Krooninen sairaus

tiivistelmä

rooli

WDR3

geenin perimän epävakaisuuden on arvioitu joukko 115 eriytetty kilpirauhassyöpä (DTC) potilasta. Genomin epästabiilisuuden on mitattu vasteen mukaisesti perifeerisen veren lymfosyyttejä ionisoivalle säteilylle (0,5 Gy). Vastaus on mitattu Mikrotumatestin (MN) testi arvioidaan taajuus binucleated solujen MN (BNMN), sekä ennen että jälkeen säteilytyksen. Ei eroja genotyyppien, että BNMN taajuuksilla edellinen säteilytys, havaittiin. Kuitenkin merkittävä lasku DNA-vaurioita säteilytyksen jälkeen havaittiin yksilöillä, joilla variantti alleelit kunkin kolmen genotyyppi SNP-kohdista: rs3754127 [-8,85 (-15,01

-2,70), P 0,01]; rs3765501 [-8,98 (-15,61

-2,36), P 0,01]; rs4658973 [-8,70 (-14,94

-2,46), P 0,01]. Nämä arvot vastaavat niitä saadaan olettaen hallitseva malli. Tämä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa, että

WDR3

voivat muuntaa genomin vakautta.

Citation: García-Quispes WA, pastori S, Galofré P, Biarnés J, Castell J, Velázquez A, et al . (2012) mahdollinen rooli

WDR3

Gene on Genome vakaus Kilpirauhasen syöpäpotilailla. PLoS ONE 7 (9): e44288. doi: 10,1371 /journal.pone.0044288

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 01 elokuu 2012; Julkaistu: 26 syyskuu 2012

Copyright: © García-Quispes et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Spanish Ministry Opetusministeri (SAF2007-6338) ja Katalonian (CIRIT; 2009SGR-725). W. A. ​​Garcia-Quispes tukivat predoctoral apurahan päässä Universitat Autònoma de Barcelona (PIF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kromosomi alueella 1p12 on yhdistetty eri syöpien, mukaan lukien eriytetty kilpirauhasen karsinooma (DTC) [1], [2]. Aiemmat tutkimukset ryhmämme tällä alueella on todettu, että

WDR3

geeni, kartoitettu tällä alueella, osoittaa merkittävää yhteyttä DTC, mikä viittaa sen mukanaoloa etiologiassa kilpirauhassyövän [3].

olemassa hyvin vähän tietoa roolista

WDR3

, mutta tiedetään, että se kuuluu perheeseen eukaryoottien geenien kuljettavat WD toistaa [4]. WD toistot ovat minimaalisesti konservoituneita alueita on noin 40 aminohappoa, tyypillisesti haarukoitua by Gly-His ja Trp-Asp, joka voi helpottaa muodostumista heterotrimee- tai Multiproteiinikompleksit. Koska WD-repeat proteiinit eivät ole prokaryoottisissa genomeja, oletetaan, että luultavasti ne ovat syntyneet välittömässä esiasteiden eukaryoottien [5]. Proteiinit kuuluvat WD toista perhettä ovat mukana erilaisissa solun prosesseja; kuten solusyklin etenemistä, signaalitransduktion, apoptoosin, ja geenisäätelyssä [6]. Mitä tulee kohtaan

WDR3

geeni, on syytä mainita, että se koodaa nukleaarinen proteiini on 943 aminohappoa, joka sisältää 10 WD toistaa [4]. Tämä geeni osallistuu solusyklin etenemisen ja signaalitransduktion [7], ja vaikka tietty toiminto

WDR3

on tuntematon, roolinsa ribosomin biogeneesissä on viime aikoina raportoitu [8].

koska kumpikaan määritellyistä tehtävistään WDR3 voidaan nimenomaan liittyvän kilpirauhassyöpä, me arveltu, että ehkä se osallistuu yleisemmin mekanismeja ylläpitää genomista vakautta. Näin ollen vaihtelut

WDR3

liitetyn toiminnon olemassaolon geneettisten polymorfismien voi tuottaa genomin epävakautta, joka voi johtaa lisääntyneeseen syövän riskiä. Tässä yhteydessä on mainittava, että ribosomi-proteiinien on raportoitu myös mukana ylläpitää genomin eheyden [9].

Vaikka genomin epästabiilisuuden on monimutkainen parametri, yleinen ominaisuus yksilöiden osoittaa sairauksia, kuten Fanconin anemia tai ataksia teleangiektasia on huono vaste vastaan ​​vaikuttavia aineita genomin eheyttä, koska se on kyse ionisoivan säteilyn (IR). Näin ollen, radioherkkyyttä pidetään biomarkkeri genomin epästabiilisuuden [10]. Määrittää, jos ehdokas geeni osallistuu genomisessa vakautta on osoitettava, että solut, jotka kantavat eri geneettisten polymorfismien ovat erityisen herkkiä edessä IR toimintaa.

Täällä arvioimme suhdetta kolme ei-koodaavan yhden nukleotidin polymorfismia

WDR3

geeni ja taajuus mikronukleuskokeessa, sekä spontaani ja jälkeen IR altistuksen. Tutkimus on toteutettu ääreisveren lymfosyyttien ryhmä 115 DTC potilaita, ja tasot DNA-vaurioita on arvioitu käyttämällä sytokineesiin-lohkon mikrotumatutkimuksessa (CBMN), koska se on vakiintunut sytogeneettinen tekniikka monien etuja muihin sytogeneettisen lähestymistapoja. Tässä yhteydessä on syytä korostaa, että se on hyvin osoitettu, että CBMN määritys on erittäin käyttökelpoinen merkkiaine spontaani ja indusoitu DNA-vaurioita [11] – [13].

Materiaalit ja menetelmät

Ethic selvitys

tutkimus hyväksynyt eettisen valiokuntien päässä Hospital Universitari Vall d’Hebron Barcelonassa, ja sairaala Universitari tohtori Josep Trueta Girona (Espanja).

Väestö tutkittu

tutkimus toteutettiin yhteensä 115 kilpirauhassyöpä potilailla, 93 (81%) naisista ja 22 (19%) miehiä, rekrytoidaan sekä sairaalan Universitari Vall d’Hebron Barcelonassa, ja sairaala Universitari tohtori Josep Trueta Girona (Espanja). Keskimääräinen ikä diagnoosin oli 43,30 ± 15,07 (keskiarvo ± SD) vuotta ja 49,76 ± 16,49 kun näyte saatiin. Mukaan kasvaimen tyyppi, 99 (86%) potilaista luokiteltiin papillaarinen ja 16 (14%) kuin follikulaarinen.

Verinäytteet kerättiin ennen jodin hoitoa (

131I), saatuaan kirjallinen suostumus kaikista potilaista. Kaikki osallistujat täytti kyselylomakkeen, joka kattaa standardi demografiset kysymyksiä sekä lyhyt ammatillisia, lääketieteen ja suvussa. Histologinen luokitus kasvaimen saatiin potilastietoja. Kaikki osallistujat allekirjoittaneet kirjallisen suostumuksen.

Soluviljely ja käsittely IR

sytokineesiin-lohko mikrotumatutkimuksessa (CBMN) suoritettiin käyttäen sytokalasiini B tekniikkaa ja seuraavaa normaali menettely [14]. Verinäytteet otettiin laskimosta ja 0,5 ml heparinisoitua verta laimennettiin 4,5 ml: lla täydellistä kasvatusalustaa, joka koostuu RPMI 1640, johon on lisätty 15% naudan sikiön seerumia, 1% antibiooteilla (penisilliini ja streptomysiini) ja 1% L-glutamiinia; kaikki kemialliset saatiin PAA Laboratories GmbH, Pasching, Itävalta. Lymfosyytit stimuloitiin jakaa 1% fytohemagglutiniini (PHA) (Gibco San Diego, USA) heti hoidon IR.

neljä perustettiin viljelmät kohti jokaisen luovuttajan. Kaksi säteilytettiin 0,5 Gy 137Cs γ-säteet, kun taas kaksi muuta jättää käsittelemättä. Säteilytys suoritettiin klo Unitat Tecnica de Protecció Radiologica (UTPR-UAB) Universitat Autònoma de Barcelona. Annos oli 6,00 Gy min

-1. Lymfosyytit (säteilytetty ja ei säteilytetty) viljeltiin 37 ° C: ssa 72 tunnin ajan. 44 tunnin kuluttua PHA stimulaation, 10 ui (3 mg /ml) sytokalasiini B (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) lisättiin, jotta saatiin lopullinen konsentraatio viljelmässä 6 ug /ml. Viljelmiä ylläpidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Cell korjuun ja MN pisteytys

Solut kerättiin sentrifugoimalla (10 min, 120 g). Supernatantti heitettiin pois jokaisen sentrifugoimalla. Hypotoninen käsittely suoritettiin lisäämällä 5 ml KCI 0,075 M 4 ° C: ssa 10 min. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin ja metanoli /etikkahappo-seosta (03:01 v /v), lisättiin varovasti. Tämä kiinnitys vaihe toistettiin kahdesti, ja tuloksena solut suspendoitiin uudelleen pieneen tilavuuteen fiksatiiviliuosta. Ilmakuivattiin valmisteltiin ja levyt värjättiin 10% Giemsa (Merck KGaA, Darmstadt, Saksa) fosfaattipuskurissa (pH 6,8), 7 min. Objektilasit koodattu henkilö ei osallistunut pisteytyksen.

tason ilmaisemiseksi geneettisiä vaurioita, taajuus binucleated solujen mikrotumia (BNMN) arvioitiin. Sokkoutettu pisteytystä 1000 binucleated solua näytettä kohti (säteilytetty ja ei säteilytetty) analysoitiin määrittämään mikrotumien, standardin kriteerien [14].

SNP valinta

Polymorfiat käytetty tässä tutkimuksessa valittiin mukaan edellisessä analyysien [3]. Niinpä valitsimme kolme tag SNP osoittaa haplotyyppi yhdessä kilpirauhassyöpä, rs3754127 (C /T, 5 ’lähellä geeni), rs3765501 (G /A, introni) ja rs4658973 (T /G, introni).

DNA: n uutto ja SNP genotyypityksen

DNA eristettiin ääreisverenkierron, käyttäen standardia fenoli-kloroformilla menetelmällä. SNP tehtiin genotyypin Centro Nacional de Genotipado (CeGen) käyttäen iPLEX (Sequenom) tekniikka, ja se on menestyksekkäästi genotyyppi mukaisesti laadunvalvontakriteerit on CeGen (https://www.cegen.org). Vakuuttaa genotyypityksen luotettavuutta, 10% näytteistä valittiin satunnaisesti ja kaksinkertainen genotyypitettiin rinnakkaisnäytettä useina 96 kuoppalevyillä. Lisäksi kaksi HapMap viittaus trios sisällytettiin levyt ja genotyyppi vastaavuutta ja oikea Mendelin perintö todennettiin.

Tilastollinen

analyysi eroista, kytkentäepätasapainossa ja haplotyyppi taajuusarviointiprosessi suoritettiin käyttämällä web-työkalu SNP-analyysi SNPStats [15]. Lineaarinen regressiomallin hallitseva ja codominant perintö tehtiin. Kaikki analyysit ikä-, sukupuoli- ja histologiset diagnoosi. Haplotyypin analyysit suoritettiin käyttäen samaa web työkalu. Haploview ohjelmisto [16] on käytetty tutkimaan LD SNP: iden välillä. Muut tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen R versio 2.12.1 [17].

Tulokset

Yleiset ominaisuudet valitun DTC potilaat yhteenveto Materiaali ja menetelmät osassa. Kuten on osoitettu, naisten osuus oli suurempi kuin miesten, mikä suurimman vaikutuksen DTC naisilla. Lisäksi kohonnut ilmaantuvuus papillaarinen kilpirauhassyövän osoittaa valta tämän histologiset alatyypin.

Taulukko 1 osoittaa, että keskimääräinen spontaani BNMN taajuus 115 potilailla oli 6,87 ± 0,55 (keskiarvo ± SE). BNMN arvot osoittivat 4,6-kertainen kasvu (31,35 ± 1,5) altistumisen jälkeen 0,5 Gy ionisoivan säteilyn, osalta spontaani tasolle. Nämä erot spontaani ja jälkeen säteilytyksen BNMN taajuus oli, kuten odotettua, tilastollisesti merkitsevä (P 0,001). Vaikka keskimääräinen spontaanin BNMN oli suurempi naisilla (7,19 ± 0,65) kuin miehillä (5,51 ± 0,94) tämä ero ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä (P = 0,339). Toisaalta Eroja ei havaittu naisilla ja miehillä jälkeen säteilytyksen (31.19 ± 1,70 ja 31,01 ± 3,11; vastaavasti P = 0,833).

Spontaani BNMN arvot alatyypin potilaita, joilla papillaarisen kilpirauhassyöpä oli lievästi, mutta ei merkittävää laskua, verrattuna follikulaarinen alatyypin (6,64 ± 0,57 ja 8,31 ± 1,82; vastaavasti P = 0,559). Arvot BNMN säteilytyksen jälkeen ei osoittanut merkittäviä eroja molempien alatyyppejä (31.71 ± 1,50 ja 29,13 ± 5,53; vastaavasti P = 0,553).

Kuvassa 1 on havaittu hyvä korrelaatio, joka vallitsee spontaani BNMN arvot ja ne havaittiin säteilyttämisen jälkeen (R

2 = 0,28, P 0,001). Tämä viittaa taustalla geneettinen syy.

Olemme myös arvioineet soluproliferaation nopeus käyttämällä sytokineesiin-tukossa leviämisen indeksi (CBPI). CBPI arvo osoittaa keskimäärin solusykleihin solua kohden [18]. Tulokset (tietoja ei esitetty) osoittavat merkittävää laskua CBPI kulttuureissa altistetaan ionisoivalle säteilylle (P 0,001).

erot ja niiden 95%: n luottamusväli laskettiin lineaarisella regressioanalyyseissä käyttäen viitearvona homotsygoottinen genotyyppi yleisin alleeli, jossa säätö iän, sukupuolen ja diagnoosit. Taulukossa 2 esitetään erot havaittu spontaanisti BNMN arvoihin, mukaan eri polymorfismien, ottaen huomioon codominant malli perintö. Sillä spontaani BNMN taajuus pieni eroja genotyyppien havaittiin kaikkien arvioitiin polymorfismit. Mielenkiintoista on, että kaikissa tapauksissa BNMN arvot olivat suuremmat viite genotyyppien (homotsygoottisia yhteisen alleelin), mutta nämä erot eivät saavuttaneet tilastollista merkitykset.

haplotyyppianalyysissä suoritettiin kolmelle SNP WDR3 ja tulokset on esitetty taulukossa 3. Kolme haplotypes ennustettiin olevan taajuuden 0,01. Toinen haplotypes ennustettiin olevan liian outoa mielekkään tilastollisen analyysin. Merkittäviä eroja ei havaittu mitään yleisimmistä haplotyypit kanssa spontaani BNMN arvot.

keinoja BNMN taajuudet olivat merkittävästi erilaiset genotyypin kolmesta

WDR3

polymorfismien (taulukko 4) . Havaitsimme huomattavasti alhaisempi keskimääräinen BNMN taajuuksia läsnä ollessa vähäinen alleelin jälkeen ionisoivan säteilyn altistuksesta määräävä malli perintö. Esimerkiksi rs3754127 C /T-T /T genotyyppien osoitti vähentynyt BNMN taajuus verrattuna CC yksilöiden (katso taulukko 4). Samoin myös havaittu väheneminen säteilyn aiheuttamaa vahinkoa haplotyyppi, kun yhdistämällä pienet alleelin kunkin kolmen genotyyppi SNP: [-4,9 (-9,16

-0,63), P = 0,026] (ks taulukko 5).

Kun analyysi tehtiin kerrostetaan väestön kasvaimen tyyppi diagnoosin (follikulaarista tai papillaarilihaksessa), papillaarilihaksessa alaryhmä osoittivat arvoja säteilytyksen jälkeen samanlaisia ​​kuin koko väestön: rs3754127 [-8,39 (-14,45–2,33), P 0,01]; rs3765501 [-8,83 (-15,37–2,29), P 0,01]; rs4658973 [-8,36 (-14,46–2,27), P 0,01], kaikki hallitseva mallia. Toisaalta, vaikutus havaittiin follikulaarinen alatyypin säteilytyksen jälkeen oli korkeampi kuin papillaarinen ja yleisessä DTC potilaita; kuitenkin, erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä, johtunee pieni määrä yksilöitä: rs3754127 [-27,78 (-55,54–0,02), P = 0,074]; rs3765501 [-28,67 (-62,46-+5,12), P = 0,12]; rs4658973 [-29,10 (-60,26-+2,06), P = 0,094], kaikki hallitseva malli.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet merkittävää suhdetta kolmen valitun polymorfismia

WDR3

geeni ja tasoja DNA-vaurion jälkeen hoidon IR. Tämä osoittaa roolin WDR3 ylläpidossa genomista vakautta.

WDR3

geeni koodaa ydin- proteiinia, joka sisältää 10 WD toistuu Tuntematon toiminto [4] ja jäseniä tämän suuren perheen ovat rakenteellisesti läheisistä, mutta toiminnallisesti erilaisia. Osa solutoiminnoille kulkeutumisväylät säätelee tämän perheen jäseniä kuuluu geenisäätelyn, signaalitransduktion, RNA käsittely ja silmukoinnin imusolualapopulaatiot itseohjautuva, säätely solusyklin etenemistä, solunjakautumisen /kromatiinin erottaminen ja solujen /kudosten erilaistumiseen, muun, arvostelluksi [5], [6]. Kuitenkin, tähän asti ei ole tietoja, joiden mahdollisesta osallisuudesta korjausmekanismit tai vaikutus, ylläpito genomisen vakautta

WDR3

, tai joku jäsen sen perheen.

Tavoitteena löytää järkevä selitys yhdistyksen havaittu

WDR3

polymorfismien ja DTC esiintyvyys, olemme jo raportoineet säätely ylöspäin

WRD3

eri kilpirauhassyöpä solulinjoissa, mikä viittaa sen mahdollista vaikutusta kilpirauhasen syöpä kasvaimien syntyyn [3]. Näin samaa mieltä tutkimukset suoritetaan rinsyöpäsolulinja MCF-7 osoittaa, että tukahduttaminen

WDR3

vähentää solujen lisääntymistä, pienentää solukoko ja vähentää pesäkkeet muodostumista, mikä osoittaa, että

WDR3

annetaan kasvua ja proliferatiivinen etuna syöpäsoluihin [8]. WDR3 proteiini uudelleen tumassa kun ribosomin biogeneesin häiriintyy. Solutapahtumiin tunnu olevan vaikutusta asetuksessa ilmentymisen

WDR3

muuttamalla ribosomien biogeneesin [8]. Lasku ohimenevä muutoksia tasoja DNA-vaurioita korjaus proteiineja (ei-homologisen end-liittymällä proteiinit) on havaittu nucleolus jälkeen ionisoivan säteilyn altistumisen; Siksi näyttää mahdolliselta, että nämä muutokset heijastavat biologisesti relevantti vaste DNA double-lohkon murtuma vahinkoa [19].

löydökset viittaavat korrelaatio vähäinen taajuus alleelit rs3754127, rs3765501, rs4658973 polymorfismit ja alarajat DNA-vaurion jälkeen ionisoivalla säteilyllä. Vaikka SNP käytetään tutkimuksessamme eivät tuota muutoksia aminohappojen proteiinisekvenssin, on tunnettua, että ei-koodaavan yhden nukleotidin polymorfismit voivat muuttaa geenin ilmentymistä [20]. Muutokset kohteen promoottorisekvenssin (rs3754127) voidaan keskeyttää oikea vuorovaikutus transkriptiotekijöiden muuttuvat täysin geenin ilmentymistä tai vaikuttaa ilmentymisen taso [21]; tämä tarkoittaa, että transkriptiota WDR3 voi riippua geneettinen vaihtelu sen promoottorialueen. Vaikka vaihtoehtoisen silmukoinnin takia läsnäolon SNP, luultavasti tapahtua [22], [23], on todettava, että vaihtoehtoisia selostukset myös ionisoivan säteilyn aiheuttama [24]. Siten polymorfismeja rs3765501 ja /tai rs4658973 voi myös vaikuttaa vaihtoehtoisen silmukoinnin, ei pelkästään sen läsnäolo vaan myös lisä- tai ero vaikutusten kanssa ionisoivan säteilyn vaikutuksia. Vaihtoehtoisesti mikä tahansa näistä polymorfismien voi olla vastuussa väheneminen DNA-vaurion jälkeen IR, mutta ne toimivat geneettisiä markkereita geneettistä vaihtelua on WDR3 suoraan osallisena WDR3 genomista vakautta.

havaitut vaikutukset, osoittaa osallistuminen on

WDR3

ylläpitämisessä genomista vakauden altistumisen jälkeen IR, samaa mieltä yhdistyksen löytyi DTC ja rooliin johtuvan ribosomissa biogeneesissä. Täten muutokset ilmaus

WDR3

häiritsisivät signalointireittejä välisistä ribosomin biogeneesiä ja p53 aktivaation [8]. Kaikki nämä tulokset kokonaan viittaavat tärkeä rooli

WDR3

ylläpitämisessä genomissa vakauden sekä syövän synnyn ja solukierron säätelyssä. Mielenkiintoista, alustavat tulokset paksusuolen syöpäpotilaiden (V. Moreno, henkilökohtainen tiedonanto) näyttävät osoittavan muuttuneeseen ilmaus

WDR3

paksusuolen syöpä, joka tukee mielestämme ehdottaa rooli WDR3 genomi- vakautta ja syöpä. Tuloksemme ovat tarpeeksi mielenkiintoisia suorittaa lisätutkimuksia

WDR3

geeniekspression vahvistaa tämän hypoteesin.

Kiitokset

Kiitämme kaikkia aiheita osallistuvat tässä tutkimuksessa, sekä jäsenille ja isotooppilääketieteen Service, Hospital Vall dHebron (Barcelona) ja endokrinologian yksikkö sairaalan Josep Trueta (Girona) tarjoamiseksi potilaan verinäytteestä.