Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa testasimme yleisyydestä, histoanatomical jakelu ja kasvaimen biologista merkitystä Wnt kohdeproteiinin ja syövän kantasolujen markkeri LGR5 kasvaimissa ihmisen ruoansulatuskanavassa. Differential ilmentyminen LGR5 tutkittiin transkription (reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio) ja translaation tasolla (immunohistokemia) pahanlaatuiset ja vastaavat ei-pahanlaatuisia kudoksia 127 potilasta, joka käsittää kuusi eri primaarikasvaimen sivustoja, eli ruokatorvi, maha, maksa, haima, paksusuoli ja peräsuolen. Kliinis-patologinen merkitys LGR5 ilmaisun tutkittiin 100 potilaalla mahalaukun karsinooma (GC). Non-kasvainkudoksessa yleensä kanna vain hyvin harvoilla LGR5

+ soluja. Vastaava karsinoomat, ruokatorven, mahan, maksan, haiman, paksusuolen ja peräsuolen osoitti merkittävästi enemmän LGR5

+ soluja samoin kuin huomattavasti korkeampi LGR5-mRNA verrattuna vastaaviin ei-kasvainkudoksessa. Kaksoisvärjäys kokeissa paljasti -parin LGR5 kanssa oletetun kantasolujen merkkiaineita CD44, Musashi-1 ja ADAM17. Seuraavaksi testasimme hypoteesin, että peräkkäiset muutokset mahasyövän, eli krooninen atrofinen gastriitti, suoliston metaplasiaa ja invasiivisia karsinooma, liittyy uudelleenjako on LGR5

+ soluja. Mielenkiintoista, alueellisen jakautumisen LGR5 muuttui: ei-neoplastisia mahalaukun limakalvon, LGR5

+ soluja löydettiin lähinnä limakalvojen kaulan alueella; suolen metaplasiaa LGR5

+ solut paikallistaa krypta pohja ja GC LGR5

+ soluja läsnä luminaalipinnalla, kasvaimen keskelle ja hyökkäyksen edessä. Ilmentyminen LGR5 kasvaimen keskelle ja invaasion edessä GC korreloi merkittävästi paikallisten kasvaimen kasvua (T-luokka) ja solmukohtien leviäminen (N-luokka). Lisäksi potilailla, joilla LGR5

+ GC oli lyhyempi elinajan mediaani (28,0 ± 8,6 kuukautta) kuin potilailla, joilla LGR5

– GC (54,5 ± 6,3 kuukautta). Tuloksemme osoittavat, että LGR5 ilmentyy differentiaalisesti ruoansulatuskanavan syöpien ja että spatiaalinen histoanatomical jakautumista LGR5

+ soluja on otettava huomioon, kun niiden kasvain biologinen merkitys haetaan.

Citation: Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) alueellisen jakautumisen LGR5

+ Solut korreloi mahalaukun syövän etenemisessä. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10,1371 /journal.pone.0035486

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 16 maaliskuu 2012; Julkaistu: 18 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Simon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruoansulatuskanavan karsinoomat ovat yleisimpiä syöpäsairauksia ja ovat johtava syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti [1], [2]. Syyt heikkoon ennusteet ovat monimutkaisia: monet syövät ruoansulatuskanavassa diagnosoidaan edenneessä vaiheessa ilman parantava hoito, ei ole olemassa luotettavia kasvainmerkkiaineet joka voi mahdollistaa varhaisen diagnoosin tai seulontaan riskiryhmien. Hoitovaihtoehtoja on rajoitettu paikallisesti edennyt ja etäpesäkkeitä, ja huomattava määrä kasvaimia uusiutua huolimatta aluksi hoitovasteen [3]. Oletettu selitys tehottoman hoito on syövän läsnäolon kantasolujen (CSC). CSC: n hypoteesi oletetaan, että kasvain on ryhmittymässä heterogeeninen solupopulaatioiden. Vain alapopulaatio tämän Ryhmittymän ylläpitää valmiutta pesäkkeiden muodostumista, ja siten toistuminen ja metastaaseja. CSCS ovat vastustuskykyisempiä kemoterapiaa, mikä johtaa kasvaimen uusiutumisen, etenemistä ja lopulta potilaan kuolemaan [4], [5]. Vaikka CSC-malli on yhä hyväksytään, tunnistaminen ja vahvistus ns kantasolujen merkkiaineita ihmisen luonnollisessa kudos on vaikeaa ja pitkälti puuttuvat. Äskettäin leusiinirikkaita, G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori (GPCR) ja Wnt kohdegeenin

LGR5

tunnistettiin uutena kantasoluja markkeri ohutsuolen, paksusuolen ja karvatupet hiirten [6] . Expression of LGR5 useita muissa elimissä osoittaa, että se voi edustaa maailmanlaajuinen markkeri aikuisen kantasoluja. Kuitenkin vähän tiedetään sen ilmentymistä maksa- ruoansulatuskanavassa ihmisten.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin korjaamaan tämä puute tietojen ja testataan hypoteesi, että syöpä kantasolujen markkeri LGR5 on prognoosi- ja kasvain biologinen merkitys.

Materiaalit ja menetelmät

Oppiaineet

Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut pahanlaatuiset ja vastaavat ei-pahanlaatuinen kudos 127 potilaalla, joka käsittää kuusi anatominen sijainnit maksa- ruoansulatuskanavan suolikanavan (eli ruokatorven, vatsa-, maksa-, haima-, paksusuolen ja peräsuolen) haettiin arkistoista Institutes of Pathology kristillisen-Albrechts-yliopistossa Kiel ja Charité yliopistollisen sairaalan Berlin (molemmat Saksa). Kaikki potilaat olivat käytettiin joko yliopistollisessa sairaalassa Schleswig-Holstein (1997-2009) tai Charité University Hospital Berlin (1995-2008; taulukko 1). Kiinnittämättömiä, tuore kudos oli saatavissa 105 näistä potilaista kahdeksalla eri kasvaintyypit eli Barrettin adenokarsinooma (9 potilasta) ja okasolusyöpä (7), ruokatorven, suoliston (19) ja diffuusi (21) tyyppi mahasyöpä, adenokarsinooma paksu (19) ja peräsuolen (20), maksasolusyövän (HCC, 4), ja kolangiokarsinooma (CC; 6). Potilaat on koottu taulukkoon 1.

riippumaton sarja 487 mahasyöpäpotilaista oli noudetaan arkistosta Institute of Pathology kristillisen-Albrechts-yliopistossa (taulukko 2 ja taulukko 3) . Nämä potilaat olivat läpikäyneet joko kokonaan tai osittain gastrektomia adenokarsinoomille mahan tai oesophago-mahalaukun risteyksessä. Jokainen resektio näyte oli tehty histologinen tutkimus koulutettu kirurginen patologia. Aika potilaan kuolemaan saatiin

Epidemiologiset Syöpärekisteri

valtio Schleswig-Holstein, Saksa. Follow-up data potilaiden elossa haettiin sairaalasta kirjaa ja ottamalla yhteyttä yleislääkärien.

Ethics lausunto

Kaikki kudosnäytteet saatiin osana diagnostista tai terapeuttinen leikkaus suoritetaan sen jälkeen potilas antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen. Potilaat tarjoaa näytteitä tutkimusta varten pseudonymisoitu ja analysoitiin anonyymisti, joten mikään yksittäinen liittyviä tietoja sisältyvät tietokantaan. Tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen komitea yliopistollisen sairaalan Kiel, Saksa (vrt. Numero D 453/10).

Reaaliaikainen RT-PCR

Yhteensä RNA eristetty viljellyistä soluista ja cryoconserved kudoksia käyttäen Ambion n Mirvana miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa), jota seurasi DNaasi käsittelemällä Turbo DNA-sarjaa (Ambion). RNA laatu arvioitiin 1,5% agaroosigeelillä. CDNA-synteesiä varten, 2 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Gene-spesifisiä alukkeita syntetisoitiin Biomers.net (Ulm, Saksa) (taulukko S1). Reaaliaikainen RT-PCR (reaaliaikainen RT-PCR) suoritettiin käyttäen LightCyler® 480 Probes Master (Roche) ja LightCycler® 480 System (Roche). Vertaileva Ct-arvot normalisoituivat että kolmen taloudenhoito geeneistä:

Homo sapiens sukkinaattidehydrogenaasi monimutkainen, alayksikkö A flavoproteiini (Fp) (SDHA), Homo sapiens kalpaiinin 2 (CAPN2) B ja

Syklofiliiniesimerkkeihin C ( CYCC)

. Ei templaattikontrollien (no cDNA PCR) ajettiin jokaiselle geenin havaitsemiseksi epäspesifisen tai genomivahvistuksen ja pohjamaali dimerisaatio. Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena.

Generation ja puhdistus anti-LGR5-vasta-aineen

Polyklonaaliset antiseerumit muodostettiin vastaan ​​karboksiterminaalinen häntä ihmisen LGR5 reseptoria. Kanit immunisoitiin kolmen eri peptidien identiteetin SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (kutsutaan Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (kutsutaan 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (kutsutaan 12) Pineda-abservice (Berliini, Saksa). Monospesifinen IgG puhdistettiin nopealla proteiinien nestekromatografialla ÄKTAprime ™ -järjestelmän (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi) käyttäen proteiini A-pylvääseen (GE Healthcare). Sillä kaikki myöhemmät analyysit, eli immunofluoresenssilla, immunosytokemiassa, western blot ja Immunohistokemiaa monospesifisiä IgG-jae puhdistettiin affiniteetin vastaan ​​immunisoimalla peptidejä, joita Pineda-abservice. Dot blot-analyysit ja immunohistokemiallista tutkimuksiin monospesifisiä IgG anti-LGR5-11b-vasta näkyy suuri affiniteetti sekä vahvoja ja erityisiä immunovärjäys. Näin ollen, tämä vasta-ainetta käytettiin koko tämän tutkimuksen. Reaktiivisuus ja spesifisyys monospesifistä vasta-aineen tyypillistä western blot; immunofluoresenssi ja immunosolukemiallisten määrityksissä.

Plasmidi rakentaa

Expression konstruktin LGR5 tuotettiin amplifioimalla koko koodaava sekvenssi ihmisen

LGR5

(NM_003667.2) PCR: llä (taulukko S1 ). Helpottaa jatkokloonauksen monistetun fragmentin ekspressiovektoriin pcDNA3.1 (-), eteenpäin aluke sisälsi Nhel-restriktiokohdan sovittimen ja reverse-aluke sisälsi BamHI-ja c-Myc-tag tarkistaa onnistuneen transfektion. PCR-fragmentit ja pcDNA3.1 (-) ekspressiovektori pilkottiin erikseen Nhel ja BamHI ennen ligaatio T4-ligaasia (Roche). Plasmidi varmistettiin digestoimalla Nhel: llä ja BamHI: llä ja DNA: n sekvensointi käyttäen ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, versio 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Saksa).

Soluviljely ja transfektio

ihmisen mahalaukun syövän solulinja MKN74 saatiin Japani Health Science Research Resource Bank (Osaka, Japani), ja MKN45 Saksan kerääminen mikro-organismien ja Cell Cultures (Braunschweig, Saksa). HEK293 EBNA-solut ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Soluja kasvatettiin RPMI 1640 Medium (MKN74, MKN45) tai Dulbeccon Modified Eagle Medium (HEK293), jota oli täydennetty 10% (MKN74, HEK293) tai 20% (MKN45) naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Itävalta). DNA-transfektio HEK293 EBNA, MKN74 ja MKN45 solut tehtiin käyttäen Lipofectamine LTX reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, soluja viljeltiin kuuden kuopan levyillä. Stabiili transfektio MKN74 ja MKN45 ekspressioplasmideilla suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Ohimenevää transfektio HEK293-solut 1 ug plasmidi-DNA: ta ja 5 pl Lipofectamine LTX-reagenssia laimennettiin 500 ul: aan Dulbeccon Modified Eagle Medium ilman seerumia, vastaavasti. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, seos lisättiin HEK293-soluissa. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, transfektoituja soluja kerättiin ja RNA: ta tai proteiineja, eristettiin. Transfektoitu pcDNA3.1 (-) yksinään ja transfektoimattomilla solut toimivat negatiivisina kontrolleina.

Immunofluoresenssikoe

Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen kylvö on CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia), solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka vahvistetaan 07:03 acetone:methanol (20 minuuttia, -20 ° C) ja sen jälkeen tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton-X (5 minuuttia, huoneenlämpötila). Dioja inkuboitiin sitten c-Myc hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Clontech, Mountain View, CA, USA) yön yli 5 ° C: ssa kosteassa kammiossa, jota seurasi anti-hiiri-Alexa Fluor 555 konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Invitrogen). Havaitsemaan onnistuneen transfektion LGR5, soluja inkuboitiin anti-LGR5-vasta-aine, jota seurasi anti-kaniini-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu Alexa Fluor 488 (Invitrogen), joista kukin yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Poisjättäminen ensisijainen vasta-aineiden LGR5 transfektoiduissa HEK293 EBNA solut toimivat negatiivisena kontrollina. Asennus ja counterstaining tehtiin Vectashield Hard-setissä DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).

Immunosytokemia

immunosytokemi- värjäys suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, paraffiini- upotettu MKN45 mahalaukun syöpäsoluja. Tätä tarkoitusta varten MKN45 solut upotetaan pieniä agaroosi- helmiin, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Jatkojalostukseen ja immunovärjäys anti-LGR5-vasta-aineella (laimennus 1:1000) suoritettiin mukaisesti immunohistokemiallinen analyysit ihmisen kudosleikkeiden (katso alla). Jättämällä pois primaarinen vasta-aine on LGR5 transfektoiduissa MKN45 solut toimivat negatiivisena kontrollina, kun taas spesifisyys anti-LGR5-vasta-aineen värjäys vahvisti inkuboimalla vasta-aineen kanssa immunisoivalla estävän peptidin.

Western blotting

proteiini lysaatit saatiin inkuboimalla ihmisen mahalaukun kudoksesta ja viljellyt mahalaukun solujen ProteoJET ™ Mammalian Cell Lysis Reagent (Fermentas, St. Leon-Rot, Saksa) ja proteaasiestäjäseostabletit (Complete EDTA-vapaa, Roche). Proteiininäytteet denaturoitiin Laemmli-puskurissa (60 mM Tris-HCI, pH 6,8, 2% natriumdodekyylisulfaattia, 10% glyserolia, 5% β-merkaptoetanolia ja 0,01% bromifenolisinistä) lämmittämällä 95 ° C: ssa kymmenen minuuttia ja sittemmin loaded 4%: sta 16,5% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja visualisoitiin värjäämällä Coomassie-sinisellä. Erottamisen jälkeen, proteiinien värjäämätön polyakryyliamidigeeleillä siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham, Freiburg, Saksa), immunoblotattiin anti-LGR5-vasta-ainetta (laimennus 1:20,000) ja anti-β-aktiini-vasta-aine (1:10,000; klooni AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tasapuolisen lastaus määriä. Kalvoon sitoutunut HRP leimattuja sekundaarisia vasta-aineita (DakoCytomation, Glostrup, Tanska) havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin käyttämällä ECL-järjestelmää (Amersham). Jättämällä pois primaarinen vasta-aine toimi negatiivisena kontrollina, kun taas spesifisyys anti-LGR5-vasta-aineen värjäys vahvisti inkuboimalla vasta-aineen kanssa immunisoivalla estävän peptidin.

Histologia

histologiset analyysit, kudos näytteet kiinnitettiin 10% neutraloitua formaliinia ja upotettiin parafiiniin. Parafiini osat värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) ja kaupallisen polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja LGR5 (LGR5

com , 1:400; Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (laimennus 1:50; Sigma-Aldrich) ja Musashi-1 (1:500; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA). Sen jälkeen 20 minuuttia esto vetyperoksidilla lohkon (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 5 minuuttia hoito Ultra V Block (Thermo Scientific) ja inkubointi ensisijaisen vasta-aineen tehtiin kosteassa kammiossa huoneenlämmössä 30 minuuttia. Objektilasit pestiin vaiheiden välillä Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS). Immunoreaktioita tehtiin näkyviksi n-Histofine Simple Stain MAX PO System (Nichirei Bioscience, Tokio, Japani) ja DAB-alustan (Linaris, Wertheim-Bettingen, Saksa). Kaksoislaimennustoiminnassa värjäys LGR5 kanssa CD44, ADAM17 ja Musashi-1, vapaa sitoutumiskohdat salvattiin hiiren IgG ja kani-IgG ohjaus (Abcam) laimennettu vasta-laimentimeen (ZYTOMED Systems, Berliini, Saksa) jälkeen DAB-hoidon. Näytteet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Jättämällä pois primaarinen vasta-aine toimi negatiivisena kontrollina. Ei-neoplastisia ihmisen mahaan (CD44) ja aivokudoksessa (LGR5

com, LGR5 ja Musashi-1) toimi positiivisena kontrollina.

arviointi Immunovärjäyksen

immunovärjäys ei-neoplastisten epiteelin ja kasvainsolujen teki soveltamalla immunoreaktiivisuus pisteytysjärjestelmä (IRS). Lyhyesti, luokka A dokumentoitu intensiteetti Immunovärjäyksen kuin 0 (ei Immunovärjäyksen), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) ja 3 (voimakas). Luokka B dokumentoitu prosenttiosuus immunoreaktiivisia solujen 0 (negatiivinen), 1 (hajallaan positiivisia soluja; ≤1%), 2 (2-10% positiivisia soluja), 3 (11-50%), 4 (51-80%) ja 5 ( 80%). Lisääminen luokan A ja B johti IRS välillä 0 8 kunkin yksittäisen tapauksen. Jakautumista muutokset LGR5

+ solua 100 Koko kohteen osia suoliston tyypin mahasyövän pisteytettiin seuraavasti: lukumäärä immunoreaktiivisten solujen luokiteltiin 0 (negatiivinen), 1 ( 10 positiiviset solut), 2 (10 -50 positiiviset solut) ja 3 ( 50 positiiviset solut) erikseen luminaalipinnalla, kasvaimen keskustasta ja hyökkäyksen edessä.

Tilastolliset analyysit

Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen PASW Statistics 18 tilastollinen paketti (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Vertailut ryhmien välillä testattiin käyttämällä Fisherin testiä. Korrelaatio LGR5 ilmaisun ryhmän sisällä perustettiin Kendallin tau listalla kertaluvun korrelaatio. Survival käyrät sovitettiin Kaplan-Meier menetelmä ja erot eloonjäämisessä arvioi log rank-testi. Merkitys korrelaatiot LGR5 ilmaisun ensisijainen kasvaimia ja vastaavien ei-pahanlaatuinen kudos arvioitiin Wilcoxonin testi. Reaaliaikainen RT-PCR tiedot, jotka arvioitiin kanssa pariksi kaksipuolinen t-testiä, mutta logarithmized saatiin noin normaalisti jakautunut tiedot. P-arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

LGR5-mRNA ilmentyy differentiaalisesti maksa- ruoansulatuskanavan karsinoomien

LGR5 raportoitiin ilmentyvän hiiren kantasoluja suoliston kryptissa [12], ja usein yli-ilmentynyt koolonsyöpäsolulinjoissa [13]. Tutkia sen ilmentymistä ei-neoplastisia ja neoplastisia ihmisen kudos, arvioimme transkription ilmaus LGR5 ihmisen kliinisissä näytteissä koostuu laajan maksa- ruoansulatuskanavan karsinoomia. Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi suoritettiin sarja 105 potilasta käsittävät pahanlaatuisten ja vastaavat ei-pahanlaatuinen kudos, joka on saatu samasta potilaista, kahdeksan eri kasvaintyypeille: ruokatorvi [Barrettin adenokarsinoomat (9 potilasta) ja okasolusyöpää ( 7)], mahan [suolen (19) ja diffuusi tyyppi (21) mahakarsinoomat], maksan [HCCs (4), serttiä (6)], paksusuolen (19) ja peräsuolen (20; taulukko 1).

LGR5-mRNA oli merkittävästi eri tavalla ilmaistu adenokarsinoomat ruokatorven (p = 0,007), vatsa [suoliston tyyppi (p = 0,006) ja hajanainen tyyppi (p = 0,013)], maksa [sertiä (p = 0,022)], paksusuoli (p 0,001) sekä peräsuoleen (p = 0,002) verrattuna sovitetun ei-kasvainkudoksessa. Ei kuitenkaan ero ekspressio havaittiin okasolusyöpää ruokatorven (p = 0,503) ja HCCs verrattuna vastaaviin ei-neoplastisten kudosten (p = 0,545, kuvio 1).

Boxplots kuvaa yleinen jakautuminen LGR5 verrataan pahanlaatuinen versus viereisen ei-pahanlaatuisen kudoksen (A) Barrettin adenokarsinooma ja (B) levyepiteelisyövän ruokatorven, (C) suoliston tyypin mahasyöpä, (D) diffuusi tyyppi mahasyöpä, (E) maksasyövän, (F) kolangiokarsinooma, (G) paksusuolen ja (H) peräsuolen syöpä.

polyklonaalista anti-LGR5-vasta-aine havaitsee ihmisen LGR5 transfektoitiin HEK293 ja MKN45 solujen

tutkimaan edelleen histoanatomical jakelu of LGR5 ihmisen kudoksissa ja tutkia sen kliinis-patologisia merkitystä, joka on LGR5-spesifistä vasta-ainetta nostettiin, koska kaupallisesti saatavilla vasta-aineet eivät täytä vaatimuksia (kuvio 2A). Jos haluat sulkea pois ristireaktiivisuus hiljattain syntyy vasta-eniten rakenteeltaan samanlaisia ​​LGRs, LGR4 ja LGR6, teimme sekvenssikohdistuksen kanssa

National Center for Biotechnology Information

kohdistustyökalu etukäteen (tuloksia ei ole esitetty). Ei sekvenssihomologia löydettiin LGR4 tai LGR6 alueella on LGR5 peptidin käytimme immunisaatiossa. Valintaa varten erittäin spesifinen vasta-aine LGR5, kloonattiin täyspitkä cDNA transfektoitiin HEK293-EBNA-soluihin ja niitä käytettiin positiivisena kohteena suorittaa immunofluoresenssimenetelmällä. LGR5 cDNA suoraan merkitty myc-epitoopin, joka mahdollisti arvioinnin transfektion anti-myc-tag-vasta-ainetta. Käyttäen immunofluoresenssilla, sitovat anti-myc-vasta-aineen havaittiin inkubaation jälkeen LGR5 /HEK293-soluissa, mutta ei tyhjän vektorin-transfektoiduissa soluissa (vektori /HEK293), transfektoimattomista HEK293-solut, tai negatiivinen kontrolli on LGR5 /HEK293-soluja inkuboitiin vasta-aineen kanssa laimennusaineen sijasta primaarisen vasta-aineen. Sama tulos saatiin, kun käytetään anti-LGR5-vasta-aineella (kuvio 3), mikä osoittaa spesifistä leimaamista LGR5.

edustaja kuvia immunohistokemiallisella värjäyksellä LGR5

com (A) ja LGR5 (B) on mahasyövän yksilö. Sen jälkeen erilliset värjäytyminen ADAM17 (C) ja LGR5 (D), sekä kaksinkertainen värjäytymisen ADAM17 (punainen väri) ja LGR5 (ruskea väri, E) sarjamuotoisen osan terveen mahalaukun limakalvon. Verrattaessa terveen mahalaukun limakalvon (F, G) ja neoplastisten mahalaukun kudoksesta (H), Msh-1

+ /LGR5

– (punainen väri), Msh-1

– /LGR5

+ (ruskea väri; F) sekä Msh-1

+ /LGR5

+ soluja (G) ovat läsnä. Pääosin CD44

+ /LGR5

+ solujen kaksinkertainen värjäys kokeiden CD44 (punainen väri) ja LGR5 (ruskea väri) terveillä (I) ja neoplastisten (J) mahalaukun limakalvon. Double positiivisia soluja nuolilla, Nuolenpäät hajallaan yhden värjätään solut. Alkuperäiset suurennokset × 400 (A-J); X 600 (E).

immunofluoresenssi HEK293 EBNA-solujen LGR5 spesifistä vasta-ainetta (vihreä) ja anti-myc-tag-vasta-ainetta (punainen). Solut vastavärjättiin DAPI näyttää solun tumaan (sininen). Solut, jotka on transfektoitu myc-merkittyä LGR5 cDNA: n (ensimmäinen paneeli) verrattuna kontrollisoluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla (kontrolli tyhjä vektori); jättäen transfektoimattomissa (hallita transfektoimattomat); tai inkuboitiin ilman primaaristen vasta-aineiden, vastaavasti. Alkuperäiset suurennokset × 400.

spesifisyyttä LGR5-immunoleimaus edelleen validoitu käyttämällä formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut MKN45 mahalaukun syöpäsoluja. Solut valmistettiin ja värjättiin siten, että rinnasteinen käsittely kliinisen ihmisen kudosnäytteitä. Immunosytokemiallinen analyysit parafiinileikkeillä paljasti positiivista värjäytymistä anti-LGR5-vasta-aineen MKN45 pysyvästi transfektoitujen solujen LGR5 cDNA (LGR5 /MKN45). Sen sijaan, tyhjä vektori transfektoitiin MKN45 soluja (vektorin /MKN45), sekä negatiivisena kontrollina (jättämällä pois primaarinen vasta-aine) ja peptidi ohjaus (pre-inkuboitu vasta-aineen kanssa, sen immunisoivalla estävän peptidin) ja LGR5 /MKN45 soluista osoitti ei ole sitovaa vasta-aineen (kuvio S1).

LGR5 proteiinia spesifisesti havaitaan anti-LGR5-vasta-aine, ihmisen transfektoiduissa MKN74 solujen

ihmisen mahalaukun syövän solulinjat MKN74, tunnettu omaavansa kohtalainen LGR5-mRNA: n ekspressio (tuloksia ei ole esitetty), ja ihmisen ei-neoplastisia mahassa, jolla hyvin pieni LGR5 ilmentymistä (kuvio 1) valittiin kuvaamaan reaktiivisuus ja spesifisyys anti-LGR5-vasta-ainetta proteiinin tasolla.

western blot -analyysissä, LGR5 proteiini tunnistettiin erityisesti, että monospesifisiä anti-LGR5-vasta-ainetta laimennoksella 1:20,000. Se tunnistettiin yksi vyöhyke, jonka ilmeinen molekyylipaino 100 kDa MKN74 solulysaateista (kuvio 4), joka vastaa molekyyli- massa laskettu LGR5 proteiinia. Sitä vastoin ei ole detektoitiin lysaateista ihmisen ei-neoplastisen vatsaan kudosta, joka sulkee pois ristireaktiivisuutta anti-LGR5-vasta-ainetta solun proteiinien kanssa. Mukaisesti mRNA: n ekspression tietojen voimakkaampi ilmentyminen LGR5 proteiinin havaittiin MKN74 pysyvästi transfektoitujen solujen LGR5 cDNA, verrattuna MKN74 ohjaus transfektoitu tyhjällä vektorilla. LGR5 proteiinin ilmentymistä ihmisen ei-neoplastisia mahalaukun limakalvon ylitti määritysrajan western blotting, näytetään kaistaa. Poisjättäminen anti-LGR5-vasta-ainetta tai edellisen inkuboitu vasta-aineen kanssa, sen immunisoivalla estävän peptidin näyttää ei proteiinijuovat, vastaavasti. Detection of β-aktiini-proteiinin (noin 43 kDa; kuvio 4) toimi latauskontrollina ja vahvisti kuormittuu tasaisesti proteiinia määriä kaikissa kaistoilla.

Coomassie blue-värjäys (Coomassie) kuvaa laatu ladattu kokonaisproteiinista lysaatit. Western blot -analyysissä anti-LGR5-vasta-ainetta (1:20,000) havaitsee yhden juovan proteiinia lysaateissa stabiilisti transfektoitujen MKN74 soluja, jotka yli-ilmentävät LGR5 (MKN74 + LGR5), heikompi kaista transfektoitujen solujen valvontaa tyhjällä vektorilla (MKN74 + tyhjä vektori), ja kaistaa lysaateissa ihmisen ei-neoplastisia mahalaukun limakalvon, vastaavasti. Rinnakkaisella blot ei tavoitetta bändit ovat näkyvissä, kun anti-LGR5-vasta-ainetta esi-inkuboida sen immunisoivalla esto (peptidi esto). Top bändit (100 kDa, nuoli) näyttää LGR5 proteiini, kun taas pohja nauhat (~43 kDa, nuoli) kuvaavat β-aktiini, käytettiin latauskontrollina.

LGR5 ilmaistaan ​​non -neoplastic ja neoplastisen kudoksen maksa- ruoansulatuskanavan

ilmentymisen ja histoanatomical jakelu LGR5 sen jälkeen tutkittiin immunohistokemiallisesti sarjassa 127 kudoksen dioja saatu vastaavilla ei-neoplastisten ja neoplastisten kudosten ja maksa- ruoansulatuskanavan ruoansulatuskanavan, joka käsittää ruokatorven (14 potilasta), vatsa (32), maksassa (24), haimassa (17), paksusuolen (20), ja peräsuolen (20; taulukko 1). Tästä kohortin neoplastisten ja vastaavat ei-neoplastisia kudosnäytteistä 105 potilasta tutkittiin myös sen transkription tasolla (katso edellä).

LGR5 ilmaus yleisestä kohortti oli positiivinen 65 tapauksessa (51%) kaikista ei-pahanlaatuisten kudosten ja 103 tapausta (81%) kaikista syöpäkudoksissa. Lokalisointia LGR5 ilmentymisen havaittiin pääasiassa sytoplasmaattinen, kun taas myös satunnaista kalvo tai ydin kalvo korostunut ilmaisu tapahtunut. LGR5-immunoreaktiivisuus havaittiin kaikissa kudoksen osien, ts stroomasoluilla, endoteelisolut, solujen ei-neoplastisten epiteelin ja syöpäsoluissa (kuvio 5). LGR5-immunoreaktiivisuus stroomasoluilla havaittiin 49 (39%) kaikista ei-pahanlaatuinen kudosten ja 80 tapauksessa (63%) kaikista syövän kudoksissa. Endoteelin immunoreaktiivisuus LGR5 havaittiin 42 tapauksessa (33%) kaikissa kudoksissa.

LGR5 ilmentymisen normaalissa paksusuolen limakalvossa (A), kalvo (B) ja sytoplasminen (C) värjäytymistä vastaa paksusuolen syöpäsoluissa. Arrows merkki hajallaan immunoreaktiivisten solujen krypta pohja. Tähdellä (*) merkitsee luminaaliselle sivustolla. Variable LGR5-immunoreaktiivisuus endoteelisolujen havaittiin syöpäkudoksessa: läsnäolo LGR5-immunonegative endoteelisoluja (D) vahvistettiin CD34 (E) käyttäen leikesarjojen. Huomautus vahva endoteelin LGR5-immunoreaktiivisuus toisessa tapauksessa paksusuolensyöpä (F). (G) Expression of LGR5 vuonna desmoplastic stroomasoluilla. Alkuperäiset suurennokset × 200 (A); × 400 (B-G).

Ei-pahanlaatuisen epiteelin, LGR5 oli yleensä löytyy harvoilla soluissa lähellä tyvikalvon mahalaukun limakalvon yksikkö, haiman kanavat, ja peräsuolen kryptissa . LGR5 ei löydy levyepiteeli ruokatorven, intrahepaattinen sappitiehyeiden ja hepatosyyteissä (kuvio 6). Kaikille kudostyypit paitsi ruokatorven kudoksesta keskiarvo IRS oli merkitsevästi suurempi kasvainkudoksen suhteessa sovitettuun ei-pahanlaatuinen kudos, joka vahvistaa havaintomme on transkription tasolla (taulukko 1).

Expression of LGR5 vuonna normaali ruokatorven limakalvo (A) verrattuna adenokarsinooma (B) ja okasolusyöpä (C). LGR5 ilmentyminen normaalissa maksassa (D) verrattuna hepatosellulaarista karsinoomaa (E), normaali (F) ja pahanlaatuinen (G) epiteelin sappitiehyen, samoin kuin ei-neoplastisia (H) ja neoplastisten (I) haimakudoksesta. Alkuperäiset suurennokset × 400.

LGR5 on läsnä hajallaan soluissa normaalia mahalaukun limakalvon

olemassaolo multipotentteihin kantasolujen sisällä hiiren vatsan osoitettiin kloonivalinnalla merkinnällä tutkimuksissa. Lopulliset tunnistaminen Näiden solujen toistaiseksi epäonnistuneet johtuen ei ole saatavilla erityisiä endogeenisen merkkiaineiden [14]. Käyttämällä leikesarjojen saatu holkki resektio yksilö, joka saadaan tavallisesti hoitoon ylipainoinen, ja osoittanut mitään histologisia todisteita mahasyöpä tai krooninen gastriitti, etsittiin LGR5

+ epiteelisolujen. Mielenkiintoista on, että hajallaan LGR5

+ solujen havaittiin limakalvojen kaulan alueella välillä foveolae ja rauhaset (kuvio 7).

Distribution kuviot LGR5

+ soluja terveiden mahalaukun limakalvon (A, E) , suoliston metaplasiaa (B, F), ja mahalaukun adenokarsinooman (C, G) ja sen invasiivisia edessä (D). Ylempi kenttä esittää edustaja immunohistokemiallisella värjäyksellä anti-LGR5-vasta-aineen koko vuori osissa suoliston tyypin syöpien. Alempi paneeli esittää vastaavaa kaavamainen malli jakautumiseen muutoksia eri vaiheissa mahalaukun tuumorigeneesiä. Nuolet merkitsevät LGR5

+ soluja. Tähdellä (*) merkitsee luminaaliselle sivustolla. Musta viiva korostetaan kasvaimen isäntäliitäntä (invaasio edessä). Alkuperäiset suurennokset × 200.

LGR5 on ekspressoidaan muiden mahdollisten mahalaukun kantasolujen tai kantasolujen merkkiaineiden

Kantasolut ei-kasvainkudoksessa ja CSCS tunnistetaan yleensä ja vahvistanut ilmaisu on enemmän kuin yksi kantasolu markkeri [15]. Käyttämällä immunohistokemia, me seuraavaksi analysoitu -parin LGR5 muiden otaksuttu CSC markkereita eli ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] – [21]. ADAM17 valittiin, koska aiemmat tutkimukset tunnistettu ADAM17 putatiivisena kantasoluja markkeri mahan [8]. Immunovärjäyksen (joko kaksinkertainen värjäys tai värjäys leikesarjojen) toteutettiin on mahasyövän näyte ja terveistä uninflammed mahalaukun limakalvon saatu hihassa gastrectomy. Yleensä vain harvoilla solut osoittivat positiivisia immuunivärjäykseen yhden ja /tai toisen otaksuttu kantasolujen merkkiaine.