sekä Akt ja eNOS oli kohonnut merkittävästi. Tämä korkeus johtui fosforylaation Akt

Ser473 ja eNOS

Ser1177, kuten osoitettiin Western blot -analyysillä. Altistuminen LY294002 esti efriini-A1-indusoidun ilmentymisen P-Akt

Ser473 ja P-eNOS

Ser1177 ilmeisesti osoittaa, että PI3K /Akt: sta riippuvaisen signaalireitin osallistui ohjaamiseksi efriini-A1-aktivaatio eNOS.

Hypoksia on yksi tärkeimmistä ominaisuuksista kasvaimen mikroympäristössä, ja moduloi lajikkeet angiogeenisten tekijöiden, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) [36]. Efriini-A1 tunnetaan myös angiogeeninen tekijä, ja sillä keskeinen rooli uudissuonittumisen erilaisten syöpien [4]. Aikaisemmat tutkimukset ovat havainneet, että efriini-A1-geeni voidaan saada aikaan tuumorinekroositekijä-α (TNF-α) endoteelisoluissa [37]. Äskettäin Uemura et ai. tunnistettu efriini-A1 mahdollisena ehdokkaana hypoksia-geenin, jonka mikrosiruanalyysillä kudosnäytteitä metastasoitunut kolorektaalisyöpä [38]. Myös ilmaus efriini-A1 ja liittyvät geenit olivat merkittävästi pienentyneet HIF-2α taintumisen (kd /kd) endoteelisolujen, mikä rooli hypoksia efriini-A1 sääntelyä [39]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme jos suoraa näyttöä siitä, että altistuminen hypoksia johti kohonnut efriini-A1 ilmentymistä syöpäsoluissa Western blot -analyysillä. Efriini-A1 oli ensimmäinen tunnistettu GPI-ankkuroitu proteiini, joka vaatii kalvoon sitoutumisen tai klustereiden /oligomerisaatioon sen aktivointia EphA2 [40]. Näin ollen meidän tulokset viittaavat siihen, että säätely ylöspäin kalvoon sitoutuneen efriini-A1 aiheuttama hypoksia saattaa edistää kasvaimen angiogeneesin vuorovaikutuksessa sen reseptorin EphA2 endoteelisoluissa kasvaimen mikroympäristössä. Lisäksi olemme dokumentoitu tässä tutkimuksessa, että hypoksian sääteli liukoista muotoa efriini-A1 vapauttava syöpään solujen solunulkoiseen ympäristöön. Noudattaen havainnon, efriini-A1 on myös havaittu seerumissa potilailla, joilla on maksan karsinooma [41]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että liukoinen monomeerinen efriini-A1 on toiminnallinen ligandi EphA2, ja että liukoinen efriini-A1 vapautuu HeLa ja SK-BR3-soluja on tarpeen solujen kasvun ja transformaatio [4]. Samanlaisia ​​näihin tutkimuksiin, havaitsimme morfologiset muutokset U-251-soluilla CM stimulaatiota. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan vahvistaa, onko hypoksian aiheuttaman liukoisen efriini-A1 voi toiminnallisesti vuorovaikutuksessa EphA2 aloittaa angiogeneesiä.

Yhteenvetona merkittävin ja uusia havaintoja esitetään tässä tutkimuksessa sisältävät että 1) efriini -A1 yhteistyötä eNOS edistämisessä angiogeneesissä HUVEC; että 2) cross-talk välillä efriini-A1 ja eNOS välittyy PI3K /Akt-riippuvaisen reitin; ja että 3) hypoksia ajan säätelee sekä kalvoon sitoutuneita ja erittävät efriini-A1 proteiinin syöpäsoluissa. Koska vain muutama tutkimukset ovat keskittyneet efriini-A1-laukaista loppupään molekyyli tapahtumia, tulokset on raportoitu tässä tunnistaa PI3K /Akt-riippuvaisen eNOS

Ser1177 fosforylaation uutena mekanismin taustalla efriini-A1modulation angiogeneesin (kuvio 6).

tukeminen Information

Kuva S1.

ilmentyminen EphA2 reseptorin viljellyissä HUVEC. Immunofluoresenssi (A), RT-PCR: llä (B) ja Western blot-analyysi (C) osoitti positiivisen EphA2 ilmentymistä HUVEC.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0074464.s001

(TIF)

Kuva S2 .

Cell migraatiokokeessa osoitti, että L-NAME ja LY294002 esti efriini-A1 stimuloiman migraation HUVEC (200 x). Endoteelisolujen migraatiota mitattiin HUVEC, joka oli nälkiinnytettiin kasvutekijä-free 0,1% BSA EBM-2: ssa yön yli ja käsiteltiin efriini-A1-Fc: tä (1 ug /ml) 24 tuntia.

Doi: 10,1371 /lehti. pone.0074464.s002

(TIF) B Kuva S3.

Tube muodostuminen määrityksessä osoitti, että L-NAME ja LY294002 esti efriini-A1-stimuloi putken muodostumiseen HUVEC. A, B, C: Kuvat ovat 40 x. D: Kuvat ovat 200 x.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0074464.s003

(TIF) B Kuva S4.

endoteelisolujen proliferaatiota mitattiin HUVEC käsitelty efriini-A1-Fc: tä (1 ug /ml) ja 0 h, 24 h ja 48 h. Ei ollut tilastollista merkitystä välillä EA1-Fc ja kontrolliryhmä. EA1-Fc, efriini-A1-Fc. (#,

P

0,05, n = 3).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0074464.s004

(TIF) B Kuva S5.

vaikutus efriini-A1-Fc fosforylaatiota eNOS ja Akt in HUVEC. A, B, C: Western blotit osoittavat, että P-eNOS

Ser1177 ja P-Akt

Ser473 oli ajan säännellään efriini-A1-Fc stimulaatiota ajasta riippuva tavalla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0074464.s005

(TIF) B Kuva S6.