Krooninen sairaus

tiivistelmä

hallinto tehoton syöpähoidolla liittyy tarpeetonta myrkyllisyyttä ja kehittämiseen resistenttien kloonien. Cancer kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSLCs) vastustaa kemoterapiaa, mikä aiheuttaa uusiutumisen tauti. Siten kehittäminen testi, joka tunnistaa tehokkain kemoterapiaa johto tarjoaa suuren lupauksen yksilöllistä syöpähoitoihin. Olemme kehittäneet ex vivo kemoterapian herkkyyden määritys (ChemoID), joka mittaa herkkyyttä CSLCs sekä suurin osa kasvainsolujen erilaisia ​​kemoterapeuttisten aineiden. Kaksi potilasta, 21-vuotias mies (potilas 1) ja 5 kuukauden female (potilas 2), vaikuttaa anaplastinen WHO luokka III ependymoma seulottiin käyttäen ChemoID määritystä. Potilas 1 havaittiin herkkä yhdistelmä irinotekaanin ja bevasitsumabin, mikä johti pitkään taudin etenemistä vapaa 18 kuukauden ajan. Uusiutumisen jälkeen, yhdistelmä eri kemoterapialääkkeiden testattiin jälleen ChemoID määrityksessä. Huomasimme, että bentsyyli- isotiosyanaatin (BITC) huomattavasti lisääntynyt kemosensitiivisyys että ependymoma solujen yhdistelmä irinotekaanin ja bevasitsumabin. Sen jälkeen potilas 1 hoidettiin kahden kuukauden ajan irinotekaanin, bevasitsumabin ja täydentää ristikukkainen kasviuutteita sisältävä BITC, havaitsimme yli 50% kasvaimen regressio verrattuna pre-ChemoID skannata osoituksena MRI. Potilas 2 todettiin vastustuskykyiseksi kaikki hoidot testattu ja seuraavat 6 sykliä vinkristiini, karboplatiini, syklofosfamidi, etoposidi ja sisplatiini eri yhdistelminä, kasvain tämän potilaan nopeasti edennyt ja protonikimpulla hoito on suositeltavaa. Kuten odotettua eläinkokeissa suoritettu potilaan johdettu ksenografteissa hoidettiin ChemoID seulotaan lääkkeiden kertasi kliininen havainto. Tämä määritys osoittaa, että potilailla, joilla on sama histologinen vaiheessa ja luokan syöpä voi vaihdella huomattavasti heidän kliininen vaste, mikä viittaa siihen, että ChemoID testaus, joka mittaa herkkyyttä CSLCs sekä suurin osa kasvainsolujen erilaisia ​​kemoterapia-aineisiin voi johtaa enemmän tehokkaita ja yksilöllisiä syöpähoitoihin tulevaisuudessa.

Citation: Mathis SE, Alberico A, Nande R, Neto W, Lawrence L, McCallister DR, et al. (2014) Chemo-Ennakoiva määritys Targeting Cancer Stem-Like Solut Potilaat Vaikuttavat aivokasvaimia. PLoS ONE 9 (8): e105710. doi: 10,1371 /journal.pone.0105710

Editor: Caterina Cinti laitos Kliinisen fysiologian, c /o Toscana Life Sciences Foundation, Italia

vastaanotettu: toukokuu 27, 2014; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2014; Julkaistu: 21 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Mathis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimukset tukee osittain National Center for edistäminen Translational Sciences, National Institutes of Health, kautta lupanumeroon UL1TR000117 päässä National Center tutkimuksen Resources (NCRR), ja 5P20RR020180 National Cancer Institute, WV-INBRE 5P20RR016477, ja osittain Marshall yliopiston Translational palkinnon ja palkinnon Marshall-yliopiston Neuroscience (PPC). Pohjimmiltaan tämä käsikirjoitus on yksinomaan vastuu kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä NCRR ja NIH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka ependymomas ovat kolmanneksi yleisin aivokasvain lapsilla (seuraavissa astrosytooma ja medulloblastooma), ne ovat suhteellisen harvinaisia, noin 200 tapausta diagnosoitiin Yhdysvalloissa vuosittain [1], [2]. Niiden osuus 60% kaikista intramedullary kasvaimia ja 50% syntyy filum terminale [3].

hoito ependymomas voi olla haastavaa. Alkuperäinen vakiohoito ependymoma on leikkausta seuraa usein sädehoito ja kemoterapia. Vaikka kemoterapia on käytetty laajasti lapsilla ependymomas, on vain vähän kliinistä näyttöä siitä, että kemoterapia eloonjäämistä lasten tämäntyyppisen kasvaimen. Kemoterapia usein varattu diabeetikoilla, joiden kasvain leikkauksen jälkeen ja käytettäväksi alle 3-vuotiaiden yritetään viivyttää sädehoitoa [4].

Ei ole täysin selvää, miksi ei ole parannettu selviytymisen kemoterapiaa, mutta on tunnettua, että vastustuskyky erilaisia ​​yleisesti käytetty kemoterapeuttisten aineiden on yleinen ependymoma [5]. Siksi tutkimus ja kehitys uusien strategioiden ja integroitu hoitomuotojen on löydettävä tehokkaampia hoitoja tämän tyyppisen kasvaimen.

Potilaat, joilla on samassa vaiheessa ja arvosana syövän voi vaihdella huomattavasti niiden kliinisen vasteen ja siedettävyyden kemoterapiaa. Tehoton syöpähoidolla voi aiheuttaa tarpeetonta myrkyllisyyttä ja kehittämiseen resistenttien kloonien. Eloonjäänyt syöpäsolut ovat usein resistenttejä. Monia yrityksiä on tehty vuosien mittaan kehittämään

ex-vivo

syöpälääkkeen testi, joka voisi auttaa erottamaan parhaat hoitovaihtoehtoja jokaiselle potilaalle minimoiden myrkyllisyys.

Eläinten ksenograftimalleissa on osoittaneet, että vain osa syöpäsolujen kussakin kasvain kykenee aloittamaan kasvaimen kasvua. Tämä ominaisuus on esitetty useita erilaisia ​​ihmisen syövissä, sisällyttää ependymomas [6]. Tämä allas syöpäsolujen toiminnallisesti määritellään ”Cancer Stem-Like Cell” (CSLC) osajoukko. Mukaan ”syöpä kantasolujen kaltaisia ​​solu” teoria, kasvaimet ovat monimutkaisia, kasvava väestö poikkeavien solujen peräisin vähemmistö CSLCs. Nämä solut säilyttää varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia, että ne lisääntyvät hyvin hitaasti ja on ominaista itsensä uudistaa ja erilaistua fenotyypiltään heterogeeninen, poikkeava jälkeläiset [7] – [10]. Toisin kuin suurin osa kasvainsolujen, CSLCs vastustaa kemoterapiaa ja sädehoitoa ja vastaavat kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäkkeiden [9], [10].

Jotkut ependymomas ilmaista erilaisia ​​merkkiaineita stemness, kuten CD133. Lisäksi uusiutunut kasvaimet näytteille geeniekspression allekirjoituksen muodostaa jopa geenien mukana Kinetokori (ASPM, KIF11) tai hermoston kehittymistä (CD133, Wnt ja Notch väyliä) [11].

kohdistaminen CSLCs vuonna lisäksi suurin osa muista syövän solujen kasvain on uuden paradigman syövän hoidossa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että Hydrodynamic Tarkennus BIOREAKTORITEKNIIKKA (HFB) (Celdyne, Houston TX) valikoivasti rikastaa CSLCs syöpään solulinjoista, joita voidaan käyttää kemosensitiivisyys määrityksessä [8]. Lisäksi tämän strategian avulla voimme optimoida rikastamista CSLCs peräisin kasvainbiopsioissa ja ovat kehittäneet ChemoID kemoterapiaa herkkyyden määritys, joka mittaa vastauksen CSLCs ja suurin osa kasvainsolujen kemoterapian määrittää tehokkain yhdistelmä syöpälääkkeiden varten pahanlaatuisia hermostoa.

tässä tutkimuksessa me raportoimme, ensimmäistä kertaa, meidän tutkimus käyttäen ChemoID määritystä mitata herkkyys ja kestävyys CSLCs ja pääosa kasvainsoluja viljeltiin 2 koepaloja ihmisen ependymoma altistettiin useiden solunsalpaajiin jotka myös korreloi vastetta eläimen ksenografteissa käsitelty ennustetun lääkkeiden ja kliinisen vasteen saaneista potilaista.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

bentsyyli isotiosyanaatti (BITC) ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Bevasitsumabi (Avastin), sisplatiini, Oksaliplatiini, arabinosidi-C, VP-16, Irinotecan (Camptosar®, CPT-11), busulfaani, metotreksaatti, hankittiin kuten kliinisen laadun solunsalpaajiin.

Potilaat

Tapaus 1 on 21-vuotias miespotilas oli diagnosoitu intraduraalinen, intramedullary, ja ekstramedullaarista anaplastinen hajanainen selkärangan ependymoma, WHO luokka III. Tapaus 2 on 5-kuukauden ikäinen naispotilas diagnosoitu anaplastic WHO luokka III ependymoma.

ChemoID koe suoritettiin saatuaan potilaan kirjallinen suostumus mukaisesti eettisiä standardeja Helsingin julistuksen (1964, muutettu viimeksi vuonna 2008) on Maailman lääkäriliiton. Kaikki tiedot, myös kuvat, on anonymisoitu. Marshall University Institutional Review Board (IRB) on hyväksynyt tämän tutkimuksen pöytäkirjan mukaisesti # 326290. Osallistujat tai huoltajat osallistujan (jos lapsi osallistuja) antoivat kirjallisen suostumuksensa IRB hyväksytty tietoisen suostumuksen muoto osallistumaan tähän tutkimukseen jälkeen koulutettu noin tutkimusta protokollaa. Eettisten toimikuntien /IRB Marshall yliopistossa hyväksyi tämän lupamenettelyssä. Lapsille osallistujia tutkimukseen, kirjallinen suostumus saatiin lähiomaiset, talonmiesten tai huoltajat puolesta alaikäisten /lapsista omassa tutkimuksessa.

yksisolususpensioon ja Ensisijainen Cell Culture

yksisoluiset suspensiot päässä ependymoma koepalat valmistettiin käyttämällä gentleMACS Dissociator (Miltenyi, Auburn, CA), ja C putket käyttäen standardoitua, puoliautomaattista protokolla perustuu yhdistelmä mekaanisten kudoksen häiriöt ja inkubointi 50% liuos 0,025% trypsiiniä ja Accutasella (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA). Solut sarjaan maljattiin 24-kuoppaisille, 12-kuoppaisille, 6-kuoppaisille, 10-cm käsitellyn ruokia ja viljeltiin alakonfluenssista RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 5%: säteilytetty, lämmöllä inaktivoitua, määritellään naudan sikiön seerumia (ThermoFisher /Hyclone), ja 50 U penisilliiniä ja 5 ug streptomysiiniä /ml väliainetta (ThermoFisher /Mediatech).

Kolmiulotteinen BIOREAKTORITEKNIIKKA CSLCs Culture

hydrodynaaminen keskittyen bioreaktori (HFB) (Celdyne, Houston TX ) käytettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu proliferoituvat selektiivisesti CD133 (+) syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja [8]. Kasvatusaine, hapetus, nopeus, lämpötila ja CO

2 pidettiin johdonmukaisesti vakiona kymmenen päivää.

Solut laskettiin ja 1 x 10∧6 solut saatettiin pyörivään alus on 25 rpm ilmavirran vahvistettu 20%. Sitten solut poistettiin ja laskettiin uudelleen käyttäen trypaanisiniekskluusiolla määrittämiseksi solussa elinkelpoisuus ja solujen lukumäärä ja maljattiin 96 kuopissa kemosensitiivisyys testaus. Soluja inkuboitiin myös fluoresoiva vasta fenotyyppinen karakterisointi [8].

Cell Sorting

enintään 1 x 10∧7 solut järjestetty magneettinen soluerottelulla (MACS) järjestelmä , joka koostuu magneettisten helmien, joka on konjugoitu vasta-aine CD133 (Miltenyi, Auburn, CA). Lyhyesti, solut kerättiin käyttämällä 0,25% trypsiiniä, pelletoitiin ja merkitty CD133 /1 biotiini ja CD133 /2-PE. Solut pestiin ja leimattiin anti-biotiini magneettiset helmet, ja sitten läpi magneettisen kolonnin, jossa CD133 (+) soluja säilytetään, kun taas leimaamaton solut pylvään läpi. CD133 (+) säilytetään solut eluoitiin pylväistä poistamisen jälkeen magneetti. Positiiviset ja negatiiviset solut analysoitiin sitten FACS: lla puhtaudella.

virtaussytometria Studies

Solut analysoitiin antigeeninen kriteerien käyttäen anti-CD34 (Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD38 ( Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD44 (BD Bioscience, Sparks, MD), -CD117 (Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD133 /2 (prominin1) (Milteny Biotech, Auburn, CA), -Oct3 /4 (BD Bioscience, Sparks, MD), ja -Nanog (BD Bioscience, Sparks, MD). Lyhyesti, solut irrotettiin käyttäen 0,02% EDTA: ta PBS: ssä ja pelletoitiin (10 minuuttia 1000 rpm), pestiin 0,1% BSA: ta 1X PBS: ssä 4 ° C: ssa ja inkuboitiin liuoksessa, jossa oli 1 mg vasta-ainetta +9 ml: lla 0,1% BSA: ta 1X PBS: llä. Solut pestiin samalla liuosta kerran ja analysoitiin käyttäen C6 Accuri virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA).

ChemoID Pitoisuus

herkkyys kemoterapia arvioitiin käyttämällä elinkyvyn (WST8) 1 x 10∧3 solut levytettiin 5 jäljitelmät 96-kuoppaisille levyille. Lyhyesti, yhtä monta irtotavarana kasvainsolujen kasvatettu yksikerroksisessa ja CSLCs kasvatettiin bioreaktorissa, laskettiin ja ympättiin erikseen 96-kuoppaisilla levyillä ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sitten soluja altistettiin 1 tunnin pulssi paneelin kanssa syöpälääkkeiden valitsemalle onkologi matkia keskimääräinen kliininen kemoterapiaa infuusio aikataulussa.

vaikutuksen tutkimiseksi BITC on Chemosensiti- syöpäsolujen kemoterapiaa lääkkeet, soluja käsiteltiin tunnin pulssin 5-30 uM BITC seurasi tunnin eri syöpälääkkeiden. Kukin syöpälääke testattiin eri annoksina, mukaan lukien kliinisesti merkittäviä annosta.

WST8 koe suoritettiin 48-tunnin kuluessa kemoterapian hoidon arvioimiseksi solujen elinkelpoisuuden aikaisemmin kuvatulla [12]. Annoksesta vaste kaavio on kehitetty, jossa näytteet pisteytettiin reagoiva (0-30% solujen eloonjääminen), väli- (30-60% solujen eloonjääminen), ja ei-reagoiva (60-100% solujen eloonjääminen).

rajoittavan laimennuksen Kasvaimia synnyttävä Assay in Immuunijärjestelmän hiirissä

valikoima 1 × 10∧2, 1 x 10∧3, 1 x 10∧4, ja 1 x 10∧5 ependymoma soluja Potilas 1 ruiskutettiin ihon alle 5 atyymisissä immuunivajausta nude

nu /nu hiirtä ryhmää kohti. Lyhyesti, yhtä monta vanhempien suurin kasvainsolujen kasvatettu 2D yksikerroksinen, CD133 (+) kolmiulotteisesti kasvanut hydrofocusing bioreaktorissa, ja CD133 (+) MACSorted CSLCs injektoitiin 100 ui Matrigel kylkeen NOD-

Scid

hiiret ja verrattuna kasvua CD133 negatiivisia soluja 3 kuukautta.

Kemoterapia animal Study

Kaikki eläinkokeet on tehty seuraavat hyväksyntää Marshall University IACUC, protokolla # 373017. Vaikutukset kemoterapian seulotaan in vitro ChemoID määritys testattiin ihmisen kasvainbiopsioissa jotka olivat ksenosiirrettyjä kylkeen on NOD-

Scid

hiirimallissa. 1 × 10∧6 ependymoma solut sekoitettiin 100 ui matrigeelin (BD Biosciences, San Jose, CA) ruiskutetaan ihon alle kylkeen 10 atymisiin, NOD.Cg-Prkdc

Scid

ll2rgtm1wjl /SzJ immuunivajaisiin hiiriä ( NOD-

Scid

) /ryhmä ja kasvatettiin 10 viikon ajan tai kunnes 100 mm∧3. Hiiret satunnaistettiin eri hoito- ja kontrolliryhmiin ja kemoterapia annettiin vatsaonteloon (i.p.) injektioita 200 ui seuraavasti ajan 4 viikkoa: 1) ryhmä # 1, kontrolliryhmä primaaristen kasvainsoluja injektoidaan kylkeen ja sai i.p. steriiliä suolaliuosta injektiota. Ryhmä # 2, koeryhmä injektoidaan i.p. vähiten tehokas kemoterapia määritettynä

in vitro

ChemoID määritys. Group # 3, koeryhmä injektoidaan i.p. tehokkaimman kemoterapiaa määritettynä

in vitro

ChemoID määritys. Ryhmä # 4, koeryhmä injektoidaan i.p. toisen tehokkain kemoterapiaa määritettynä

in vitro

ChemoID määritys. Ryhmä # 5, koeryhmä injektoidaan i.p. tehokkaimman kombinatorinen kemoterapiaa määritettynä

in vitro

ChemoID määritys.

Kemoterapia hiiri annokset laskettiin käyttäen kehon pinta-ala (BSA) normalisoinnin menetelmää [13] kliinisestä annoksesta ja tarkistettu annoksia aiemmin määritetty kirjallisuushaun.

eutanasia

Eläimet uhrattiin jälkeen nykyinen vahvistamien suuntaviivojen uusin raportti AVMA paneelin eutanasia avulla CO2 hengitysteitse ja hengitysvaikeuksia seurasi kohdunkaulan sijoiltaan.

tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen IBM SPSS tilasto-ohjelmalla. Tulokset kunkin variantin eri koeasetelmia edustavat keskimäärin 3 eri kokeessa. Tiedot 5 mittaukset otettiin keskiarvo; variaatiokerroin näistä arvoista koskaan ylittänyt 10%. Keskiarvot ja keskivirheet laskettiin jokaiselle pisteen Yhdistetyt normalisoidut hallita tietoja. Tilastollinen analyysi tulosten merkityksen suoritettiin 1-suuntainen ANOVA.

p

arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Potilas 1 Historia ja valinta kemoterapioita kanssa ChemoID Pitoisuus

fyysisesti aktiivinen 17 -vuotias mies esitti lokakuussa 2005 tuntoharhat hänen jalkansa ja melko vakava tarkkanäköinen menetys. Tämä voimistui yhä enemmän joulukuussa 2005 nousevat jalkansa melko vakava tunnottomuus oikea jalka ja kipu hänen vasen jalka, puolivälistä reiteen alas puolivälissä vasikka mediaalisesti. Tutkittaessa hänellä ei ollut polttovälin heikkous koko hänen ylä- ja alaraajojen. Hänellä oli hypoalgesia osittaisella aistien tasolla ylemmässä Rintaranka alas. Hänellä oli myös vakava Asentoaisti menetys hänen jalkansa ja varpaat. Magneettikuvaus (MRI) kaularangan osoitti läsnäolon epänormaali parantavaa massa, joka ulottui puolivälistä C5 huonompi C7 (4,5 pituus x 1,0 x 2,0 in cephalocaudal ja anteroposterior ulottuvuus), joka aiheutti johto puristus (kuvio 1A). MRI Rintaranka osoitti parantamisesta leesion T2-3 (1,5 pituus x 0,6 x 0,6 cm anteroposterior ja poikittaismitta) useiden muiden pienempien nodulaarinen massat, parhaiten nähty T2 painotettu sekvenssi, joka ulottuu läpi koko rintakehä tasolla T11 (kuvio 1 B).

A) magneettikuvauksessa (MRI) kaularangan osoittaa, että läsnä on parantaa massan, joka ulottuu puolivälistä C5 huonompi C7 (4,5 pituus x 1,0 x 2,0 in cephalocaudal ja anteroposterior ulottuvuus) ja aiheuttaen johto puristus. B) MK Rintaranka esittää parantamisesta leesion T2-3 (1,5 pituus x 0,6 x 0,6 cm anteroposterior ja poikittaismitta) useiden muiden pienempien nodulaarinen massat, parhaiten nähty T2 painotettu sekvenssi, joka ulottuu läpi koko rintakehä tason T11. C) hematoksyliinillä ja eosiini värjäyksen kasvaimen leikkaus, joka esittää yleistä hallitseva tiheä solukomponenttiin, alkeellisia ydinvoiman piirteitä, mitoosi toimintaa, kuolion ja verisuonten lisääntymistä. Läsnäolo hyvin muodostuneita, ilmeinen verisuonia pseudorosettes (jossa vasocentric kuvio, verisuonia ydinaseettomia vyöhykkeitä, ja klassinen ohut glial prosesseja säteilevää /aluksesta seinälle) löytyivät tukevat diagnoosin intraduraalinen, ekstramedullaarista anaplastinen hajanainen selkärangan ependymoma, WHO luokka III.

potilas sai laminectomy joulukuussa 2005 C5, C6 ja C7 osittainen resektio kasvaimen mikroskoopilla käyttäen mikrokirurginen tekniikoita. Leikkauksen jälkeen, potilas käsiteltiin säteilyn ja temotsolomidia.

morfologinen analyysi histologia osat värjättiin hematoksyliinillä Eosiini osoittivat yleistä hallitseva tiheä solukomponenttiin, alkeellisia ja pleomorphic ytimet, lisääntynyt mitoosinopeudella ja apoptoosin, ja pesäkkeet, joissa mikrovaskulaarisen leviämisen. Läsnäolo hyvin muodostuneita, ilmeinen verisuonia pseudorosettes (jossa vasocentric kuvio, verisuonia ydinaseettomia vyöhykkeitä, ja klassinen ohut glial prosesseja säteilevää /aluksesta seinä) havaittiin tukemaan diagnoosin anaplastinen hajanainen selkärangan ependymoma, WHO luokka III. Kuvio 1C esittää hematoksyliinillä ja eosiinivärjäykset kasvaimen osiossa diagnoosin vuonna 2005.

Jaksot kasvaimen arvioitiin immunoperoksidaasivärjäyksellä tekniikoita sopivilla värjäys kontrollileikkeissä. Kasvain osoitti positiivista värjäytymistä vasta-aineilla Neuron enolaasin, vimentiinistä, S-100, ja GFAP. Heikkoa värjäytymistä esiintynyt vasta-aineita aktiini. Focal värjäys tapahtui vasta epiteelikalvo antigeeni, sytokeratiinista AE1 /AE3, ja synaptofysiini. Kasvain oli negatiivinen valkosolujen yhteinen antigeeni, desmiini, ja myogeniinin. Lisäksi osa värjätään PAS osoitti polttoväli PAS-positiivisia fibrillar materiaalia. Osiot ja kasvainblokki myös lähetettiin Biopathology Center (BPC) sekä Lasten Oncology Group (COG) oli kaksi neuropatologien itsenäisesti uudelleen asian ja vahvisti diagnoosin anaplastic ependymoma, WHO luokka III.

uusiutumisen jälkeen ja eteneminen, potilas sai monimutkainen kemoterapiahoidon tammikuussa 2006 ja maaliskuussa 2006 syklofosfamidilla, talidomidin, selekoksibi seuraa etoposidi, talidomidi ja selekoksibi. Kemoterapiaa tehtiin syyskuussa 2006, mutta elokuussa 2007 potilaalla oli kasvain uusiutumista at T7-T8, joista hän koki robotti radiosurgery hoitoa. Potilaalla oli toinen rajaamisvai- leikkaus huhtikuussa 2008, mutta myöhemmin joulukuussa 2008 hän oli etenevä tunnottomuus jalkansa kanssa selkäkipu magneettikuvauksella osoittaa uusiutumisen kirurgisen alueella (kuvio 2A) sekä lannerangan. Sitten hänet käsiteltiin jälleen temotsolomidi mutta ei ollut hoitovastetta.

) 2009 MRI kaularangan osoittaa toistuminen kirurgisessa alueella. B) 2009 magneettikuvauksessa Rintaranka osoittaa etenemisen tärkeimmistä vaurion mittaamalla 23,9 mm, ja ulkonäkö useita muita pienempiä vaurioita. C ja D) 2010 magneettikuvauksessa kohdunkaulan ja rintarangan osoittaa kasvaimen regressio jälkeen hoidon irinotekaania ja bevasitsumabin.

Maaliskuussa 2009, koska taudin etenemistä hänellä oli rintakehä laminectomy ja resektio intraduraalinen intramedullary kasvain. Hänellä oli vakavia selkäydinkompressio ja alkoi ottaa heikkous jaloissa. Johtuen edelleen toistuminen, potilas sitten oli toinen rajaamisvai- leikkaus heinäkuussa 2009. Hän sai myös oksaliplatiinia ja etoposidin käsittely heinäkuussa ja elokuussa 2009 mutta kasvain eteni vieläkin (kuvio 2B).

Asianmukainen suostumus allekirjoitettiin ja aikaan rajaamisvaiheeseen leikkauksen heinäkuun 2009 steriili koepala otettiin arvioida herkkyyteen kasvaimen solut (pääosa kasvain ja CSLCs) kohti standardi-of-care kemoterapiaa huumeita käyttämällä ChemoID määritystä. Biopsia pantiin RPMI-1640 steriilien ja kudos hajotettiin laboratoriossamme yhdeksi-solususpensiota käyttämällä GentleMACS kudoksen dissociator (Miltenyi, Aubourn, CA). Yhden solun ependymoma suspensio maljattiin RPMI-1640: n läsnä ollessa 5% säteilytetty, lämmöllä inaktivoitua, määritellään naudan sikiön seerumia, streptomysiiniä ja penisilliiniä ja soluja viljeltiin yhtenä kerroksena on 15 päivää. Solut immunophenotyped mukaan virtaussytometrillä käyttämällä vasta-aineita CD34, CD38, CD44, CD117, CD133, Oct3 /4, ja Nanog.

ependymoma solujen havaittiin positiivinen Oct3 /4 (2,73%), Nanog (0,95 %), CD133 (49,93%), CD117 (36,81%), ja CD44 (20,39%) verrattuna isotyyppikontrolli-vasta-ainetta (kuvio S1 AE). Kaksinkertainen värjäys CD34 ja CD38 osoitti, että läsnä oli 1,88% soluista CD34 + /CD38 +, ja 78,4% CD34 + /CD38-solut (kuva S1 F).

Jos haluat laajentaa CSLC populaatio CD133 + solujen ependymoma ensisijainen kulttuuri, ependymooma soluja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [8]. 1 × 10∧6 n ependymoma solujen yksikerroksinen ensisijainen kulttuuri kasvatettiin kymmenen päivää käyttäen Hydrodynamic Tarkennus BIOREAKTORITEKNIIKKA (HFB) (Celdyne, Houston, TX) [8]. Ependymoma soluja viljeltiin bioreaktorissa muodostunut soluklusterien (kuvio 3A), jotka laajenivat 14,7 kertaiseksi (taulukko 1) ja näytti olevan 95,93% CD133 positiivisia 10 päivän jälkeen kulttuurin bioreaktorissa (kuva S1 C, rikastettu CSLCs).

a) Kontrasti vaihe kuva klusterin rikastetun CSLCs seuraavat 7-päivän kulttuuria hydrofocusing bioreaktorissa. B) immunodefisienssimalleissa nude-hiiriin (nu /nu), injektoitiin 1 x 10∧2 ependymoma solujen MacSorted CD133 (+) solujen tai CD133 (+) ependymoma soluja kasvatettiin hydrofocusing bioreaktorissa, jossa tuki 100 ui Matrigel kylkeen on muodostettu kasvain 3 kuukauden kuluessa verrattuna CD133 (-) solut.

Voit tarkistaa kasvain aloittamista kapasiteetti HFB kasvaneet solut, me pistetään 5 immuuni puutteellinen nude hiirtä /ryhmä erilaisia ​​1 × 10∧2, 1 x 10∧3, 1 x 10∧4, ja 1 x 10∧5 soluja kasvatettiin HFB (-96% CD133 +) ja verrattiin niiden kasvua yhtä monta CD133 (+) MACsorted solut ja CD133 (-) solujen 3 kuukautta. Havaitsimme, että molemmat 1 x 10∧2 MacSorted CD133 (+) solujen tai CD133 (+) bioreaktorista kasvoi kaikilla immuunijärjestelmän hiirissä injektoitiin ja muodostivat palpoitavissa kasvaimen sisällä 12 viikkoa (kuvio 3B).

suorittamiseksi ChemoID määrityksen vertailukelpoinen määrä soluja (1 x 10∧5) bulk syöpäsoluja kasvatetaan 2D yksikerroksisen ja CSLCs rikastunut bioreaktorissa [8] otettiin erikseen levitettiin 96-kuoppalevyille (n-5 jäljennöksiä) ja käsiteltiin tunnissa sarja syöpälääkkeiden at konsentraatioalueella myös kliinisesti merkittäviä annostus (taulukko 2). ChemoID määritys suoritettiin käyttäen paneelia huumeiden käsittää sisplatiinin, oksaliplatiini, arabinosidi-C, VP-16, busulfaani, metotreksaatti, irinotekaanin ja bevasitsumabin valitsema Hoitavan onkologi.

Herkkyys kemoterapiaa arvioitiin 48-tunnin WST8 elinkelpoisuuden määrityksessä. Se luokiteltiin seuraavasti perustuu prosenttiosuus elinkelvottomien solujen: reagoiva (0-40% solujen eloonjääminen), väli- (40-70% solujen eloonjääminen), ja ei-reagoiva (70-100% solujen eloonjääminen). WST8 määritys suoritettiin kolme erillistä kertaa n-5 hyvin jäljennöksiä /huume /annos joka kerta.

ChemoID määritys osoitti, että ependymoma kasvatettujen solujen yksikerroksisessa ja edustaa suurin osa kasvainsoluista olisi herkkiä kliinisesti relevantteja annoksia sisplatiinin, irinotekaanin, busulfaani, ja yhdistelmä irinotekaanin ja bevasitsumabin tilastollisesti merkittävällä tavalla (p 0,05). Mielenkiintoista on, että CSLCs olivat herkkiä yhdistelmä irinotekaanin ja bevasitsumabi (p 0,05), välillisesti herkkä sisplatiini, ja irinotekaani, mutta ei ole herkkä busulfaani. Toisaalta, sekä CSLCs ja suurin osa kasvainsoluista olisi ei reagoi metotreksaattia, oksaliplatiini, arabinosidi-C, ja VP-16 (kuvio 4).

1 x 10∧3 suurin osa kasvainsolujen tai CSLCs levytettiin 5 jäljitelmät 96-kuoppaisia ​​levyjä altistettiin 1 tunnin pulssi paneelin kanssa syöpälääkkeiden ilmoittama onkologi. WST-8-määritys suoritettiin 48-tunnin kuluessa kemoterapia arvioida solujen elinkykyä. Tiedot on piirretty pylväskaavio kuin reagoiva (0-40% solujen elinkelpoisuuden), kohtalaisen reagoiva (40-70% solujen elinkelpoisuuden), ja ei-reagoiva (70-100% solujen elinkelpoisuuden). Vaaleanharmaa bar edustavat herkkyyttä CSLCs kemoterapiaan suhteen negatiivisten käsittelemätön kontrolli soluja. Tummanharmaa palkki edustaa herkkyys irtotavarana kasvainsolujen kemoterapiaan suhteen negatiivisten käsittelemätön kontrolli soluja. Syöpälääkkeiden testattiin esitetty alaosassa kuvassa. Tilastollinen analyysi tulosten merkityksen suoritettiin 1-suuntainen ANOVA. Tähdet osoittavat

p

arvot alle 0,05.

Koska ei saatu vastauksia oksaliplatiiniannokselle ja etoposidin hallinta annettu elokuussa 2009 (kuvio 2B) (joka aloitettiin ennen vastaanottaa tulokset ChemoID määritys), potilas koki lokakuussa 2009 käsittelemällä bevasitsumabin ja irinotekaanin, joka annettiin kahden viikon välein 6 kuukautta. Vuonna seurantaa magneettikuvaus toukokuu 2010 potilasta osoitti alkuperäisen taudista regressio jäljellä vapaita tauti eteni 18 kuukauden (kuva 2 C ja D). Tämä vastasi pisin taudin etenemistä Odotusaika havaittu tässä potilasryhmässä ilman suuria de-täyteaineena leikkaus.

uusiutuminen kasvaimen kasvun jälkeen 18 kuukauden taudista vapaa eteneminen johti meidät tutkimaan uusia terapeuttisia lähestymistapoja hoitoon tämän potilaan syöpä. Tältä osin yhdistelmä kemoterapiaa tutkittiin, jotta voidaan tunnistaa luonnollisia yhdisteitä, jotka voivat lisätä kliinistä tehoa syöpälääkkeiden.

BITC on osoitettu muissa laboratorioissa [14], [15] lisätä kemosensitiivisyys syövän solut. Olemme viime aikoina havaittu laboratoriossamme (tietoja ei esitetty), joka bentsyyli-isotiosyanaattia (BITC) kasvaa erityisesti kemo- ja CD133 positiivisia syöpäsoluja. Koska ensisijainen ependymoma solujen potilaamme näkyy suuri osa soluista positiivinen CD133, halusimme testata hypoteesia, jonka BITC voivat lisätä kemosensitiivisyys irinotekaanille ja bevasitsumabin. Olemme löytynyt ChemoID määrityksen, että kasvavien pitoisuuksien BITC välillä 2,5 uM ja 20 uM laski elinkelpoisuutta CD133 (+) ependymoma soluja Potilas 1 90%: sta 62% tilastollisesti merkittävällä tavalla (kuvio 5A). ChemoID määrityksessä myös, että yhdistelmä irinotekaanin ja myrkytön 10 uM BITC vähensi elinkelpoisuuden ependymoma solujen 60%: sta 40% (yli 40% enemmän chemosensitive verrattuna ei BITC käsiteltyjen solujen) (kuvio 5 B) . Lisäksi yhdistelmä irinotekaanin ja bevasitsumabin kanssa BITC vähensi entisestään elinkelpoisuuden ependymoma solujen 30% (kuvio 5 B). Potilasta hoidettiin irinotekaanin ja bevasitsumabin, mutta tällä kertaa yhdistelmä 2 kapselia /päivä Triple Action Cruciferous vihannesuutteisiin sisältävän runsaasti BITC (LifeExtension, https://www.lef.org), kaksi kuukautta. Sen jälkeen yhdistelmähoito irinotekaanin, bevasitsumabi ja täydentää cruciferous vihannekset, olemme havainneet 4 cm regressio (mikä vastaa 50% regressio) vauriot rinta- ja kohdunkaulan alueen [vertaa kuviota 5C (at toistuminen) ja Kuva 5D (hoidon jälkeen)]. Lisäksi raportoimme että potilas pystyi sietämään koko kurssin irinotekaanin ja bevasitsumabin kemoterapiaa vähemmän väsymystä ja sietää kylmää.

A) 1 x 10∧3 CSLCs levytettiin 5 jäljitelmät 96-kuoppaisiin levyt altistettiin 1 tunnin pulssi 2,5, 10, ja 20 uM BITC. WST-8-määritys suoritettiin 48-tunnin kuluttua hoitojen arvioida solujen elinkykyä. B) 1 × 10∧3 CSLCs levytettiin 5 jäljitelmät 96-kuoppaisia ​​levyjä altistettiin 1 tunnin pulssi 10 uM BITC seurasi 1 tunnin pulssi 0,5 mM CPT-11. WST-8-määritys suoritettiin 48-tunnin kuluessa kemoterapian hoidon arvioimiseksi solujen elinkykyä. Tiedot on piirretty pylväskaavio kuin reagoiva (0-40% solujen elinkelpoisuuden), kohtalaisen reagoiva (40-70% solujen elinkelpoisuuden), ja ei-reagoiva (70-100% solujen elinkelpoisuuden). Vaaleanharmaa bar edustavat herkkyyttä CSLCs kemoterapiaan suhteen negatiivisten käsittelemätön kontrolli soluja. Tummanharmaa palkki edustaa herkkyys irtotavarana kasvainsolujen kemoterapiaan suhteen negatiivisten käsittelemätön kontrolli soluja. Tilastollinen analyysi tulosten merkityksen suoritettiin 1-suuntainen ANOVA. Asteriskit osoittavat

p

-arvot alle 0,05. C) 2012 magneettikuvauksessa kohdunkaulan ja rintarangan osoittaa uusiutumisen jälkeen 18 kuukautta etenemistä vapaan ajan. D) 2012 MRI kaularangan osoittivat ilmeistä kasvainregressio Rintaranka vaurio seuraavat yhdistelmähoito irinotekaanin (CPT11), bevasitsumabi (Avastin), ja BITC täydentämistä.

tehoa chemotherapies seulalla vitro ChemoID määrityksessä testattiin ependymoma solujen Potilas 1, jotka olivat ksenosiirrettyjä on NOD-

Scid

hiirimallissa (kuva 6 A ja B).