Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on yksi johtavista syöpäsairauksia maailmanlaajuisesti, mutta sääntelymekanismi sen kasvun ja etäpesäkkeiden on edelleen huonosti. Olemme tutkineet voi ilmoittaa immunoglobuliini G (IgG) geenien okasolusyöpää ja adenokarsinoomista keuhko- ja liittyvät syöpäsolun linjat. Runsas mRNA IgG ja olennaisia ​​entsyymejä IgG-synteesi, rekombinaation aktivaation geenien 1, 2 (RAG1, 2) ja aktivointi aiheuttama sytidiinideaminaasin (AID) havaittiin syövän soluissa, mutta ei viereiseen normaaliin keuhkokudoksessa tai normaali keuhkojen epiteelisolujen line . Laajuudet IgG ilmaisun 86 keuhkosyövässä todettiin yhdistää kliiniseen vaiheeseen, patologisia laatu ja imusolmuke etäpesäke. Huomasimme, että knockdovvn IgG siRNA aiheutti laskua solujen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja lisälaite viljellyt keuhkojen syöpäsoluja. Etäpesäke liittyvä geeni 1 (MTA1) näytti koekspressoitu IgG keuhkojen syöpäsoluja. Tilastollinen analyysi osoitti, että määrä IgG ilmentyminen korreloi merkittävästi että MTA1 ja imusolmukemetastaaseja. Inhibitio MTA1 geeniekspression siRNA johti myös vähenee solujen maahanmuuton ja lisälaite viljellyt keuhkojen syöpäsoluja. Nämä todisteet ehdotti, että estäminen syövän muuttoliikkeen ja kiinnityksen aiheuttama IgG alassäätöä voitaisiin saavuttaa MTA1 sääntelyn kautta. Tulosten perusteella näyttää, että keuhkosyöpä tuotettu IgG on todennäköisesti tärkeä rooli syövän kasvua ja etäpesäkkeiden merkittäviä kliinisiä vaikutuksia.

Citation: Jiang C, Huang T, Wang Y, Huang G, Wan X, Gu J (2014) immunoglobuliini G ilmentäminen Keuhkosyöpä ja sen vaikutuksia etäpesäke. PLoS ONE 9 (5): e97359. doi: 10,1371 /journal.pone.0097359

Editor: Oliver Schildgen, Kliniken der Stadt Köln gGmbH, Saksa

vastaanotettu: 19 joulukuu 2013; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 22, 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia (30971150 JG, 81001199 ja ZC) National Natural Science Foundation of China. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista pahanlaatuisia kasvaimia maailmanlaajuisesti erittäin korkea kuolleisuus [1], [2]. Etäpesäke on tärkein kuolinsyy ja ajan tasalla ei ole tehokasta hoitoa metastaattisen keuhkosyövän. Keuhkosyöpä voidaan jakaa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), joka perustuu niiden patologisia piirteitä ja kliininen käytös [3]. NSCLC aiheuttaa 84% keuhkosyövässä, joista suurin osa on okasolusyöpä (LSCC) ja adenokarsinooma (LAC) [4]. LSCC ja LAC valittiin esineitä tässä tutkimuksessa.

Äskettäin, kumulatiivinen todisteita ovat osoittaneet, että ihmisen kasvainsoluissa, mukaan lukien syöpää rinta-, keuhko-, eturauhas-, paksusuoli-, ruokatorven, kilpirauhasen ja istukan trophablast sekä sarkoomat voi syntetisoimiseksi immunoglobuliini G (IgG) [5] – [19]. Olennaisia ​​entsyymejä, mukaan lukien rekombinaation aktivaation geenien 1, 2 (RAG1, 2) ja aktivointi aiheuttama sytidiinideaminaasin (AID) syntetisoimiseksi IgG: B-lymfosyyttien ja plasman soluja havaittiin myös syöpäsoluja [20] – [22]. CA215, immunoglobuliinisuperperheen proteiini alun perin eristetty munasarjasyöpä on ajateltu olevan IgG syöpä alkuperä [23] – [25]. Blockade syöpä IgG antisense-RNA tai IgG-vasta tukahdutti syöpäsolujen kasvua ja apoptoosin [5], [26] – [28]. Havaitsemalla IgG ilmentymistä 142 ruokatorven syöpiä ja 80 pehmytkudoksen kasvaimet, ja vertaileva analyysi IgG ilmaisutapoja patologinen parametreja, syöpä- IgG havaittiin korreloivan kasvaimen ja proliferatiivista markkereita, kuten PCNA ja Ki-67 rinta-, ruokatorven ja pehmeät kudokset [8], [11], [29]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että syöpä IgG saattaa olla rooli säätelyssä syövän kasvua. Kuitenkin vaikutus IgG keuhkosyövän ja mahdollinen mekanismi ohjaavien toimien ei ole tutkittu.

Etäpesäke on monimutkainen prosessi, erilaisia ​​proteiineja, jotka toimivat irrottamalla syöpäsolujen ensisijainen sivustoja, soluttautuminen aluksiin ja lymphatics , ankkurointia endoteelejä, tunkeutumisen ympäröivään matriisiin, extravasating, angiogeneesin, välttäen kasvaimen vastaisen immuniteetin, ja kasvaa metastaasien. Metastasis liittyvä geeni 1 (MTA1) on olennainen osa nukleosomin remodeling ja deasetyloimalla (Nurd) kompleksi histoni [30], [31]. MTA1 säätelee transkriptiota etäpesäkkeiden liittyvien geenien muokkaamisen kohteena chromatin asetylaatio asema sekä kofaktorina saatavuutta kohde-DNA. Korkea MTA1 ilme on havaittu olevan läheistä sukua invaasion ja imusuonten etäpesäkkeiden eri karsinoomat [32] – [34].

Tässä tutkimuksessa selvitimme hajotuskuvio IgG, ja suhde sen ilme ja patologinen parametrit 86 LSCC ja LAC. Tutkimme lisäksi mahdollisia vaikutuksia syövän tuotetun IgG solu- kiinnitys ja muuttoliike käyttäen tekniikkaa siRNA häiriöiden liitetiedostona määrityksessä siirtokuoppaan määritys, ja haavan paranemista määritys kahdella keuhkosyöpä solulinjoissa sekä normaalissa keuhkoepiteelin solulinjassa. Tutkimme myös suhdetta IgG-geenin ilmentymisen ja metastaasien lukumäärän liittyviä geenejä. Huomasimme, että syöpä IgG voi olla keskeinen rooli keuhkosyövän etäpesäke läpi säännellä metastaattisen geenin MTA1.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus toteutettiin mukaisesti Helsingin julistuksen ja hyväksynyt eettinen komitea Shantou University Medical College. Kirjallinen suostumus saatiin potilailta tai heidän perheensä käyttämiseksi näytteitä tutkimusta.

Solulinjat

Ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma solulinjaa SK-MES-1, keuhkoadenokarsinooma A549, normaali keuhkojen epiteelisolujen linja Beas2B, ja Burkittin lymfooman Raji ostettiin ATCC: ltä (Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää. Kaikki solulinjat viljeltiin kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

kudosnäytteitä

kahdeksankymmentäkuusi formaliini fiksaatio parafiiniin upotettuja keuhkosyöpä yksilöitä erityisesti viereisille normaali keuhko kudosta haettiin Patologian osasto, Shantou University Medical College sidoksissa Kasvain sairaalan ja Patologian osasto, Xiangyang keskussairaala, Hubein maakunnassa 2006-2011 täydelliset kliiniset tiedot ikäisiä, sukupuoli, histologinen tyyppi, patologinen laatu, kliinisessä vaiheessa ja imusolmuke etäpesäke. Kaksi harjoitellaan patologit tutkinut uudelleen hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Zymed Laboratory, South San Francisco), ja visualisoitiin 3-amino-9-etyyli-karbatsoli (AEC; Golden Bridge International). Ensisijainen vasta-aineet on lueteltu taulukossa S1. Ruumiinavaus terve nielurisojen kudokset käytettiin positiivisina kontrolleina Igγ, IgK ja Igλ immunovärjäyksin. PBS sijaan primaaristen vasta-aineiden, käytettiin negatiivisena kontrollina. Jotta varmistetaan spesifisyyden immunovärjäyksen vasta-aine, pre-absorption koe suoritettiin, jossa ensimmäinen vasta-aine Igγ on esi-inkuboida puhdasta ihmis-IgG: n moolisuhde 1:01, 1:05 ja 1:10. Sekoitettua liuosta inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli ja sitten sijasta käytettiin primaarisen vasta-aineen.

Igγ ja MTA1 ilmaisun pisteytys

pisteytys on Igγ immunovärjäyksellä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu pienin muutoksin [8]. Prosenttiosuus ja voimakkuus positiivisten solujen hankittiin laskemalla syöpäsolujen 10 satunnaisesti valittua näkökentät alle 400-kertainen suurennus. Pisteytys 0-3 varten positiivisten solujen prosenttiosuuden oli: 0 = 5%; 1 = 5-25%; 2 = 25-50%; ja 3 = 50%. Intensiteetti IHC värjäys pisteytettiin: 0, 1, 2, 3, joka edustaa puuttuminen signaali, heikko signaali (vaaleanpunainen), kohtalainen signaali (punainen) ja vahva signaali (tummanpunainen), tässä järjestyksessä. Lopullinen tulos tapauskohtaisesti määritettiin lisäämällä molemmat tulokset yhteen ja kokonaistulokset luovutettiin negatiivinen (-), kun summa on 0 tai 1, heikosti positiivinen (+), kun summa oli 2 tai 3, kohtalaisen positiivinen (++ ), kun summa oli 4 tai 5, ja vahvasti positiivinen (+++), kun summa oli 6. tutkia suhde Igγ ja MTA1 näytteet keuhkosyöpään jaettiin 2 ryhmään mukaan tulokset Igγ immunovärjäyksen. Tapaukset pistein 0-3 pidettiin ”heikko ilmaus” ja 4-6 kuten ”vahva ilmaus”.

pisteytys on MTA1 Immunovärjäyksen laskettiin käyttäen merkintöjä indeksi (LI) seuraavasti: LI = 100 x (p /t),% ( ”p” on määrä MTA1-positiivisten syöpäsolujen ja ”t” on määrä yhteensä syöpäsoluja). Noin 3000 solua alle × 400 suurennus laskettiin (10 satunnaisesti valittua kenttiä kukin dia).

In situ -hybridisaatio

Koettimet suunniteltu havaitsemaan ihmisen immunoglobuliini G1 raskaan ketjun pysyvä alue (IGHG1) . PCR-alukkeet IGHG1 olivat seuraavat: sense, 5′-ACGGCGTGGAGGTGCATAATG-3 ’; antisense, 5’-CGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTT-3 ’. Menetelmä syntetisoida spesifisiä koettimia on raportoitu aiemmin [6]. Lyhyesti sanottuna, revennyt perna aiheuttama trauma käytettiin erottamaan lymfosyyttejä. PCR-tuote subkloonattiin pGEM-T -vektoriin (Tiangen Biotech, Peking, Kiina). Tämän jälkeen endonukleaasi

Ncol

I tai

Sal

I käytettiin linearisoimaan uusi plasmidi, ja T7 tai Sp6-RNA-polymeraasia käytettiin tuottamaan antisense- tai sense koettimen kanssa uusi plasmidi kuin malli.

ISH suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Lyhyesti, parafiini poistettiin, vedettömät kudoksen Levyjä käsiteltiin 0,1 M HCl: ssa 10 minuuttia, kuumennettiin 100 ° C: sitraattipuskurissa (0,01 M, pH 6,0) 15 minuutin ajan, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan ja sitten kuivattu 90 % etanolia. Kuiviin kokonaan, laseja inkuboitiin 20 ul: lla hybridisaatio- sisältävä seos lisättiin 18 ui laimennusainetta ja 2 ui sense tai antisense-koettimella 50 ° C: ssa 18~20 h. Kun oli pesty 5 x SSC, 2 x SSC plus 50% formamidia ja 2 x SSC kahdesti 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, kalvot estettiin hevosen seerumia huoneenlämmössä 1 h, ja inkuboitiin anti-digoxigemin-Ap Fab-fragmentteja (1:500, Roche Diagnostics, Rotkreuz, Sveitsi) huoneenlämpötilassa 1 tunti. Objektilasit värjättiin käyttäen NBT-BCIP (Promega, Madison, USA). Viljeltyjä soluja kasvaa dioja, kaikki menettelyt olivat samanlaisia ​​kuin kudos dioja, paitsi deparaffin, nesteytys ja lämmitys haku. Muihin laseja inkuboitiin sense-koettimien negatiivisina kontrolleina.

Immunofluoresenssi

A549, SK-MES-1 ja Beas2B annettiin kasvaa dioja. Immunofluoresenssikoe suoritettiin protokollan kuten aiemmin on kuvattu [11]. Primaaristen vasta-aineiden Tässä määrityksessä käytetyt on kuvattu taulukossa S1. Pesun jälkeen PBS: ssä, laseja inkuboitiin FITC-konjugoidun vuohen anti-kani-/vuohen anti-hiiri-IgG (Zhongshan Golden Bridge, Peking, Kiina) huoneenlämpötilassa 30 min. DAPI käytettiin vastavärjäämiseksi ytimiä. Objektilasit tutkittiin ja valokuvattiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss AxioImager Z1, Zeiss GmbH, Göttingen, Saksa).

Laser ohjataan mikrodissektion, RNA ja käänteistranskriptioon

Tuoreet jäädytetyt kudosnäytteet leikattiin 10 pm, joka on asennettu polyeteeni (PEN) -kalvo dia (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa) ja sitten heti kiinnitettiin 75% etanolilla 1 minuutin ajan. Kohdesoluja kohdissa otettiin microdissected ja kerätään korkki Eppendorf-putkessa laser teho käyttämällä Leica Mikrodissektiomenetelmiä Systems 6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa). Kokonais-RNA uutettiin eristettyjä soluja, joilla on RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Target cDNA syntetisoitiin, jossa yläindeksi III ensimmäisen juosteen synteesiin (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

TRIZOL (Invitrogen), kloroformin, isopropanolin ja etanolin käytettiin poimia RNA kudosnäytteistä protokollan mukaisesti, jonka Invitrogen. RNase Free DNaasia (Invitrogen) käytettiin poistamaan mahdollisimman genomisen DNA-kontaminaation. Target cDNA tuotettiin ensimmäisen juosteen cDNA systhesis Kit (Toyobo tieteellinen, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden.

polymeraasiketjureaktion (PCR) B

Kuten aiemmin on kuvattu, IGHG1, RAG1, rag2, ja AID monistettiin nested PCR [8]. Alukkeet (Sangon Biotech, Shanghai, Kiina), jota käytetään tässä määrityksessä on esitetty taulukossa S2. PCR-tuotteet tutkittiin 2% agaroosigeelielektroforeesilla. Sijasta vettä cDNA: ta käytettiin PCR-malleja negatiivisina kontrolleina niiden geenejä, joiden alukkeet ulottuvat kaksi eksonia. Sillä RAG1, rag2 ja IgK, jonka alukkeet sijaitsee yksi eksoni, RNA käsiteltiin DNaasi käytettiin negatiivisena kontrollina. Raji solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina. Housekeeping-geeni GAPDH käytettiin normalisoimaan suhteellisten ekspressiotasojen.

DNA: n sekvensointi

PCR prodocts varten Vγ, VK ja V ^ uutettiin agaroosigeelissä DNA Extraction Kit (TaKaRa Biotech, Dalian, Kiina) ja sitten kloonataan pGEM-T -vektoriin (Tiangen Biotech, Peking, Kiina). Sen jälkeen transfektoidaan toimivaltaisten

E. coli

TOP10, uutta kloonia muodostettiin jotka monistettiin bakteerien jalostukseen. Sen jälkeen, uudet kloonit puhdistettiin Universal DNA Purification Kit (Tiangen Biotech) ja tutkittiin 2% agaroosigeelielektroforeesilla. Uudet klooneja käytettiin DNA: n sekvensointi, joka suoritettiin BGI-Shenzhen, Kiina. Sekvenssit Uuden kloonien verrattiin tunnettuihin sekvensseihin GenBank verkkosivuilla (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Real-Time PCR ja kvantitatiivinen analyysi

Käyttämällä ABI PRISM 7500 väline, reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBR Esisekoite Ex Taq II (Takara Bio Inc., Dalian, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Havaita alavirran geenien mahdollisesti säätelee IgG, yhteinen metastaattinen geenit MTA1, CD44, E-kadheriinin, MMP-9, MMP2 ja Intergrin β1 tutkittiin seuraavia siRNA häiriötä (katso ”RNA-interferenssi”). Käytetyt alukkeet reaaliaikaista PCR lueteltu taulukossa S3. Monistuminen β-aktiini käytettiin normalisointi. Suhteellinen ilmauksia kunkin geenin testattu solutyypit määritettiin menetelmän 2

-ΔΔCt [36].

Western blot

Western blot suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [11 ]. Proteiininäytteitä 150 ug ajettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Koko molekyyli IgG oli ei-pelkistävällä geelit ja muut proteiinit olivat vähentämiseen geelejä. Primaaristen vasta-aineiden Tässä määrityksessä käytetyt on kuvattu taulukossa S1. Havaitsemaan alavirran geenien mahdollisesti säätelee IgG, yhteinen metastaattinen geenit MTA1, CD44, E-kadheriinin, MMP-9, MMP2 ja Intergrin β1 tutkittiin seuraavia siRNA häiriöitä IgG geenejä. Puhdasta ihmisen IgG: tä käytettiin positiivisena kontrollina ja siivous geenin β-aktiini käytettiin normalisoimaan suhteellisten ekspressiotasojen.

RNA-interferenssi

viljeltiin A549, SK-MES-1 ja Beas2B solujen jaettiin kolmeen ryhmään (siRNA-IGHG1 tai siRNA-MTA1, siRNA-salattu ja käsittelemättömän). Salattu siRNA: t käytettiin negatiivisena kontrollina. Kaikki siRNA: t hankittiin Shanghai GenePharma Inc. IGHG1 siRNA sekvenssit olivat sense: 5′-CCAAGGACACCCUCAUGAUTT-3 ’ja antisense: 5′-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3′; MTA1 siRNA sekvenssit olivat sense 5’-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCTT-3 ’ja antisense 5′-GCUUUAACUUGCUCUCAGCTT-3′; salattu siRNA sekvenssit olivat sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’ja antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. Sillä siRNA transfektiota, X-tremeGENE reagenssia (Roche Diagnostics) käytettiin. Suhde transfektioreagenssia että siRNA oli 10 ui: 2 ug per 3 x 10

5 solua. Transfektion menettely suoritettiin valmistajan ohjeiden. Tehokkuus siRNA häiriöitä tutkittiin Reaaliaikainen PCR 48 tuntia myöhemmin ja Western blot 72 tuntia myöhemmin.

MTS-määritys

Noin 1 x 10

4 syöpäsolujen (A549 tai SK-MES-1) ympättiin ja viljeltiin 96-kuoppaisella levyllä 24 tuntia. Solut jaettiin seuraaviin ryhmiin: testiryhmään (siRNA-salattuja ja siRNA-IGHG1), käsittelemätön ryhmä ja tyhjä ryhmä (täydellistä alustaa ilman syöpäsolun). RNA häiriöitä menettely toteutettiin ja viljeltiin 48 tunnin ajan. MTS (Jianchen Biosciences, Nanjing, Kiina, 20 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja inkuboinnin jälkeen 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa 1 h: n OD-arvo kunkin luettiin 450 nm: ssä ultraviolettisäteilyllä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Solulisäkasvumäärityk- laskettiin seuraavasti:

Liite määritys

Tiedot kiinnityskohdassa määritykset on kuvattu aikaisemmin vähäisin muutoksin [37]. Lyhyesti, viljellyt A549, SK-MES-1 ja Beas2B solut transfektoitiin siRNA. Kaksi päivää myöhemmin, 1 x 10

4 solua kuoppaa kohti ympättiin Matrigel-päällystetty 96-kuoppalevyille (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). 2 tunnin kuluttua, levyt pestiin poistamaan ei-liima-soluja. Kukin kuoppa, inkuboitiin 20 ul: MTS reagenssit 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja optinen tiheys havaittiin 450 nm: n aallonpituudella ultravioletti. Ohjaimia salattu siRNA: t suoritettiin samaa protokollaa edellä kuvatulla tavalla. Solu istutustiheyteen on empiirinen arvo. Tavoitteena on luoda 30% -50% cell yhtymäkohta jälkeen solu noudattaminen viljelylevyssä helpottamaan kasvua. Kun perustettu, istutustiheyteen oli sama kaikissa ryhmissä varmistamiseksi tasapuolinen vertailu.

Transwell määrityksessä

Sulanut metrigel sekoitettiin precolled DMEM lopullisessa konsentraatiossa 0,8 ug /ul ja sitten päällystettiin yläkammiot transwell inserttien (Millipore, Billerica, MA) 100 ul /kuoppa vasta saostavat 37 ° C: ssa. 48 tunnin kuluttua siRNA transfektion, noin 1 x 10

5 trypsinisoitiin solut ympättiin ylempään kammioon käyttämällä seerumitonta DMEM. Jälleen solun istutustiheyteen oli samanlainen kaikissa ryhmissä. Transvvell- insertit asetettiin 24-kuoppaisen levyn kuoppiin, joissa 200 ui DMEM plus 10% FBS asetettiin. Levy asetettiin vielä 37 ° C: ssa 24 tuntia. Analyysit lopetettiin sitten poistamalla ei-valtaavat solut ylemmässä kammiossa vanupuikkoja. Solut alapuolen insertin värjättiin hematoksyliinillä. Solut viidellä visuaalinen kentiltä 400 kertainen suurennus kohti insertin laskettiin ja valokuvattiin.

Haavan paranemista määritys

Viljelty A549, SK-MES-1 ja Beas2B solut ympätään 12-kuoppalevyille ( 1 x 10

5 solua /kuoppa) transfektoitiin siRNA kuten edellä on kuvattu. Kun solut saavuttivat 90% konfluenssin, pyyhkien yksisolukerros steriilillä 10 ui pipetin kärjen käytettiin luomaan haava-alueelle. Sitten levyt pestiin PBS: llä poistamiseksi irrotettuja soluja, ja soluja viljeltiin FBS-DMEM: llä. Sen jälkeen levy asetettiin vielä 37 ° C: ssa 48 tuntia. Haava-alue seurattiin käännettyä mikroskooppia ja valokuvattiin.

Tilastollinen

väliset korrelaatiot Igγ ilmentyminen keuhkosyövässä ja erilaisia ​​kliinisiä patologisia parametrejä suoritettiin Pearson chi-neliö testi.

t-testiä käytettiin vertaamaan saatujen tietojen kanssa kolme ryhmää, eli siRNA-IGHG1, siRNA-salattu ja käsittelemättömän määrityksissä MTS, siirtokuoppaan, kiinnitys, reaaliaikainen PCR ja Western blot. Korrelaatiot Igγand MTA1 ilmaisuja ja välillä MTA1 ilmaisun ja kliinisiä patologisia parametreja arvioitiin Studentin t-testiä. Merkitsevyystasoksi asetettiin

p

0,05.

Tulokset

Igγ, IgK ja Igλ ilmaisuja LSCC ja LAC

Useimmat keuhkosyöpätapauksista ( 85%), tutkittiin ilmaistuna Igγ ja IgK, kun taas pieni määrä ( 15%) ilmaisi myös Igλ samanaikaisesti. Igγ, IgK ja Igλ ilmaistiin samoissa soluissa kuin osoitettu peräkkäistä leikettä. Positiivinen värjäys signaalit paikantuvat sytoplasmaan sekä solukalvoissa. Suurin osa positiivisten syöpäsolujen jaettiin syrjäseutujen syöpä pesii LSCC tai epäjatkuva täplikäs kuvio putkimainen rakenteisiin LAC (kuvio 1, A-F). Monet IgG postive syöpäsoluissa oli epätyypillinen ytimet ja ydinvoiman tiivistymistä. Ruumiinavaus risat sisälsi Igγ, IgK ja Igλ immuunivaikutukset B-lymfosyyteissä (Kuvio 1, G-I). Hyödynsimme CD20 merkkiaineena B-lymfosyyttejä ja pannulla CK markkerina solujen epiteelin alkuperää. Joiden sarjanumero kohdat, havaitsimme kahdenlaisia ​​soluja, jotka ilmentävät Igγ. Yksi on suuri epithelioid soluja positiivinen pannulla CK, ja toinen on pieni pyöreä soluja positiivinen CD20. Perustuen morfologia ja solujen markkereita, tunnistimme, että entiset ovat syöpäsoluja ja jälkimmäiset soluttautuminen B-lymfosyyttejä (kuvio 1, J-O). Normaali keuhko- kudosta vieressä syövän pesiä ei sisältänyt positiivisia IgG immunoreaktiivisuus (kuvio 1, P-R).

A-C, Igγ (A), IgK (B) ja Igλ (C) immunovärjäyksin ovat positiivisia sytoplasmaan ja solun kalvo LSCC sarjavalmistukseen osissa. Huomautus: IgG positiiviset syöpäsolut jakautuvat kehällä kasvaimen massan. D-F, positiivisia signaaleja Igγ (D), IgK (E) ja Igλ (F) on esitetty sytoplasmassa ja solukalvon on LAC. G-I, Igγ (G), IgK (H) ja Igλ (I) ilmaisuja havaitaan lymfosyyteissä nielurisojen kudosten positiivisena kontrollina. J-L, Igγ (J), pan CK (K) ja CD20 (L) ilmaistaan ​​LSCC sarjavalmistukseen osissa. M-O, Igγ (M), pan CK (N) ja CD20 (O) ilmaistaan ​​leikesarjojen LAC. Igγ (P), IgK (Q) ja Igλ (R) eivät ilmenny normaaleissa epiteelisoluissa vieressä kasvaimen massan leikesarjojen. Musta arrowheads osoittavat samaan syöpäsolu sarjavalmistukseen osissa. Mustat nuolet osoittavat positiivisia lymfosyyttejä. AEC colorization, positiivinen immunovärjäyksin kanssa AEC ovat väriltään punaisia. Huomautus: IgG on positiivisia sekä syöpäsolujen ja tunkeutuvia lymfosyyttejä jälkimmäisen vahvempi kuin edellinen. Mitta-asteikko: 20 um.

vasta ennalta-absorption testejä, kasvavien pitoisuuksien puhdasta ihmisen IgG antigeenin johti intensiteetin vähentyessä immunovärjäyksen (kuvio 2, A-F). Tunkeutumisatmosfääri B lymphoctyes on mesenchyma ympäröivästä syöpä pesiä tai putkimaisen rakenteiden ilmaistuna IgG voimakkaampi kuin syöpäsolut. Edelleen erottaa syöpäsolujen lymfosyyteistä, tutkimme ilmauksia CD16, CD32, CD64 ja FcRn vuonna LSCC ja LAC. Ei syöpäsolut havaittiin ilmentävän näitä reseptoreita (kuvio 3, A-H), ja ainoastaan ​​solut, jotka ilmentävät niitä oli lymfosyyttejä (kuvio 3, I-L).

A-C, hiiren anti-humaani-Igγ monoklonaalinen vasta-aine: puhdas ihmisen IgG = 01:01, 01:05 ja 1:10 LSCC osissa. D-F, samanlainen kaltevuus suhde Igγ: puhdas n jatkuvassa LAC osissa. Lisäyksen kanssa antigeenin pitoisuuden (puhdas ihmisen IgG), positiivisen IgG signaali heikkeni. Bar: 20 pm.

CD16 (Fcy reseptori III) on esitetty LSCC (A) ja LAC (E) kudoksiin. CD32 (Fcy reseptori II) näkyy LSCC (B) ja LAC (F) kudoksiin. CD64 (Fcy-reseptori I) on esitetty LSCC (C) ja LAC (G) kudoksiin. FcRn (vastasyntyneiden Fcy reseptori) on esitetty LSCC (D) ja LAC (H) kudoksiin. Näissä kohdissa, positiivisia signaaleja vain ilmaistaan ​​sytoplasmassa ja kalvo lymfosyyttien, mutta ei positiiviset signaalit löytyvät syöpäsoluja. CD16 (I), CD32 (J), CD64 (K) ja FcRn (L) ilmaistaan ​​koepalana otetulle ihmisen nielurisojen kudokset positiivisina verrokkeina. Bar: 20 pm.

Lähes kaikki syöpäsolut olivat positiivisia IGHG1 mRNA. Peräkkäisissä leikkeissä, proteiinin ja Igγ ja mRNA IGHG1 olivat paikallisia sytoplasmaan saman syöpäsolujen ja infiltroivia B-lymfosyyttejä (kuvio 4, A, B, D ja E). Positiiviset signaalit IgG mRNA löydettiin myös B-lymfosyyttien ihmisen nielurisojen kudosten (kuvio 4, G ja H). Mitään positiivista signaalia ei havaittu lymfosyyttien ja syövät, kun tunne koetinta käytettiin (kuvio 4, C, F ja I). Normaali keuhko- kudosta vieressä syöpä pesiä ei ilmaista IgG-proteiinia ja mRNA IGHG1 (kuvio 4, J-L).

rinnakkaispaikantumisen IgG-mRNA: n ja proteiinin LSCC ja LAC kudosnäytteiden osoitettu ISH ja IHC . A-C, Igγ immunovärjäystä (A, punainen) ja mRNA-signaaleja (B, violetti, jossa antisense anturi) ovat positiivisia sarja osioita LSCC. C on negatiivinen kontrolli sense anturi. D-F, Igγ immunovärjäystä (D, punainen) ja mRNA-signaaleja (E, violetti, jossa antisense anturi) ovat positiivisia leikesarjojen LAC. F on negatiivinen sense anturi. G-I, Tonsil kudoksia käytetään positiivisena kontrollina. G on Igγ kanssa IHC positiivisia lymfosyyttejä. H on antisense anturin ISH positiivisia lymfosyyttejä. I on sense koettimen ISH näkyvissä mitään positiivista signaalia. J-L, Igγ proteiini (J) ja mRNA: n (K, antisense-koetin) eivät ilmenny normaaleissa epiteelisoluissa vieressä syöpäkasvaimen. L on järkeä koetin. Musta arrowheads osoittavat samaan syöpäsolut sarjavalmistukseen osissa. Mustat nuolet osoittavat positiivisten lymfosyyttien.

tuore kirurginen keuhkosyöpä kudosta, teimme LMD kaapata syöpäsolujen ja normaalien keuhkojen epiteelisolujen vieressä syövän pesiä vain ilman lymfosyyttejä (kuvio 5, A) havaitsemaan mRNA-transkriptit IgG lukien IGHG1, κ vakio (CK), λ vakio (CX), γ muuttuja (Vγ), κ muuttuja (VK), λ muuttuja (V ^), steriili ituradan selostukset (Iγ-Cy) ja olennaisia ​​entsyymejä kuten RAG1, rag2 ja AID immunoglobuliini synteesi ja luokan vaihtumista. Positiiviset signaalit näistä geeneistä havaittiin LSCC ja LAC syöpäsolujen sijaan normaalien keuhkojen epiteelisolujen (kuvio 5, B). Neljä tapausta keuhkosyövässä osoitti erittäin korkea homologia julkaistujen sekvenssien Vγ, VK ja V ^ vain muutamia geenimutaatioita. Vuoteen sekvenssirinnastus, Huomasimme myös, että V (D) J uudelleenjärjestely tapahtui raskasta ketjua tai kevyttä ketjua syntetisoitiin, mutta esitti yksitoikkoinen kuvio (kuva 6).

on edustava kuvia LMD vuonna LSCC, LAC ja normaali keuhkojen vieressä kasvain massa. B, bändit edusti että IgG-synteesi liittyviä geenejä havaittiin LSCC, LAC ja normaali keuhkojen kanssa LMD yhdistettynä RT-PCR. Ei CD19 havaittu, jolloin ilman mahdollisia B-lymfosyyttien saastuminen. Raji solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina. Vettä käytettiin negatiivisena kontrollina sijasta alukkeita. RNA käsiteltiin DNaasi (lyhennetty R) käytettiin mallina voidaan estää vääriä positiivisuuden 1 R-6R. NL on lyhenne normaali keuhko.

on sarjoissa Vγ, B on VK, ja C on V ^.

Detection IgG ja välttämättömiä entsyymit IgG-synteesi A549, SK-MES-1 ja Beas2B solulinjoissa

LSCC solulinja (SK-MES-1) ja LAC solulinja (A549) havaittiin ilmentävän Igγ, IgK ja Igλ kanssa immunofluoresenssilla (kuvio 7, A-F). Positiivinen signaali nähtiin sytoplasmassa ja solukalvon. Positiivisena kontrollina, Igγ, IgK ja Igλ havaittiin myös sytoplasmassa Raji-soluja (kuvio 7, G-I). Normaali keuhkojen epiteelisolujen linja (Beas2B) ei ilmaista Igγ, IgK ja Igλ (kuvio 7, J-L). Runsas IGHG1 mRNA: ta havaittiin A549 ja SK-MES-1 (kuvio 7, M ja O) sekä Raji-soluja (kuvio 7, Q). Mitään positiivista signaalia ei havaittu, kun sense-koetinta käytettiin (kuvio 7, N, P ja R). IGHG1 mRNA ei löytynyt Beas2B (kuvio 7, S ja T).

A-C, Igγ (A), IgK (B) ja Igλ (C) on ilmaistu A549-solujen immunofluoresenssilla. D-F, Igγ (D), IgK (E) ja Igλ (F) on ilmaistu SK-MES-1-soluissa. G-I, Igγ (G), IgK (H) ja Igλ (I) ovat Raji-soluja positiivisena kontrollina. J-L, Igγ (J), IgK (K) ja Igλ (L), ei ole ilmoitettu Beas2B soluissa. Positiiviset signaalit (violetti) ja IGHG1 antisense koetin nähdään sytoplasmassa A549 (M), SK-MES-1 (O) ja Raji (Q) soluja. N, P ja R esittävät negatiivisia tuloksia (sense koetin) A549, SK-MES-1 ja Raji-soluja. Ei positiivisia signaaleja löytyy Beas2B soluissa (S, antisense koetin, ja T, tunne koetin). Korosta solut ilman violetti signaalia, metyyli vihreä oli hyötyä vastavärjäämiseksi ytimet. Mittaviivat: 20 pm.

mRNA: t IgG ja olennaisten entsyymit IgG-synteesi oli kaikki ilmaistuna A549- ja SK-MES-1 sijasta Beas2B (kuva 8, A). Koko molekyylin IgG sekä eri fragmentteja, ts Igγ, IgK ja Igλ olivat havaittavissa A549 ja SK-MES-1-soluissa (kuvio 8, B), joka vastaa molekyylipainoltaan samankaltaisia ​​IgG B-lymfosyyttien. Läsnäolo RAG1, rag2 ja AID A549 ja SK-MES-1 Lisäksi vahvistettiin kanssa Western blot (kuvio 8, C). Toisin kuin syöpäsoluja, Beas2B ei näihin IgG osia tai näiden entsyymien IgG-synteesi (kuva 8, B ja C).

A, nauhojen edustaa, että IgG-synteesi liittyviä geenejä havaittiin RT-PCR-menetelmällä A549 ja SK-MES-1, kun taas ei Beas2B. B osoittaa, että IgG koko molekyylin, Igγ, IgK ja Igλ havaitaan A549, SK-MES-1, kun taas ei Beas2B kanssa Western blot. Ihmisen puhdas IgG käytettiin Molekyylipainostandardien verrata että keuhkosyöpään soluista. Raji-solulinja oli positiivinen kontrolli. C osoittaa, että RAG1, rag2 ja AID ilmentyvät keuhkosyövän soluja, kun taas ei Beas2B. Raji-solulinja toimi positiivisena kontrollina.

IgG ja MTA1 geeniekspressioiden inhiboi siRNA häiriöitä IGHG1

ilmentyminen Igγ sekä mRNA: ta (kuvio 9, A) ja proteiini tasoilla (kuvio 9, C ja D) oli nimenomaan alas-säädellä siRNA-IGHG1 A549 ja SK-MES-1cell linjat. Yhdessä IgG, MTA1 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt mRNA (kuva 9, B) ja proteiini tasolla (kuvio 9, C ja D) kahdessa solulinjassa. *,

p

0,05.